多糖

多糖（精选9篇）

篇1：多糖

冬虫夏草产多糖菌株的筛选鉴定及多糖提取

摘要：为了得到多糖收率较高的冬虫夏草菌株，从西藏那曲地五高山草甸中采集的新鲜冬虫夏草子实体初步分离得到50株菌株，并对其进行形态观察和18S rDNA-ITS序列分析鉴定，采用超声辅助热水浸提法进行冬虫夏草多糖的提取。结果表明，CC-3菌株Cladosporium sp.的模式菌株JN084020的18S rDNA-ITS同源相似性为100%，初步确定为冬虫夏草的无性型，经过超声辅助热水浸提后多糖收率最高为6.619%。

关键词：冬虫夏草；真菌；筛选；rDNA-ITS序列；Cladosporium sp.中图分类号： S182 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）03-0240-03

冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）是中国传统的名贵中药材，系麦角菌科虫草属真菌寄生于蝙蝠蛾的幼虫所形成的的菌虫复合体[1]。2001年统计，全球冬虫夏草种类已有400种，其中中国记载有105种左右[2]。

冬虫夏草在中国传统医学里已经流传1 300多年，最早记载冬虫夏草的文献始于唐朝前期公元710年的《月王药诊》，记载冬虫夏草能治疗肺部疾病。公元780年《藏本草》记载的冬虫夏草具有润肺、补肾的作用；1765年，赵学敏在《本草纲目拾遗》中记载冬虫夏草的作用是润肺、补肾、益精气，理诸虚百损；1757年，吴仪洛所著《本草从新》中指出冬虫夏草保肺益肾，止血化痰。其后，《黔囊》《文房肆考》《四川通志》《本草图说》等100多部古书都记载了冬虫夏草名贵药材[3]。

目前，研究证实冬虫夏草有降血糖、免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗纤维化、抗炎等功效，对肺脏、肾脏、中枢神经系统、免疫系统、心脏、肝脏等均有较好的临床保护作用[4]。由于冬虫夏草的生长环境及人们过于采挖，冬虫夏草已经远远不能满足医疗的需求，人们开始研究冬虫夏草成分与功能的关系，冬虫夏草多糖作为冬虫夏草的重要活性成分，具有抗疲劳、抗衰老、提高免疫力的作用[5-6]。表明冬虫夏草多糖在新药开发方面有广阔的前景。

已报道的冬虫夏草的无性型菌株涉及13个属，22个种名[7]，包括细脚拟青霉（Paecilomyces tenuipes）、虫草蚧霉属（Lecanicilliuum sp.）、轮枝孢属（Verticillium sp.）、被毛孢属（Hirsutella）、头孢属（Cephalosporium sp.）等，其中部分冬虫夏草的无性型还有待进一步确定[8]。冬虫夏草的无性型研究已成为研究热点。

本研究分离筛选了50株能够产多糖的菌株，分子生物学鉴定分别为虫草蚧霉属、枝孢菌属、黑粉菌属。超声辅助热水浸提法提取冬虫夏草多糖，CC-3菌株的多糖得率最高为6.619%。研究结果为应用发酵方法生产冬虫夏草多糖替代冬虫夏草应用于医疗，以及进一步确定冬虫夏草多糖的功能奠定基础。材料与方法

1.1 材料

新鲜冬虫夏草采自西藏那曲地五高山草甸。

1.2 培养基及试剂

PDA加富培养基：土豆200 g/L、葡萄糖20 g/L、酵母膏 1 g/L、蛋白胨1 g/L、KH2PO4 1g /L、琼脂240 g/L、MgSO4 0.5 g/L、蚕蛹粉1 g/L。pH值6.7，121 ℃蒸汽灭菌30 min。

种子瓶液体培养基：KH2PO4 3 g/L、MgSO4 1.5 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖20 g/L。pH值6.7，121 ℃蒸汽灭菌30 min。

发酵培养基：葡萄糖9 g/L、麦芽糖19 g/L、蛋白胨 10 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、MgSO4 1 g/L、MnSO4 0.5 g/L。pH值6.7，121 ℃蒸汽灭菌30 min。

CTAB提取液：NaCl 1.4 mol/L、EDTA 20 mmol/L、CTAB 20 g/L、Tris-Cl 100 mmol/L、巯基乙醇2 g/L、pH值8.0。

苯酚 ∶氯仿 ∶异戊醇溶液=25 ∶24 ∶1。

RNA酶：1 mg/mL。

真菌通用引物：ITS1和ITS4。

1.3 试验方法

1.3.1 冬虫夏草菌株的分离纯化

无菌条件下将新鲜的冬虫夏草用1%HgCl2溶液消毒，用无菌水冲洗干净，并用无菌的滤纸吸干表面的水分，分离冬虫夏草的蛹体和子座部分，分别研磨成粉，用无菌湿棉签蘸取粉末涂于加入氯霉素1 g/L 的PDA加富平板上，倒置于28 ℃培养箱中培养至单菌落出现。挑选菌丝色泽洁白、生长健壮、无杂菌污染的菌株，转接加入氯霉素1 g/L 的PDA加富试管斜面中，28 ℃培养箱中培养7～10 d，直至整个斜面都长满菌丝，选取生长健壮，无杂菌的菌株即为分离得到的菌株。

1.3.2 菌种的鉴定

1.3.2.1 菌体形态观察

将分离得到的菌株梯度划线接种于PDA平板中，用无菌镊子取无菌盖玻片，斜插入培养基中，每天观察并记录菌落生长情况，7 d后，拔出插片，显微镜下观察菌丝形态及产孢形式。

1.3.2.2 菌株的ITS序列测定

（1）基因组DNA的提取。采用CTAB法[9]提取基因组DNA。

（2）ITS序列分析。

ITS序列引物为真菌通用引物，ITS1和ITS4[10]。ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；

ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

PCR扩增反应体系（25 μL）：DNA 2 μL、TaqDNA聚合酶0.3 μL、10×TaqBuffer（含Mg2+）2.5 μL、ITS1 2 μL、ITS4 2 μL、dNTP 2 μL、ddH2O 14.2 μL。

PCR扩增程序：95 ℃预变性10 min，94 ℃变性30 s、55 ℃ 退火30 s、72 ℃ 延伸50 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。

（3）琼脂糖凝胶电泳及测序。

PCR产物扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，条带清晰，用蛋白核酸测定仪测定后无蛋白和核酸残留，送北京宝锐通生物技术有限公司测序。

（4）ITS测序数据分析。

在NCBI中对菌株的ITS序列进行BLAST分析，然后用MEGA5进行系统发育树的构建。

1.3.3 提取冬虫夏草多糖

1.3.3.1 冬虫夏草菌丝体的制备

在无菌条件下挖取1 cm2的分离菌株的培养菌苔接种于装有100 mL种子培养基的三角瓶（容量500 mL）中，180 r/min、28 ℃摇床培养7 d。

按10%的接种量，接种于装有100 mL发酵培养基的三角瓶（容量500 mL）中，180 r/min、28 ℃摇床培养7 d。

发酵液 8 000 r/min 离心10 min。收菌丝体、80 ℃烘干、粉碎、过80目筛，备用。

将烘干的冬虫夏草菌丝体粉碎，过40目筛，备用。

1.3.3.2 超声辅助热水浸提法提取冬虫夏草多糖

取干燥恒重的冬虫夏草菌丝粉10 g，提取溶液为去离子水（首次加量料液比为1 g ∶20 mL，浸泡30 min之后，加水量料液比按前加量的75%递减）。提取条件：温度90 ℃、提取4次、每次浸提时间90 min，超声功率150 W。

1.3.4 冬虫夏草多糖含量测定

采用苯酚-硫酸比色法[11-12]测定。

1.3.4.1 绘制葡萄糖标准曲线

取烘干至恒重的葡萄糖标准品配置成最终浓度为0.1 mg/mL的标准液，取9支试管分别取葡萄糖标准液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，各补加蒸馏水至1.0 mL，然后加入5%苯酚1.0 mL，迅速加入浓硫酸5.0 mL，摇匀，静置10 min。于40 ℃水浴中加热 30 min，以蒸馏水替代葡萄糖标准液为空白对照，于D490 nm波长处测吸光度。

1.3.4.2 冬虫夏草多糖含量的测定

取冬虫夏草多糖提取滤液，稀释一定的倍数，取1 mL稀释液，加入5%苯酚溶液 1 mL，摇匀、迅速加入5mL浓硫酸，摇匀、静置10 min。于 40 ℃ 水浴中加热30 min，以蒸馏水作空白对照，在D490 nm处测定吸光度。按回归方程计算稀释液多糖含量。按下式计算多糖含量：多糖含量（mg/g）=待测液中多糖浓度（mg/mL）×溶液体积（mL）×稀释倍数/原料质量（g）。结果与分析

2.1 冬虫夏草菌株的分离纯化

对分离出的50株生长健壮、无杂菌、菌丝洁白的菌株进行多糖的提取，并测定多糖含量，根据葡萄糖标准曲线得到的回归方程，计算虫草多糖得率。回归方程为y=10.399x-0019 5，r=0.998 7。根据计算得到，CC-3菌株的多糖得率最高，达6.619%。不同菌株的多糖含量结果见表1。讨论与结论

冬虫夏草的生活史分为有性型的子囊孢子阶段和无性型的分生孢子阶段。而人工培养、液体发酵菌丝体的冬虫夏草均为无性型阶段，因此，冬虫夏草无性型及菌种的鉴定至关重要。

最早人们判定冬虫夏草有性型和无性型的关系，依据假定无性型与虫草有性型子实体有相关性，用人工诱导虫草子实体的形成。人工诱导方法在人工诱发子实体长出子囊孢子非常困难，培养出的虫草子实体寥寥无几，人工诱导方法只能为虫草有性型和无性型的鉴定提供依据。

刘作易等从云南收集的新鲜冬虫夏草（Cordyceps sinensis），利用微循环对其子囊孢子的产孢结构进行了观察，并与组织和子囊孢子分离的菌株的产孢结构进行比对，还与中国被毛孢（Hirsutella sinensis）的产孢结构进行比较。结果显示微循环的产孢结构与分离菌株和中国被毛孢的产孢结构相似，由此确定冬虫夏草的无性型为中国被毛孢[13]。该方法虽操作简单，但必须要先明确此菌株的种属关系，该方法在冬虫夏草无性型的鉴定上也还是一种辅助手段。

随着分子生物学的发展，RAPD-PCR技术为确定虫草的无性型提供了可靠的分子生物学证据，但该方法不能很好地确定菌株的种和亚种。ITS序列分析的发展，为菌株无性型与有性型关系及菌株的近缘关系方面提供了可靠证据。Kang等报道，甘肃虫草和冬虫夏草具有相同的 ITS序列，并认为甘肃虫草可能是冬虫夏草的分类异名[14]。张泽文对古尼拟青霉菌种的完整的 rDNA的ITS 区进行序列测定并进行比对，结果表明，分离到菌种为古尼虫草的无性型，即古尼拟青霉（Paecilomyces gunnii）[15]。

本研究从采摘的新鲜冬虫夏草子实体中分离得到CC-3菌株，运用插片法对该菌株的菌丝形态和孢子结构进行显微观察，初步判断菌株的菌属关系，通过RAPD-PCR技术，用通用引物ITS1 和ITS4扩增出18S rDNA片段，进行序列比对，最后确定该菌株的种属关系。

多糖提取方法很多，如水提醇沉方法提取多糖，在醇沉过程中会损失大量多糖；酶解法提取多糖，条件温和、质量好，但是经济价值高；热水浸提法提取多糖，方法简单易行，但效率较低。超声波产生的强烈振动和空化效应，使细胞破碎程度增大，加速了多糖的溶出，有利于多糖的提取。本试验采取超声波辅助热水浸提法提取虫草多糖。

