花粉介导法获得玉米转基因植株（共3篇）
篇1：花粉介导法获得玉米转基因植株
花粉介导法获得玉米转基因植株
利用花粉作为外源基因的`载体进行遗传转化在玉米(ZeamaysL.)上获得了成功。以玉米自交系太9101、综31等为受体，以pGLⅡ_RC_1质粒为供体，在玉米开花期，用花粉与质粒DNA混合并附加超声波处理，然后辅以人工授粉的方法将外源基因导入到受体中。DNA斑点杂交和PCR扩增以及PCR_Southernblot杂交检测结果证明，几丁质酶基因确已导入玉米自交系中。所得结果表明：玉米花粉可以介导外源基因的转化。利用花粉作为载体介导外源基因转化，避免了传统的基因枪法和土壤杆菌法转化所要求的组织培养技术，转化方法简单，易操作，具有很强的实用性。
作 者：王景雪 孙毅 崔贵梅 胡晶晶 作者单位：山西省农业生物技术研究中心， 太原 030031 刊 名：植物学报 ISTIC SCI英文刊名：ACTA BOTANICA SINICA 年，卷(期)： 43(3) 分类号：Q943.2 关键词：玉米 花粉介导法 基因转化
篇2：花粉介导法获得玉米转基因植株
1 花粉管通道法的提出
花粉管通道法是我国科学家周光宇在1983年首次在“Methods in Enzymology”报道的研究成果。其原理是将外源DNA片段在作物受粉后特定时期注入柱头或花柱, 外源DNA沿着花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊, 转化不具备正常细胞壁的受精卵、合子及早期胚胎细胞[3]。花粉管通道法自问世以来, 引起国际上的广泛关注, 美、欧、亚等一些实验室将这一技术应用于稻、麦、棉、豌豆、牧草等基因重组和总DNA导入的研究中, 其中在水稻、小麦等粮食作物上的应用比较多, 在一定程度上拓宽了其种质基础, 但在改良玉米育种中应用较少。
2 花粉管通道法在玉米改良上的应用
2.1 研究内容
目前, 花粉管通道法用于改良玉米自交系的研究主要集中在抗虫、抗除草剂以及提高植株抗逆性上, 其中抗除草剂和抗Bt虫蛋白基因的研究成果显著, 孟山都和先正达两个国际知名公司已将其推广应用于生产中。
2.2 研究成果
在玉米自交系改良中, 国内外学者利用花粉管通技术获得的品种有30多个。1986年Ohta在美国科学道技术取得了大量有价值的成果, 据统计, 每年利用此院报上报道应用外源DNA与玉米花粉混合授粉, 得到F0转化率高达10%的胚乳基因转移[4]。王秀君等采用花粉管通道法将含有耐草甘膦基因mG2-epsps的植物表达载体pUmG2导入优良玉米自交系X90中, 经检测有阳性植株为29株[5]。张慧英等提取甘蔗DNA, 采用该方法将其导入普通玉米自交系普7313, 从自交后代中选出2个叶绿素、可溶性糖、蛋白质含量均比对照提高的优良株系;他们还将提取的糯质玉米12-9-10 DNA导入甜玉米自交系孟加拉超甜玉米, 其后代产生了株高、穗位高、叶面积等性状上的变异[6,7]。王罡等采用该技术, 以生产上7922等9个优良玉米自交系为材料, 将Bt杀虫蛋白基因导入其中, 最终得到3株抗性转化植株[8]。关淑艳等利用该技术将淀粉分支酶基因的反义表达载体转入玉米自交系铁7922、吉853、丹340、Mo17、5003和春09中, 初步证明外源目的基因已整合到玉米基因组中, 并得到了转化植株的种子[9]。刘丹梅以抗虫的胰蛋白酶抑制剂基因 (CpTI) 为供体, 以8个品种玉米为受体进行外源DNA直接导入, 通过对抗性植株的初步分子鉴定, 证实外源CpTI基因存在并整合入获得的玉米基因组植主中[10]。此外, 研究者还在玉米自交系抗逆性上取得一定成果, 例如丁群星等研究发现玉米矮花叶病毒 (MDMV) B株外壳蛋白在转基因植株中表现出对MDMV的抗性;张永胜等人还研究了将抗旱耐盐基因以及抗叶斑病基因导入玉米自交系中, 并获得了初步成功[11,12]。
2.3 花粉管通道法转化方式
花粉管通道法将外源DNA导入玉米自交系中的转化方式有柱头滴加法、花粉粒携带法、子房微注射法、开苞导入法等。但笔者结合自身经历, 认为柱头滴加法不论从转化效率还是对幼穗的伤害程度上都有一定的优势。该方法的主要技术手段是选取自交授粉后18~26 h的玉米果穗, 剪去距穗顶部l cm以上的苞叶和花丝, 将DNA滴在切口处, 外源DNA经花粉进入时形成的通道进入幼胚, 从而完成外源DNA导入过程。1995年祁永红等报道了利用猪头滴加法成功将外源总DNA导入玉米自交系, 此后又有研究者陆续报道了利用该法获得了具有广泛变异的不同类型的玉米自交系[13~15]。
3 花粉管通道法应用前景展望
篇3：花粉介导法获得玉米转基因植株
关键词：农杆菌介导法；遗传转化；植株再生；抗性愈伤；bar基因
中图分类号：Q943.2；S513.03文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0051-03
