抗病类基因

抗病类基因（精选三篇）

抗病类基因 篇1

关键词：抗病育种,候选基因,畜禽

畜禽抗病育种有着巨大的潜在经济效益及应用前景。国外学者早在20世纪80年代初就相继提出了基因工程抗病育种的设想, 国内的畜禽抗病育种进程也随着分子生物学和分子遗传学及基因工程技术的发展日益完善。在过去的研究中发现, 很多畜禽疾病的发病机制受单基因或多基因控制, 即畜禽对某些疾病存在完全或部分抗性。目前, 为解决困扰畜禽生产的畜禽疾病问题, 人们尝试通过遗传手段来提高畜禽自身的抗病力, 使畜禽少发病, 从而达到控制疾病、减少药物残留的目的。

1 抗菌肽或蛋白类基因

抗菌肽或蛋白类基因编码的产物在动物机体天然防御中起着很重要的作用。这类基因的突变会引起表达产物结构功能或在体内含量的变化。如果这些变化引起的是机体天然抗菌活性的增强, 那么机体则表现出对某些病原菌的抗性。

1.1 主要组织相容性复合体 (MHC) 等位基因

MHC是参与调节机体免疫反应的基因群, 它是一种白细胞抗原系统, 其中有多对等位基因与抗病性有关, 其编码区和调控区都显示有丰富的多态性, 不同基因型显示与某些疾病的抗性有关。研究证实MHC基因与鸡马立克病、罗斯肉瘤病、禽霍乱和淋巴白血病的抵抗力有关。Kaufman J等对鸡B复合体的研究证实, 免疫应答与抗病力有关。此外, 研究还表明Rfp- Y单倍型对马立克病也有影响。在鸡的其他MHC单倍型中, b2、b6、b14有较弱的马立克病抗性, 而b3、b4、b5、b13、b15则与马立克病的敏感性有关。这些研究成果使人们能够通过分子标记辅助选择等方法定位抗病基因并寻找与其连锁紧密的分子标记, 从而快速、高效地培育抗病品系。猪的MHC又叫猪白细胞抗原 (SLA) 复合体, 结构和功能与人的类似。1989年, Lacey C等测定了4周龄和8周龄的NIH小型猪SLA噬菌作用和单核细胞杀灭沙门杆菌和葡萄球菌作用, 发现SLA对细菌的吸收、杀灭作用显著, 而且已经证实NIH小型猪对线虫类旋毛虫具有抗性。

1.2 杀菌通透性增强蛋白 (BPI) 基因

BPI基因是人和哺乳动物内源性阳离子蛋白质, 存在于多形核白细胞的嗜苯胺蓝颗粒中, 由Weiss等最先从人中性粒细胞中分离纯化得到, 具有很强的杀革兰阴性菌活性、中和内毒素活性和调理作用。我国学者周红等[1]在国外人医研究基础上成功地从猪嗜中性粒细胞 (PMN) 中提取并纯化了猪源BPI, 通过对其体内外生物活性的研究, 显示猪源性BPI具有中和内毒素、革兰阴性菌的作用。Christopher K T等分别在约克、汉普夏、杜洛克、长白、大白、野猪和眉山猪中, 检测到BPI基因外显子4, 10分别存在AvaⅡ和HpaⅡ酶切多态性, 通过攻毒试验发现, 基因型与猪沙门杆菌的易感性有关, 因此把BPI基因确立为抗病育种候选基因。国内安徽农大的祁克宗等[2]通过RT-PCR技术从鸡PMNs细胞mRNA中成功地扩增获得了目的基因片段, 然后筛选重组子进行鉴定, 测序结果经与GenBank预测的红原鸡BPI序列比对, 发现在扩增的序列中仅有3个碱基不同, 核苷酸同源性98%, 氨基酸同源性100%, 构建了鸡BPI克隆载体pMD18-BPI, 为今后该基因的融合表达及生物制剂的研制提供了条件。