多糖测定方法也很多，通常采用硫酸-蒽酮法、苯酚-硫酸法测定多糖的含量。硫酸-蒽酮法由于糖与蒽酮试剂的显色深度不同，糖混合时，常因不同糖类比例造成一定的误差。而苯酚-硫酸法测定多糖，方法简单、灵敏度高、不受蛋白质存在的影响，产生的颜色稳定。

从西藏新鲜的冬虫夏草中初步分离得到50株菌株，经过多糖含量测定，CC-3菌株多糖得率最高，为6.619%，多糖含量高达6.619 mg/g。对CC-3菌株进行形态学观察、分子生物学18S rDNA序列分析，初步鉴定CC-3菌株为Cladosporium sp.菌株。

参考文献：

[1]于洪飞.冬虫夏草无性型鉴定的几种方法[J].安徽农业科学学报，2006，34（12）：2763-2787.[2]Kirk P M，Cannon P F，David J C，et al.Ainsworth & Bisbys：dictionary of the fungi[M].9th ed.Wallingford，UK：CAB International，2001.[3]郭文场，刘 颖，冯贺林，等.冬虫夏草的研究[J].特产研究，1981（4）：1-5.[4]Paterson R R.Cordyceps：a traditional Chinese medicine and another fungal therapeutic biofactory[J].Phytochemistry，2008，69（7）：1469-1495.[5]Qiao D L，Luo J G，Ke C L.Immunostimulatory activity of the polysaccharide from Hyriopsis cumingii[J].International Journal of Biological Macromolecules，2010，47：657-680.[6]任 健，张倩落，郑 丽.人工虫草多糖对免疫低下小鼠免疫功能的影响[J].第四军医大学学报，2007，28（21）：1967-1969.[7]Schildkraut J J.The catecholamine hypthesis of affective disorders：a review of supporting evidence[J].Am J Psychiatry，1965，12：509-522.[8]李春如.35种虫草及其无性型鉴定、活性筛选和细脚拟青霉提取物的抗抑郁作用及相关机制[D].合肥：安徽医科大学，2006.[9]马 明，杨克强，郭启荣.改良CTAB 法提取林木树种基因组DNA的研究[J].生物技术，2007，17（3）：36-37.[10]王洪凯，张天宇，张 猛.应用5.8S rDNA 及ITS区序列分析链格孢种级分类[J].菌物系统，2001，20（2）：168-173..[11]宁慧青.不同食用菌多糖含量的比较研究[J].山西化工，2007（3）：44-45.[12]荆留萍，杜双田，金凌云，等.8 种物质对蛹虫草液体发酵中虫草素及多糖含量的影响[J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2010，38（11）：156-160.[13]刘作易，梁宗琦，刘爱英.冬虫夏草子囊孢子萌发及其无性型观察[J].贵州农业科学，2003，31（1）：3-5.[14]Kang J C，Liang Z Q，Liu A Y，et al.Molecular evidence of polymorphism in cordyceps based on 5.8S rDNA and ITS sequences[J].Mycosystema，2000，19（4）：492-497.[15]张泽文，傅 岚，陈作红.古尼虫草无性型的分子鉴别[J].菌物学报，2005，24（3）：344-348.

篇2：多糖

多糖是药用黄芪根中的.主要有效成分之一.本研究分析测定了分属于膜荚黄芪(Astragalus membranaceus)和蒙古黄芪(Astragalus membranaceus var.mongolicus)的6个品种在不同时期根中多糖含量的变化以及采收期根中多糖含量的差异和可溶性糖含量的变化.结果表明:各品种均从8月开始根中多糖迅速积累,至受霜害时多糖含量达到最高,受霜害后多糖含量迅速下降,可溶性糖含量上升;在初霜降时(10月4日)6个品种中以旬邑野生膜荚黄芪多糖含量最高.因此8月至初霜降是黄芪多糖积累的主要时期,黄芪的最佳采收期为初霜降前后.而旬邑野生膜荚黄芪是多糖含量较高的优良品种.

作 者：曹建军 王长如 梁宗锁 陈专科 王渭玲 CAO Jian-jun WANG Chang-ru LIANG Zong-suo CHEN Zhuan-ke WANG Wei-ling 作者单位：曹建军,王长如,王渭玲,CAO Jian-jun,WANG Chang-ru,WANG Wei-ling(西北农林科技大学,生命科学学院)

梁宗锁,LIANG Zong-suo(西北农林科技大学,生命科学学院;中国科学院,水利部,水土保持研究所,陕西,杨陵,712100)

陈专科,CHEN Zhuan-ke(宝鸡秦岭国药厂,陕西,宝鸡,721004)

篇3：黄芪多糖的免疫作用

1 黄芪多糖对免疫器官的促进作用免疫器官包括中枢免疫器官和外周免疫器官, 前者包括胸腺、骨髓 (禽类为法氏囊) ;

后者包括脾脏、淋巴结、消化道、呼吸道及泌尿生殖道的淋巴结。免疫器官的发育状况会直接影响到机体免疫力的高低。黄芪多糖对动物机体免疫器官的促进作用, 主要体现在对动物胸腺、脾脏、法氏囊重量的增加上。黄芪多糖也能对抗免疫抑制剂泼尼松龙或强的松龙所造成的对脾、胸腺、肠淋巴结等免疫器官的萎缩作用, 也能对抗环磷酰胺引起的脾脏萎缩。

应用小鼠非麻醉状态下Ⅲ度烧伤模式, 观察烧伤后8d细胞免疫功能的变化及AIS体内应用对烧伤后细胞免疫功能的影响。结果显示, 烧伤后8d小鼠的脾脏指数 (脾脏重量/体重) 和胸腺指数 (胸腺重量/体重) 降低, AIS经腹腔注射 (260mg/kg体重, 1次/d, 连用10d) 不仅明显提高正常小鼠的脾脏指数和胸腺指数, 还可使烧伤小鼠的脾脏指数和胸腺指数恢复正常。

