拟南芥在植物抗病性分子机制研究中的作用

拟南芥在植物抗病性分子机制研究中的作用（精选8篇）

篇1：拟南芥在植物抗病性分子机制研究中的作用

植物凝集素及其在抗病虫害分子育种中的应用

文章简要介绍植物凝集素的抗虫特点,并与其他类型的.抗虫基因进行了比较;对目前研究较多、应用前景较好的植物凝集素的性质、抗虫性、转基因植物的抗虫性等研究进展作了阐述;并对植物凝集素在抗虫转基因工程中的应用现状和前景进行了讨论.

作 者：侯学文 黄剑威 HOU Xue-Wen HUANG Jian-Wei 作者单位：华南农业大学生命科学学院,广州,510642刊 名：植物生理学通讯 ISTIC PKU英文刊名：PLANT PHYSIOLOGY COMMUNICATIONS年，卷(期)：42(6)分类号：Q94关键词：植物凝集素 甘露糖结合凝集素 基因克隆 RACE-PCR 抗虫基因工程

篇2：拟南芥在植物抗病性分子机制研究中的作用

信号分子Ca2+在植物逆境应答中的作用

钙信号系统参与了植物对非生物胁迫的应答已经被证实,研究表明,逆境下植物产生的钙信号有助于激发植物产生适应逆境的`反应,钙信号系统可通过调控基因表达而提高植物的逆境适应性.

作 者：王文静 高志英 WANG Wen-jing GAO Zhi-ying  作者单位：王文静,WANG Wen-jing(商丘师范学院,生命科学系,河南,商丘,476000)

高志英,GAO Zhi-ying(运城农业职业技术学院,农林与工程系,山西,运城,044000)

刊 名：商丘职业技术学院学报 英文刊名：JOURNAL OF SHANGQIU VOCATIONAL AND TECHNICAL COLLEGE 年，卷(期)： 8(2) 分类号：Q7 关键词：植物   钙离子   应答  

篇3：拟南芥在植物抗病性分子机制研究中的作用

1材料与方法

1.1实验动物C57BL/6-PAX6雄性小鼠,周龄为8周,体重19~21 g之间,购自中国科学院上海动物研究所。

1.2小鼠5/6肾切除模型建立采用先切除一侧肾脏的上下极程度达2/3的肾脏体积,1周后切除另一侧肾脏的方法建立小鼠5/6肾切除(5/6NC)模型。

将实验小鼠分成正常对照组、假手术组、试验组3组。正常对照组无任何处理(normal组,6只小鼠),假手术组(sham组,10只小鼠),试验组(5/6NC组,10只小鼠)。造模后12周后收集心脏标本。将心脏标本分成2部分,分别用于检测心脏组织病理和心脏组织细胞因子。

1.3心脏组织病理学检测及电镜检测将小鼠心肌组织置于4%多聚甲醛固定12 h。将组织块在0.01 M磷酸缓冲盐溶液(PBS)中清洗过夜,然后经梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡包埋。石蜡包埋的组织块切片后行HE及免疫组织化学染色。切片厚4μm。染色后行光镜观察:观察10个高倍镜视野,计数每个视野染色阳性心肌细胞比例。Ubiquitin及Cathepsin D抗体购自Dako公司(DAKO Japan,yoto Japan)。Rab7抗体购自Santa Cruz公司(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz CA)。取小于1 mm3组织块,5%戊二醛、磷酸缓冲液配制固定2 h或更长时间,用0.1 M磷酸漂洗液漂洗3次,1%锇酸固定液固定2 h,然后脱水、包埋、固化、切片,3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色,透射电镜观察并拍片。

1.4心肌组织自噬相关蛋白及炎症因子测定心肌组织蛋白提取:用颈椎脱臼法处死小鼠,70%酒精浸泡5 min,开胸摘取心脏,去除心脏周围结缔组织,D-PBS冲洗3次,在试管中加入1 m L蛋白提取液,然后将心肌组织超声匀浆化,离心取上清液备测。

TNF-α、IL-1β、IL-6测定采用ELISA方法,试剂盒购自R&D公司,按试剂盒提供的方法进行检测。LC-3、Beclin-1及AKT检测采用Western-blot方法,蛋白电泳及转印装置、凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。LC-3及Beclin-1抗体购自Santa Cruz公司,AKT抗体购自cellsignal公司(cellsignal,Beverly,MA),α-Tubulin抗体购自Sigman公司。