1.3 天然抗性相关的巨噬蛋白 (Nramp1) 基因

Nramp1基因是Nramp基因家族的一个成员。Sun H S等研究发现测试猪品种中的Nramp1等位基因频率差异很大, A等位基因仅在母系 (白色) 中存在, 相应的C等位基因只在公猪品种中存在。猪的不同Nramp1基因型与抗病力差异之间的关系及对不同病原菌显示的抗性还需进一步研究。以Nramp1基因作为猪抗病力候选基因的研究中, Christopher K T等发现Nramp1基因存在5个多态性位点, 通过攻毒试验发现基因型与猪沙门杆菌的易感性有关。吴宏梅[3]对猪Nramp1基因PCR-RFLP多态性与免疫指标、生产性状的相关性进行分析, 结果表明Nramp1基因第6个内含子的突变对免疫功能及生产性状有影响, 可作为有价值的抗病力候选基因。由于Nramp1基因具有天然抵抗胞内微生物的作用, 基因的突变可能影响动物个体的抗病力。1995年, Vidal S M等用病原菌侵染小鼠时发现, Nramp1基因突变导致小鼠在感染早期免疫力低下。Hu J等在研究鸡Nramp1基因与沙门伤寒菌感染的关系时发现, 编码区序列有11处核苷酸突变, 其中3处引起了氨基酸的替换, 第696位的突变Arg→G1n只发生在易感系。吴宏梅研究也发现, Nramp1基因蛋白可抵抗分枝杆菌、沙门杆菌等多种胞内寄生病原菌的侵染而发挥重要的免疫功能。

1.4 干扰素 (IFN) 基因

IFN是动物机体内可被多种诱导物诱导产生的生物活性蛋白。IFN产生后与应答细胞的表面受体结合, 触发多种生物效应, 如抗病毒、免疫调节、抗增生等。Young H A等将基因质粒导入小鼠受精卵, 表达后获得抗病转基因小鼠。体内外试验结果表明, 猪INF对传染病病毒具有防御和抑制作用。猪INF-γ可以抑制蓝耳病病毒的复制, Suradhat S等进行动物体内试验, 结果表明同时注射猪瘟疫苗和干扰素可增强对猪瘟病毒的防御能力;Bautista E M等用IFN2γ处理感染繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 的猪巨噬细胞, 可抑制PRRSV增殖。

1.5 白细胞抗原 (Mx) 基因

Mx蛋白是由Ⅰ型干扰素诱导宿主细胞所产生的抗病毒蛋白中的一种, 广泛存在于人、哺乳动物、家禽和鱼类各种组织细胞质及细胞核中, 具有广泛的抗病毒作用和GTP酶活性。Lindenmann J[4]首先在小鼠中发现, 因其能抵抗黏液病毒而命名为Mx基因。有关猪Mx1蛋白抗病毒活性及多态性研究的试验显示, 其具有抵抗某些特定病毒感染的功能。Chung等通过对急性感染猪繁殖呼吸综合征病毒的猪细胞INF-α和Mx1的表达研究发现, INF-α和Mx1对宿主早期抵抗PRRSV感染有很重要的作用。Nagata K等在不同猪种中检测到Mx1基因14个外显子中分别存在一个缺失和一个点突变, 因此认为产生缺失和突变有可能成为一种抗黏液病毒的基因型。在人和小鼠中, 位于细胞质和细胞核中的Mx1蛋白显示出不同的抗病毒活性。Jae hong K等研究发现鸭的Mx蛋白无抗病毒活性, 鸡的Mx蛋白的抗病毒活性受631位氨基酸的影响, 当631位氨基酸为天冬酰胺时有抗病毒活性, 为丝氨酸时则无抗病毒活性。倪黎纲等对鸡Mx蛋白基因的cDNA进行PCR诱变, 构建了表达鸡Mx蛋白的重组真核表达载体。诱变修饰重组Mx蛋白具有较强的抗新城疫病毒生物活性, 为进一步研究禽类Mx蛋白的抗病机理奠定了基础。

2 其他相关抗病育种的候选基因

2.1 Ⅰ型兰尼定受体 (RYRI) 基因

猪应激综合征是由RYRⅠ基因控制的一种单基因隐性遗传病, 可导致猪的应激死亡和产生灰白水样肉。分子检测发现, 其cDNA上的第1 843位碱基由C突变成T, 造成编码氨基酸由Arg 615变成Cys 615, 引起其结构和功能的改变。当应激发生时, Ca2+大量非正常释放, 引起肌肉持续收缩, 因而产生应激综合征。该位点突变导致限制性内切酶酶切位点由HhaⅠ (5′-GCG↓C-3′) 变为HgiAⅠ (5′-GTGCT↓C-3′) , 因而可通过酶切图谱鉴别氟烷基因型。这对生产上消除氟烷基因影响很有意义。

