非肺结核分枝杆菌

第一篇：非肺结核分枝杆菌

非结核分枝杆菌医院感染的预防和控制措施

一、加强重点部门的医院感染控制工作。医疗机构应当加大对重症监护病房(ICU)、手术室、新生儿室、血液透析室 、内镜诊疗中心(室)、消毒供应中心、治疗室等医院感染重点部门的管理。

二、加强手术器械等医疗用品的消毒灭菌工作。对耐高温、耐高湿的医疗器械、器具和用品应当首选压力蒸汽灭菌，尽量避免使用液体化学消毒剂进行浸泡灭菌。使用的消毒药械、一次性医疗器械、器具和用品应当符合国家有关规定。一次性使用的医疗器械、器具和用品不得重复使用。进入人体组织和无菌器官的相关医疗器械、器具及用品必须达到灭菌水平，接触皮肤、粘膜的相关医疗器械、器具及用品必须达到消毒水平。

三、规范使用医疗用水、无菌液体和液体化学消毒剂。氧气湿化瓶、雾化器、呼吸机、婴儿暖箱的湿化装置应当使用无菌水。各种抽吸的输注药液或者溶媒等开启后应当注明时间，规范使用，并避免患者共用。无菌液体开启后超过24小时不得使用。需要使用液体化学消毒剂时，要保证其使用方法、浓度、消毒时间等符合有关规定。同时加强对使用中的液体化学消毒剂的浓度监测。

四、严格执行无菌技术操作规程。医务人员实施手术、注射、插管及其他侵入性诊疗操作技术时，应当严格遵守无菌技术操作规程和手卫生规范，避免因医务人员行为不规范导致患者发生感染，降低因医疗用水、医疗器械和器具使用及环境和物体表面污染导致的医院感染。

五、加强医院感染监测工作。加强重点部门(重症监护病房(ICU)、手术室、新生儿室、血液透析室、内镜诊疗中心(室)、消毒供应中心等)，重点部位(导管相关性血流感染、外科手术部位感染等)以及关键环节(各种手术、注射、插管、内镜诊疗操作等)医院感染监测工作，及时发现、早期诊断感染病例。特别是发生聚集性、难治性手术部位或注射部位感染时，应当及时进行非结核分枝杆菌的病原学检测及抗菌药物敏感性、耐药模式的监测，根据监测结果指导临床及时应用抗菌药物，有效控制非结核分枝杆菌医院感染。

六、医疗机构发生非结核分枝杆菌感染的暴发时，应当按照《医院感染管理办法》、《医院感染暴发报告及处置管理规范》等有关规定进行报告。

第二篇：2结核分枝杆菌教案（本站推荐）

程名称：临床微生物学检验 NO：2 授课班级 12检验

4、5班 授课日期 2014.2.27-28 授课教师

模块三,临床细菌学

学习任务二 第14章 分枝杆菌、放线菌与诺卡菌 【学习目标】

1.掌握结核分枝杆菌的基本特性及实验室检查方法 2.熟悉结核分枝杆菌的临床意义 3.了解分枝菌属的分类 【教学重难点】

重点：结核分枝杆菌的基本特性及实验室检查方法 难点：实验室检查方法 【教学方法】 讲授+自主+讨论 【导入新课】

复习前面的内容、提问及一些关于结核杆菌的故事，临床上对结核病的检测依据是是什么，通过什么样的检查才能尽快尽早对病情进行临床诊断，这就是我们今天要学习的内容。 【教学内容】

第14章 分枝杆菌 放线菌与诺卡菌 概 述

分枝杆菌与放线菌属放线菌目（Actinomycetates）

分枝杆菌属（Mycobacterium）是一类细长略带弯曲专性需氧性杆菌。该菌一般认为革兰染色阳性。多数细菌在生长的一定时期抵抗酸-醇（acid-alcohol-fast），故又称抗酸杆菌（acid-fast bacillus）

放线菌（Actinomyces）是一群在生物学特性上与细菌类同的原核细胞型微生物，与分枝杆菌、棒状杆菌等有着亲缘关系

放线菌是多数不致病，对人致病的主要有放线菌属和诺卡菌属。

前者为厌氧或微需氧菌，细胞壁中不含分枝菌酸，多引起内源性感染。

后者为需氧菌，细胞壁中含有分枝菌酸，非人体正常菌群的成员，常引起外源性感染。

第一节 结核分枝杆菌

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）简称结核杆菌、人和动物结核病的病原菌

一、分 类 MTB包括

人结核分枝杆菌（M.tuberculosis）

牛分枝杆菌（M.bovis）

非洲分枝杆菌（M.africanum）

坎纳分枝杆菌（M.canettii）

田鼠分枝杆菌(M.microti)等

前四种对人类致病，其中人型MTB感染率最高

二、临床意义

大约1/3的人口已感染MTB 有2000万活动性结核病患者

每年新发病900万人，死于结核病300万人

近年来，AIDS的发病率上升，AIDS患者又极易患结核病，结核病已成为威胁人类健康的一个严重的全球性公共卫生问题

1 WHO已把结核病与AIDS、疟疾一起列为人类的最主要杀手

(一) 所致疾病

通过呼吸道、消化道和损伤的皮肤等多途径 感染机体，引起多种脏器的结核病，其中以肺结核为多见 (二)免疫性

有菌免疫或称传染性免疫 细胞免疫

迟发型超敏反应 (三) 变异

• 结核分枝杆菌易发生形态、菌落、生长温度、毒力以及耐药性的变异

• 卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）是有毒力的牛型结核分枝杆菌在甘油、胆汁和马铃薯的培养基中经13年230次传代而获得的减毒变异株 • 现已广泛用于人类结核病的防治 •

二、临床意义 (四)耐药性

• 对常见抗菌药物天然耐药

• 多重耐药结核病(multiple-drug resistance tuberculosis，MDRTB)是指对2种或2种以上的抗结核药产生耐药性的结核菌感染。临床治疗相当棘手，死亡率很高