2 黄芪多糖对特异性免疫的促进作用

免疫细胞主要包括T细胞、B细胞、K细胞和NK细胞等。在免疫细胞中, 受抗原刺激后能分化增殖, 发生特异性免疫应答, 产生抗体或淋巴因子的细胞为免疫活性细胞, 主要是T细胞和B细胞, 而单核细胞系的细胞和粒细胞则主要起协同作用。黄芪多糖能使小鼠脾脏增大, 脾内浆细胞增生, 促进抗体合成, 增强体液免疫功能。黄芪多糖能显著提高机体的细胞免疫和体液免疫。黄芪多糖可增加PHA诱导的小鼠体内淋巴细胞转化率, 并能对抗环磷酰胺引起的淋巴细胞转化率下降。APS对小鼠体内淋巴细胞转化率有明显促进作用, 黄芪的体液免疫作用是通过作用于特异性体液免疫和非特异性体液免疫途径中某些环节, 如免疫球蛋白或补体成分而产生作用的。黄芪多糖能促进雏鸡未成熟T细胞转化并提高其活性, 刺激T淋巴细胞和B淋巴细胞的功能。

3 黄芪多糖对非特异性免疫的促进作用

非特异性免疫主要是机体单核巨噬细胞系统的各种巨噬细胞产生的非针对某特定病原体的防御机能。黄芪多糖能显著提高机体的非特异性免疫功能, 促进小鼠的网状内皮质系统的吞噬功能, 诱导产生白细胞介素。黄芪多糖经腹腔注射, 可增加小鼠腹腔巨噬细胞数量, 显著促进小鼠巨噬细胞的吞噬功能, 还可对抗强的松龙或环磷酰胺对吞噬功能的抑制作用。

4 黄芪多糖对肿瘤、病毒的作用

黄芪多糖具有促进机体对抗病毒诱导产生干扰素的能力, 一定程度地抑制了病毒的繁殖。黄芪多糖能使动物体诱生内源性干扰素, 作用于细胞, 使产生抗病毒蛋白而抑制病毒蛋白合成, 产生抗病毒感染的作用。

篇4：多糖

关键词：冬虫夏草；真菌；筛选；rDNA-ITS序列；Cladosporium sp.

中图分类号： S182 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）03-0240-03

冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）是中国传统的名贵中药材，系麦角菌科虫草属真菌寄生于蝙蝠蛾的幼虫所形成的的菌虫复合体[1]。2001年统计，全球冬虫夏草种类已有400种，其中中国记载有105种左右[2]。

冬虫夏草在中国传统医学里已经流传1 300多年，最早记载冬虫夏草的文献始于唐朝前期公元710年的《月王药诊》，记载冬虫夏草能治疗肺部疾病。公元780年《藏本草》记载的冬虫夏草具有润肺、补肾的作用；1765年，赵学敏在《本草纲目拾遗》中记载冬虫夏草的作用是润肺、补肾、益精气，理诸虚百损；1757年，吴仪洛所著《本草从新》中指出冬虫夏草保肺益肾，止血化痰。其后，《黔囊》《文房肆考》《四川通志》《本草图说》等100多部古书都记载了冬虫夏草名贵药材[3]。

目前，研究证实冬虫夏草有降血糖、免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗纤维化、抗炎等功效，对肺脏、肾脏、中枢神经系统、免疫系统、心脏、肝脏等均有较好的临床保护作用[4]。由于冬虫夏草的生长环境及人们过于采挖，冬虫夏草已经远远不能满足医疗的需求，人们开始研究冬虫夏草成分与功能的关系，冬虫夏草多糖作为冬虫夏草的重要活性成分，具有抗疲劳、抗衰老、提高免疫力的作用[5-6]。表明冬虫夏草多糖在新药开发方面有广阔的前景。

已报道的冬虫夏草的无性型菌株涉及13个属，22个种名[7]，包括细脚拟青霉（Paecilomyces tenuipes）、虫草蚧霉属（Lecanicilliuum sp.）、轮枝孢属（Verticillium sp.）、被毛孢属（Hirsutella）、头孢属（Cephalosporium sp.）等，其中部分冬虫夏草的无性型还有待进一步确定[8]。冬虫夏草的无性型研究已成为研究热点。

本研究分离筛选了50株能够产多糖的菌株，分子生物学鉴定分别为虫草蚧霉属、枝孢菌属、黑粉菌属。超声辅助热水浸提法提取冬虫夏草多糖，CC-3菌株的多糖得率最高为6.619%。研究结果为应用发酵方法生产冬虫夏草多糖替代冬虫夏草应用于医疗，以及进一步确定冬虫夏草多糖的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜冬虫夏草采自西藏那曲地五高山草甸。

1.2 培养基及试剂

PDA加富培养基：土豆200 g/L、葡萄糖20 g/L、酵母膏 1 g/L、蛋白胨1 g/L、KH2PO4 1g /L、琼脂240 g/L、MgSO4 0.5 g/L、蚕蛹粉1 g/L。pH值6.7，121 ℃蒸汽灭菌30 min。

种子瓶液体培养基：KH2PO4 3 g/L、MgSO4 1.5 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖20 g/L。pH值6.7，121 ℃蒸汽灭菌30 min。

发酵培养基：葡萄糖9 g/L、麦芽糖19 g/L、蛋白胨 10 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、MgSO4 1 g/L、MnSO4 0.5 g/L。pH值6.7，121 ℃蒸汽灭菌30 min。

CTAB提取液：NaCl 1.4 mol/L、EDTA 20 mmol/L、CTAB 20 g/L、Tris-Cl 100 mmol/L、巰基乙醇2 g/L、pH值8.0。