2.2 FUT1基因

Qi Shun S等发现仔猪断奶后发生的腹泻和水肿病主要是肠毒性大肠杆菌引起的细菌性疾病, 死亡率可达11.5%～29.5%, 对养猪业造成较大的危害和损失。其中, F18是重要的致病菌, 它与猪小肠黏膜上皮细胞刷状缘的F18受体结合, 大量繁殖、释放肠毒素而引起仔猪疾病。Vogeli用候选基因法进行连锁分析表明, FUT1是控制F18黏附的候选基因。该基因位点有一对等位基因, 是能与F18黏附素结合的敏感性基因, 呈显性遗传;反之则为抗性基因, 呈隐性遗传。

2.3 抗禽白血病病毒 (ALV) 基因

Daniel等研究得出ALV是通过特定膜蛋白作为受体位点吸附进入细胞的, 其中ALV-A型受体为Tva, 相应的编码基因属于低密度脂蛋白受体家族成员, ALV- B、抗禽白血病病毒基因 (ALVD) 、ALV-E亚型受体Tvb相对应的编码基因是肿瘤坏死家族的成员, ALV-C亚型的受体是Tvc。通常易感鸡DT40细胞能通过同源重组使Tvc等位基因断裂而抗ALV-C的感染。Tvc基因突变的L15鸡能抵抗ALV-C感染。Zekarias等证明, 一些内源性反转录病毒基因表达的膜糖蛋白可阻断ALV受体, 使机体对ALV产生抗性。这给笔者提供了一个思路, 通过转基因的方法破坏或改变Tv基因的表达, 可以培育出抗ALV相应亚系的鸡品系。

除了以上基因外, 其他的蛋白类基因如富含保守的胱氨酸防御素超家族、Cathelicidins家族等是否也可作为畜禽抗病育种的候选基因, 有待进一步研究。

2.4 Toll样受体 (TLR) 基因

TLR蛋白最早是在果蝇体内发现的, 它是果蝇胚胎发育过程中必需的蛋白。后来发现该蛋白还具有受体功能, 能感受到入侵的病原体, 并且在此基础上使果蝇分泌多种抗微生物感染的多肽以清除病原体[5]。Medzhitov R等首次发现与果蝇同源的人Toll 蛋白, 并命名为TLR。TLR能识别病原体, 在病原体入侵机体的早期即启动天然免疫, 提示其在机体抗感染中的重要作用[6]。

综上所述, 基因对提高畜禽机体在抗某些遗传缺陷病及抵御病原微生物感染的天然防御中起重要的作用。而这些基因缺失或突变的个体, 分别表现出对某些疾病的抗性。目前, 抗病基因研究已取得一定进展, 但还不够深入, 现在研究还只是初步的试验阶段, 更深入地研究这些候选基因, 通过免疫学与分子生物学的结合将进一步促进畜禽抗病育种技术的发展和完善, 建立畜禽持久的抗病力, 这是疾病预防工作的根本。

参考文献

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抗病类基因 篇2

论文中英文摘要

作者姓名：丁新华

论文题目：水稻抗病相关基因的分离克隆和功能鉴定

作者简介：丁新华，男，1980年06月出生，2002年09月师从于华中农业大学王石平教授，于2008年06月获博士学位。

中

文

摘要

水稻白叶枯病和稻瘟病分别是由白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae, Xoo）和稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）引起，是世界水稻生产中的两大重要病害，造成巨大的损失。通过改良水稻自身防御体系来有效的控制病害，是一种即经济又“绿色”的方法。鉴定水稻抗病相关基因，研究水稻抗病机理对改良水稻有着重要的科学意义和应用前景。