三、微生物学检验

（一）基本特性

•

结核分枝杆菌尚未发现产生内毒素、外毒素及侵袭性酶

• 致病性可能与细菌在组织细胞内大量繁殖引起的炎症、代谢物质的毒性以及菌体成分引起的免疫损伤有关

• 结核分枝杆菌的致病物质主要是荚膜、脂质和蛋白质

（二）标本采集

• 据感染部位的不同采集不同的标本

• 疑肺结核：收集清晨第一口痰，清洁干燥的容器内送检

• 疑泌尿系结核：清晨一次全部尿量或24小时尿沉淀10～15ml送检，必要时作无菌导尿送检（诊断泌尿道结核通常需3～5份标本）

• 采集脓液应直接从溃疡处取脓汁或分泌物,深部脓肿用无菌注射器抽取送检

• 其他：无菌抽取脑脊液、胸水、腹水及关节液等盛无菌试管送检。脑脊液标本静置后，表面可有细薄凝块，取凝块作涂片或接种培养

（三）标本直接检查

1. 形态学检查

（1）直接涂片染色镜检

（2）浓缩集菌涂片检查法

2. 核酸检测 • 形态学检查

• 齐-尼染色（Ziehl-Neelsen technique）是常用的抗酸染色法，染色后结核分枝杆菌呈红色，背景呈蓝色 • 形态学检查

• 用荧光染料金胺“O”染色，在荧光显微镜下菌体呈橘黄色 • 用PCR法快速诊断MTB感染

• PCR法检测DNA特异性更强，敏感性更高

• PCR须按法规要求规范操作，应防止标本污染出现假性结果

（四）分离培养与鉴定

1. 培养特性

– 专性需氧

2 – 3％～5％CO2能促进其生长

– 营养要求高:须在含血清、卵黄、马铃薯、甘油以及含某些无机盐类的特殊培养基上才能生长良好。常用罗氏培养基

– 最适生长温度为35～37℃，最适pH6.5～6.8 – 14～18h分裂1次，在固体培养基上2～5周才出现肉眼可见的菌落

– 典型菌落为粗糙型，表面干燥呈颗粒状，不透明，乳白色或淡黄色，如菜花样

2.分离培养

• 标本接种于选择性培养基中(常用罗氏，所含的孔雀绿或青霉素可抑制杂菌生长) • 37℃，5％～10％CO2培养8周

• 结核杆菌出现干燥呈颗粒状、灰白色菌落 • 涂片染色为抗酸阳性 •

三、微生物学检验 3. 菌种鉴定 (1) 生化反应

（2）噬菌体鉴定法

（3）分子生物法菌种鉴定

(4) 高效液相色谱（HPLC）检测分枝菌酸

• 生化反应--烦琐、费时（ 4～8 周）,影响因素多 • 结核分枝杆菌不发酵糖类 • 能产生触酶

• 人型MTB能合成烟酸，还原硝酸盐，耐受噻吩-2-羧酸酰肼，而牛型MTB则不能 • 人型和牛型的毒株中性红试验均阳性，无毒株则为阴性，并失去索状生长现象 • 噬菌体鉴定法（PhaB）

• Wilson 等于1997年建立的快速检测新技术

• 原理：是分枝杆菌噬菌体D29能感染活的分枝杆菌,未进入感染菌体内的噬菌体被随后加入的杀毒剂灭活 ,已进入菌体内的噬菌体不受影响。噬菌体在感染菌体内大量增殖 ,并将菌体裂解 ,释放出的子代噬菌体可感染随后加入的指示细胞 ,并将其裂解 ,在琼脂平板上出现透亮的噬菌斑。

• 分子生物法菌种鉴定

• PCR 限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP） • PCR单链构象多态性分析（PCR-SSCP） • 核酸探针 • 核酸序列分析 • 多重PCR • 高效液相色谱（HPLC）

• 检测分枝菌酸：由于不同种的分枝杆菌细胞壁中的分枝菌酸不同，所以利用HPLC检测分枝菌酸可鉴定菌种。 •

三、微生物学检验

（五） 免疫学诊断 1．结核菌素试验

2．结核分枝杆菌抗原检测 3. 结核分枝杆菌抗体检测 4. 全血干扰素测定法

结核菌素试验

• 针对旧结核菌素(OT)与结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)两种菌体蛋白

• 原理：当将蛋白注入皮内后，如受试者已感染结核杆菌，则结核菌素与致敏淋巴细胞特异性结合，在局部释放淋巴因子，形成迟发性超敏反应性炎症，若受试者未感染MTB则无反应。

3 结核分枝杆菌抗原检测

• 用ELISA 方法在血清中检测结核分枝杆菌抗原-结核菌外分泌特异性抗原 (external secreted specific antigen) 浓度。

• 任何体液如血液、痰液、脊髓液、尿液和各式组织萃取液等体液可用于检测特异蛋白抗原。 结核抗体

• 作为活动性MTB感染的快速诊断方法之一

• 比传统的痰涂片抗酸染色、MTB培养等方法简便、快速、敏感性高，但存在一定的假阳性。 • 近年，胶体金、蛋白芯片检查结核杆菌IgG抗体抗体，特别是后者，针对三种抗原（脂阿拉伯甘露糖、38K Da和16K Da蛋白质抗原），其灵敏度和特异性均有所提高。 全血干扰素测定法

• 原理：当全血与PPD和对照抗原（植物血凝素）共同孵育后，致敏的淋巴细胞可分泌IFN-γ，通过检测IFN-γ的含量来鉴定菌种。

• 2004年，Quantiferon-TB Gold assay 问世，应用结核分枝杆菌RD1区域编码的早期分泌抗原靶（ESAT）和培养滤液蛋白（CFP-10）特异抗原刺激细胞检测。

• 近来ESAT/CFP-10融合蛋白-ELISPOT用于诊断活动性结核病，准确、灵敏、特异、快速。 • 结果与结核菌素试验相当，干扰因素小。

（六）药物敏感性试验

• 将纯培养物菌悬液，接种含各种浓度药物的固体培养基上，同时做不含药物的对照组。 • 经过培养，含有药物的培养基上菌落数目是对照组的75％以上，则认为该菌对该药物浓度为完全耐药，如无菌落生长则为敏感。

【小结】

结核分枝杆菌为专性需氧，营养要求较高。生长缓慢，在固体培养基上2～5周才出现肉眼可见的菌落。典型菌落为粗糙型，表面干燥呈颗粒状，不透明，乳白色或淡黄色，如菜花样。微生物检验包括染色镜检、核酸检测、分离培养、鉴定试验、免疫学诊断和药物敏感性试验。

【课后预习】非结核分支杆菌，放线菌、卡诺菌 【课后作业】

1、如何进行结核分支杆菌的微生物学检验？

2、结核菌素试验的原理是什么？

第三篇：结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂注册技术审查指导原则

附件 结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂 注册技术审查指导原则 本指导原则旨在指导注册申请人对结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。

本指导原则是对结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，如不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。

本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，也不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。

一、范围 结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应(即γ-干扰素释放试验，IGRAs)的主要原理：受到结核分枝杆菌抗原刺激致敏的T淋巴细胞(T细胞)再次遇到相同抗原时可产生γ-干扰素，IGRAs通过检测全血或者分离自全血的外周血单个核细胞(PBMC)在结核分枝杆菌特异性抗原刺激下产生的γ-干扰素，判断受试者是否存在结核分枝杆菌感染。目前，国际上较成熟的IGRAs有两种：一是采用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测全血中致敏T细胞再次受到结核分枝杆菌特异性抗原刺激后释放的γ-干扰素水平;

二是采用酶联免疫斑点技术(ELISPOT)方法测定在结核分枝杆菌特异性抗原刺激下，外周血单个核细胞中能够释放γ-干扰素的效应T细胞数量。

上述两种检测方法的原理类似，检测技术和操作程序略有不同，采用的结核分枝杆菌特异性抗原主要存在于结核分枝杆菌复合群中，在卡介苗和大多数非结核分枝杆菌中缺失。

目前，结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂是指：利用免疫学检测技术，如ELISA或ELISPOT技术等，以结核分枝杆菌特异抗原刺激T细胞产生的γ-干扰素为检测靶标，对人静脉全血中的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应进行体外检测的试剂，可用于结核分枝杆菌感染的检测或用于结核病的辅助诊断。本指导原则所述内容是针对结核病辅助诊断预期用途的，对于预期用途为结核分枝杆菌感染检测的申报试剂，申请人可以根据产品特性对不适用部分进行修订或补充其他的评价和验证。

本指导原则的技术要求是基于ELISA和ELISPOT方法建立的，对于其他方法，可能部分要求不完全适用或本文所述技术指标不够全面，申请人可以根据产品特性对不适用部分进行修订或补充其他的评价和验证，但需阐述不适用的理由，并验证替代方法的科学合理性。本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。