苯酚 ∶氯仿 ∶异戊醇溶液=25 ∶24 ∶1。

RNA酶：1 mg/mL。

真菌通用引物：ITS1和ITS4。

1.3 试验方法

1.3.1 冬虫夏草菌株的分离纯化

无菌条件下将新鲜的冬虫夏草用1%HgCl2溶液消毒，用无菌水冲洗干净，并用无菌的滤纸吸干表面的水分，分离冬虫夏草的蛹体和子座部分，分别研磨成粉，用无菌湿棉签蘸取粉末涂于加入氯霉素1 g/L 的PDA加富平板上，倒置于28 ℃培养箱中培养至单菌落出现。挑选菌丝色泽洁白、生长健壮、无杂菌污染的菌株，转接加入氯霉素1 g/L 的PDA加富试管斜面中，28 ℃培养箱中培养7～10 d，直至整个斜面都长满菌丝，选取生长健壮，无杂菌的菌株即为分离得到的菌株。

1.3.2 菌种的鉴定

1.3.2.1 菌体形态观察

将分离得到的菌株梯度划线接种于PDA平板中，用无菌镊子取无菌盖玻片，斜插入培养基中，每天观察并记录菌落生长情况，7 d后，拔出插片，显微镜下观察菌丝形态及产孢形式。

1.3.2.2 菌株的ITS序列测定

（1）基因组DNA的提取。采用CTAB法[9]提取基因组DNA。

（2）ITS序列分析。

ITS序列引物为真菌通用引物，ITS1和ITS4[10]。ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；

ITS4：5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

PCR扩增反应体系（25 μL）：DNA 2 μL、TaqDNA聚合酶0.3 μL、10×TaqBuffer（含Mg2+）2.5 μL、ITS1 2 μL、ITS4 2 μL、dNTP 2 μL、ddH2O 14.2 μL。

nlc202309032225

PCR扩增程序：95 ℃预变性10 min，94 ℃变性30 s、55 ℃ 退火30 s、72 ℃ 延伸50 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。

（3）琼脂糖凝胶电泳及测序。

PCR产物扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，条带清晰，用蛋白核酸测定仪测定后无蛋白和核酸残留，送北京宝锐通生物技术有限公司测序。

（4）ITS测序数据分析。

在NCBI中对菌株的ITS序列进行BLAST分析，然后用MEGA5进行系统发育树的构建。

1.3.3 提取冬虫夏草多糖

1.3.3.1 冬虫夏草菌丝体的制备

在无菌条件下挖取1 cm2的分离菌株的培养菌苔接种于装有100 mL种子培养基的三角瓶（容量500 mL）中，180 r/min、28 ℃摇床培养7 d。

按10%的接种量，接种于装有100 mL发酵培养基的三角瓶（容量500 mL）中，180 r/min、28 ℃摇床培养7 d。

发酵液 8 000 r/min 离心10 min。收菌丝体、80 ℃烘干、粉碎、过80目筛，备用。

将烘干的冬虫夏草菌丝体粉碎，过40目筛，备用。

1.3.3.2 超声辅助热水浸提法提取冬虫夏草多糖

取干燥恒重的冬虫夏草菌丝粉10 g，提取溶液为去离子水（首次加量料液比为1 g ∶20 mL，浸泡30 min之后，加水量料液比按前加量的75%递减）。提取条件：温度90 ℃、提取4次、每次浸提时间90 min，超声功率150 W。

1.3.4 冬虫夏草多糖含量测定

采用苯酚-硫酸比色法[11-12]测定。

1.3.4.1 绘制葡萄糖标准曲线

取烘干至恒重的葡萄糖标准品配置成最终浓度为0.1 mg/mL的标准液，取9支试管分别取葡萄糖标准液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，各补加蒸馏水至1.0 mL，然后加入5%苯酚1.0 mL，迅速加入浓硫酸5.0 mL，摇匀，静置10 min。于40 ℃水浴中加热 30 min，以蒸馏水替代葡萄糖标准液为空白对照，于D490 nm波长处测吸光度。

1.3.4.2 冬虫夏草多糖含量的测定

取冬虫夏草多糖提取滤液，稀释一定的倍数，取1 mL稀释液，加入5%苯酚溶液 1 mL，摇匀、迅速加入5mL浓硫酸，摇匀、静置10 min。于 40 ℃ 水浴中加热30 min，以蒸馏水作空白对照，在D490 nm处测定吸光度。按回归方程计算稀释液多糖含量。按下式计算多糖含量：多糖含量（mg/g）=待测液中多糖浓度（mg/mL）×溶液体积（mL）×稀释倍数/原料质量（g）。

2 结果与分析

2.1 冬虫夏草菌株的分离纯化

对分离出的50株生长健壮、无杂菌、菌丝洁白的菌株进行多糖的提取，并测定多糖含量，根据葡萄糖标准曲线得到的回归方程，计算虫草多糖得率。回归方程为y=10.399x-0019 5，r=0.998 7。根据计算得到，CC-3菌株的多糖得率最高，达6.619%。不同菌株的多糖含量结果见表1。

3 讨论与结论

冬虫夏草的生活史分为有性型的子囊孢子阶段和无性型的分生孢子阶段。而人工培养、 液体发酵菌丝体的冬虫夏草均为无性型阶段，因此，冬虫夏草无性型及菌种的鉴定至关重要。

最早人们判定冬虫夏草有性型和无性型的关系，依据假定无性型与虫草有性型子实体有相关性，用人工诱导虫草子实体的形成。人工诱导方法在人工诱发子实体长出子囊孢子非常困难，培养出的虫草子实体寥寥无几，人工诱导方法只能为虫草有性型和无性型的鉴定提供依据。

刘作易等从云南收集的新鲜冬虫夏草（Cordyceps sinensis），利用微循環对其子囊孢子的产孢结构进行了观察，并与组织和子囊孢子分离的菌株的产孢结构进行比对，还与中国被毛孢（Hirsutella sinensis）的产孢结构进行比较。结果显示微循环的产孢结构与分离菌株和中国被毛孢的产孢结构相似，由此确定冬虫夏草的无性型为中国被毛孢[13]。该方法虽操作简单，但必须要先明确此菌株的种属关系，该方法在冬虫夏草无性型的鉴定上也还是一种辅助手段。

