酵母双杂交技术研究进展

酵母双杂交技术研究进展（共7篇）

篇1：酵母双杂交技术研究进展

酵母双杂交技术研究进展

提 要 酵母双杂交技术是一种有效的真核活细胞内研究方法，在蛋白质相互作用的研究方面得到了广泛的应用并取得了许多有价值的重要发现。作为一个完整的实验系统，它自建立以来经过了不断的改进与完善，不仅进一步提高了实验结果的可靠性与精确性，而且在此基础上又发展了反向双杂交，三杂交及核外双杂交等多项技术。这些都将对功能基因组学和蛋白质组学的研究起到促进作用。

0 引言

随着分子生物学研究尤其是人类基因组计划的迅速发展，大量关于基因结构的信息不断涌现，对这些信息进行系统研究以了解新基因功能的要求也日益迫切。这不仅需要利用计算机进行生物信息学的分析和预测，而且必须结合生物学实验获取证据。为适应同时对多个基因或蛋白进行研究的发展趋势，已出现了很多新技术，如DNA微阵列技术（DNA micoarry）,基因表达的系列分析（SAGE）,肽质谱分析法，蛋白双向胶电泳技术及酵母双杂交技术（Yeast Two-Hybrid System）等。其中酵母双杂交技术以其简便，灵敏，高效以及能反映不同蛋白质之间在活细胞内的相互作用等特点在基因功能的研究中得到了广泛的应用。酵母双杂交技术的基本原理

1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统〔1〕。很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain，AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。

酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。酵母双杂交技术的应用现状

酵母双杂交技术产生以来，它主要应用在以下几方面：(1）检验一对功能已知蛋白间的相

互作用。(2）研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域。通常需对待测蛋白做点突变或缺失突变的处理。其结果若与结构生物学研究结合则可以极大地促进后者的发展。(3)用已知功能的蛋白基因筛选双杂交cDNA文库，以研究蛋白质之间相互作用的传递途径。(4)分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛选文库。然后根据钓到的已知基因的功能推测该新基因的功能。常见问题的解决与改进

酵母双杂交系统应用中常遇到的问题一是假阳性较多，二是转化效率偏低。所谓假阳性就是:在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下,报告基因被激活。主要原因是由于BD融合诱饵蛋白有单独激活作用,或者这种融合蛋白的激活作用被外来蛋白激活。另外AD融合靶蛋白如果有DNA的特异性结合,则也可单独激活报告基因的表达。因此,为排除假阳性就需要作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定。目前几个公司推出的酵母双杂系统都采用了多个报告基因,且每个报告基因的上游调控区各不相同,这可减少大量的假阳性。另外,报告基因通常整合到染色体上,可以使基因表达水平稳定,消除了由于质粒拷贝数变化引起基因表达水平波动而造成的假阳性。即使根据严格的对照实验证明确实发生了蛋白间的相互作用，还应对以下方面进行分析：

(1)这种相互作用是否会在细胞内自然发生,即这一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同一时间表达且定位在同一区域。

（2)某些蛋白如是依赖于遍在蛋白的蛋白酶解途径的成员,它们具有普遍的蛋白间的相互作用的能力。

（3)一些实际上没有任何相互作用的但有相同的模体(motif)如两个亲a-螺旋的蛋白质间可以发生相互作用。十年来,酵母双杂交技术一直在消除假阳性方面不断改进,并且已取得较好的效果。

在酵母双杂交的应用中有时也会遇到假阴性现象。所谓假阴性，即两个蛋白本应发生相互作用,但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来。造成假阴性的原因主要有两 方面：一是融合蛋白的表达对细胞有毒性。这时应该选择敏感性低的菌株或拷贝数低的载体。二是蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株及多拷贝载体。目前假阴性现象虽不是实验中的主要问题,但也应予以重视。

转化效率是酵母双杂交文库筛选时成败的关键之一，特别是对低丰度cDNA库进行筛选时，必须提高转化效率。转化时可采用共转化或依次转化，相比之下共转化省时省力。更重要的是如果单独转化会发生融合表达蛋白对酵母细胞的毒性时,共转化则可以减弱或消除这种毒性。一种更有效的方法是将诱饵蛋白载体与靶蛋白载体分别转入不同接合型的单倍体酵母中,通过两种接合型单倍体细胞的杂交将诱饵蛋白与靶蛋白带入同一个二倍体细胞。目前很多机构建立了大量的cDNA文库和基因组文库，但这些文库大多无法直接用于双杂交系统的筛选。而文库的质量对于转化和筛选又非常关键。因此，大量构建适用于酵母双杂交的文库非常必要。现已出现一种采用体内重组技术来达到这个目的的方法。酵母双杂交技术的新发展