二、注册申报资料要求 (一)综述资料 综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及国内外同类产品上市情况介绍等内容。其中，同类产品上市情况介绍部分应着重从预期用途、方法学、检验原理、结核分枝杆菌特异性刺激抗原以及最低检测限等方面写明申报试剂与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。如所用刺激抗原为新发现的结核分枝杆菌特异性抗原，则应详细论述其能提高该类试剂灵敏度和特异性的科学依据，并提供充分的支持资料。

综述资料应符合《体外诊断试剂注册管理办法》(国家食品药品监督管理总局令第5号，以下简称《办法》)和《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》(国家食品药品监督管理总局公告2014年第44号，以下简称44号公告)的相关要求。

(二)主要原材料的研究资料 应提供主要原材料如抗原肽/重组抗原、抗体、阴性对照、阳性对照、标准品(γ-干扰素)、酶以及企业参考品等的选择与来源、制备过程、质量分析和质量控制标准等的研究资料。如主要原材料为企业自己生产，其生产工艺必须相对稳定;

如主要原材料购自其他供应商，应提供的资料包括：供应商提供的质量标准、出厂检定报告或性能指标证书，以及该原材料到货后的质量检验资料。

企业参考品：申请人应提供企业参考品的详细的来源、制备和确定等资料。

对于采用ELISPOT方法的申报试剂，企业参考品至少应包括：阴性参考品、阳性参考品和精密度参考品。其中，阳性参考品建议采用结核病患者(菌阴和菌阳)的全血，阴性参考品建议采用健康人和其他易混淆疾病患者的全血，精密度参考品建议采用结核病患者的全血。如申请人采用除全血之外的其他样本形式作为企业参考品，请提交申请人所采用的企业参考品的组成、来源、稳定性、延续性、性能可控性等详细的理论和试验数据。

对于采用ELISA方法的申报试剂，企业参考品至少应包括：阴性参考品、阳性参考品、最低检测限参考品、线性参考品、准确度参考品和精密度参考品等。其中，阴性参考品、阳性参考品和精密度参考品的设置可参考ELISPOT方法申报试剂的相关要求。最低检测限参考品、准确度参考品和线性参考品，主要考察ELISA部分的性能，可采用含有γ-干扰素的溶液(建议采用血浆作为基质溶液)。

对于阴性/阳性对照：申报试剂的质控体系通过设置阳性、阴性对照来实现，申报资料应详细描述各种对照的原料选择、制备、定值过程等试验资料。本指导原则的技术要求是基于ELISA和ELISPOT方法建立的，对于采用上述方法学的结核细胞类检测试剂，建议至少设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般采用外周血单个核细胞非特异性刺激物，用于质控外周血单个核细胞功能是否正常，避免产生假阴性。阴性对照用于控制细胞在活化过程中所产生的各种因子的非特异性影响，避免产生假阳性。

标准品(如适用)的选择及质量标准：应详细描述标准品原料的来源、制备、纯度、浓度(或复溶后浓度)、分子量、功能活性等的确定和验证资料。

多肽/重组抗原的选择及质量标准：应详细描述多肽的来源(来自何种抗原)/重组抗原的来源、组成、分子量、纯度、浓度、重组抗原的内毒素含量、刺激活性、特异性等的确定和验证资料。如为冻干抗原，还应设置水分含量的质控标准。

抗体的选择及质量标准：应详细描述抗体的来源、纯度、浓度、分子量、刺激免疫原、效价和功能活性等的确定和验证资料。

(三)主要生产工艺及反应体系的研究资料 主要生产工艺包括：配制工作液、分装和包装等，可用流程图表示。应提供主要生产工艺的确定依据，包括试验方法和数据等。

反应体系研究资料应能对产品说明书中检验方法部分涉及的基本内容，如样本用量、试剂用量、反应条件等，提供确定的依据，包括试验方法和数据等。

(四)分析性能评估资料 申请人应提交对申报试剂进行的所有性能验证的研究资料，包括具体的试验方法、内控标准、实验数据和统计分析等。对于结核分枝杆菌细胞免疫反应检测试剂，建议着重对以下分析性能进行研究。

1.对于采用ELISA方法的申报试剂 检验方法分为两大部分：(1)将结核分枝杆菌特异性抗原与全血样本共培养，获得含有γ-干扰素的血浆样本;

(2)以γ-干扰素标准品做标准曲线，对第(1)步的血浆样本采用ELISA方法进行定量检测。基于该方法学的分析性能，需要对上述两方面的性能均进行验证。

1.1最低检测限 申请人可采用合理方法确定和验证申报试剂的最低检测限。建议采用含有系列γ-干扰素稀释浓度的样本，对每个浓度样本进行多次重复检测，选取测定平均OD值-2SD大于0浓度测定平均OD值+2SD的浓度作为最低检测限浓度。

1.2线性范围 线性范围确定的研究应使用高值样本(采用血浆基质，采用可溯源至国际校准品的方法对血浆样本中的γ-干扰素进行定量)进行梯度稀释，稀释液应使用血浆，应包含接近最低检测限的临界值浓度。通过评价一定范围内的线性关系确定申报试剂的线性范围。

1.3准确度 可采用如下方法进行评价，如：与国际标准品的偏差分析、回收试验或者方法学比对等方法，申请人可根据实际情况选择合理方法进行研究。

1.4分析特异性 1.4.1交叉反应 交叉反应的验证主要考虑全血自身含有的细胞因子或全血刺激培养过程中产生的细胞因子与申报试剂所用γ-干扰素抗体对是否存在交叉反应。需要进行交叉反应验证的细胞因子包括：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、TNFα、IFN-α和IFN-β等。建议在0浓度γ-干扰素水平和中浓度γ-干扰素水平分别进行交叉反应的验证。

同时，建议申请人采用一定数量的其他常见分枝杆菌感染患者的全血样本进行试验，评价申报试剂的特异性。

1.4.2干扰物质 应对全血样本中常见的干扰物质进行验证，包括：抗凝剂、甘油三酯、血红蛋白、胆红素、类风湿因子、抗核抗体、抗线粒体抗体和免疫抑制剂等。建议采用含有不同浓度γ-干扰素的血浆样本分别进行干扰物质的验证，给出不会对γ-干扰素检测值产生干扰的最高干扰物浓度。

1.5精密度 1.5.1采用全血样本进行试验的精密度：分别采用阳性全血样本和阴性全血样本，进行不少于10次重复检测，判断检测结果的阴阳性，多次重复检测结果应一致。

1.5.2采用含有γ-干扰素的血浆样本进行试验的精密度：建议在γ-干扰素低浓度和中等浓度2个浓度水平分别进行验证。

1.5.2.1低浓度样本：γ-干扰素浓度略高于试剂盒的最低检测限(n≥20)。

1.5.2.2中等浓度样本：采用中等浓度的样本进行重复检测，CV≤15%(n≥20)。

1.5.3申请人应设置合理的精密度评价周期，以便对批内/批间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。