随着分子生物学的发展，RAPD-PCR技术为确定虫草的无性型提供了可靠的分子生物学证据，但该方法不能很好地确定菌株的种和亚种。ITS序列分析的发展，为菌株无性型与有性型关系及菌株的近缘关系方面提供了可靠证据。Kang等报道，甘肃虫草和冬虫夏草具有相同的 ITS序列，并认为甘肃虫草可能是冬虫夏草的分类异名[14]。张泽文对古尼拟青霉菌种的完整的 rDNA的ITS 区进行序列测定并进行比对，结果表明，分离到菌种为古尼虫草的无性型，即古尼拟青霉（Paecilomyces gunnii）[15]。

本研究从采摘的新鲜冬虫夏草子实体中分离得到CC-3菌株，运用插片法对该菌株的菌丝形态和孢子结构进行显微观察，初步判断菌株的菌属关系，通过RAPD-PCR技术，用通用引物ITS1 和ITS4扩增出18S rDNA片段，进行序列比对，最后确定该菌株的种属关系。

多糖提取方法很多，如水提醇沉方法提取多糖，在醇沉过程中会损失大量多糖；酶解法提取多糖，条件温和、质量好，但是经济价值高；热水浸提法提取多糖，方法简单易行，但效率较低。超声波产生的强烈振动和空化效应，使细胞破碎程度增大，加速了多糖的溶出，有利于多糖的提取。本试验采取超声波辅助热水浸提法提取虫草多糖。

多糖测定方法也很多，通常采用硫酸-蒽酮法、苯酚-硫酸法测定多糖的含量。硫酸-蒽酮法由于糖与蒽酮试剂的显色深度不同，糖混合时，常因不同糖类比例造成一定的误差。而苯酚-硫酸法测定多糖，方法简单、灵敏度高、不受蛋白质存在的影响，产生的颜色稳定。

nlc202309032225

从西藏新鲜的冬虫夏草中初步分离得到50株菌株，经过多糖含量测定，CC-3菌株多糖得率最高，为6.619%，多糖含量高达6.619 mg/g。对CC-3菌株进行形态学观察、分子生物学18S rDNA序列分析，初步鉴定CC-3菌株为Cladosporium sp.菌株。

参考文献：

[1]于洪飞. 冬虫夏草无性型鉴定的几种方法[J]. 安徽农业科学学报，2006，34（12）：2763-2787.

[2]Kirk P M，Cannon P F，David J C，et al.Ainsworth & Bisbys：dictionary of the fungi[M]. 9th ed. Wallingford，UK：CAB International，2001.

[3]郭文场，刘 颖，冯贺林，等. 冬虫夏草的研究[J]. 特产研究，1981（4）：1-5.

[4]Paterson R R.Cordyceps：a traditional Chinese medicine and another fungal therapeutic biofactory[J]. Phytochemistry，2008，69（7）：1469-1495.

[5]Qiao D L，Luo J G，Ke C L.Immunostimulatory activity of the polysaccharide from Hyriopsis cumingii[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2010，47：657 -680.

[6]任 健，张倩落，郑 丽. 人工虫草多糖对免疫低下小鼠免疫功能的影响[J]. 第四军医大学学报，2007，28（21）：1967 -1969.

[7]Schildkraut J J.The catecholamine hypthesis of affective disorders：a review of supporting evidence[J]. Am J Psychiatry，1965，12：509-522.

[8]李春如. 35种虫草及其无性型鉴定、活性筛选和细脚拟青霉提取物的抗抑郁作用及相关机制[D]. 合肥：安徽医科大学，2006.

[9]马 明，杨克强，郭启荣. 改良CTAB 法提取林木树种基因组DNA的研究[J]. 生物技术，2007，17（3）：36 -37.

[10]王洪凯，张天宇，张 猛. 应用5.8S rDNA 及ITS区序列分析链格孢种级分类[J]. 菌物系统，2001，20（2）：168 -173..

[11]宁慧青. 不同食用菌多糖含量的比较研究[J]. 山西化工，2007（3）：44-45.

[12]荆留萍，杜双田，金凌云，等. 8 种物质对蛹虫草液体发酵中虫草素及多糖含量的影响[J]. 西北农林科技大学学报：自然科学版，2010，38（11）：156-160.

[13]劉作易，梁宗琦，刘爱英. 冬虫夏草子囊孢子萌发及其无性型观察[J]. 贵州农业科学，2003，31（1）：3- 5.

[14]Kang J C，Liang Z Q，Liu A Y，et al.Molecular evidence of polymorphism in cordyceps based on 5.8S rDNA and ITS sequences[J]. Mycosystema，2000，19（4）：492- 497.

[15]张泽文，傅 岚，陈作红. 古尼虫草无性型的分子鉴别[J]. 菌物学报，2005，24（3）：344- 348.

篇5：多糖蛋白片说明书

【英文名称】DuotangDanbaiPian

【拼音全码】DuoTangDanBaiPian(JinXiang)