酵母双杂交技术在应用中发挥了巨大的作用，但人们也注意到了它有一定的局限性。为此发展了多种适应不同目的需要的改型的双杂交技术。

反向双杂交技术 在研究中检测并鉴定出那些能阻断两个蛋白间相互作用的因素有重要意义。在研究那些能使相互作用被阻断的因素(如寻找哪些结构域上发生突变可使相互作用中

断或那些分子可以阻断相互作用)时，传统的双杂交技术有较大的局限性。因此，反向双杂交系统(Reverse Two-Hybrid System)应运而生。这项技术的特点是采取了反选择筛选策略。根据反选择设计的不同，大致可以分为两类。一类是用便于反选择的URA3或CYH2基因作为报告基因。URA3基因编码尿嘧啶合成途径中的重要酶：乳清酸核苷5’-磷酸脱羧酶，它能把5’-氟乳清酸（5’-FOA）转变为细胞毒性物质，使细胞无法生长。反之，在能生长的细胞中，外界因素已使蛋白间的相互作用不能发生，而我们想知道的正是这些因素。因此，只要对存活的克隆进行检测就可以得到结果。Vidal等人用这种技术发现了影响转录因子E2F1中与DP1相互作用必需区内的点突变。另一类是将常规报告基因(如HIS3)置于大肠杆菌转座子Tn10编码的tet-抑制因子(TetR)/操纵基因控制之下。待测蛋白之间发生相互作用后首先激活tet-R基因表达抑制因子TetR,TetR结合到tet操纵基因后就抑制了报告基因的表达，结果转化子不能生长。只有当待测蛋白之间的相互作用被某种因素所阻断而无法激活tet-R基因时，报告基因才能摆脱tet操纵基因的控制而表达，使转化子获得在选择培养基上生长的能力。Shih 等人利用这种方法鉴定出cAMP-应答元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)中磷酸化位点的Ser133突变会阻断其与辅助激活因子(CREB结合蛋白)的相互作用。

三杂交技术 在许多细胞内信号传递过程中，两个蛋白间的相互作用常涉及到其它的大分子。如蛋白，激酶，RNA,多肽及其它大分子。在研究这些大分子对蛋白间相互作用的影响过程中发展了一种新的技术系统——三杂交系统(Three-Hybrid System)，其本质与双杂交是相同的，只是需通过第三个分子的介导把两个杂交蛋白带到一起。例如小配体三杂交系统(Small Ligand Three-Hybrid System)是利用可以渗透的二聚体化学诱导物(Chemical Inducers of Dimerization,CIDs)作桥梁，将AD和BD融合蛋白连接到一起，激活报道基因的表达。研究较多的是免疫抑制剂FK506。Belshaw等将FK506与环孢菌素A(Cyclosporin

A)构建成异源二聚体，它能把分别与FK506和环孢菌素A有相互作用的AD和BD融合蛋白拉倒一起，激活报告基因。Licitra将FK506与地米塞松(dexamethasone)通过共价键连接成二聚体。通过实验进一步证实了FK506与蛋白FKBP-12间的特异性相互作用，表明用这种方法鉴定蛋白与小分子间的相互作用是切实可行的。RNA与蛋白之间的相互作用是许多细胞生命活动的基础，例如mRNA的翻译，早期发育以及RNA病毒的感染等。然而可用于这方面研究的简便方法却很少。RNA三杂交系统(RNA Three-Hybrid System)的建立为分析RNA与蛋白之间的相互作用提供了有效的手段。这个系统主要是由一个RNA分子和两个都能结合该RNA的蛋白质组成。此RNA的一部分与一个已知蛋白结合后就可利用它的另一部分去筛选新的RNA结合蛋白。因此这种技术既可检测由RNA介导的两个蛋白质之间的相互作用，也可筛选鉴定新的蛋白结合RNA。Putz等把HIV-1病毒Rev蛋白的突变体RevM10与Gal4 DB域融合作为诱饵蛋白，利用该RevM10蛋白能识别并结合其靶RNA中Rev蛋白反应元件(Rev responsive element,RRE)的作用去筛选同样也能与此RNA结合并已与Gal4 AD域融合的未知蛋白。根据同样的原理，如将一个已知RNA与RRE融合形成杂合RNA分子并配以RevM10-Gal4 DB融合蛋白作为诱饵，便可用于筛选该RNA结合蛋白的cDNA克隆。SenGupta 等利用RNA噬菌体衣壳蛋白能识别结合其基因组内一种21核苷酸的RNA茎环结构的特性，将RNA噬菌体衣壳蛋白与Lex DB域融合，构建成可用于寻找体内的RNA结合蛋白的酵母三杂交系统。

核外双杂交技术 在传统的酵母双杂交系统中，蛋白之间的相互作用是在细胞核内发生的。因此,它不能检测某些在核外蛋白之间的相互作用。为了克服这种局限性，近年来有人建立了核外双杂交技术。其中SRS 和USPS就是这种技术的两个代表。SRS也称Sos蛋白召集系统(Sos Recruitment System)。它的基本原理是分别将待测蛋白X与哺乳动物细胞的一种鸟苷交换因子(EGF)Sos蛋白融合；将Y蛋白与锚定在酵母细胞膜上的Src肉豆寇烯化信

号蛋白融合，并使它们共表达于一个cdc25-2基因温度敏感型突变的酵母菌株内。由于该菌株中cdc25-2基因编码的EGF蛋白在36℃条件下不能激活细胞膜上的Ras蛋白，Ras途径不通。所以细胞无法在36℃条件下生存。但如果待测蛋白X与Y之间发生相互作用就能把Sos蛋白带到细胞膜上并激活附近的Ras蛋白，从而打通Ras途径，使该菌株获得在36℃条件下生存的能力。Aronheim等用此技术鉴别出了一些新的c-Jun相互作用蛋白，并分离到了一个AP-1抑制因子JDP2。USPS也称为基于遍在蛋白的裂解蛋白感受器(Ubiquitin-based Split Protein Sensor)。它的设计是根据这样一个事实，即真核细胞中遍在蛋白与某一蛋白之间新生成的融合会被遍在蛋白特异的蛋白酶(UBPs)迅速切开，但这种切割只有当遍在蛋白正确折叠时才会发生。研究发现，遍在蛋白基因的N端和C端这两部分即使分离，只要共表达与同一个细胞内，它们仍能正确折叠。将待测蛋白X与带有点突变的遍在蛋白N端片段融合，将待测蛋白Y与下游接有报告蛋白的正常遍在蛋白C端片段融合，并使它们共表达与同一个细胞内。因遍在蛋白N端片段内含有点突变，它与C端片段之间不能自然形成正确的折叠。只有当蛋白X和Y之间发生相互作用时才能克服点突变的影响，使遍在蛋白的两端形成正确折叠，从而引来UBPs切除与C端片段连接的报告蛋白。此技术建立之初是通过Western blot检测有无被切下的报告蛋白来判断待测蛋白之间是否发生了相互作用的，所以操作比较繁琐，不便于推广。最近有人对它作了改进，以一种融合的转录激活因子PLV作为报告蛋白。PLV一旦被从遍在蛋白C端片段上切下，它就会进入细胞核内激活特定的报告基因，如：LacZ 和HIS3等。这样就可以根据转化细胞是否生长及显色来判断待测蛋白之间有无相互作用。因此极大地简化了操作步骤，提高了筛选效率。酵母双杂交技术发展与应用的趋势

