纸层析法鉴定转氨酶的转氨基作用实验的新方法

2022-09-29

“纸层析法鉴定转氨酶的转氨基作用”是生物化学的一个基础性实验, 总结近几年的实验教学经验, 笔者发现过去的实验方法 (参阅徐州医学院生物化学实验教学用的《生物化学实验指导》) , 有几种实验试剂和几个实验步骤需要改进, 例如:实验试剂所用的展开剂 (酚水饱和液) 、用丙酮配制的茚三酮溶液等有毒试剂易挥发, 污染环境, 影响师生身体健康;实验步骤肝匀浆在沸水中加热10分钟等操作不方便, 且比较复杂、费时。针对上述问题, 结合我校实际情况, 笔者进行了大量的实验摸索, 找到了一种切实可行、又相对环保、效果良好的新实验方法。

1 材料和仪器

新鲜家兔肝脏0.5g、0.1mol/L丙氨酸溶液、0.1mol/Lα~酮戊二酸溶液、1%谷氨酸溶液、0.1mol/L (pH7.4) 磷酸盐缓冲液、0.5%茚三酮丙酮溶液、原展开剂 (苯酚、水) 、新展开剂 (正丁醇、冰醋酸、水) , 低速台式离心机、恒温循环水浴箱、匀浆器、红外线干燥器、微波炉、圆形定性滤纸 (直径9cm) 、三角烧瓶、康维皿、离心管、试管、喷瓶、牙签等。

2 实验方法

2.1 肝匀浆制备

取家兔一只, 放血后处死, 取出肝脏, 去除结缔组织, 立即用冷生理盐水洗去肝脏表面血液3~5次, 取肝0.5g, 剪碎后放入匀浆器, 加入0.1mol/L (pH7.4) 磷酸盐缓冲液1.0mL, 迅速研成匀浆后再加入pH7.4磷酸盐缓冲液3.5mL混匀后, 将肝匀浆液等份加入两个三角烧瓶内, 其中一份存放在冷藏箱内, 另一份用微波炉煮沸3~5次约5分钟 (旧实验将肝匀浆放入沸水中加热10分钟) 。

2.2 酶促反应过程

(1) 取两支离心管, 编号:a (测定管) 、b (对照管) , a管加入0.5mL肝匀浆, b管加入煮沸的肝匀浆0.5mL。 (2) 两管内依次各加入0.1mol/L丙氨酸溶液0.5mL、0.1mol/Lα~酮戊二酸溶液0.5mL、0.1mol/L (pH7.4) 磷酸盐缓冲液1.5mL, 摇匀。 (3) 两管均放到恒温循环水浴箱保温37℃, 1小时后取出。 (4) 旧方法把测定管放到沸水浴中煮沸5分钟, 取出冷却;新方法可省略此步骤。 (5) 两管皆离心3500rpm5分钟, 把上清液分别加入两支小试管中, 标清管号, 供层析用。

2.3 标记

用肥皂水把手洗干净, 操作中尽可能少用手接触滤纸, 以免污染滤纸;取出滤纸一张放在干净的白纸上, 以圆点为中心, 约0.6cm半径, 用铅笔轻轻划圆线作基线, 在线上四等分处标清四点标号做为点样原点, 在各点对应滤纸边缘标上“测”、“对”、“谷”、“丙”字样, 以免混淆。

2.4 点样

旧方法用4根毛细管分别沾取对照管、测定管、谷氨酸、丙氨酸在滤纸相应的点样原点点样, 经实验我们发现点1滴液体过多, 样品扩散的位置过大。新方法改用10uL的微量进样器, 每滴5uL, 标准样各点2滴共10uL, 这样每滴的量较小, 量也好控制, 而且点样均匀, 层析效果很好[1]。

2.5 层析

先用牙签在滤纸圆心处轻轻打一小孔 (铅笔芯粗细) , 再取同样滤纸一条 (约2×2cm) , 卷成灯芯状, 上端插入滤纸中心孔中。取5个直径8cm的98干燥的康维皿, 向其内室中分别加入不同的展开剂10mL, 即酚∶水溶液饱和液和正丁醇∶冰醋酸∶水溶液 (3∶2∶1, 4∶1∶2, 4∶2∶3, 4∶2∶4四种比例) 。把滤纸平放在上述康维皿上, 使纸芯下端浸入展开剂溶液中, 盖上康维皿盖[2]。旧实验方法在常温下层析 (约40分钟) , 新方法将康维皿放在红外线干燥器中层析 (约15分钟) , 层析结束, 取出滤纸, 原实验方法用吹风机吹干滤纸 (约5分钟) , 新实验方法将滤纸放入干燥器内烤干 (约2分钟) 。