1.6阴性参考品符合率 建议选择至少15份健康人和其他易混淆疾病患者的全血样本进行试验，上述健康人和患者应包括不同等级的结核菌素(PPD)皮试人群。

1.7阳性参考品符合率 建议选择至少20份结核病患者(至少10例菌阳，至少10例菌阴)全血样本进行试验。

1.8标准品的溯源资料 γ-干扰素具有国际标准品，建议检测结果的量值溯源至国际标准品。申请人应提供从国际标准品到产品标准品的溯源链以及各级赋值资料。

2.对于采用ELISPOT方法的申报试剂 检验方法为：将结核分枝杆菌特异性抗原与分离的外周血单个核细胞(PBMC)共培养，活化刺激PBMC分泌的γ-干扰素被微孔板上包被的单克隆抗体捕获，再用酶标记的另一个单克隆抗体进行反应显色，一个斑点即代表一个细胞，计数斑点的多少，从而判断是否存在结核分枝杆菌特异性的细胞免疫反应。基于该方法学的分析性能，需从下述几个方面进行性能验证。

2.1分析特异性 2.1.1交叉反应 交叉反应的验证主要考虑PBMC刺激培养过程中产生的细胞因子与申报试剂所用γ-干扰素抗体对是否存在交叉反应。需要进行交叉反应验证的细胞因子包括：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、TNFα、IFN-α和IFN-β等。建议在0浓度γ-干扰素水平和中浓度γ-干扰素水平分别进行交叉反应的验证。

同时，建议申请人采用一定数量的其他常见分枝杆菌感染患者的全血样本进行试验，评价申报试剂的特异性。

2.1.2干扰物质 应对全血样本中常见的干扰物质进行验证，包括：抗凝剂、甘油三酯、血红蛋白、胆红素、类风湿因子、抗核抗体、抗线粒体抗体和免疫抑制剂等。建议采用全血样本进行干扰物质的验证，给出不产生干扰的最高干扰物浓度。

2.2精密度 采用全血样本(包括高斑点数样本、中等斑点数和低斑点数样本)分别进行精密度评价，进行不少于10次重复试验，判断检测结果的阴阳性，多次重复检测结果应一致。同时，还应计数检测孔斑点数，计算其CV值，CV值应≤25%。

申请人应设置合理的精密度评价周期，以便对批内/批间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。

2.3阴性参考品符合率 建议选择至少15份健康人和其他易混淆疾病患者的全血样本进行试验，上述健康人和患者应包括不同等级的结核菌素(PPD)皮试人群。

2.4阳性参考品符合率 建议选择至少20份结核病患者(至少10例菌阳，至少10例菌阴)全血样本进行试验。

(五)阳性判断值的研究资料 此类试剂的阳性判断值较为复杂，阳性判断值对应产品说明书中“检验结果的解释”部分的内容，申请人应对产品说明书中“检验结果的解释”部分所涉及的各个数值提供详细的确定和验证资料。该部分资料应采用临床样本进行试验，请注意临床样本的选择应与申报产品声称的预期用途相一致。建议采用受试者工作特征(ROC)曲线的方式进行确定。

(六)稳定性研究资料 稳定性包括申报试剂稳定性和样本稳定性(包括全血样本稳定性和血浆样本稳定性)。前者主要包括实时稳定性(有效期)、开封稳定性及冻融次数限制(如适用)等。稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据及结论。对于实时稳定性研究，应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。

试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果均应在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中进行详细说明。

(七)临床试验 临床试验总体要求及临床试验资料的内容应符合《办法》、44号公告和《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》(国家食品药品监督管理总局通告2014年第16号)的规定，以下仅结合结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂的具体特点对其临床试验中应重点关注的内容进行阐述。

1.临床试验机构的选择 申请人应当选定不少于3家(含3家)临床试验机构，按照法规要求开展临床试验。

2.对比试剂的选择 对于预期用于结核病辅助诊断的申报试剂，申请人可选择境内已批准上市、临床普遍认为质量较好的同类产品作为对比试剂，采用试验用体外诊断试剂(以下称申报试剂)与对比试剂进行比较研究试验，证明本品与已上市产品等效。

3.临床试验对象的选择 对于预期用于结核病辅助诊断的申报产品，临床试验对象应满足：(1)临床试验总病例至少1000例;

(2)具有结核病相关体征/症状的疑似结核病患者;

(3)最终临床诊断为结核病患者的病例中，应包括肺结核患者和肺外结核患者，并且涂片阴性的肺结核患者占所有肺结核患者的比例不应小于50%;

单纯肺外结核患者至少30例;

(4)非结核的其他呼吸道疾病患者以及其他易混淆疾病的患者病例(最终临床诊断不是结核病)，包括肺炎、肺癌、支气管炎、支气管扩张、非结核分枝杆菌病、慢阻肺等，其中肺癌至少50例;

(5)上述人群应包括PPD阴性和阳性人群，不能人为选择PPD阴性人群进行临床试验;

(6)各临床试验机构的样本量和样本分布应相对均衡。

全血样本不能冻融，临床试验应采用新鲜样本，样本采集和保存等应满足申报试剂和对比试剂说明书的相关要求。

4.临床试验方法、临床原始数据及统计分析 4.1分别依据申报试剂和对比试剂各自的说明书对入组临床样本进行检测，记录结果。

4.2临床报告中应明确：总样本例数;

临床诊断为肺结核患者的总例数，说明涂片阴性和涂片阳性的肺结核患者例数;

肺外结核患者的例数，说明各类肺外结核患者的例数;

非结核的其他呼吸道疾病患者以及易混淆疾病样本例数，并详细说明各类非结核疾病的患者例数。

4.3临床原始数据应以列表的方式表示，包括每个病例样本的年龄、性别、临床诊断结果、申报试剂的结果以及对比试剂的结果等。

4.4对临床试验数据的统计应选择合适的统计方法，如受试者工作特征(ROC)曲线分析、阴性/阳性符合率等。常选择四格表的形式总结两种试剂的定性检测结果，对定性结果进行四格表卡方或kappa检验以验证两种试剂定性结果的一致性，统计分析应可以证明两种方法的检测结果无明显统计学差异。

4.5申报试剂对涂片阴性的肺结核患者和肺外结核患者均应有一定的检出率。

5.结果差异样本的验证 对于两种试剂检测结果不一致的样本，应采用临床上公认较好的第三方试剂或其他合理方法进行复核，同时结合患者的临床病情对差异原因及可能结果进行分析。

6.临床试验方案 各临床试验机构的方案设置应保持一致，且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案实施，不可随意改动。整个试验过程应在临床试验机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成，申请人的技术人员除进行必要的技术指导外，不得随意干涉试验进程，尤其是数据收集过程。

试验方案中应确定严格的样本入选/排除标准，任何已经入选的样本再被排除出临床试验都应记录在案并明确说明原因。各临床试验机构选用的对比试剂应保持一致，以便进行合理的统计学分析。

7.其他问题 如果申报试剂的预期用途为结核分枝杆菌感染的检测，申请人应按照法规要求，设置合理的对比方法，选择合适的预期适用人群，进行临床试验。

(八)产品技术要求 产品技术要求应符合《办法》和《医疗器械产品技术要求编写指导原则》(国家食品药品监督管理总局通告2014年第9号)的相关规定。内容主要包含产品性能指标和检验方法，并在附录中明确主要原材料、生产工艺及半成品检定要求。

对于采用ELISA方法的申报试剂，产品技术要求的性能指标至少应包括：外观、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、线性、准确度、最低检测限和精密度等。对于采用ELISPOT方法的申报试剂，产品技术要求的性能指标至少应包括：外观、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率和精密度。