1.5统计学方法Western-blot结果应用Gel-Pro analyzer v.4进行条带分析并获得相应IOD值,计量资料采用one-way ANOVA(多组)和student-t-test(2组),计数资料采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1尿毒症小鼠心肌组织电镜及病理变化透射电镜下观察到自噬体的形成,见图1;免疫组织化学染色显示心肌细胞Ubiquitin、Cathepsin-D、Rab 7表达尿毒症小鼠较正常对照小鼠明显增强,见图2。

*造模组与对照组(包括正常对照组和sham组)相比P<0.05

2.2尿毒症小鼠心肌组织自噬相关蛋白及炎症因子表达的变化尿毒症小鼠心肌组织中自噬相关基因LC-3、Beclin-1表达较正常对照小鼠明显增强,而AKT、α-Tubulin表达较对照组明显减弱,见图3。尿毒症小鼠心肌组织中TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的表达明显增加,见图4。

3讨论

自噬现象最初是通过电镜发现的,在细胞亚结构水平,可以观察到具有双层膜结构的自噬体,内含被降解的线粒体、内质网碎片等胞浆内容物。电镜检测被认为是检测细胞自噬的金标准。在本研究中我们通过透射电镜观察到尿毒症心肌细胞中含有双层膜结构的自噬体,说明在尿毒症心肌细胞中存在细胞自噬现象。为了进一步证实自噬现象的存在,我们检测了自噬相关蛋白LC3及Beclin-1等,发现LC3、Beclin-1表达明显增加,而抑制自噬的蛋白AKT的表达明显下降。免疫组织化学染色显示心肌细胞Ubiquitin、Cathepsin-D、Rab 7表达尿毒症小鼠较对照组小鼠明显增强。由此可以说明心肌细胞自噬与尿毒症小鼠心功能的改变密切相关。

既往研究发现在多种心脏疾病中存在细胞自噬,如心肌病、心脏缺血再灌注损伤、慢性心功能不全等[2]。然而心肌细胞的自噬在不同心脏疾病中对心功能的影响是利、是弊,目前尚有较大的争论。在心肌缺血、再灌注损伤的研究中,多数学者认为在心肌缺血的早期细胞自噬对心肌细胞具有保护作用,而在再灌注期或长期慢性缺血则导致细胞的自噬性死亡,加速病情的进展[3]。国外有研究者发现在压力负荷所致的慢性心功能不全小鼠中心肌细胞自噬明显增加并伴有心肌细胞的重塑,加重心功能不全[4]。既往研究发现,在豚鼠心肌病模型中,心肌细胞存在明显的细胞自噬,其严重程度与心功能不全程度呈正相关。粒细胞集落刺激因子(G-CSF)治疗可明显抑制心肌细胞自噬,改善心功能[5]。本研究证实在尿毒症所致慢性心功能不全中心肌细胞自噬对心功能不全的发生发展起着负性作用。

参与自噬过程的信号转导分子非常复杂,目前我们尚未完全了解。当前主要有以下两种途径:m TOR(Mammalian Target of Rapamycin J信号途径)和Class I PI3K/PKB途径。TOR激酶是氨基酸、ATP和激素的感受器,对细胞生长具有重要调节作用,可抑制自噬的发生,并发挥“门卫”作用[6,7,8]。Class I PI3K是自噬的负调节分子,可磷酸化Ptdlns4P和Ptdlns(4,5)P2,生成Ptd Ins(3,4)P2和Ptd Ins(3,4,5)P3,然后结合AKT/PKB和它的活化分子PDK1,抑制自噬的发生[9,10,11]。既往研究发现,在心肌细胞的自噬调控基因中PI3/Akt/m TOR及Beclin-1信号蛋白可能起重要作用[3,12]。上调心肌细胞PI3/Akt蛋白的表达能显著改善慢性缺血性心功能不全及尿毒症小鼠的心功能[13,14]。