近年来，转基因技术已经在农业生产领域获得了极大的发展，利用转基因技术可以将外源基因整合到基因组中，从而改良农作物的性状。玉米是世界第三大粮食作物，广泛应用于食品、化学、医疗卫生等领域，它的遗传转化研究一直备受关注。
目前玉米转化的方法主要有基因槍法和农杆菌介导法。基因枪法花费成本比较大，转入的片段拷贝数多；而农杆菌介导法方法比较简单，且成本少、转化效率比较高、插入片段的拷贝数比较少，同时遗传比较稳定，因而被广泛采用。自1988年Rhodes等第1次获得完整的玉米转基因植株[1]以来，玉米的遗传转化体系取得了很大的进步和发展，目前国外许多转基因品种已经应用于农业生产领域，转化方法也越来越成熟。近年来，国内的转基因技术得到了重大的突破，黄璐等采用农杆菌侵染玉米单交种胚性愈伤组织成功，同时获得再生植株[2-3]；王国英等通过侵染玉米幼胚并将其诱导成愈伤，成功将Bt基因导入玉米中[4]。
本研究利用农杆菌介导法，用抗粗缩病的RNA干扰基因转化由HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料诱导出的胚性愈伤组织，以转移粗缩病RNA干扰基因，结果得到了抗性愈伤组织并再生成苗。此外，试验对影响转化效率的部分因素进行了初步研究，优化了农杆菌转化玉米的条件，提高了农杆菌介导法对HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料的转化效率，为今后培育抗病新品种打下基础。
1材料与方法
1.1试验材料
玉米材料HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99中由中国农业大学赖锦盛教授赠送，于2013年4月下旬至5月中旬分期播种于河南农业大学科教园区。载体为RNA干扰抗玉米粗缩病载体。
1.2试验方法
取HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料授粉10d左右、大小为1～2mm的未成熟幼胚，盾片向上放置于基本培养基上进行诱导，每2周继代1次，约45d后形成稳定的愈伤组织。分别用继代3、4、5、6、7次的4种基因型玉米的愈伤组织进行侵染转化，侵染后的愈伤组织经选择培养基筛选2次，最后获得抗性愈伤组织，计算抗性愈伤率。分别选取继代3次，预培养2、5、6、8、10d的4种玉米材料愈伤进行侵染，通过3次抗性筛选后，计算抗性愈伤率。将预培养5d的愈伤组织分别用D600nm值为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8的菌液浸泡10min，通过3次抗性筛选后，计算抗性愈伤率。
1.3数据处理
试验数据采用SPSS19.0和Excel2013软件进行统计分析。
2结果与分析
2.1不同继代次数对4种玉米材料抗性愈伤率的影响
分别将继代3、4、5、6、7次的HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米幼胚诱导出来的愈伤组织用D600nm=0.5的农杆菌侵染，根据产生的抗性愈伤数作统计分析，详见表1。
由表1看出，继代3次的HiⅡ玉米对农杆菌最敏感，抗性愈伤组织率为31.25%；其次是HiⅡB，为26.56%；HiⅡA为24.45%，H99为10.26%。继代7次的抗性愈伤率均低于继代3、4、5、6次，其中H99的抗性愈伤率最低，仅为5.13%。
本试验结果显示：随着继代次数的增加，愈伤组织的转化效率逐渐降低，继代3次是农杆菌侵染的最佳时期。
2.2预培养时间对抗性愈伤转化率的影响
分别选取继代3次，预培养2、5、6、8、10d的愈伤进行侵染，通过3次抗性筛选后，其抗性愈伤率见表2。
由表2可以看出，侵染前愈伤组织的培养状态对玉米转化效率有很大的影响。HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99这4种玉米材料都以继代6d的抗性愈伤率最高，而继代2d的抗性愈伤率最低。HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99这4种玉米材料在新鲜继代培养基中预培养2d的抗性愈伤率分别为9.00%、10.00%、9.55%、4.29%；预培养2～6d，抗性愈伤率呈直线上升趋势，6d时达到最高值，4种材料以HiⅡ继代6d时的愈伤组织转化率最高，达到了27.70%，同期的HiⅡB、HiⅡA、H99分别为22.73%、21.43%、9.30%；6～10d时的抗性愈伤率有所降低，10d时最低，HiⅡ为15.94%，HiⅡB为12.38%，HiⅡA为11.91%，H99仅为4.76%。
2.3农杆菌浓度对抗性愈伤转化率的影响