【主要成份】氨基酸、核酸、多糖等。

【性状】多糖蛋白片(金象)为糖衣片，除去糖衣后显褐色。

【适应症/功能主治】用于白细胞减少症、传染性肝炎、神经衰弱等症的辅助治疗。

【规格型号】0.3g*48s

【用法用量】口服。一次4-6片，一日3次。

【不良反应】少数病人有恶心，或呕吐，部分有腹泻，腹泻在减少药量或服药数天后逐渐消失。

【禁忌】对多糖蛋白片(金象)过敏者禁用。

【注意事项】1.当药品性状发生改变时禁止使用。2.请将药品放在儿童不能接触到的地方。

【儿童用药】尚不明确。

【老年患者用药】尚不明确。

【孕妇及哺乳期妇女用药】尚不明确。

【药物相互作用】尚不明确。

【药物过量】尚不明确。

【药理毒理】多糖蛋白片含氨基酸、核酸、多糖等有效成分，可使白细胞明显上升，肝功能好转，调节神经系统机能，提高人体免疫能力。

【药代动力学】口服后在胃肠道内吸收迅速且完全。

【贮藏】遮光，密封保存。

【包装】铝塑板，12片*4板。

【有效期】24月

【批准文号】国药准字H35021339

【生产企业】福州海王金象中药制药有限公司

篇6：竹叶多糖提取条件的优化

为了探索竹叶多糖的.提取条件和最佳工艺条件,通过正交试验设计优化工艺条件,考察了水提条件下不同浸提温度、浸提时间、浸提固液比、浸提次数对多糖提取率的影响.结果表明,影响竹叶多糖提取率因素的主次关系依次是固液比、浸提次数、时间、温度,最佳提取工艺条件为80,浸提90 min,固液比1:25,浸提3次.比较水提法、超声波提取和微波提取3种方法对竹叶多糖提取率的影响,结果表明,超声波浸提的提取率高于水提法和微波浸提,分别提高21.3%和23.6%.

作 者：周跃斌 王伟 李适 邓克尼 罗理勇 ZHOU Yue-bin WANG Wei LI Shi DENG Ke-ni LUO Li-yong 作者单位：周跃斌,ZHOU Yue-bin(湖南农业大学产业处,湖南,长沙,410128)

王伟,李适,WANG Wei,LI Shi(湖南农业大学天然产物研究中心,湖南,长沙,410128;湖南农业大学园艺园林学院,湖南,长沙,410128)

邓克尼,罗理勇,DENG Ke-ni,LUO Li-yong(湖南农业大学园艺园林学院,湖南,长沙,410128)

篇7：香菇多糖胶囊说明书

【通用名称】香菇多糖胶囊

【商品名称】香菇多糖胶囊(创力)

【拼音全码】XiangGuDuoTangJiaoNang(ChuangLi)

【主要成份】香菇菌多糖。

【性状】香菇多糖胶囊(创力)为胶囊剂。

【适应症/功能主治】益气健脾，补虚扶正。香菇多糖胶囊用于慢性乙型迁延性肝炎及消化道肿瘤的放、化疗辅助药。

【规格型号】0.185g*24s

【用法用量】口服。一次3-5粒，一日2次。

【不良反应】尙不明确。

【禁忌】尙不明确。

【注意事项】尙不明确。

【药物相互作用】尙不明确。

【贮藏】密封。

【包装】每盒24粒。

【有效期】24月

【批准文号】国药准字Z20080579

【生产企业】湖北创力药业有限公司

篇8：大蒜多糖提取工艺研究

近年来对大蒜的研究十分活跃, 继大蒜素和大蒜油的研究之后, 大蒜多糖 (Garlic Polysaccharide, GP) 的功能研究逐渐引起人们的关注。国内外大量研究证实大蒜多糖具有多种生理活性。

作者在此对大蒜多糖提取率的影响因素进行研究, 确定了大蒜多糖的最佳提取工艺。

1 实验

1.1 材料与仪器

大蒜产自江苏徐州。

1.2 方法

流程:大蒜→去皮→清洗→捣碎→加水蒸煮→离心→抽滤→调pH8→CaCl2溶液, 搅拌→离心→上清液浓缩→干燥

检测方法:苯酚→硫酸法测定总糖含量。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 水料比对大蒜多糖提取率的影响

称取蒜泥50克, 在100℃水浴锅温度下按不同水料比加蒸馏水, 浸提90min。结果如图1所示。

由图1可以看出, 当水料比增大时, 大蒜多糖的提取率也提高, 但当水料比达到6:1以后, 提取率升高不明显。而增大水料比会延长浓缩时间, 增加操作费用, 所以料水比以6:1为宜。

2.1.2 温度对大蒜多糖提取率的影响

称取蒜泥50克, 按水料比6:1加蒸馏水, 在不同水浴锅温度下提取粗多糖, 浸提90min, 结果图2所示。

由图2可以看出, 当温度低于80℃时, 随着提取温度的升高, 大蒜多糖的提取率逐渐上升;但当温度超过80℃以后提取率有所下降。从节能和保护营养成分方面考虑, 提取温度以80℃为宜。

2.1.3 提取时间对大蒜多糖提取率的影响

称取蒜泥50克, 在80℃水浴锅温度下, 按水料比6:1加蒸馏水, 考察不同提取时间对多糖提取率的影响, 结果如图3所示。

由图3可以看出, 随着提取时间的延长, 粗多糖的提取率呈上升趋势, 但是超过150min以后, 延长提取时间提取率反而稍有下降。因此, 提取时间以150min为宜。

2.2 正交试验

根据单因素试验结果, 以水料比、温度和提取时间为考察对象, 以总糖得率为指标, 进行三因素三水平正交试验。结果如表1所示。

由正交试验结果可以看出, 各因素的影响主次顺序为:A>B>C, 即温度>提取时间>水料比, 最优组合为A2B3C3, 即温度80℃、提取时间150min、水料比6 (6:1) , 经验证试验得大蒜多糖提取率为15.72%。

3 结论

通过正交试验对大蒜多糖的提取工艺进行优化, 确定大蒜多糖提取的最佳工艺为:温度80℃、提取时间150min、水料比6 (6:1) , 其大蒜多糖提取率为15.72%。

参考文献

[1]魏绍云, 齐慧玲, 王继伦等.苯酚-硫酸法测定蛋白及多糖[J].天津化工, 2000.

[2]黄雪松.大蒜多糖的提取分离与分析[J].食品科学, 2005.