此外有研究发现自噬与细胞因子之间具有双向调节的作用。细胞因子可以诱导自噬,尤其是IFN-γ、TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6和TGF-β已经证明可以诱导自噬的产生。最近有研究发现用IFN-γ刺激人或鼠类的巨噬细胞可以诱导Irgm1/IRGM依赖的自噬的发生[15,16,17]。许多研究证明TNF-α可以刺激细胞自噬的产生,包括人或鼠类巨噬细胞、人T淋巴细胞白血病细胞、人类血管平滑肌细胞、人类骨骼肌细胞、大鼠上皮细胞等[18,19,20]。细胞因子IL-4、IL-10和IL-13不同于IFN-γ、TNF-α等Th1类细胞因子,这类细胞因子是抑制细胞自噬的发生。在鼠类巨噬细胞中IL-10通过AKT途径抑制饥饿诱导的自噬的发生[21],通过AKT和STAT3途径抑制雷帕霉素诱导的自噬的发生[22]。此外,自噬可以调节细胞因子的产生和分泌[23]。在本研究中我们发现尿毒症小鼠心肌细胞内TNF-α、IL-1、IL-6等炎症因子的表达明显增加,提示TNF-α、IL-1、IL-6等炎症因子可能参与了尿毒症心肌细胞自噬的调节。然而究竟是炎症因子诱导或是抑制自噬的产生还是自噬促进了炎症因子的分泌,以及这其中错综复杂的详细作用机制尚有待我们进一步研究。

篇4：拟南芥在植物抗病性分子机制研究中的作用

关键词:次生代谢;信号分子;活性氧;茉莉酸;水杨酸

中图分类号:S5-3文献标识码:A

文章编号:1674-0432(2010)-05-0023-2

植物次生代谢产物合成的多代谢途径性使得人们不得不通过不同的方法来刺激代谢途径以增加目标次生产物的合成量。其中利用诱导子对目的次生代谢产物的生物合成途径进行调控,目前已被看作是大幅度提高培养物中代谢产物含量的重要方法之一。但目前关于诱导子在培养的植物细胞中具体的作用机制尚未形成一套详尽的理论体系,随着人类对于植物次生代谢产物需求量的不断增加,及植物组织/细胞培养技术的不断进步,诱导子详尽的机制越来越受到关注。

一、胞内信号分子的来源与应用

(一)活性氧(ROS)

活性氧是正常细胞新陈代谢过程中通过光合作用产生的超氧化阴离子自由基、过氧化氢、羟自由基。在植物细胞培养生产次生代谢物的过程中也发现诱导物与受体结合可引发胞内活性氧的爆发。研究发现植物体内活性氧(ROS)的反应链为O2→(H)O2"→H2O2→OH+H2O→2H2O,其中O2"和OH的半衰期(分别为2-4s、<1s)很短,H2O2的半衰期为1ms,相对较长,可以从产生位点扩散一定的距离,因此有关ROS信号的研究多集中于H2O2。在红豆杉培养中,通过茉莉酸甲酯类似物(DHPJA)的诱导可以产生活性氧的爆发。金爪炭细胞壁激发子(Cle)激发人参悬浮细胞可通过促进氧进发,进而激活NAD(P)H氧化酶活性,导致H2O2产生,H2O2作为第二信使,激活苯丙氨酸途径,诱发人参皂苷的合成及hrgp防御基因的表达。以下激发子诱导下次生代谢物质的积累同样受到H2O2的介导,如大豆中异黄酮的积累、长春花中吲哚生物碱的积累、人参中皂苷的积累、水稻细胞培养中植保素momilactones的积累等。

(二)钙(Ca2+)

钙是植物体内重要的第二信使,它介导了由包括诱导子在内的许多刺激因子所引发的细胞进程。次生代谢过程中,诱导子或生理性刺激使细胞质膜去极化、超极化或由于机械敏感性,膜上的钙离子通道打开,Ca2+内流;同时,IP3(Inositol trisphosphate)、cADPR等与配体结合,使液泡膜上的Ca2+通道开放,液泡中Ca2+释放,胞质中Ca2+浓度升高。此类诱导子包括:外源ROS、IP3、以及寡聚糖、蛋白质等能够诱导胞内Ca2+浓度的升高,且不同刺激所触发的钙信号在幅度、频率、持续时间和细胞内定位等方面都存在差异。钙峰的形成主要依赖于植物细胞质膜上存在的电压依赖型和牵张激活型两类钙离子通道,进而引起钙离子内流。液泡膜上钙离子通道可分为两类:电压依赖型和膜脂代谢产物IP3及环腺苷二磷酸核糖(cADPR)等配体激活型Ca2+通道。诱导的Ca2+峰直接激活或通过Ca2+传感器(钙调素,CaM)激活Ca2+/CaM依赖的蛋白激酶、蛋白磷酸酶、膜结合酶或转录因子,进而影响细胞内生命活动。岳才军等报道,钙通过激活人参细胞体内葡萄糖转移酶的活性影响人参皂苷的生物合成及其异质性。总而言之,由激发子诱导的钙离子通量对激发子诱导的次生代谢物质的积累是非常重要的,具体的作用机制见下文。