(九)产品注册检验报告 根据《办法》要求，首次申请注册的第三类产品应在具有相应医疗器械检验资质和承检范围的医疗器械检验机构进行连续三个生产批次样品的注册检测。

(十)产品说明书 产品说明书的格式应符合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》(国家食品药品监督管理总局通告2014年第17号)的要求，境外试剂的中文说明书除格式要求外，其内容应尽量保持与原文说明书一致，翻译力求准确且符合中文表达习惯。产品说明书的所有内容均应与申请人提交的注册申报资料中的相关研究结果保持一致。结合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的要求，下面对结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂说明书的重点内容进行说明。

1.【预期用途】 应至少包括以下几部分内容：

1.1本产品用于体外定性检测人新鲜外周静脉抗凝血中结核分枝杆菌特异性的T细胞免疫反应，用于结核分枝杆菌感染的检测或者用于结核病的辅助诊断(根据临床试验等研究资料确认预期用途)。

1.2说明与预期用途相关的临床适应症背景情况，说明相关的临床或实验室诊断方法。

1.3待测人群特征介绍：具有结核病相关体征/症状的疑似结核病患者、地域要求或年龄限制(如有)等。

2.【主要组成成分】 2.1说明试剂盒包含组分的名称、数量、比例或浓度等信息，说明不同批号试剂盒中各组分是否可以互换。

2.2试剂盒中不包含但对该项检测必须的组分，应列出相关试剂/耗材的名称、货号及其他相关信息。

2.3申报试剂的注册单元不应包含真空采血管，真空采血管应按相应法规申报注册。

3.【检验原理】 3.1说明试剂盒所用的刺激抗原/抗原肽(名称、是否多肽抗原/重组抗原)，以及所用抗原/抗原肽在卡介苗和非结核分枝杆菌中的存在情况。

3.2试剂盒技术原理的详细介绍，建议结合适当图示进行说明。

4.【储存条件及有效期】 说明试剂盒的效期稳定性、开封稳定性、复融稳定性、冻融次数要求(如适用)等，应明确具体的储存条件及有效期。

5.【样本要求】 重点明确以下内容：

5.1样本的采集：明确所用抗凝剂。

5.2样本的保存：

5.2.1对于采用ELISPOT方法的申报试剂，应明确：全血样本进行外周血单个核细胞分离前的保存温度与时间;

分离后外周血单个核细胞在与抗原孵育培养前的保存温度与时间。

5.2.2对于采用ELISA方法的申报试剂，应明确：全血样本在与抗原孵育培养前的保存温度与时间。

6.【检验方法】 该类产品的检测步骤繁多，应详细描述从全血采集开始到结果判读前的每个步骤，并明确注意事项。重点关注以下问题：对于采用ELISPOT方法的申报试剂，明确培养时所用外周血单个核细胞的数量以及所用培养基类型。

7.【检验结果的解释】 结合阳性对照、阴性对照以及样本管检测结果，以列表的形式对所有可能出现的结果组合及相应的解释进行详述，明确灰区结果的处理方式。

8.【检验方法的局限性】 8.1本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。

8.2有关假阴性结果的可能性分析，如：某些免疫功能受损的患者，可能导致假阴性。

8.3有关假阳性结果的可能性分析，如：与其他分枝杆菌是否存在交叉反应。

9.【产品性能指标】 9.1最低检测限(如适用)：说明试剂的最低检出浓度，简单介绍最低检测限的试验方法及结果。

9.2企业阴阳性参考品的检测符合情况：简单介绍阴阳性参考品的组成和符合率结果等信息。

9.3精密度：明确精密度参考品的组成及结果。

9.4分析特异性 9.4.1交叉反应：明确可能产生交叉反应的其他细胞因子的验证情况。

9.4.2干扰物质：明确样本中常见干扰物质对检测结果的影响。

9.5对比试验研究(如有)：简要介绍对比试剂(方法)的信息、所采用的统计学方法及统计分析结果。

9.6境外(如适用)和境内临床试验数据总结。

《结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂注册技术审查指导原则》编制说明 一、编制背景 结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂是指利用免疫学检测技术，如ELISA或ELISPOT技术等，以结核分枝杆菌特异抗原刺激T细胞产生的γ-干扰素为检测靶标，对人静脉全血中的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应进行体外检测的试剂，可用于结核分枝杆菌感染的检测或用于结核病的辅助诊断。

本指导原则所述内容是针对结核病辅助诊断预期用途的，对于预期用途为结核分枝杆菌感染检测的申报试剂，申请人可以根据产品特性对不适用部分进行修订或补充其他的评价和验证。

二、重点问题的说明 (一)企业参考品的组成和样本类型 目前，该类试剂采用全血样本作为检测样本类型，所涉及的方法学包括：ELISPOT和ELISA。针对企业参考品的样本类型，考虑到全血样本的不可冻存性和该类试剂质控的关键点，指导原则建议：如申请人采用除全血之外的其他样本形式作为企业参考品，应提交申请人所采用的企业参考品的组成、来源、稳定性、延续性、性能可控性等详细的理论和试验数据。

针对企业参考品的组成，由于ELISPOT方法是在全血细胞培养后，直接在固体基质表面形成斑点，计数斑点判断结果，理论上可计数一个斑点。但在实践时，很难保证获取的全血样本刚好形成一个斑点，因此，采用该方法学的试剂仅需要设置阴性参考品、阳性参考品和精密度参考品。而ELISA方法是在全血培养后，吸出血浆上清，检测上清中的干扰素的含量，因此，采用该方法学的此类试剂需要设置培养阶段和干扰素ELISA检测阶段参考品，包括：阴性参考品、阳性参考品、线性参考品、最低检测限参考品和精密度参考品等。

(二)分析性能评估相关问题 1.最低检测限的要求与方法 采用ELISPOT方法的试剂，理论上可计数到一个斑点，因此理论上其最低检测限为1个斑点，但现实中通过试验证明该类试剂的最低检测限为1个斑点具有很大困难，难以实现。因此，参考美国FDA已批准同类试剂的要求，经讨论后，对ELISPOT方法学的此类试剂，无需进行最低检测限的验证。

采用ELISA方法的试剂，最低检测限检测的是血浆样本中干扰素的最低含量。指导原则建议，申请人可根据自己的研发平台，设置科学合理的方法，进行最低检测限的试验。

2.精密度的要求与方法 采用ELISPOT方法的试剂，精密度必须采用全血进行试验，方可模拟整个检测过程。在讨论日间精密度时，企业和相关专家均提出，因为全血样本无法冻存，无法在不同的自然天内进行日间精密度的研究。同时，现有认知水平下，也无科学合理的替代方法来进行日间精密度的研究，因此，对此类试剂不做日间精密度的要求。

采用ELISA方法的试剂，精密度不仅需要考察全血培养阶段的精密度，而且需要考察ELISA检测部分对干扰素含量检测的精密度，前者可参考ELISPOT方法的相关要求和方法，后者参考常见ELISA方法检测试剂的要求和方法。

3.交叉反应的要求与方法 采用ELISPOT方法和ELISA方法的试剂，尽管结果的判读方式存在差异，但其检验原理均是采用特异性的γ-干扰素抗体，检测T细胞刺激活化后分泌的γ-干扰素。因此，此类试剂的交叉反应性，主要考虑全血自身含有的细胞因子或全血刺激培养过程中产生的细胞因子与申报试剂所用γ-干扰素抗体对是否存在交叉反应。