植物激素生长素诱导的信号通常被认为调节植物的生长和发育。本研究报道的水稻基因GH3-8是一个生长素反应基因，在依赖于生长素的发育中发挥功能，同时也调节不依赖于水杨酸和茉莉酸的信号路径的抗病反应。白叶枯病病菌诱导水稻至少在被侵染部位合成生长素，而生长素继而诱导水稻大量合成松弛细胞壁的蛋白质－伸展蛋白（α-和β-expansins），破坏细胞壁对病原菌的先天屏障作用，以利病原菌在水稻中生长繁殖。在携带有抗病基因Xa21或Xa26抗病水稻品种中，病原菌引起的水稻感染部位生长素的合成可诱导水稻快速合成IAA酰胺合成酶GH3-8。GH3-8通过催化IAA－氨基酸的合成抑制生长素的作用，从而阻止细胞壁的松弛，增强植物对病原菌的自身免疫功能。超量表达GH3-8基因增强水稻对白叶枯菌的抗性，同时也延缓了植株的生长和发育，至少部分因为抑制了生长素信号从而抑制了α-和β-expansins。本研究结果揭示了病原菌利用生长素作为毒性因子侵染水稻的机理、以及水稻应对这一毒性因子的调控途径，同时也从一个方面解释了植物在抗病反应中通常要付出生长被抑制的代价的原因。

超量表达GH3-8导致植株不育。通过正反交试验显示GH3-8超量表达植株是雄性和雌性都不育。通过形态学观察发现GH3-8超量表达植株的雌蕊柱头发育不正常；通过激光共聚焦显微镜对雌蕊胚囊观察发现，GH3-8超量表达植株的成熟胚囊发育不正常，这可能是GH3-8超量表达植株雌性不育的原因。通过形态学观察发现GH3-8超量表达植株的雄蕊和野生型无异，但花粉碘染显示GH3-8超量表达植株大部分花粉都败育，这可能是GH3-8超量表达植株雄性不育的原因。通过分析GH3-8基因表达模式显示GH3-8基因特异在雄蕊高表达，并随着花的发育表达强弱也不断变化，而在雌蕊基本检测不到表达。组织和时间的特异表达也印证了GH3-8在调控花的发育中作用。利用酵母单杂交技术，筛选得到和GH3-8基因启动子互作的几个生长素反应因子。其中OsARF8超量表达激活GH3-8基因的表达，证明OsARF8是调控GH3-8基因表达的转录因子。通过分析OsARF8基因表达模式显示OsARF8基因特异在雌蕊高表达，而在雄蕊表达很低。OsARF8基因超量表达植株和野生型植株相比育性下降。花粉碘染显示OsARF8基因超量表达植株大部分花粉败育；检测雌蕊没有发现和野生型有显著

差异。花粉的育性下降可能是OsARF8超量表达植株育性下降的原因。生长素信号路径中的基因（OsARF8和GH3-8）的不正常表达影响了水稻育性，说明生长素信号可能在调控水稻育性中有重要作用。检测水稻穗发育中生长素分布也显示生长素和穗的发育密切相关。

在水稻品种明恢63中抑制一个维生素B1合成基因OsDR8的表达，显著提高了转基因植株对白叶枯病和稻瘟病的敏感。外源应用维生素B1可以互补抑制OsDR8基因对水稻植株抗病的影响。几个防御反应基因包括防御信号路径的早期功能基因OsPOX和OsPAL基因以及路径下游基因OsPR1a、OsPR1b、OsPR4、OsPR5 和OsPR10的表达在OsDR8抑制表达的植株中下降。这些结果说明OsDR8影响植株的抗性可能是通过影响防御反应基因的表达，OsDR8的功能在信号路径的上游。另外，维生素B1的积累可能是水稻植株对白叶枯病和稻瘟病的抗性所必须的。

通过筛选水稻T-DNA插入突变体库，发现一个类病斑突变体。侧翼序列分析显示T-DNA插在一个基因（命名为OsDR9）的开放读码框。预测的OsDR9基因编码由180个氨基酸组成的功能未知蛋白。OsDR9基因在茎和幼穗中表达很低，而在幼苗、剑叶、叶鞘和愈伤表达较高，在根中没有检测到表达。另外OsDR9基因在老叶中比新叶表达更高。突变体对稻瘟病和胡麻叶斑病表现高抗。对有类病斑的叶片进行组织化学检测和DNA断裂分析显示细胞死亡具有凋亡特征。病程相关蛋白PR4和PR8以及稻瘟病相关基因AOS2在突变体中上升表达。突变体植株也积累了自发荧光物质、SA、JA和植保素（momilactone A 和 sakuranetin）。突变体提高了超氧化物和H2O2的水平。将一个来源于水稻品种日本晴的包含有OsDR9基因的10.5kb片段转入突变体02Z15AM37，转基因植株类病斑表型消失，说明由于T-DNA插入导致的OsDR9突变是是引起类病斑表型的原因。这些结果说明OsDR9是水稻抗病和细胞凋亡的一个负调节子。