在后基因组时代更具意义且更能发挥酵母双杂交技术的领域是研究生命活动中的网络调节。第一个具有开拓性的工作是Bartel利用酵母双杂交技术建立了一个T7-噬菌体的网络调节图(linkage-map)。Fromont-Racine等对筛选到的阳性克隆进行鉴定测序，并将它们分为5类，然后对其中的四类(非编码序列除外)通过15轮的筛选与分析，绘制出一张综合了酵母蛋白相互作用的全局性信息图。这是以往的实验所难以获得的。

为适应功能基因网络调控研究的需要，CLONTECH公司在Merck-Washington大学的EST项目研究成果基础上，采用了与传统建库方式完全不同的细胞内同源重组方法，以高通量规模构建了一种阵列模式的酵母双杂交cDNA文库。它主要有以下特点：

(1)来源于多种组织器官和细胞系，因此含有几乎所有基因的cDNA；

（2）所含各种cDNA的丰度趋于平衡；

（3)含有较长的插入序列，但不是全长cDNA序列。

这样既避免了5’非编码区可能存在的终止密码阻碍融合蛋白的翻译，又保证了表达出的蛋白构象接近于天然。这种建库方法不仅减少了工作量，而且在双杂交中新发现的相互作用蛋白种类也明显增多。

最后，有必要指出的是，酵母双杂交技术必须与其它技术结合才能有利于对实验结果作出更为完整和准确的判断。

胡文峰

2007040380106

篇2：酵母双杂交技术研究进展

目的 应用酵母双杂交技术筛选干扰素β(IFNβ)结合蛋白.方法 用多聚酶链反应(PCR)技术扩增IFNβ基因,连接酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109,与含人肝细胞cDNA文库质粒的.酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性克隆,提取酵母质粒后转化大肠埃希菌(DH5α)并经氨苄西林抗性筛选,提取单克隆菌落质粒,进行酶切鉴定及序列测定,并进行生物信息学分析.结果 应用酵母双杂交技术筛选出阳性克隆29个,经生物信息学分析,排除读码框架不正确者,最后得到19个克隆基因,编码14种已知蛋白和一种未知功能蛋白.初步发现铁蛋白与IFNβ具有结合作用.结论 应用酵母双杂交技术筛选出多种与IFNβ具有结合作用的蛋白.

作 者：钟彦伟 成军 郭风劲 曲建慧 纪冬 程勇前 李晓东 郭江 戴久增 王琳 徐东平ZHONG Yan-wei CHENG Jun GUO Feng-jin QU Jian-hui JI Dong CHENG Yong-qian LI Xiao-dong GUO Jiang DAI Jiu-zeng WANG Lin XU Dong-ping 作者单位：钟彦伟,曲建慧,纪冬,程勇前,李晓东,戴久增,王琳,徐东平,ZHONG Yan-wei,QU Jian-hui,JI Dong,CHENG Yong-qian,LI Xiao-dong,DAI Jiu-zeng,WANG Lin,XU Dong-ping(100039,北京,解放军第三○二医院传染病研究所病毒性肝炎研究室)

成军,郭江,CHENG Jun,GUO Jiang(北京地坛医院传染病研究所)

郭风劲,GUO Feng-jin(重庆医科大学细胞生物学与遗传学教研室)

篇3：酵母双杂交系统及应用

随着分子生物学的发展,人们对生命的研究逐渐从基因组时代转到后基因组时代。蛋白质间相互作用的研究是后基因组时代的重要组成部分,对蛋白质相互作用的认识可以更好地理解生命的本质,众所周知蛋白质在细胞生命活动过程中起着非常关键的作用。酵母双杂交系统是体内分析蛋白质间相互作用的一种有效的遗传学方法,而过去也有许多方法用来研究蛋白质间的相互作用,但都是体外研究方法如交联、免疫共沉淀、亲和层析等,这些方法容易受外界条件的影响,还需要纯化蛋白,同时要求蛋白质间存在比较强的作用力,而酵母双杂交系统操作是在核酸水平上进行,是在酵母细胞内研究蛋白质间的相互作用,并且还能检测到蛋白质间微弱的相互作用,无需对蛋白质进行纯化,因此自从该技术建立以后,得到了迅速广泛的应用。

1 酵母双杂交系统的原理

酵母双杂交系统由Fields和Song[12]等于1989年首先在研究真核基因转录调控中建立,此系统是在酿酒酵母体内分析蛋白质间的相互作用。真核生物转录调控过程的认识为酵母双杂交系统的建立奠定了基础,其理论依据为典型的真核生长转录因子,如GAL4、GCN4等都含有两个可分离的结构域:DNA结合结构域(DNA-binding domain,简称为DB)和转录激活结构域(transcription-activation domain,简称为AD),前者负责识别DNA上的特异序列,并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游,后者与转录复合体的其他成分作用,启动所调节基因的转录,这两个结构域结构上相互独立但功能上又相互依赖,一个完整的转录因子必须同时含有这两个结构域,否则将无法完成转录激活功能。酵母双杂交是将BD的核酸序列与诱饵蛋白X的核酸序列结合构建成BD-X融合表达载体,X往往是已知蛋白,将AD的核酸序列与猎物蛋白Y的核酸序列结合到一起构建成AD-Y表达载体,之后将这两个质粒共同转入同一酵母细胞内表达,如果X和Y之间存在相互作用,那么与他们分别融合的BD和AD在空间上就能充分接近,呈现出完整的转录因子活性并激活相应报告基因的表达,而单独的BD和AD均不能激活报告基因。通过检测报告基因表达与否,就可以很容易地判断出X和Y之间是否存在相互作用,当把Y变成基因文库或c DNA文库时,就可以直接从文库中找到与X相互作用的蛋白的DNA序列。