(三)茉莉酸(JA)

JA、MeJA及其他衍生物统称为茉莉酸类(jasmonates,JAs),是通过硬脂酸途径产生的脂肪酸衍生物,是环戊酮衍生物之一。拟南芥中至少存在两条合成茉莉酸族成员的途径,即从亚麻酸开始的十八烷途径和从十六碳三烯酸开始的十六烷途径。多条合成途径的存在为茉莉酸在植物响应生物与非生物胁迫起重要作用奠定了基础。植物体内的茉莉酸及其衍生物是植物受外界刺激后反应最快的信号分子,利用JA生物合成突变体spr-2及JA反应突变体jai-1的研究表明,JA及其衍生物可作为长距离传输的信号分子发挥作用。依赖于茉莉酸类作为调节信号的重要的防御应答也是植物次生代谢物积累的前提,茉莉酸类通过开启一系列生物合成基因的协调表达从而在转录水平上影响植物次生代谢,进而参与调节萜类和吲哚类化学信息分子的合成,如紫杉烷的生物合成基因GGPPS和TS及人参皂苷的合成基因SQS和SE。

(四)水杨酸(SA)

水杨酸是植物体内普遍存在的一类酚类物质,化学名称为邻羟基苯甲酸,在植物的许多生理活动中发挥重要作用。自然条件下,SA可由植物体自身合成,含量较低,于韧皮部运输。除作为生理调节物质在植物的开花、侧芽萌发、性别分化等生长发育过程中发挥作用外,作为植物抗病反应的重要信号分子,它可以激活多种与抗病相关的植物防御机制,涉及并参与植物过敏反应和系统获得抗性(SAR)反应,在植物的抗病反应中起重要作用。

在真菌诱导子诱导红豆杉细胞时加入一定量的水杨酸促进紫杉醇的合成。如在红豆杉细胞培养生产紫杉醇的实验中,SA的类似物三氟水杨酸也可以发挥诱导子的功能。应用毛状根培养Brugmansia candida生产东莨菪碱和莨菪时,SA能够刺激两种药物在培养物中的释放。Krinke et al认为在SA所诱导的信号通路中,有磷脂酶D(PLD)的参与,PLD作为它的下游分子诱导基因表达。

二、胞内信号分子的作用机制

(一)活性氧

一般情况下,胞内H2O2浓度水平保持稳定,但在胁迫条件下,H2O2浓度升高且作为第二信使引发胞内一系列抗性反应,防卫基因和次生代谢物合成基因的表达,它可专一性地诱导谷胱甘肽转移酶以及谷胱甘肽过氧化物酶的表达,外源H2O2处理菜豆悬浮培养细胞可诱导PAL、查尔酮合成酶等的表达。外源H2O2处理后拟南芥悬浮细胞中PAL的mRNA丰度增加。胞内超量的H2O2可以通过NADPH氧化酶和脂氧合酶途径启动茉莉酸生物合成,进而激活下游防御基因的表达。

在Fe2+压力下培养柏细胞时,同样产生大量的活性氧,进而提高乙烯量及β-thujaplicin 的产量。这一结果证实,对于β-thujaplicin的产生,H2O2是积极的信号,而超氧阴离子自由基负面影响β-thujaplicin感应并强烈诱导细胞死亡。

适量的活性氧可以提高植物次生代谢物的产量,但过多的活性氧对细胞是有害的,自由基具有很强的氧化能力,很不稳定,能持续进行连锁反应,对许多功能分子有破坏作用。水杨酸作为一种过氧化物酶可有效地消除H2O2等自由基,从而有利于降低膜脂的过氧化程度,因而在诱导子应用中应考虑互作。