关键词：

水稻；白叶枯病；稻瘟病；抗病相关基因；生长素；水杨酸；茉莉酸；基础抗性；发育；伸展蛋白；GH3；维生素B1；类病斑突变体；凋亡；植保素；活性氧物质

Isolation and Functional Characterization of Pathogen-induced Defense-responsive Genes of Rice

Xinhua Ding

ABSTRACT Rice bacterial blight disease caused by Xanthomonas oryza sative pv.oryza and fungal blast disease caused by Magnaporthe grisea, are two of the most devastating diseases of rice worldwide.These two diseases cause tremendous yield loss each year.Efficient control of disease through improving rice defensive system is economic and green way.Characterizing rice disease resistance related genes and elucidating the mechanism of rice disease have important significance in science and application for improving rice.The signaling induced by the plant growth hormone auxin is generally recognized to regulate plant growth and development.Here we report that rice GH3-8, an auxin-responsive gene functioning in auxin-dependent development, activates disease resistance in a salicylic acid– and jasmonic acid–signaling-independent pathway.Bacteria induce accumulation of indole-3-acetic acid(IAA), the major type of auxin, in rice.IAA induces the expression of α-and β-expansins, the proteins that are known to loose cell wall, the native barrier of biotic intruder, to facilitate the growth of cells.In resistance rice variety carrying Xa21 or Xa26, the infection of bacteria induce rice to synthesize GH3-8 in infection site of rice.GH3-8 encodes an IAA-amino synthetase that prevents free IAA accumulation and looseness of cell wall.Overexpression of GH3-8 results in enhanced disease resistance and retarded growth and development, which is at least partly due to inhibiting the expression of α-and β-expansins via suppressing auxin signaling.Here we show the mechanism of bacteria hijacks auxin as virulence factor to infect rice, and the regulating pathway of rice to the virulence factor;in addition to, explain the cause that plants growth was restrained in disease resistance.Overexpression of GH3-8 results in sterility of plants.Analysis of forward cross and reverse cross showed that GH3-8-overexpressing plants were male sterility and female sterility.We found that the stigmas of GH3-8-overexpressing plants are abnormal by morphological observation.We observed the mature embryo sac of GH3-8-overexpressing plants using laser scanning confocal microscopy.The result showed that the mature embryo sacs of GH3-8-overexpressing plants were abnormal.This may be the reason of female sterility.No obvious difference was observed in stamen between GH3-8-overexpressing plants and wide type in stamen, but the most of pollen of GH3-8-overexpressing plants were sterile.This may be the reason of male sterility.GH3-8 had high expression level in stamen, and the expression of GH3-8 changes as the development of flower.Tissue and time differential expression confirmed the role of GH3-8 in regulating flower development.We gained several auxin responsive factors(ARFs)that interacted with the promoter of GH3-8 by analysis of yeast one hybrid.Overexpression of OsARF8 in Mudanjiang 8 activated the expression of GH3-8.This result suggested that OsARF8 is the transcription factor in regulating the expression of GH3-8.OsARF8 had high expression level in pistil, and very low expression level in stamen.GH3-8-overexpressing plants had lower fertility than wide type.The most of pollen of OsARF8-overexpressing plants were sterile.The overexpression of Auxin signaling genes(OsARF8

抗病类基因 篇3

摘要:简述了植物抗病基因的结构特点,介绍了利用RGA法克隆的抗病基因同源序列及其应用,对RGA法的应用前景进行了展望。

关键词:RGA;抗病基因;结构域

中图分类号:Q78文献标识码: A 文章编号:1006-6500(2009)01-0010-03

Research Advance on Disease-resistant Gene of Plant by RGA Labeling

ZHANG Rong,CHEN Ou,WANG Zhen-ying

(Tianjin Key Lab of Cyto-genetical and Molecular Regulation,College of Chemistry and Life Science,Tianjin Normal University,Tianjin 300387,China)

Abstract:The structure characteristics about plant disease-resistant gene was summarized, the same sequences of cloned disease-resistant genes by RGA and its applications were introduced. At last, the application prospect of RGA was expected.