2 酵母双杂交系统的特点和优点

酵母双杂交系统与其它研究蛋白质间相互作用的方法相比其主要表现在[5,14]:(1)发现和研究在活细胞体内的蛋白质间的相互作用,转录因子功能是在融合基因表达后,在细胞内重新组建转录因子之后发挥作用的,不需要分离纯化蛋白质,这就避免了在提纯蛋白过程中可能引起蛋白变性,因此保持了蛋白的生物活性,能更真实地反映体内相互作用的真实情况。(2)可以直接从文库中获得相互作用蛋白的核酸序列。(3)能敏锐地通过报告基因检测到蛋白间微弱的、瞬间的作用,是一种研究蛋白间相互作用非常灵敏的技术。(4)酵母双杂交系统可采用不同组织器官细胞类型和分化时期材料构建c DNA文库,能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质。(5)常用酵母细胞作为报道株,具有直接进行选择的标记基因,易于转化、便于回收扩增质粒,同时酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合等特点和优点。

3 常见问题及改进

酵母双杂交系统是分析蛋白质间相互作用的一种非常有效的方法,自从建立以来,得到广泛的应用,但仍存在一些局限性,容易出现假阳性和假阴性,而且对蛋白质在细胞中的定位有非常严格地要求,同时转化效率偏低[1,2,5,8]。

3.1 假阳性现象

假阳性就是指待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下,报告基因被激活,假阳性发生频率较高,归纳起来有以下几个原因:某些蛋白质本身具有转录激活功能如转录因子,就无需BD和AD相互作用就能激活报告基因表达或者是在酵母表达时发挥了转录激活作用;两个相互作用的蛋白质在原宿主内不在同一种组织或细胞内表达,或者是在发育的不同时期、同一种细胞的不同区域表达,利用此系统分析把这些在生理状态下是不可能碰到一起的蛋白拉到一起进行相互作用而导致假阳性结果的出现;某些蛋白表面含有的多种蛋白质低亲和力区域,也会导致报告基因的表达,产生假阳性结果;酵母细胞内还存在其他因素的影响,有时会把两个原本无直接相互作用的蛋白拉到一起,从而激活报告基因的表达。针对这些缺陷,可以通过做严格的对照试验排除假阳性,应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定,也可以采用双筛选系统以减少假阳性的发生[1]。

3.2 假阴性现象

假阴性是指两个蛋白本应发生相互作用,但报告基因不表达或表达程度非常低以至于检测不出来。原因是有些融合蛋白的表达对细胞会产生毒性,这时应该选择敏感性低的菌株或低拷贝数的载体去避免;也有可能是蛋白间的相互作用较弱,这时应选择高敏感的菌株及多拷贝载体去避免;还有就是此系统分析蛋白质的相互作用是定位于细胞核内,这就造成此系统对所有蛋白质并非都适用,对于核外蛋白就不能用此系统分析相互作用,因为它们的相互作用不是发生在核内,如果用此系统就会出现假阴性结果;同时许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等,这些反应在核内无法进行,另外在酵母中大量表达融合蛋白有可能会影响目的蛋白的修饰和折叠,尤其是在研究异源蛋白相互作用时,它们的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助,因此不能正确修饰和折叠的蛋白质也会导致假阴性结果的出现。

3.3 转化效率

如何提高转化效率也是酵母双杂交文库筛选时应给予高度重视的一个问题,在双杂交系统筛库过程中转化BD-X载体和AD-Y载体时可以依次转化,也可以共转化,这两种方法相比之下共转化更具有优势,首先它比较节省时间,工作量也没有依次转化时的工作量大,其次共转化还可以减弱或消除融合表达蛋白大量表达对酵母产生的毒性,尤其对一些低表达量的基因进行筛库时,就更应该提高转化效率,才有可能筛到与目的蛋白有作用的蛋白质,利用酵母的有性生殖即酵母接合型的引用可以更有效地提高双杂交的转化效率。

4 酵母双杂交系统的应用

酵母双杂交系统产生以来,主要应用在以下几方面:可用来寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白[3,4,6],这是双杂交系统最广泛、最有价值的应用。比如将感兴趣的目标蛋白基因克隆至BD载体,而将要筛选的c DNA库克隆在AD载体,共同转化酵母宿主菌,如果c DNA序列编码的某一段蛋白能和靶蛋白形成聚合体,就会激活报告基因,这样就可以找到一个与靶蛋白结合的新蛋白,目前使用双杂交系统已经筛选到许多新蛋白,而且在不断扩大;确定功能已知蛋白间的相互作用[7]或已知有生理作用的蛋白间的作用位点、结构域、关键氨基酸残基[1,2],通过构建待测蛋白的缺失突变体,检测不同缺失突变体报告基因的表型可以判断出在相互作用中起关键作用的功能结构域,之后在功能结构域内进行DNA点突变,改变其氨基酸残基,以确定突变体能否使报告基因表达,就会找到蛋白质间相互作用的必需氨基酸;验证通过其他方法发现的蛋白间的相互作用;分析新基因的生物学功能,即以功能未知的新基因去筛选文库,然后根据钓到的已知基因的功能推测新基因的功能;此外酵母双杂交系统还应用于绘制蛋白质联系图谱等许多方面。该系统现已被广泛应用于各个领域的研究中,如信号转导、蛋白质功能、癌基因研究、细胞凋亡研究、细胞周期与分化、绘制蛋白质相互作用图谱、基因表达调控以及药物设计等领域[8,9,10,11,15,16],但是此系统只能反应蛋白间可能发生相互作用,而在生物体内的真实情况是不是正如实验所显示的还没有报道,因此实验结果还需要其它研究方法来验证。有研究指出用酵母双杂交系统获得的相互作用的蛋白网络估计会有近50%的假阳性[13],尽管如此,酵母双杂交系统还是大大推动了蛋白质相互作用的研究,在蛋白质相互作用的研究中得到了广泛的应用。