(二)钙离子

Ca2+通过两种方式发挥其调节作用,直接激活Ca2+依赖的蛋白激酶或通过激活Ca2+调节蛋白(如CaM) 的活性传递Ca2+信号,响应各种环境刺激。负责茉莉酸或其它信使如IP3、磷脂酸(PA)和甘油二酯(DAG)生物合成的磷酸酶是受Ca2+调节的一类主要酶。另外,伤害及MeJA 均可诱导番茄植株中CaM mRNA 的积累。Ca2+峰的另一个重要的作用是不同转录因子的激活,而转录因子则直接调节所有防卫基因的表达。JA也可促进水稻悬浮细胞中钙调蛋白基因osMLo的表达。在拟南芥依赖JA 的伤害信号转导通路中,CaM可能作用于JA 的下游。

钙诱导的钙释放是作用的第二种机制:即PLC对磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)(一个重要的磷酸肌醇)水解产生2个第二信使IP3和甘油二酯(DAG)。PLC需要Ca2+峰的形成来激活IP3能动员植物细胞内Ca2+库(内质网、高尔基体或液泡)中的Ca2+。因此IP3、Ca2+信号通路与激发子诱导的植物抗毒素的产生有关。

(三)茉莉酸

茉莉酸类可作为细胞内或细胞间的信号分子,通过与转录因子相互作用而调节防御基因的表达及次生代谢物质的合成。其中作为诱导子诱导植物细胞生产更多的次生代谢产物的报道很多,如前所述,具体的作用机制目前认为:茉莉酸类诱导与次生代谢物合成有关的关键酶基因的表达。茉莉酸进一步诱导转录因子进入细胞核,活化蛋白酶抑制剂基因表达。但是有关JA在植物体内信号转导的分子机制及JA信号通路与其他信号通路间的相互关系尚不清楚。再有如对JA的受体缺乏了解。利用茉莉酸类对植物次生代谢途径进行诱导,结合功能基因组学等相关技术,进行转录物分析,能进一步阐明许多尚不清晰的次生代谢途径.

Goossens研究组以烟草为实验材料,采用cDNA扩增片段多态性分析技术(cDNA-AFLP),以茉莉酮酸甲酯作为诱导子,鉴定出近600个茉莉酮酸甲酯诱导的烟碱合成相关基因,更加明确了烟草中烟碱的生物合成途径。此小组还利用CDNA-AFLP技术,结合代谢组学方法,发现了长春花生物碱代谢途径中417个基因标签的转录图谱,和178个峰的代谢物图谱,进一步深入研究了长春花中生物碱的代谢途径。Choi等利用EST数据库,通过研究茉莉酮酸甲酯诱导的人参毛状根系鉴定出了与人参皂甙生物合成有关的基因,进一步阐释了人参皂甙的合成途径。目前已经利用微阵列技术与功能基因组等研究方法筛选了一些茉莉酸类应答基因,今后还要对这些基因的应答机制进行深入研究,以便进一步了解其信号转导机制及植物次生代谢途径。

(四)水杨酸

水杨酸发挥作用没有特异性。能够诱导与次生代谢物质合成有关的基因的表达。植物细胞对于SA信号的反应目前已取得重大进展。然而当SA信号通路未能揭开之前,主要工作侧重于相关转录调节因子的确定与识别。如SA处理后一个迅速发生的事件就是磷脂酰肌醇的水平的剧烈变化取决于PI4K的活力。应用拟南芥细胞悬浮培养研究发现,激活磷脂酶D(PLD)是水杨酸信号通路中的一个早期信号。在系统获得性抗性中,生物体内的SA同外源SA都能够诱导相同的信号通路,最终导致发病机理相关(PR)基因的表达及防御蛋白的产生。如在烟草细胞中水杨酸触发的蛋白磷酸化级联反应涉及到MAP激酶,特别是伤口诱导的蛋白激酶和SA诱导的蛋白激酶。另据报道,表达发光蛋白的烟草BY-2细胞经SA处理后,其胞内的钙离子浓度升高。由此看来,SA的另一个作用机制与生物体内的钙信号有所相关,具体相关机制有待进一步研究。

通过多个信号通路进行交谈是植物转导网络的重要机制。本文综述了当前应用诱导子对植物次生代谢进行调节过程中,胞内信号分子如Ca2+、ROS、JA、SA等介导的植物次生代谢信号转导在实际生产中的应用及其作用机制。文中部分环节是在前人实验基础上的推测、假设,许多环节的机理还不清楚,需要进一步研究证明。植物次生代谢信号转导过程中,有关ROS是否直接参与JA合成的调节,JA和SA相互影响的机理,活性氧、Ca2+与胞内SA、JA等植物激素如何沟通进而通过与次生代谢相关的代谢途径如苯丙烷代谢途径、异戊二烯途径以及含氮次生物质合成途径的调控提高次生代谢物质的产量等问题急需早日解决,以为实际生产提供理论依据。

参考文献

[1]齐凤慧,詹亚光,景天忠.诱导子对植物细胞培养中次生代谢物的调控机制[J].天然产物研究与开发,2008(20):568-573.