Key words: RGA;resistance gene;construction domain

植物在长期的发展进化过程中,不可避免的会遭到各种病害的侵袭,在不断地抵抗其危害的过程中,植物本身形成了一套比较完整的抗病基因序列,然而在不同的植物品系之间,这类抗病基因之间存在着很大的同源性,这类基因被通称为植物抗病基因(Resistance gene,R基因),并在1992年被首次克隆成功[1]。针对作物、园艺等不同方面的需求,人们对大量植物种类进行了广泛的实验验证,均证明植物的抗病基因同源性确实存在且相对稳定,这逐渐成为实验研究的一种重要引证和新的实验方法的源泉。

1 植物抗病基因的结构特点

R基因是在植物抗病过程中抵抗病菌浸染及扩展的有关基因,也就是Flor经典遗传学的基因对基因(gene-for-gene)假说中所指的与病原菌无毒基因相对应的基因,存在于植物的特定品种中,在植物生长的整个周期或其中某个阶段表达的植物抗病品种所特有的一类基因。研究表明,这些抗病基因的氨基酸序列之间具有较高的同源性。

1.1 NBS-LRR结构域的特点

富含亮氨酸重复序列(Leucine Rich Repeats, LRR),与蛋白质之间的互作及信号的转导存在密切的联系,包括两种:一种存于细胞外,一种存在于细胞内。核苷酸结合位点(Nucleotide Binding Site, NBS)—真核生物中具有结合ATP和GTP活性的蛋白,含有三个保守的特征结构域,一是激酶la,即磷酸结合环(P-loop),二是激酶2,三是激酶3a,这两类保守的区域多同时存在,形成抗病基因的保守结构域,大多数已克隆得到的R基因都有NBS-LRR区域。2004年孙学辉等人利用HMM(Hidden Markov Model)对源于日本晴的粳稻基因组和9311的籼稻基因组的蛋白数据库进行了搜索,分别获得了325个和344个富含NBS-LRR类抗病基因的蛋白序列,并得到了与它们相对应的cDNA序列。它们的共同特点是:在它们编码蛋白的近N端存在NBS,而在它们的近C端则存在LRR[2]。

1.2 TIR、STK及LZ结构域的特点

与果蝇Tol1蛋白及哺乳动物白细胞介素-1受体的细胞外相似的区域(TIR),在植物内部免疫反应过程的信号转导中起作用。它们能够与相应的免疫反应的启动子相结合,从而使相关的基因表达,以达到对病原物的抗性作用[3]。此外,还包括丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶(Serine/ Threonine Kinase, STK)和亮氨酸拉链结构(Leucine Zipper, LZ)等结构域,其中STK包含两个特征结构域,即DaKXXN和GTaGYXAP(N/E)[4],在抗病过程的信号转导途径中,此种激酶借助磷酸化其它的信号分子而达到传递其抗性信息的目的。而LZ则是存在于蛋白质一侧的亮氨酸残基结构,每7个氨基酸形成一个重复,而在最后一位上则是亮氨酸或异亮氨酸,在形成二级结构的α-螺旋时,借助疏水作用两两相连而形成类似于拉链的结构[5]。针对这样的特点,RGA方法应运而生,通过R基因的保守结构域扩增分离RGA,目的是为了找到更接近于R基因的分子标记并得到更新的植物抗病基因。作为一种简便易行的分子标记方法,RGA逐渐被大家认可并广泛地应用于抗病基因的寻找过程中。

2 利用RGA法克隆的抗病基因同源序列及其应用

2.1 RGA技术原理及其特点

RGA分析主要是针对抗病基因的表达产物存在保守区域的特性,人工合成相应的简并引物,进而以植物的总体DNA或cDNA为模板进行PCR扩增,分离出与其他植物或本种类植物与抗病基因类似的序列,再以PCR扩增所得的产物作为探针,运用RFLP等其他的分子标记方法进行分析,将该克隆产物进行定位,通过在抗病的近等基因系文库内进行筛选,获得试验预期的抗病基因的克隆产物,或进一步明确这些新获得的基因与已知的抗病基因间的连锁关系,从而为接下来的克隆或转化该基因奠定了一定的基础。