如果在全血样本的培养过程中加入可能产生交叉反应的细胞因子，势必会影响T细胞在培养过程中的功能和活性，最终影响T细胞分泌γ-干扰素的能力，影响对结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应的检测。因此，对于该类试剂，不管是采用何种方法，交叉反应的研究都是采用血浆或其他基质检测细胞因子对γ-干扰素抗体对的交叉反应性。

(三)产品预期用途 该类试剂的检测原理可检测结核分枝杆菌的感染，包括活动性结核感染(结核病)和潜伏感染。但是，因为潜伏感染的诊断在全世界均无金标准，而且中国人出生就接种卡介苗，导致对潜伏感染预期用途的临床验证目前缺乏有效的对比方法，因此，目前申请人申报该类试剂的预期用途基本用于结核病的辅助诊断。本指导原则针对结核病辅助诊断预期用途的临床试验要求，给出了较为详细的建议，并经专家和企业讨论后，达成了一致意见。

同时，指导原则也明确，如果申请人对该类试剂的预期用途设定为结核分枝杆菌感染的检测，需提供足够的临床证据支持该声称。

(四)临床试验相关问题 1.样本入组相关要求 针对结核病辅助诊断的预期用途，指导原则在临床试验样本入组方面做了较为详细的说明。申报试剂应选择疑似结核患者进行检测，以模拟临床实际使用情况。临床使用中，该类试剂不仅用于肺结核的辅助诊断，还可用于肺外结核的辅助诊断，因此，指导原则对单纯肺外结核的样本例数也给出了最低要求。鉴于临床实践和研究证明，肺癌患者是一类与γ-干扰素相关的癌症，因此，规定了肺癌患者的最低样本例数，以考察该类试剂的特异性。

2.临床特异性的相关要求 指导原则初稿时，对申报试剂的临床特异性做出了不低于75%的要求。后经专家和企业反复讨论后删除了这一要求，原因有以下几点：第一，该类试剂已有多个同类产品在国内外批准上市，按照法规要求，可选择已上市同类试剂，验证该类试剂的检测准确性;

第二，该类试剂的临床特异性受临床试验受试人群的年龄、性别以及区域的影响较大，而且目前并无大量流行病学的调查数据支持75%的声称，因此，临床特异性无法给出具体要求。

三、编写单位 国家食品药品监督管理总局医疗器械技术审评中心。

第四篇：结核杆菌的生物危害评估报告

一、结核杆菌的传播与致病

结核杆菌通常指结核分枝杆菌和牛分枝杆菌，其中结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起人类结核病的主要病原体。

结核分枝杆菌的主要传染途径是经呼吸道传播，由排菌的肺结核病人在咳嗽、喷嚏或大声说话时随呼吸道分泌物排出到空气中，或排菌的肺结核病人随地吐痰通过再生气溶胶(尘埃)，携带结核杆菌，飞扬在空气中，被健康的人吸入后发生感染和发病，因此排菌的肺结核患者(尤其是痰涂片阳性未经治疗者)是结核病的主要传染源。一般结核病患者痰中结核杆菌越多，传播的危险性越大。患者排出的飞沫在1-10微米者，在空气中漂浮时间长，传染性越大。患者病变和症状越严重，传染性也越大。周围人群与患者接触越密切者，受感染的机会越多。与患者同处于空气不流通的室内的密切接触者，受感染的可能性增大。

未受结核感染的人是结核病易感人群，由于结核病是人畜共患病，哺乳类动物如牛、鹿、猴、猪、猫、狗等也都可以患结核病。

感染结核杆菌后，终身都有可能发病，发病时间因人而异，一般2个月～20年才发病。典型肺结核起病缓慢，病程较长，有低热、倦怠、食欲不振、咳嗽及少量咯血。但多数患者病灶轻微，无显著症状。(1)症状 ①全身症状 表现为午后低热、乏力、食欲不振、消瘦、盗汗等。②呼吸系统症状 通常为干咳或带少量黏液痰;继发感染时，痰呈粘液脓性。约1/3患者有不同程度咯血，咯血后常有低热。大咯血时可发生失血性休克，偶因血块阻塞大气道引起窒息。病灶炎症累及壁层胸膜时，相应胸壁有刺痛，一般多不剧烈，随呼吸及咳嗽而加重。若并发气胸或大量胸腔积液，呼吸困难症状尤为严重。(2)体征 早期病灶小或位于肺组织深部，多无异常体征。若病变范围较大，患侧肺部呼吸运动减弱，叩诊呈浊音，听诊时呼吸音减低，或为支气管肺泡呼吸音。因肺结核好发于肺上叶尖后段及下叶背段，故锁骨上下、肩胛区叩诊略浊，咳嗽后偶可闻及湿啰音，对诊断有参考意义。肺部病变发生广泛纤维化或胸膜粘连增厚时，患侧胸廓常呈下陷、肋间隙变窄、气管移位与叩浊，对侧可有代偿性肺气肿征。

二、结核杆菌的生物学特性

从分类学上看结核杆菌属于裂殖菌纲、放线菌目、分枝杆菌科、分枝杆菌属。

结核分枝杆菌正常典型的形态是直或稍弯曲、两端钝圆的杆菌，菌体长1-4纳米，宽0.3-0.6纳米，无芽胞、无荚膜、无鞭毛，生长发育期间有分枝生长倾向。镜下常呈单个散在或呈“人、V、T、Y”形排列，菌体多时细菌扭集一起呈绳索状、束状或丛状。此外结核杆菌菌体还具有多形态特征，受不良生长条件的影响可分别表现为杆菌型 (基本形态)、滤过型、颗粒型和球菌型(L型)4种不同的类型。

分枝杆菌生长缓慢，在人工培养基内繁殖一代约需15-20小时，一般需2-4周或更长时间始见菌落生长，甚至有极少数生长极为缓慢者需8周以上才开始有菌落生长。它为专性需氧菌，生长的温度范围是35-40℃，pH 5.5-7.2。培养营养要求较高且特殊，培养基需含鸡蛋、血清、 氨基酸、甘油等营养丰富的复杂有机物及少量无机盐类。而且结核杆菌随着环境的改变易发生菌落形态、毒力、L型及药物耐药性变异，如在人工培养基上反复连续传代，可产生变异而致毒力降低，

三、结核杆菌的检测与诊断

(1)细菌的实验室检查及其它检查

① 结核菌检查 是确诊肺结核最特异性的方法，痰中找到结核菌为确诊肺结核的主要依据。涂片抗酸染色镜检快速简便。在我国非典型分枝杆菌尚属少见，故抗酸杆菌阳性，肺结核诊断基本即可成立。痰菌阳性表明其病灶是开放性的，具有传染性。培养法更为精确，尚可作药物敏感试验与菌型鉴定。但结核菌生长缓慢，培养较为费时，但精确可靠，特异性高。若涂片阴性或诊断有疑问时，培养尤其重要;而且，培养后可做药物敏感性测定，指导临床用药。PCR技术检测结核菌 DNA快速、简便，并可鉴定菌型，不足之处是可能出现假阳性或假阴性。