[2]尚忠林,孙大业.植物细胞内的钙信号[J].植物生理学通讯,2002,38(6):625-630.

[3]Yue cj,Zhong jj.Impact of external calcium and calcium sensors on ginsenoside Rb1 biosynthesis by Panax notoginseng cells[J].Biotechnol.Bioeng,2005,(89)444-452.

篇5：拟南芥在植物抗病性分子机制研究中的作用

鉴于ENH1基因在盐耐受方面的特殊作用,本研究将追踪这个基因家族的进化历史,大量植物基因组的完成测序为我们的研究提供了有利条件[7]。这里,我们通过对32种陆生植物的同源基因采样,研究ENH1基因的系统发生与进化。在研究中,我们首先进行了系统发育分析,然后研究了ENH1基因家族在陆生植物中的进化式样,包括蛋白质结构域的进化,表达谱和蛋白质网络。最后,结合本次研究所提供的新信息,探索了进化模式与功能之间的联系。这些分析为今后进一步的实验研究设计打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

为了鉴别陆生植物中ENH1基因家族的潜在成员,我们用拟南芥中ENH1基因的蛋白序列(AT5G17170)作为查询序列,使用t BLASTn程序在Phytozome比较基因组学平台(http://phytozome.jgi.doe.gov/)[7]的32中陆地植物搜索同源序列,共收集到35条ENH1同源蛋白质序列(表1)。在Phytozome数据库中,如果基因模型中出现不同方式的拼接,挑选转录本最长的拼接方式,如果出现缩短了的ENH1蛋白质,它们的基因模型将重新预测。拥有RUBR和/或PDZ结构域的序列确定为拟南芥ENH1蛋白质序列的同源基因。

Note:http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!search.

1.2 方法

1.2.1 序列比对和系统发育分析

全局多序列比对使用Clustal Omega[8],并进行手工编辑调整,然后使用pal2nal程序[9]将蛋白质序列比对转变为相应的密码子比对。使用more PHYML 2.4.4[10]和MEGA[11]分别进行最大似然法(ML)和邻接法(NJ)构树分析,分别使用100和1 000次重取样进行Bootstrap树分支可靠性分析。使用苔藓植物的ENH1同源蛋白(Pp0200)作为外类群。在最大似然法中,使用MEGA[11]测试进化模型和优化参数。

1.2.2 结构域组织和蛋白质网络分析

我们使用来自Expasy的Scan Prosite(http://prosite.expasy.org/)工具来分析ENH1蛋白质的结构域组织的进化式样。为了进行蛋白质的网络分析,我们使用STRING 10[12]并选择对拟南芥ENH1蛋白质(AT5G17170)进行蛋白质相互作用分析。我们设定的参数如下:显示的关联序列不超过10条;置信度要求达到不少于0.8。

1.2.3 表达分析

为了探索拟南芥ENH1基因的表达模式,我们使用GENEVESTIGATOR[13]分析平台,探索在Affymetrix Arabidopsis ATH1微阵列表达数据中的表达式样。我们用3个拟南芥SOS途径的耐盐基因(SOS1,AT2G01980;SOS2,AT5G35410;SOS3,AT5G24270)作为对照。我们使用条件搜索工具集(CONDITION SEARCH toolset)中的发育工具(Development tool)分析4个基因在10个发育阶段的表达水平,并使用层级聚类工具(hierarchical clustering)进一步进行了聚类分析。

2 结果与分析

2.1 序列比对和系统发育分析

序列比对和比对后的编辑产生798个核苷酸位点长度的矩阵(文中未显示)。在AIC标准下,GTR模型被选为最佳进化模型(G=1.43;I=0.28)。最大似然法(ML)分析得到一个In L得分为-31892.674650的最佳树(图1)。

分支上方的数字表示Bootstrap百分值>50%。ENH1-like蛋白质的结构域组织显示在分支的上方或一侧,其中,基部的苔藓(Pp0200)和蕨类(Ss3058)只包含RUBE结构域,而被子植物包含RUBR和PDZ两个结构域。The numbers above branches are ML bootstrap percentages>50.The domain organizations of proteins were shown on sides of clades,among them,the basal moss(Pp0200)and fern(Ss3058)contain only RUBE domain,angiosperms contain both RUBR and PDZ domain.