2.6 显色

旧方法用喷瓶向上述滤纸上均匀喷上0.5%茚三酮丙酮溶液, 用吹风机吹干滤纸, 可见出现同心弧紫色斑。新方法将一定量的茚三酮加到展开剂中[3] (值得注意的是用展开剂配制茚三酮溶液时, 如果配好展开剂后再放入茚三酮, 则茚酮不容易溶解, 由于茚三酮溶于正丁醇, 所以可先将茚三酮称量好, 放入小烧杯, 用正丁醇溶解, 再转入试剂瓶, 最后加入其他试剂, 摇匀即可。) , 故从干燥箱内拿出时即出现同心弧紫色斑, 用铅笔圈下各色斑, 比较色斑的位置及颜色深浅, 并计算各色斑的Rf值, 以此判断结果。其计算公式如下:Rf=溶质层析点中心到原点中心距离 (X) /溶剂前沿到原点中心的距离 (Y)

3 结果

运用公式Rf=溶质层析点中心到原点中心距离 (X) /溶剂前沿到原点中心的距离 (Y) , 计算各色斑的Rf值, 以此判断结果, 见表1。比较滤纸上色斑位置及颜色深浅可以看到, 展开剂酚水饱和液与正丁醇∶冰醋酸∶水溶液 (3∶2∶1) , 这两张滤纸转氨基效果较明显, 且Rf值很接近, 而正丁醇∶冰醋酸∶水溶液 (4∶1∶2) , 正丁醇∶冰醋酸∶水溶液 (4∶2∶3) , 正丁醇∶冰醋酸∶水溶液 (4∶2∶4) 这三张转氨基效果不明显。

4 结语

(1) 制备煮沸肝匀浆时, 旧方法将肝匀浆放在沸水中加热10分钟, 新方法用微波炉煮沸3~5次 (约5分钟) , 酶促反应过程中, 旧方法把测定管放在水浴中煮沸5分钟, 而新方法省去此步骤, 相比较新方法节省了时间和能源, 且不影响实验结果。

(2) 新旧展开剂的比较, 旧展开剂配方为苯酚和水, 苯酚对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用, 可抑制中枢神经或损害肝、肾功能, 人们长期接触苯酚可引起头痛、头晕、咳嗽、食欲减退、恶心、呕吐、皮炎, 严重者引起蛋白尿等慢性中毒。另外, 苯酚价格较贵, 浪费实验经费, 且配制试剂时, 苯酚常温下是固体状态, 需加热溶解后, 才能配制展开剂;实验过程中, 苯酚易挥发, 对环境污染严重, 影响人类生产和生活。新展开剂的配方为正丁醇、冰醋酸和水, 几乎不损害人体健康, 不污染环境, 常温下成液体状态, 可以直接配制展开剂, 节省了很多实验时间。

(3) 层析。旧方法在室温下进行层析, 用时较长, 而新方法在干燥器内层析, 由于温度较高展开剂扩散较快, 且基本不影响实验结果, 节省了大量时间。另外, 原实验用吹风机吹干滤纸, 由于吹风机声音较大, 不适合在实验室使用, 而干燥器避免了这种情况。

(4) 显色。旧方法将滤纸从康维皿内取出后, 用铅笔标出前沿位置, 用吹风机吹干, 以质量分数0.5%的茚三酮丙酮溶液喷雾, 再用吹风机吹干后显色, 经实验发现喷雾不好掌握, 如果喷雾不均匀, 显色效果不好, 而且喷雾用的喷瓶也不是实验室常用仪器, 另外由于配制茚三酮溶液用的是丙酮, 丙酮容易挥发, 污染环境, 并且不利于师生身体健康。新方法将显色剂茚三酮加入展开剂中, 用展开剂配制成质量分数0.5%的茚三酮溶液, 即100mL的展开剂加入0.5g的茚三酮, 等层析结束后, 将滤纸取出, 用铅笔标出前沿位置, 再将滤纸放到干燥器烤干即可显色, 不用喷雾, 节省了时间, 也没有有毒物质的危害, 且达到了实验的预期效果。

综上, 笔者认为通过改进实验方法, 使原来既污染环境、危害人体健康, 又浪费时间的实验基本上变成了一个绿色实验, 也节省了很多时间, 所以, 此实验方法是一个值得在高校生物化学实验室推广的新实验方法。

摘要：通过对展开剂配方、层析温度、显色方法等研究, 解决了原实验既污染环境、危害人体健康又浪费时间的问题, 从而找到了纸层析法鉴定转氨酶的转氨基作用实验的新方法。结果表明, 此方法简单易行, 耗费低廉, 基本上不污染环境, 是一个值得在高校生物化学实验室推广的新实验方法。

关键词：展开剂,转氨基,新实验方法