分支杆菌1023株降解荧蒽研究

1 前言

多环芳烃 (P A H) 是一大类影响人类健康和生态环境的常见污染物。随着分子量的增高, PAH分子的毒性逐渐增强, 并且在环境中的持久性也随之增加[1]。因此, 人们特别关注4环以及以上的PAH的生物降解机制。在来自煤炭的含P A H污染物中, 荧蒽是其中最主要的一种高分子P A H, 在许多污染环境中普遍存在[2]。在荧蒽结构中, 存在一个五元环-该属性与一些重要的环境污染物如咔唑、二恶英以及二苯呋喃相似, 因此荧蒽常常用作高分子PAH降解研究的典型化合物[3]。本研究从海洋湿地中分离了一株荧蒽降解菌, 研究了其降解荧蒽的效率, 并探讨了荧蒽在其中降解的生化代谢途径。

2 材料与方法

2.1 试剂

荧蒽和丙酮购自Sigma-Aldrich公司。实验所用的基础盐培养基 (MSM) 为本实验室配制, 其成分为 (N H4) 2S O4, 1 0 0 0 m g L-1;K2HPO4, 800mgL-1;KH2PO4, 200mgL-1;MgSO4 (7H2O, 200mgL-1;CaCl2 (2H2O, 100mgL-1;and trace elements made up of FeSO4 (7H2O, 5mgL-1;MnSO4 (H2O, 3mgL-1;ZnSO4 (7H2O, 3mgL-1;CoSO4 (7H2O, 1mgL-1; (NH4) 6Mo7O24 (7H2O, 1mgL-1, NaCl, 2.5gL-1。所用盐类均为国产分析纯。

2.2 荧蒽降解菌的分离

取10g海洋湿地底泥, 添加10mLMSM, 加入终浓度为0.01mg/mL荧蒽。避光30oC振荡培养。每隔1周划线接种到添加荧蒽的营养琼脂培养平皿 (将1mL0.8mg/mL荧蒽的丙酮溶液均匀涂布在一块营养琼脂培养皿中, 置于通风橱内无菌挥发过夜) , 置于避光环境中3 0 o C培养7天, 分离带有降解圈的单菌落。分离的单菌落采用1 6 s r D N A法鉴定。通过PCR法克隆其16srDNA全长, 经T载体克隆后测序并采用B L A S T比对。根据序列最接近者确定分离菌株的属名。

2.3 荧蒽降解和代谢物分析

在20mL MSM中添加0.001mg/mL荧蒽, 加入0.1mL在MSM-荧蒽培养基中培养的菌液, 30oC避光振荡。在12h, 1, 2, 4, 7天分别取出三瓶。在中性条件下添加同等体积乙酸乙酯萃取两次后将有机溶剂部分浓缩为1m L。将中性萃取后水溶液部分用5 M H C l调节至pH2.5, 添加同等体积乙酸乙酯萃取两次, 浓缩至1 m L后获得酸性萃取物。将上述中性和酸性萃取物分别采用高效液相色谱-紫外 (H P L C-U V) 分析 (惠普1 1 0 0型) 。HPLC层析柱为C18柱。流动相为从45:55到95:5的甲醇-水溶液, 层析时间为30min。残留荧蒽和代谢物根据紫外广谱确认。

分别取上述中性和酸性萃取物200μL, 旋转蒸干后加入300μL乙腈和100μL BSTFA, 将其置于70oC衍生化60min。取0.5μL进样进行气象色谱-质谱 (G C-M S) 分析 (惠普5973型) 。色谱柱为30m长, 内径0.25mm。色谱升温条件为100oC1min, 15oC/min升至160oC, 再以8oC/min升至305oC并保持7min。进样器和检测器温度分别为280oC和300oC。扫描质荷比介于50-500 amu的碎片。