NJ分析获得了几乎完全一样的拓扑结构,支持了ML法的分析。我们的树分析显示,所有的家族成员被分为两个进化分支,单子叶和双子叶植物,并得到高度的Bootstrap支持(图1)。我们的分析显示,这个基因家族属于低拷贝家族,在绝大数物种中保持单个基因拷贝。系统发育分析能够将单子叶和双子叶成员明确划分,并获得高度支持(图1),提示这个家族适合作为植物系统发育重建的分子标记。

这个基因家族在绝大多数植物物种中保持单拷贝状态,表明这是一个非随机的过程。关于这种非随机过程,已有的基因平衡假说能够解释这一现象[14],蛋白质复合物中各部分的协调要求进化上保持稳定的基因拷贝数量,ENH1基因参与的叶绿体膜电子传递过程非常吻合,它要求形成一个复合物共同完成这一过程,多拷贝显然不利于这个过程。

2.2 蛋白质结构域与网络分析

蛋白质结构域分析显示,陆地植物基部类群的苔藓和蕨类的ENH1-like蛋白质仅包含RUBE结构域,而被子植物的ENH1-like蛋白质包含RUBR和PDZ结构域,因此,原始的ENH1-like基因可能只包含RUBR结构域,ENH1在进化过程中获得了PDZ结构域,该结构域是一个多功能的蛋白质-蛋白质相互作用模块,与组织膜上的蛋白质形成网络有关,表明ENH1基因在高等植物叶绿体中适应了更复杂的功能需要。我们的蛋白质网络分析显示,基于共表达证据的10个最高分值的关联蛋白(图2,表2)的功能涉及叶绿体的若干分子功能,包括参与叶绿体的核糖体的RNA的代谢,光合成的还原性戊糖磷酸途径,以及保护光和系统Ⅱ免受过氧化氢的损害等。ENH-like蛋白可能这些分子功能和过程密切相关。在功能上,ENH1涉及保护活性氧自由基的损害[4],蛋白质网络分析显示,ENH1可能与叶绿体中的多种功能活动有关,如叶绿体核糖体的RNA的代谢,光合成的还原性戊糖磷酸途径,以及保护光和系统Ⅱ免受过氧化氢的损害等(表2),有待进一步的研究验证。

基于STRING[14]的网络分析平台,设置信心值>0.8,使用共表达(co-expression)作为蛋白质相互作用的证据。An interaction network analysis based on STRING platform[12].The confidence values are set greater than>0.8,and statistically significant co-expression are used as evidences of interaction.

2.3 表达分析

利用GENEVESTIGATOR平台[15]进行的表达分析发现,拟南芥ENH1基因(AT5G17170)保持高的表达水平,用于比较的SOS耐盐途径的三个基因(SOS1,AT2G01980;SOS2,AT5G35410;SOS3,AT5G24270),在所有发育阶段处于中等表达水平。分析显示,除了在抽苔期(bolting),ENH1基因与SOS3的表达水平呈现负相关,尤其在衰老期(senesence)。其它两个SOS基因与ENH1基因之间没有显示表达水平上的关联。这一现象与已有研究一致,即ENH1基因的突变能够增强耐盐基因SOS3(AT5G24270)突变体的盐敏感性,但不会增强耐盐基因SOS2(AT5G35410)突变体的表型[6]。