② 影像学检查 胸部X线检查可以发现肺内病变的部位、范围、有无空洞或空洞大小、洞壁厚薄等。X线对各类结核病的透过度不同，通过X线检查能大致估计结核病

灶的病理性质，并能早期发现肺结核，以及判断病情发展及治疗效果，有助于决定治疗方案。肺结核的常见X线表现包括：纤维钙化的硬结病灶、浸润性病灶以及干酪样病灶等。胸部CT检查对于发现微小或隐蔽性病变，了解病变范围及病变鉴别等方面均有帮助。

③ 结核菌素试验 是诊断结核感染的参考指标。使用的变应原有旧结核菌素(old tuberculin, OT)和结核菌素的纯化蛋白衍化物(purified protein derivative, PPD)，现临床多用PPD。皮内注射0.1ml(5IU)，硬结平均直径≥5mm为阳性反应。结核菌素试验有助于判断有无结核菌感染。若呈强阳性反应，常表示为活动性结核病。结核菌素试验阳性反应仅表示曾有结核感染，并不一定现在患病。结核菌素试验阴性反应除表示没有结核菌感染外，尚需考虑以下情况：结核菌在感染4～8周后才建立充分变态反应，在这之前，结核菌素试验可呈阴性;应用糖皮质激素等免疫抑制剂，或营养不良、麻疹、百日咳等患者，结核菌素反应亦可暂时消失。

④ 其它检查 结核病患者血像通常无改变，严重病例常有继发性贫血，急性粟粒型肺结核时白细胞总数减低或出现类白血病反应。血沉增快常见于活动性肺结核。用ELISA法检测患者血清中特异性抗体，可对无痰或痰菌阴性者和肺外结核的诊断提供参考。纤支镜检查对于发现气管内膜结核、了解有无肿瘤、吸取分泌物、解除阻塞或作病原菌及脱落细胞检查，以及取活组织作病理检查等，均有重要诊断价值。浅

表淋巴结活检，有助于结核的鉴别诊断。

(2)诊断和鉴别诊断

痰结核菌检查不仅是诊断肺结核的主要依据，亦是考核疗效、随访病情的重要指标。X线检查是诊断肺结核的必要手段，对早期诊断、确定病变部位、范围、性质、了解其演变及选择 治疗等均具有重要价值。在临床诊断中，我国现用的分类法包括四部分，即肺结核类型、病变范围及空洞部位、痰菌检查、活动性及转归。肺结核分为五型：Ⅰ型为原发型肺结核;Ⅱ型为血行播散型肺结核;Ⅲ型为浸润型肺结核;Ⅳ型为慢性纤维空洞型肺结核;Ⅴ型为结核性胸膜炎。还应注意将结核病与肺癌、肺炎、支气管扩张、慢性支气管哮喘和其它发热性疾病如伤寒、败血症、白血病、纵隔淋巴瘤及结节病等进行鉴别。

四、结核杆菌的防治及生物安全防护

细菌的防治

根据《中华人民共和国传染病防治法》和《实验室生物安全通用要求》中的有关规定，结核病属于乙类传染病，按照乙类传染病进行预防控制。

在结核病的预防方面要针对传染源、传播途径、易感人群三个环节，采取以管理和控制传染源为主的综合性防治措施，努力做到“早发现、早报告、早治疗”，以利于控制和管理传染源。临床上肺结核化学治疗的原则是早期、规律、全程、适量、联合。整个治疗方案分强化和巩固两个阶段。我国结核病防治规划指南规定采用统一标准的化学治疗方案。

表1 国家防痨规划的结核病化疗方案

疗程

化疗方案

6个月

2RHZ/4RH

2ERHZ/4RH或4R2H2

2SRHZ/4RH或4R2H2 8个月

2SRHZ/6TH或6EH

2SRHZ/6S2H2Z2

R代表利福平，H代表异烟肼，Z代表吡嗪酰胺，E代表乙胺丁醇，S代表链霉素，

T代表丙硫异烟胺。下标数字表示每日用药次数;其余数字表示用药月数，斜线前数字表示前2个月，斜线后字表示后几个月。

对复治病例，一般可用以下几种方案：① 2S(E)RHZ/4RH(E)，督促化疗，保证规律用药。② 初治规则治疗失败的患者，可用2S3H3Z3E3/6H3R3E3;③ 慢性排菌者可用敏感的一线药与二线药联用，应严密观察药物不良反应，疗程以6～12个月为宜。

对毒性症状严重者，可加用糖皮质激素，以减轻炎症及过敏反应，促进渗液吸收，减少纤维组织形成及胸膜粘连。对咯血患者，应对症治疗，包括休息、止咳、镇静以及应用止血药如安络血等。

五、细菌的实验室安全防护

根据《病原微生物生物实验室生物安全管理条例》中的有关规定，人间传播的微生物名录(待 颁布)结核杆菌属于二类，BSL-3。WHO将结核杆菌生物危害等级定为Ⅲ级。所有参与结核杆菌防治和研究的实验室和实验室人员都必须遵守《结核病实验室生物安全管理条例》和《结核病诊断实验室检验规程》。

(1)安全防护

大多数实验室获得性结核病是由于处理感染者标本引起——可从痰、尿、组织、大便和其它体液标本中分离到结核杆菌。处理标本或培养物时产生气溶胶是实验室获得性结核病的最重要危险因素，也可通过损伤的皮肤接触感染。

因此首先应树立全程防护的观念，全面加强从事结核杆菌科研、检测、试剂和疫苗生产机构的生物安全管理。严格限定有资质开展研究的实验室和研究者。建立健全传染病病原管理组织;制订和完善传染病实验室生物安全的技术操作规范;加强可能暴露于结核杆菌或潜在感染性材料的相关业务人员生物安全知识培训和风险

和意识教育;切实落实各项管理制度，预防和控制实验室等渠道造成结核杆菌感染和传播;加强部门间沟通与合作，加强对高暴露实验室工作人员的监测工作，并保证他们能及时被发现与治疗。当进行大量活菌实验时，所有操作应在BSL-3级实验室生物安全柜中进行。为防止实验过程产生的气溶胶导致的实验室感染，所有操作

应使用三级生物安全防护。

在具体的操作过程中包括标本留取、运送、处理以及废物处置等程序都应防止感染性气溶胶的产生。病人留取标本应在独立的房间，应定时作好房间消毒，保持通风。标本应留取在封闭的器皿内送检。检验人员应穿戴防护服、口罩、手套等防护装备，严格遵守实验操作规程，实验室空气、实验台面应定时消毒。痰、尿标本找抗酸杆菌，应先高压灭菌后，再涂片染色。尤其是痰标本进行涂片制作时，在打开标本容器、涂片、加热固定时容易产生气溶胶，为防止实验过程中产生的气溶胶

导致实验室感染，所有操作应在二级生物安全柜中进行，并使用二级生物安全防护。痰标本培养时，在标本进行前处理高速振荡混合和离心、培养液或上清液的倾倒、转移和接种等操作过程有产生气溶胶和意外溅洒的可能，为防止实验过程中产生的气溶胶等导致实验室感染，所有操作应在二级生物安全柜中进行，并使用二级生物安全防护。药物敏感性测定时，在磨菌、滴加菌液、接种培养物、烧灼接种环等操作过程有产生气溶胶和意外溅洒的可能，实验者有可能直接大剂量暴露细菌。因此该项操作一定在BSL-3级实验室完成，且最好实验室内要有负压。并且操作者着二级生物防护用品。