3 结果与讨论

3.1 降解菌的分离

采用荧蒽为炭源, 从海洋湿地底泥中分离获得一株淡黄色菌株。该菌株能够在荧蒽-琼脂培养板上形成降解圈, 表明该菌株可以降解荧蒽。经鉴定, 该菌株为分支杆菌属, 命名为Mycobacterium sp.1023。近年来, 分枝杆菌属菌株常常作为高分子P A H降解菌分离, 其中主要通过芘为炭源获得, 例如Mycobacterium sp.PYR-1, 和Mycobacterium sp.CP1 and Cp2[4,5]。在以荧蒽为炭源的分支杆菌主要有Mycobacterium sp.KR20[6], 其它的荧蒽降解菌以鞘氨醇单胞菌属 (Sphingomonas sp.) 降解菌为主[3,7]。

3.2 荧蒽降解

如图1所示, Mycobacterium sp.1023株迅速降解荧蒽。在12h中性萃取样品中已经有80%的底物荧蒽被转化, 在1d时即达到99%。与其它已报道的菌株相比[4,7], 该菌株降解效率更高, 表明其有良好的生物修复应用前景。

3.2 荧蒽代谢途径

通过HPLC分析, 我们在酸性萃取物中获得了一个关键代谢物—2, 3-二氢-二羟基荧蒽 (图2) , 该产物的紫外光谱与文献报道一致[6]。在P A H的生物降解过程中, 关键第一步的起始步骤常常是在芳烃双加氧酶的作用下生成顺式双羟基产物[8]。该产物的鉴定不仅证明了分离菌株能够降解PAH;并且, 由于PAH降解途径中的异构体较多, 通过识别顺式加双羟基的位点对分析代谢途径至关重要[8]。

尽管通过H P L C法仅鉴定出少量中间代谢物, 通过硅烷衍生化后经GC-MS检测获得了大量的可能中间代谢物 (表1) 。通过时间动力学分析, 我们发现, 其中大多数代谢物随着处理时间的延长而降低, 但有一种保留时间为23.7, 质荷比为320的中间代谢物呈现积累现象, 经分析其质谱谱图, 该产物与8-羟基-7-甲酯-荧蒽相似。

根据上述结果, 我们建议荧蒽在M y c obacterium sp.1023株中的降解途径。该代谢途径有两种起始方式, A通过生成2, 3位双羟基产物, 进而通过其它中间代谢物转变为儿茶酚, 最终进入三羧酸循环;对途径B, 我们仅检测到7, 8-二羟基荧蒽, 但并未检测到顺式-7, 8-二氢-二羟基荧蒽。7, 8-二羟荧蒽不能进一步发生开环降解, 而是主要生成甲酯化代谢物积累。因此, 可以推测, 第二条途径为类似于高等生物体内发生的解毒机制—首先通过细胞色素P450氧化, 生成反式7, 8-二氢-二羟基荧蒽, 该产物在脱氢酶作用下生成7, 8-二羟荧蒽, 进而通过第二阶段解毒机制, 发生甲基化结合反应排出胞外[9]。因此, 通过双加氧酶在2, 3-位催化氧化为荧蒽在Mycobacterium sp.1023中生物降解的主要途径, 也是该菌株利用荧蒽为炭源生长的产能途径;而7, 8-位是通过P450氧化酶的解毒途径, 是次要途径。

本研究我们发现了一株新的降解高分子PAH-荧蒽的分枝杆菌菌株。该菌株通过一条矿化途径和一条解毒途径快速转化荧蒽, 可以用于荧蒽污染严重的土壤和底泥的处理。

摘要：本文研究了从海洋湿地分离的一株分支杆菌 (Mycobacteriumsp.1023) 降解荧蒽的代谢过程。通过高效液相色谱和气象色谱-质谱连用技术检测和鉴定了荧蒽在该菌株中代谢的主要中间产物。结果发现该菌株可以利用荧蒽为唯一炭源生长。它通过两条途径代谢荧蒽, 其一能够完全将荧蒽转变为二氧化碳, 而第二条途径积累8-羟基-7-甲酯-荧蒽。

关键词：分支杆菌,降解荧蒽,研究

参考文献

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