RGA既可以是一种DNA 的分子标记,也可以是个体本身所携带的特异抗病基因,在植物中是普遍存在的,多以成簇的方式随机分布于植物基因组中。它与R基因间可能存在3种关系:第一,分离的RGA可能本身就是一种新的R基因;第二,分离的RGA可能是已经得到的某种R基因的紧密连锁;第三,还有一种可能就是分离的RGA与R基因根本没有关系,只是在某些非主导型序列上存在相似性而已,因此分离后期的连锁性鉴定就显得尤其重要了。早期的RGA主要是从基因组DNA 中得到的,不可避免地会受到DNA中大量存在的非表达区域和重复区域的干扰,进而影响克隆的效果而得到错误的结果。近些年来,研究者逐渐改为从cDNA中克隆得到RGA,再利用特异引物返回到基因组DNA 中获得基因全长。

虽然在之前的工作中采用RGA法已经在抗病基因克隆方面取得了较好的成绩,但是此种方法还存在自身的缺陷:(1)NBS、LRR和STK等保守序列并非只存在于抗性基因中,导致分离得到的RGA并不是都与R基因有关,使得克隆R基因的过程变得复杂;(2)克隆所需的引物在设计时要考虑到抗病基因中的较高同源性,引物设计的好坏严重影响PCR产物的实用效果;(3)因R基因在植物中多以成簇的方式存在,因此所得到的与其连锁的RGA,还要在基因簇中进行筛选,而不是全部接受整个基因簇的基因。

2.2 RGA方法的应用

RGA标记与一般的分子标记如RAPD或RFLP相比,存在其自身的优越性,不仅用于揭示品种的遗传差异,而且还可以反映品种的功能,有助于选择品种组合和控制病害。它的应用主要包括:首先,可以作为分子标记用于抗病基因的标记;其次,构建连锁的遗传图谱和辅助植物的抗病育种;再次,RGA也可作为探针用于基因组文库的筛选或抗病基因的克隆;此外也有直接应用RGA 的简并引物分析种质资源间的遗传关系的。

目前,RGA分子标记的方法已经在多种植物中广泛应用,分离得到的RGA在GeneBank上记录的已达到200多种。涉及的植物种类广泛,主要集中在水稻、麦类等粮食作物中。随着分子生物学技术的飞速发展,植物的抗病性逐渐被大量地应用于育种实践中,进而避免化学药物防治对环境和人类造成的破坏和危害。

首先,水稻作为我国的首要粮食类作物,针对其易感染的叶枯病[6]、稻瘟病[7]等主要病害而进行的抗病基因同源序列分析,目前已经成为许多研究者的实验重点,旨在获得更接近于R基因的抗病基因序列,从根本上提高其抗病性,进而提高水稻的产量和质量。

其次,小麦作为仅次于水稻的第二类主要作物,研究其抵抗病害的基因作用原理也具有深远意义。麦类作物普遍感染的叶锈病、白粉病[8],已经成为困扰广大科学家和全国粮农的首要病害,寄希望于找到更好的抗病基因从而较为彻底的解决此类问题。在麦类植物中应用抗病基因同源序列法,也已经在一定程度上取得了骄人的成绩。胡楠等人[9]针对抗白粉病基因Pm4b进行的RGA分析,获得了稳定的长度为1 321 bp的RGA序列的多态性条带。

另外,利用抗病基因同源序列法在拟南芥、番茄、大豆等的R基因中都成功地建立了特异的分子标记。几种典型植物的抗病基因同源序列见表1。

3 RGA研究展望

RGA法作为近些年发展起来的新型分子标记方法,凭借其简便的技术以及与抗病基因的较高相关性,已得到诸多科学工作者的认可和支持,获得了不同植物的大量RGA,为进一步的实用价值的创造提供基础。通过分离RGA的方法克隆R基因或得到与R基因紧密连锁的分子标记,特别是针对复杂的基因组来说,是相对简便的一种标记方法。在接下来的研究中应当努力克服其各方面的缺陷,结合其他更加先进的分子生物学技术,从植物体内获得更多的RGA,进而获得更加有效的植物抗病基因,为植物育种做出更进一步的探索。

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