篇4：酵母双杂交技术研究进展

酵母双杂交系统在生命科学中的应用

对酵母双杂交系统原理、组成以及酵母双杂交在生命科学中的应用进行了综述,以期为酵母双杂交系统在生命科学中的.应用提供理论依据.

作 者：王改芳 作者单位：吕梁高等专科学校生命科学系,山西吕梁,033000刊 名：现代农业科技英文刊名：XIANDAI NONGYE KEJI年，卷(期)：“”(4)分类号：Q786关键词：酵母双杂交系统 生命科学 应用

篇5：酵母双杂交技术研究进展

目的 用COP岛基因片段构建酵母双杂交GAL4系统的诱饵载体pGBKT7-COPS3,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用.方法 运用RT-PCR技术从骨肉瘤细胞系SOSP-9607中扩增出COPS3基因片段,克隆入pUC19质粒,经测序正确后,插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用.结果 成功获得COPS3基因片段,其表达蛋白对酵母菌AH109无毒性,对报告基因亦无激活作用.结论 可以利用酵母双杂交GAL4系统来研究与COPS3相互作用蛋白.

作 者：苏海川 赵玉红 陈军 张伟 李陕区  作者单位：苏海川,陈军,李陕区(第四军医大学唐都医院中心实验室,西安,710038)

赵玉红(第四军医大学基础部免疫学教研室)

篇6：酵母双杂交技术研究进展

酵母双杂交系统 (two-hybrid system) 也叫相互作用陷阱 (interaction trap) , 是1989年由Stanley和Song等提出并初步建立的, 并于20世纪90年代得到发展。酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子, 例如酵母转录因子GAL4, 在结构上是组件式 (modular) 的, 往往由2个或2个以上结构上可以分开、功能上相互独立的结构域 (domain) 构成, 其中有DNA结合功能域 (DNA binding domain, DNA-BD) 和转录激活结构域 (activation domain, DNA-AD) 。这2个结合域将它们分开时仍分别具有功能, 但不能激活转录, 只有当被分开的二者通过适当的途径在空间上较为接近时, 才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性, 并可激活上游激活序列 (upstream activating sequence, UAS) 的下游启动子, 使启动子下游基因得到转录。

2 酵母双杂交系统的组成

一个酵母双杂交系统包括3个部分:带有1个或多个摄制报告基因的宿主菌株;与GAL4-BD融合表达蛋白, 被表达的蛋白称为旅馆诱饵蛋白 (bait) ;GAL4-AD融合表达载体, 被表达的蛋白称为靶蛋白 (prey) 。为了防止酿酒酵母内源性的GAL4的影响, 人们将该基因误敲除掉, 发展成双杂交宿主菌株。常用的缺陷型酵母菌株有SFY526和HF7c, 带有特定的报告基因lac Z、his3和leu2等, 但丧失表达内源GAL4转录激活因子的能力。所用的质粒载体为能在大肠埃细菌和酿酒酵母中进行复制的穿梭质粒。第1种质粒载体是p GBT9, 又叫DNA-BD载体。诱饵蛋白基因是按照正确的取向和读码结构被克隆在这个载体的多克隆位点上, 于是就在诱饵蛋白GAL4-BD之间产生融合作用, 形成杂种蛋白Ⅰ。第2种质粒载体是p GAD424, 又叫AD质粒载体, 是用来构建欲筛选靶蛋白的c DNA文库的专用载体。克隆的c DNA片段是按照正确的取向和读码结构插入到载体的多克隆位点区内, 因此, c DNA编码的蛋白质便与GAL4-AD产生融合作用, 形成杂种蛋白质Ⅱ。这2种杂种蛋白质都能在酵母细胞中得到高水平的表达, 而且在核定位序列 (nuclear localization sequence) 的作用下进入到酵母的细胞核内。p GBT9中的核定位序列是GAL4DNA结合域序列中间的一部分。而在p GAD424载体中, 核定位序列是SV40的T抗原序列, 被克隆在ADH1启动子和GAL4激发结构域序列之间。SV40的核定位序列使核内的蛋白量可以满足检测的灵敏度需要。

3 酵母双杂交的应用

3.1 利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能

酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。将已知基因作为诱饵, 在选定的c DNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白, 从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体, 并从载体中进一步克隆得到随机插入的c DNA片段, 并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较, 研究与已知基因在生物学功能上的联系。另外, 也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。例如:Engelender等人以神经末端蛋白alpha-synuclein蛋白为诱饵蛋白, 利用酵母双杂交CLONTECH MATCHMARKER SYSTEM 3为操作平台, 从成人脑c DNA文库中发现了与alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1, 并证明了Synphilin-1与alphasynuclein之间的相互作用与帕金森病的发病密切相关。为了研究2个蛋白之间相互作用的结合位点, 找到影响或抑制2个蛋白相互作用的因素, Michael等人又利用酵母双杂交技术和基因修饰证明了alpha-synuclein的1~65个氨基酸残基和Synphilin-1的349~555个氨基酸残基之间是相互作用的位点。研究它们之间的相互作用位点有利于基因治疗药物的开发。