(2)意外事故的处理

结核杆菌的灭活方式有化学的和物理的方法。实验过程中：

1)如标本或标本的前消化处理液被打翻污染操作台或地面，应以吸满75%已乙醇溶液的卫生纸覆盖污染区，15分钟以后卫生纸方可移去;

2)如污染物溅落到身体表面，或有割伤、刺伤、烧伤、烫伤等情况发生，应立即停止实验工作进行紧急处理：更换被污染的实验服装，皮肤表面用消毒液清洗，伤口以碘酒及酒精消毒，眼睛用无菌生理盐水冲洗;

3)如果发生菌液溢出、带菌的培养管破碎等，造成中、小面积污染。可用比污染面积大25%以上的纱布覆盖污染区域，边缘用脱脂棉围住，向纱布倾倒5%苯酚溶液或75%的乙醇溶液，浸泡2小时以上(其间适量添加溶液防止干燥)，再经紫外灯近距离(1米内)照射2小时以上;被污染的器械、容器等立即浸泡于75%乙醇溶液中2小时以上，实验完成后再进行高压消毒处理;

4)如果发生气溶胶污染或大面积污染，应立即停止实验并关闭实验室，对实验区域和实验室进行紫外灯照射消毒过夜;第二天对污染区域进行24小时封闭空气熏蒸消毒(乙醛消毒法：5ml乙醛+2g高锰酸钾/平方米空间)，直接被污染的区域可参照第3)条进行处理。

(3)实验室人员的防护

从事结核杆菌检测、研究的实验室工作人员必须在身体状况良好的情况下，才能进入实验室工作，出现下列情况，不能进入：身体出现开放性损伤;患发热性疾病;感冒、上呼吸道感染、或其他导致抵抗力下降的情况;妊娠、已经在实验室控制区域内连续工作4h以上，或其他原因造成的疲劳状态。

从事结核杆菌检测工作人员可间隔数年接种卡介苗一次。若操作者或其所在实验室的工作人员在此期间出现与被操作病原微生物导致疾病类似的症状或者体征时，例如发热、盗汗、咳嗽、咳痰、咯血或痰中带血等症状，则应被视为可能发生实验室感染。应立即报告实验室负责人，采取早发现、早报告、早治疗以控制管理传染源为主的综合性防治措施。

第五篇：兔巴氏杆菌病诊疗报告

2005年7月间，我市立业六队饲养的家兔发生了一起由多杀性巴氏杆菌引的起的急性败血性传染病。该病的主要特征是败血和内脏器官出血，现报告如下。

一、发病情况

该队原有大兔56只，注射过兔瘟巴氏杆菌、魏氏杆菌三联苗;1～2月龄的小兔36只，没有注射疫苗;6月初又新购进2月龄种兔20只。在7月6日新购进的小兔开始发病，当天死亡7只。截止7月14日，在4天的时间里，新购进的种兔全部死亡。在此期间，原有小兔也开始发病，并死亡14只，对原有小兔用青霉素、链霉素注射后，疫情才得到控制。

该队养兔共112只，大兔没有发病、死亡。小兔死亡34只，发病率为50%。

二、临床症状

发病初期，看不到明显症状，突然死亡。多数家兔精神萎顿，食欲废绝，呼吸急促，体温在4l℃以上;部分病兔鼻腔流粘液性或脓性分泌物。用前爪揉擦外鼻孔，伴有打喷嚏和鼻塞音，有的病兔头颈偏向一侧，四肢抽搐，临死前体温下降，全身震颤，尖叫数声后死亡。

三、病理变化

随机剖检4只，其中病兔2只，死兔2只，主要病变为：鼻孔周围皮肤发炎，鼻腔粘膜充血。红肿。有粘性、脓性分泌物。喉头、气管粘膜充血，气管内含有红色泡沫状粘液，胃肠粘膜呈出血性炎症。各脏器淋巴结出血、肿大。肺出血、水肿。肝肿大。有灰白色、针尖大小的坏死点，心肌、内外膜有大小小等的出血点。

四、实验室诊断

无菌采取兔的心血、肝、脾、肺等待检病料。

1.涂片镜检：将被检病料制成触片，美兰染色后镜检。可见两极着染的革兰氏阴性的球杆菌。

2.细菌培养：将被检病料接种于普通琼脂，血液琼脂和麦康凯琼脂平板上，37℃恒温培养24小时后观察：普通琼脂上生长的菌落形态为灰白色，针尖大小的菌落;血液琼脂上长出淡灰白色、露珠样，圆形的小菌落，不溶血：麦康凯琼脂上不生成。钩取可疑菌落接种天三糖铁培养基上37℃恒温培养24小时，其底部变黄。择取典型菌落涂片、染色、镜检，为革兰氏阴性，两极浓染的细小的球杆菌。

3.生化特性：钩取可疑菌落接种到生化反应管上，37℃24小时培养观察，该菌能分解葡萄糖、蔗糖、甘露醇，产酸不产气;不发酵乳糖、鼠李糖和麦芽糖，不产生出H2s。

4.动物试验：钩取血液琼脂上培养的菌落，悬浮稀释于2ml灭菌生理盐水中，取4只小白鼠，2只腹腔接种菌液，2只腹腔接种生理盐水。接种菌液的2只小白鼠18～24小时相继发病。主要症状为体温升高4l℃，呼吸急-促、咳嗽、喷嚏、流粘液性鼻液、食欲废绝、四肢抽搐、尖叫而亡。接种生理相加水的2只小白鼠健康存活。剖检死亡小白鼠，病变基本同前，取肝、脾、心血制触片，美兰染色，镜检，见有两极着色明显的球杆菌。

综合前述。确认兔发病死亡是由多杀性巴氏杆菌所致。

五、防治

1.剔除病兔、死兔，和粪便深埋，兔舍和用具用3%甲醛液彻底消毒。

2.对无病兔用青霉素、链霉素分两次进行预防注射。

3.对病兔用青霉素、链霉素进行治疗。每只每次为5万单位，肌肉注射，每日三次，连用4天，通过治疗，病兔症状缓解、消失。后对症状缓解的病兔重复用药一次，症状消失。20天后追访，未见复发。

六、讨论与小结

1.根据涂片镜检、细菌培养、生化特性、动物试验，结合流行病学。临床症状和剖检变化，将本病诊断为兔巴氏杆菌病。该病与兔病毒性出血症在临床症状、剖检变化上相似，容易混淆。应注意鉴别。

2.本病是由多杀性巴氏杆菌引起的水貂、兔、海狸鼠、貉等多种毛皮兽的急性败血性传染病，没有明显的季节性，多发生在春秋两季。从这次发病来看，该病具有发病急、病程短、发病率高的特点。因此及早确诊对控制本病危害有重要意义。

3.据调查，该队饲养点周围村庄和购兔的地方都未发现本病流行，可排除外来传染的机会。我们认为本病发生与气候变化、长途运输、饲养管理的改变有直接关系，发病前适逢多雨，兔舍潮湿而且管理条件差，促使兔抵抗力降低而遭致本病的侵害，引起内源性感染。

4.养兔是一项很有发展前途的多种经营项目，认为兔不易得病是一种偏见。事实上，兔对巴氏杆菌是易感的，不能掉以轻心。

5.据文献记载，本病对各种年龄兔均可感染发病。本报告仅l3月龄的小兔发病、死亡。未见大兔发病，可能与注射疫苗有关，待探讨。

6.治疗结果表明，青霉素、链霉素并用能控制本病流行，疗效较为理想。