篇9：多糖研究进展

关键词：多糖；提取分离；纯化；生物功能；综述

中图分类号：R28文献标识码：A文章编号：1674－0432(2011)－05－0321－2

1多糖概述

多糖又称多聚糖，是由10个以上的单糖通过糖苷键聚合而成的天然高分子化合物，在自然界高等植物、藻类、细菌类及动物体内均有存在，分布极广。除淀粉和肝素等几种多糖外，其他多糖类过去一直被认为无任何营养价值和生理活性，被视为无用成分。20世纪60年代后，人们对多糖的研究逐渐深入，大量研究证实，多数多糖不仅具有重要的药物活性，而且有一部分多糖具有营养保健作用。

2多糖的来源

2.1植物来源多糖

植物来源多糖存在于植物的各器官中，以果实、种仁(中草药类多为全草)多糖的提取与测定研究较多。对此类多糖药用机理的深入研究较少，这方面的研究多停留在初级层面。

2.2动物来源多糖

动物多糖包括糖原，甲壳素，肝素，硫酸软骨素，透明质酸，硫酸角质素，酸性粘多糖或糖胺聚糖。肝素、硫酸软骨素、透明质酸、硫酸角质素都属糖胺聚糖，由于在体内常以蛋白质结合状态存在，故统称为蛋白聚糖。

2.3藻类地衣来源多糖

从海藻来源中提取得到的多糖，大多含有硫酸根，其作为抗血栓药物已被大家公认，并已发现这些多糖除了具有免疫促进作用及抗肿瘤作用外，还具有抗病毒作用，如从红藻中分得一种多糖，对治疗感冒具良好作用。从海藻中还可以获得有价值的抗艾滋病的多糖药物。有些藻类多糖还可作为植物系统抗性诱导子，在农产品洁净生产中的作用也值得重视。

2.4微生物来源多糖

微生物来源多糖又可分为细菌多糖和真菌多糖。此类多糖是迄今为止研究较为深入，利用较为广泛的一类多糖，其中细菌荚膜多糖在医药上作为疫苗已应用了很长时间。

3多糖的提取和分离纯化

3.1多糖的提取

首先根据多糖的来源和提取部位不同，决定提取之前是否做预处理。动物多糖和微生物多糖多有脂质包围，通常先加入亲脂性溶剂进行回流脱脂，植物多糖因存在部位不同有所差异，从种仁中提取多糖常需脱脂处理，其他部位的预处理与否各研究报道有所不同。目前已有多种提取方法，如酶法提取，超声波提取，微波提取等。经各种方法的多糖提取液可直接过滤或离心除去不溶物，提取液一般需浓缩，而后根据多糖难溶于有机溶剂的特性加入一定体积可与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇、丙酮等，使多糖沉淀，该多糖经反复溶解与沉析，干燥后可得粗多糖。

3.2多糖的分离

粗多糖中往往混杂着蛋白质、色素、低聚糖及无机盐等杂质，必须分别除去。

3.3多糖的纯化

纯化是将多糖混合物分离为单一的多糖组分，纯化方法有有机溶剂分级沉淀法，季胺盐沉淀法，柱层析法，盐析法及制备性区带电泳法等。随着纯化技术的发展，近年来还出现了膜分离技术。

4多糖生物活性

4.1抗肿瘤活性

多糖抗肿瘤作用的免疫学机制研究较多，一般认为多糖提高宿主的免疫功能是其抗肿瘤作用机理之一。另外，也有学者从多糖对肿瘤细胞膜组分、磷脂酰肌醇(PI)转换、抗癌基因的影响等角度研究其抗肿瘤作用机理。

4.2抗氧化活性

大量研究表明，许多多糖都具有提高抗氧化酶活性、清除自由基、抑制脂质过氧化，从而保护生物膜的作用。多糖抗氧化主要是通过增强SOD，CAT，GSH－PX等抗氧化酶的活性及清除自由基，降低LOP，MDA来实现。

4.3抗凝血活性

肝素用于凝血性疾病的治疗和预防已有数十年，它主要通过增强抗凝血酶(肝素辅助因子Ⅱ，HCⅡ)的作用来抗凝血。肝素作为抗凝剂，其构效关系已经比较清楚。另外，多硫酸戊聚糖、硫酸木聚糖、糖胺聚糖肝素均是用于预防和治疗血栓的重要抗凝剂。

4.4其他作用

多糖除上述作用外，多糖还具有抗辐射作用，如冬虫夏草多糖可被用作辐射保护剂；人参多糖还具有抗溃疡的作用。

5问题与展望

近年来，多糖研究异军突起，国际科学界视多糖的研究为生命科学的前沿领域，甚至提出二十一世纪是多糖的世纪。

5.1多糖的提取分离和纯化

目前对多糖的提取分离和纯化的研究较为深入，已分离到300多种多糖，对于多糖及多糖制品的工业化生产也有所报道，但深入研究尚不多见。对多糖及多糖制品工业化生产工艺流程的深入研究是多糖能够得到广泛应用的必经之路，今后应从降低成本、提高效率、提高产品质量等方面入手优化工艺流程，逐步形成动植物产品深加工和综合性加工相结合的生产技术，做到在多糖生产的同时又能对进行多糖提取后的原料进行再加工，从而减少或避免工业废弃物的排放。

5.2多糖结构的研究

多糖有比蛋白质和核酸更为复杂的高级结构，目前在结构分析上多停留在一級结构上，二级结构的研究也少有报道。x射线衍射分析已成功地用于蛋白质和核酸的三维结构测定，但要求有结晶样品，而多糖易潮解很难形成结晶样品，这就限制了该技术在多糖三维结构分析上的应用。多糖高级结构的纷繁复杂决定了多糖拥有各种各样的生物活性，因此在多糖高级结构的分析上还应继续努力，相信随着分析手段的进一步发展定能发现适于多糖高级结构分析的新方法。

5.3多糖的药理作用

目前对多糖药理作用的研究上停留在较低层面，深入研究尚不多见。多数研究仅是阐明多糖有什么作用而没有副作用。今后对多糖的药理作用的研究重点可放在药代动力学研究上。

参考文献

[1]王常青，李红卫.多糖的生物活性及其研究进展[J].山西食品工业，1995，(2)：16

[2]陈金娥，李成义，张海容.微波法与传统工艺提取枸杞多糖的比较研究[J].中成药，2006，28(4)：573－576