3.2 利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用

酶联免疫 (ELISA) 、免疫共沉淀 (CO-IP) 技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应, 研究抗原和抗体之间的相互作用, 但是它们都是基于体外非细胞的环境研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。例如:来源于矮牵牛的黄烷酮醇还原酶DFR与其抗体sc Fv的反应中, 抗体单链的3个可变区A4、G4、H3与抗原之间作用有强弱的差异。Geer等利用酵母双杂交技术, 将DFR作为诱饵蛋白, 编码抗体的3个可变区的基因分别被克隆在AD-LIBRARY载体上, 将BD-BAIT载体和每种AD-LIBRARY载体分别转化到改造后的酵母菌株中, 并检测报告基因在克隆的菌落中的表达活性, 从而在活细胞的水平上检测抗原和抗体的免疫反应。

3.3 利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响

酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法, 阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。例如:Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾病, 研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶 (NS5) 和拓扑异构酶NS3, 以及细胞核转运受体BETA-importin的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用, 就可以阻止RNA病毒的复制, 从而达到治疗这种疾病的目的。

3.4 利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图 (Genome Protein Linkage Map)

众多的蛋白质在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列。HUA等人利用酵母双杂交技术, 以所有已知基因和EST序列为诱饵, 在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白, 从而找到基因之间的联系, 建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动, 如信号传导、代谢途径等有重要意义。

参考文献

[1]张树民, 陈英碚.酵母双杂交体系的新发展[J].国外医学遗传学分册, 1999, 22 (5) :225-227.

[2]FIELDS S, SONG O.A novel genetic system to detect protein-proteininteractions[J].Nature, 1989, 20 (340) :245-251.

[3]WONG C, NAUMOVSKI L.Method to screen for relevant yeast two-hybird-derived clones by coimmunoprecipitation and colocalization ofepitope-tagged fragments-application to Bd-XL[J].Anal Biochem, 1997, 252 (1) :33-41.

[4]BRENT R, PTASHNE M.A eukargotic transcriptional activator bearingthe DNA specificity of aprokaanyotic repreesor[J].Cell, 1985, 43 (3) :729-736.

[5]MA J, PTASHNE M.Converting a eukanyotic transcriptional inhibitorinto an activator[J].Cell, 1988, 55 (3) :443-448.

[6]YANG M, FIELDS S.Protein-peptide intevactions andyzed with the yeasttwo-hybird system[J].Nucleic Acids Res, 1995 (23) :1152-1156.

[7]WATSON MA, BUCKHOLZ R, WEINER MP.Vectors encoding alte-rnative antibiotic vesistance for use in the yeast two-hybird system[J].Biotechniques, 1996, 21 (2) :255-259.

[8]BEMIS LT, GESKE F J, STRANGE R.Use of the yeast two-hybirdsystem for identifying the cascade of protein interachions resulting inapoptotic cell death[J].Methods Cell Biol, 1995 (46) :139-151.

篇7：酵母双杂交技术研究进展

病毒感染宿主的过程中涉及病毒与宿主的相互作用, 研究蛋白之间的相互作用是理解病毒致病机制的一个重要方向。酵母双杂交系统是研究基因功能及蛋白质-蛋白质之间相互作用的重要方法, 利用该方法可以得到与诱饵蛋白相互作用的未知功能蛋白。本试验拟构建RHDV病毒蛋白酵母双杂交诱饵载体, 并检测其是否具有自激活活性和毒性, 为进一步利用酵母双杂交技术筛选与RHDV存在相互作用的宿主蛋白奠定基础。

1 材料与方法

1.1 毒株、菌株和主要试剂

RHDV (HYD株) 和E.coli DH5α感受态细胞, 哈尔滨兽医研究所自然疫源性人畜共患病创新团队保存;酵母菌株 (AH109) 、诱饵载体p GBKT7、捕获载体p GADT7、p GBKT7-Lam/p GADT7-T阴性对照、p GBKT7-53/p GADT7-T阳性对照、X-α-Gal及各种酵母培养基和相关试剂, 均购自Clontech公司。SD/-Trp、DDO (SD/-Leu/-Trp) 、QDO (SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp) 、QDO/X-α-Gal培养基按常规方法制备;反转录酶 (M-MLV) 、DNA聚合酶、限制性内切酶、p MD18-T载体及DNA A-Tailing Kit, 均购自Ta KaRa公司;胶回收试剂盒, 购自AXYGEN公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 引物的设计与合成

根据Gen Bank中已公布的RHDV HYD株 (登录号为JF412629.1) 全基因组序列, 参考FRG株 (NCBI No.NC_001543.1) 对RHDV结构蛋白VP60、小结构蛋白VP10以及7个非结构蛋白的序列长度进行分段, 使用Oligo 6.0软件设计引物 (序列见表1) , 引物由哈尔滨博仕生物技术有限公司合成。

1.3 RHDV病毒蛋白基因的扩增

采用TRIzol法提取RHDV (HYD株) 总RNA, 以6 nt随机引物和M-MLV进行c DNA第一链的合成, 然后以c DNA为模板, 用特异性引物扩增RHDV结构蛋白和非结构蛋白基因, PCR反应体系如下:上、下游引物各0.5μL, pfu DNA聚合酶0.5μL, c DNA2μL, 2.5 mmol/L d NTP 2μL, 10×pfu缓冲液2.5μL, 加dd H2O补至25μL。PCR反应条件:98℃5 min;98℃15 s, 55℃ (RdRp) /58℃ (P29) /60℃ (VPg、VP10) /61℃ (3C-like protease) /62℃ (P23、2C-like protein、VP60) 30 s, 72℃3.5 min, 共35个循环;72℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定, 胶回收目的片段, 用DNA A-Tailing Kit添加“A”尾后连接到p MD18-T载体, 转化E.coli DH5α感受态细胞, 获得重组质粒进行酶切及PCR鉴定, 选择阳性菌送哈尔滨博仕生物公司测序部进行测序。应用Meg Align软件对测序结果进行分析, 并将鉴定正确的阳性克隆命名为p MD18-T-X。