用D600nm值分别为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8的菌液侵染HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料的愈伤组织10min，图1结果显示，农杆菌浓度在0.3～0.6之间时，转化率随着农杆菌浓度升高而增高，HiⅡ的转化率从9.00%升高到33.33%，HiⅡB的转化率从10.21%升高到23.62%，HiⅡA的转化率从8.11%升高到20.31%，H99的转化率从2.06%升高到7.35%；当农杆菌浓度大于0.6时，增加农杆菌的浓度，转化率反而下降，发生这样的结果可能是因为农杆菌浓度大时造成愈伤组织污染，使转化效率降低。综合比较可以看出，D600nm值为0.5～0.6是合适的浓度范围。
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2.4抗性愈伤组织标记基因bar的PCR检测
在优化后的转基因体系中加入除草剂进行筛选，得到22块抗性愈伤组织，其中HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料分别得到10、5、4、3块抗性愈伤组织，再通过标记基因bar的PCR检测分别得到5、2、2、1块阳性愈伤组织，标记基因大小为600bp，阳性率分别为50.00%、40.00%、50.00%，33.33%（图2）。综合比较可知，HiⅡ的阳性率相对较高。
2.5抗性愈伤再生植株的获得及bar基因试纸条检测
将PCR检测得到的阳性愈伤进行进一步扩繁，一部分进行出苗试验，另一部分进行保留，保留的目的是怕阳性愈伤在出苗过程中死亡。对于出苗的植株进行bar基因试纸条检测，目的是从蛋白质水平上进一步检测目的基因是否已经导入玉米基因组，结果从HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料中分别获得4、1、2、1株阳性植株，其中HiⅡ的转基因效果最好（图3）。
2.6T0代转化植株目的基因的PCR鉴定
对PCR检测获得的10株转基因植株设计目的基因特异引物，经过PCR扩增出400bp的目的条带，检测到10株全为阳性植株（图4）。结果表明外源基因已经整合到玉米基因组中。
3讨论
对于农杆菌介导的玉米遗传转化，国内外报道大多数都是以幼胚作为遗传转化的受体[5]，但是幼胚的取材受时间影响很大，一旦错过了最佳时期就很难使试验继续进行。而愈伤组织不受时间影响，可以长期作为转化的受体，而且能长期继代培养。
玉米材料的不同对遗传转化有很大的影响，有的材料能诱导出适合转化的玉米材料，有的则不能。本试验用农杆菌转化继代3、4、5、6、7次的不同材料玉米愈伤组织，结果表明：HiⅡ的抗性愈伤率最高，其次是HiⅡB和HiⅡA，H99的最低，这与George等的研究结果[6-7]一致，即不同的玉米品种接受农杆菌侵染的能力也不同，接受转化的受体对品种的依赖性很强；基因型相同时，继代3次的抗性愈伤率高于其他继代次数，与余桂荣的试验结果相同；侵染前预培养愈伤组织的转化频率高于未预培养的，且预培养6d的侵染效果较好，这与伍晓丽等的研究结果[8]相一致。产生这些结果的原因可能有以下几点：（1）基因型方面，B73和A188是良好的转基因受体材料，HiⅡB和HiⅡA是B73与A188杂交得到的衍生系，HiⅡB诱导的愈伤组织较HiⅡA松散，HiⅡA外壳相对比较硬，HiⅡ是由HiⅡB与HiⅡA杂交所得到的，具有两者的综合优点，为Ⅱ型愈伤组织，Ⅱ型愈伤的生长速度非常快，形状类似菜花，结构松散，容易分化成苗[9]；而H99的愈伤组织大多为I型，外壳比较硬，不太容易扩大培养，抗性愈伤率比较低。（2）在愈伤组织的整个生长期间，前3次的生长比较快，细胞增殖能力强，3次以后由于代谢物质的逐渐积累，筛选出的抗性愈伤较低，因而继代3次的玉米愈伤组织侵染效率比较高。（3）侵染前预培养一段时间有利于愈伤的生理状态达到良好的状态，没有预培养的愈伤在上次继代到14d时，有可能会有少量的有毒物质产生，而預培养一段时间的愈伤组织代谢比较旺盛，适于农杆菌侵染。
农杆菌浓度对侵染效率也有很大的影响。农杆菌浓度过低时，吸附在细胞表面的农杆菌过少而不能有效地将T-DNA转移到植物体内，浓度过大时容易使愈伤组织污染。本研究表明，当菌液浓度为D600nm=0.5～0.6时，HiⅡ愈伤组织的抗性愈伤组织诱导率达最高值。
本试验通过优化后的转基因体系对4种玉米材料的愈伤组织进行侵染，在筛选过程中选择出抗性愈伤组织，取其抗性愈伤的一部分提取DNA，并对其进行PCR检测，对检测出来的抗性愈伤一分为二，一部分进行扩繁，另一部分进行再生出苗，再生出苗的植株进行bar基因试纸条的检测，进一步从蛋白质水平上对转基因结果进行检测，优化后的转基因体系极大地提高了转基因的转化率。
参考文献：
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