1.4 诱饵载体p GBKT7-X的构建

将阳性质粒p MD18-T-X用相应的限制性内切酶双酶切, 定向克隆到经同样酶切的线性化载体p GBKT7中, 转化E.coli DH5α感受态细胞, 提取重组诱饵质粒经PCR和双酶切鉴定, 并将鉴定正确的重组诱饵质粒命名为p GBKT7-X。

1.5 诱饵载体转化酵母菌AH109

按照YeastmakerTMYeast Transformation System 2 (Clontech) 制备AH109酵母感受态细胞, 在EP管中加入待转化质粒1μL (100 ng/μL) , 再加入Yeastmaker Carrier DNA 5μL (10μg/μL) 、酵母感受态细胞50μL、新鲜制备的PEG/Li Ac 500μL, 混匀, 30℃水浴30 min (每隔10 min轻轻振荡混匀) ;每管加入20μL DMSO, 混匀, 42℃水浴15 min (每隔5 min轻轻振荡混匀) ;15 000 r/min离心15 s;弃上清液, 沉淀用100μL生理盐水重悬, 取35μL重悬菌液滴加到酵母培养基平板, 30℃倒置培养3~5 d, 待酵母菌落长出。

1.6 诱饵载体p GBKT7-X的毒性检测

将p GBKT7空载体和p GBKT7-X诱饵载体分别转化入AH109酵母感受态细胞, 转化产物涂布于SD/-Trp平板上, 30℃倒置培养3~5 d, 观察比较菌落的大小, 并挑取单菌落至5 m L SD/-Trp/Kan (20μg/m L) 液体培养基中进行生长速度 (OD600值) 的比较。若含诱饵载体的酵母菌落大小和生长速度与含空载体的酵母菌差异不显著, 则判定该诱饵载体无毒性, 否则判定为有毒性。

1.7 诱饵载体p GBKT7-X的自激活活性的检测

将诱饵载体p GBKT7-X和空载体p GADT7共转化AH109酵母感受态细胞, 转化产物涂布于DDO、QDO和QDO/X-α-Gal平板上, 30℃倒置培养3~5 d;p GBKT7/p GADT7和p GBKT7-Lam/p GADT7-T设为阴性对照组, p GBKT7-53/p GADT7-T设为阳性对照组, 观察酵母菌AH109在各个平板上的生长情况。如果诱饵质粒能够自激活报告基因, 那么DDO、QDO和QDO/X-α-Gal平板上均有菌落生长, 且QDO/X-α-Gal平板上为蓝色菌落;否则仅DDO平板上有白色菌落, QDO和QDO/X-α-Gal平板上无菌落生长。

2 结果

2.1 RHDV病毒蛋白基因的扩增结果

以提取的RHDV (HYD株) 基因组RNA为模板, 经RT-PCR扩增, 产物经琼脂糖凝胶电泳分析, 扩增片段大小均与预期相符 (见图1) 。序列比对显示, 测序结果与RHDV (HYD株) 完全一致, 成功克隆到各基因。

2.2 诱饵载体p GBKT7-X的构建及鉴定结果

将重组诱饵质粒用相应的限制性内切酶做双酶切, 核酸电泳结果表明, 得到与预期大小一致的目的基因片段和p GBKT7片段, 说明诱饵载体p GBKT7-X均构建正确。酶切结果见图2。

2.3 诱饵载体p GBKT7-X的毒性检测结果

空载体p GBKT7和诱饵载体p GBKT7-X分别转化AH109酵母感受态细胞, 30℃倒置培养3 d后, SD/-Trp平板上的菌落大小无明显差异。分别挑取单菌落至SD/-Trp/Kan (20μg/m L) 液体培养基培养, 30℃振摇培养约24 h后, 测定酵母菌AH109的OD600值。结果表明, 酵母菌AH109 (p GBKT7-X) 与酵母菌AH109 (p GBKT7) OD600值相近 (见图3) , 说明构建的诱饵载体对酵母细胞无毒性作用。

2.4 诱饵载体p GBKT7-X的自激活检测分析

诱饵载体p GBKT7-X和空载体p GADT7共转化AH109酵母感受态细胞, 30℃倒置培养3 d后, 在DDO培养基上均长出白色菌落, 而QDO和QDO/X-α-Gal培养基上均无菌落生长。阴性对照p GBKT7/p GADT7和p GBKT7-Lam/p GADT7-T仅在DDO培养基上长出白色菌落, QDO和QDO/X-α-Gal培养基上均无菌落生长;阳性对照p GBKT7-53/p GADT7-T在DDO和QDO培养基上均长出白色菌落, 且QDO/X-α-Gal培养基上为蓝色菌落 (见258页彩图4) 。由此证明:诱饵载体p GBKT7-X不会自激活酵母报告基因的表达, 无自激活活性。

3 讨论

病毒感染宿主以吸附到宿主细胞表面起始, 之后将核酸注入到宿主细胞, 并在其中大量繁殖。该过程需要宿主细胞膜上的病毒受体及细胞中的相关蛋白辅助完成[8];因此, 研究病毒与宿主的相互作用对阐明RHDV在细胞核内的转录调控机理及感染机制具有重要意义。

酵母双杂交系统是研究蛋白质与蛋白质相互作用的一种快速、灵敏、有效的研究技术, 其建立基于对真核细胞调控转录起始过程的认识[9]。研究发现, 许多真核生物的转录激活因子都是由两个结构上可以分开的、功能上相互独立的结构域 (domain) 组成的, 其基本原理是将诱饵基因X和文库基因Y分别连接到GAL4的DNA结合域 (DNA binding domain, DNA-BD) 和转录激活域 (transcription activation domain, AD) 基因片段的下游使之融合表达, 当X和Y有相互作用时则可将BD和AD蛋白在空间上的距离拉得很近, 从而激活上游UAS序列, 使下游的报告基因得到表达。其优点是酵母细胞为真核细胞, 可对蛋白质进行翻译、加工、修饰使其更接近天然结构, 但其融合蛋白发生相互作用激活报告基因发生在细胞核内, 因此对胞外蛋白互作的筛选受限;同时对需要几种蛋白同时存在形成蛋白复合体才发生互作的情况也不适用[10]。目前, 杨宗伟等[11]利用真核细胞双杂交系统验证了RHDV VP60与VP10之间存在相互作用, 穆亚芳等[12]利用表达性克隆法筛选与VP60相互作用的宿主蛋白, 但利用酵母双杂交技术筛选RHDV基因组所编码的全部病毒蛋白与宿主之间相互作用的研究还未见报道。

为了筛选与RHDV病毒蛋白互作的宿主蛋白, 本试验构建了用于酵母双杂交筛选的RHDV非结构蛋白诱饵载体p GBKT7-P16、p GBKT7-P23、p G-BKT7-2C-like protein、p GBKT7-P29、p GBKT7-VPg、p GBKT7-3C-like protease、p GBKT7-RdRp和小结构蛋白诱饵载体p GBKT7-VP10以及主要结构蛋白诱饵载体p GBKT7-VP60, 经PCR、测序和酶切鉴定均构建正确。诱饵载体p GBKT7-X含有色氨酸编码基因, 故只能在SD/-Trp平板上生长, 且菌落大小和生长速度与空载体p GBKT7无显著差异, 表明诱饵载体p GBKT7-X无毒性。共转化诱饵载体p G-BKT7-X和空载体p GADT7至酵母菌AH109, 仅能在DDO平板上长出白色菌落, 证明p GBKT7-X无自激活活性, 从而排除了假阳性的可能。综上所述, 试验成功构建了RHDV病毒蛋白诱饵载体p GBKT7-X, 为利用酵母双杂交技术筛选与其相互作用的宿主蛋白和阐明RHDV在细胞核内的转录调控机理及感染机制奠定了基础。

摘要：为了研究兔出血症病毒 (RHDV) 蛋白与宿主蛋白的相互作用, 试验采用RT-PCR技术从病毒基因组中扩增病毒的7种非结构蛋白P16、P23、2C-like protein、P29、VPg、3C-like protease、RNA复制酶 (RdRp) 及小结构蛋白VP10、主要结构蛋白VP60, 测序正确后, 定向克隆至p GBKT7载体, 经转化酵母菌AH109验证诱饵载体p GBKT7-X的自激活活性和毒性作用。结果表明:诱饵载体p GBKT7-X对酵母细胞无毒性作用, 且对报告基因无自激活现象。说明构建的诱饵载体可以用于酵母双杂交系统筛选与RHDV相互作用的宿主蛋白。

关键词：兔出血症病毒 (RHDV) ,酵母双杂交,诱饵载体,自激活作用,毒性作用

参考文献

[1]MEYERS G, WIRBLICH C, THIEL H J.Rabbit hemorrhagic disease virus-molecular cloning and nucleotide sequencing of a calicivirus genome[J].Virology, 1991, 184 (2) :664-676.

[2]MARIN M S, CASAIS R, ALONSO J M, et al.ATP binding and ATPase activities associated with recombinant rabbit hemorrhagic disease virus 2C-like polypeptide[J].J Virol, 2000, 74 (22) :10846-10851.

[3]VZQUEZ A L, Matin ALONSO J M, CASAIS R, et al.Expression of enzymatically active rabbit hemorrhagic disease virus RNAdependent RNA polymerase in Escherichia coli[J].J Virol, 1998, 72 (4) :2999-3004.

[4]BONIOTTI B, WIRBLICH C, SIBILIA M, et al.Identification and characterization of a 3C-like protease from rabbit hemorrhagic disease virus, a calicivirus[J].J Virol, 1994, 68 (10) :6487-6495.

[5]LIU G Q, NI Z, YUN T, et al.A DNA-launched reverse genetics system for rabbit hemorrhagic disease virus reveals that the VP2 protein is not essential for virus infectivity[J].J Gen Virol, 2008, 89 (Pt 12) :3080-3085.

[6]WANG B B, ZHE M J, CHEN Z Y, et al.Construction and applications of rabbit hemorrhagic disease virus replicon[J].Plos One, 2013, 8 (5) :e60316.

[7]LIU G Q, NI Z, YUN T, et al.Construction of rabbit hemorrhagic disease virus replicons and its replication in RK-13 cells[J].Bing Du Xue Bao, 2007, 23 (6) :481-484.

[8]殷震, 刘景华.动物病毒学[M].2版.北京:科学出版社, 1997.

[9]李先昆, 聂智毅, 曾日中.酵母双杂交技术研究与应用进展[J].安徽农业科学, 2009, 37 (7) :2867-2869, 2926.

[10]LUBAN J, GOFF S P.The yeast two-hybrid system for studying protein-protein interactions[J].Curr Opin Biotechnol, 1995, 6 (1) :59-64.

[11]杨宗伟, 倪征, 云涛, 等.兔出血症病毒衣壳蛋白与次级结构蛋白的相互作用[J].科学通报, 2012, 57 (24) :2292-2296.