3 讨论

对植物盐胁迫防御机制的深入理解依然是作物改良面临的主要挑战。SOS(Salt Overly Sensitive)通路已经显示为植物盐胁迫防御的主要机制,然而,这个通路的基因与其它基因如何协调实现耐盐的机制尚未得到充分研究[15]。我们表达分析显示,ENH1基因与SOS通路的SOS3基因存在负相关,这一结果支持以前的报道[4]。蛋白质网络分析发现ENH1基因可能参与叶绿体的多种活动(表2),这些可能的功能活性与活性氧自由基的脱毒[4]之间是否存在关联,值得继续开展研究。从进化分析角度,目前的研究第一次在陆生植物范围内对ENH1基因的进化进行研究。ENH1基因在被子植物谱系的进化中获得了一个PDZ结构域,这个结构域负责蛋白质-蛋白质相互作用,使膜上的蛋白质形成网络以聚集信号分子[6]。我们推测,正是PDZ结构域的获得增加了ENH1基因功能的复杂性(表2)。此外,ENH1基因在进化过程中保持低拷贝(表1),并能够明确区分被子植物的两个主要类群,单子叶和双子叶植物,显示这个基因是一个优良的系统发育分子标记,在被子植物系统发育重建中有应用价值[16]。

耐盐基因可以分为三个主要的功能类型[17]:(1)控制盐的吸收和运输;(2)承担渗透或保护作用;(3)使植物在盐渍土中生长得更快。在研究中,我们发现,ENH1样基因作为叶绿体膜蛋白,参与植物的光合作用,我们建议将ENH样基因归类于第三类。在早期的蛋白质组学研究中[18],在拟南芥和盐芥(咸水芥)中已鉴定的耐盐基因覆盖有广泛的分子功能,包括光合作用、能量(呼吸)、代谢、蛋白质合成、蛋白质定位、防御、信号、转录、细胞的组织、发育及运输。盐芥细胞可以感知并传输盐压力来调节转录、蛋白质合成及加工,在这些过程中,光合作用和蛋白质合成变化在植物盐耐受性方面的具有独特的重要性[19]。必须指出的是,这是一个生物信息学研究,有必要开展进一步的实验研究,以避免对于ENH1基因的过于自信的注释。

摘要：[目的]ENH1是最近鉴定的拟南芥耐盐基因,编码一个叶绿体定位的蛋白,N末端具有一个PZD结构域,C末端具有一个RUBR结构域;功能上与活性氧自由基的脱毒有关,本文研究ENH1基因的进化历史和功能分化。[方法]从陆地植物基因组中获得同源蛋白,重建这个基因家族的系统发生,通过生物信息学手段研究其蛋白质结构域组织,蛋白质相互作用和表达谱。[结果]总共获得35个ENH1同源蛋白序列,大多数物种保持一个基因拷贝,系统发育上单子叶与双子叶被明确划分,并获得高度的支持,在进化过程EHN1蛋白获得了PDZ结构域。[结论]功能上,这个基因家族通过获得PZD结构域适应被子植物细胞的复杂功能要求,ENH1样基因可能涉及叶绿体的多种功能,此外,ENH1基因家族适合作为系统发育重建的分子标记。

篇6：拟南芥在植物抗病性分子机制研究中的作用

关键词 植物；雌雄同株；雌雄异株；分子机制

中图分类号：S-3 文献标志码：A 文章编号：1673-890X（2014）15-0-02

植物性别的产生是植物在漫长的进化过程中，随着植物的形态、结构和机能适应自然环境变化和发展，特别是繁殖方式的演变而产生的。植物的性别源于有性繁殖。有性繁殖是植物遗传物质交换、变异以及多样性的主要来源，它导致了植物性器官的产生与形成及两性异型进化。因此，植物的性别决定具有不稳定性和多样性的特点，彻底揭示其机制难度较大，目前已经成为基因组学、染色体组学、进化遗传学和发育遗传学的研究热点。与有性生殖相联系的是生物雌雄性别的分化，包括两个阶段：性别决定和性别分化。植物的性别决定由基因、环境和激素协同调控的动态过程，性别表型决定机制具有多样性。

1 植物雌雄异株的性别决定分子机制

雌雄异株植物，是指在具有单性花的种子植物中，雌花和雄花分别生长在不同植株上。被子植物中有959个属（占7%）有雌雄异株现象，大约有14620个物种（占6%），具有雌雄异株的性系统。

雌雄异株植物是性别决定机制及演化的重要研究材料，而通过现代分子生物学的相关技术，分离出性别决定的相关基因是揭示雌雄异株植物性别决定的关键问题之一。虽然，近年来已经分离出很多性染色体的连锁基因，但还没有发现明确的证据，来证明这些是决定雌雄异株植物性别的关键因素。近10年来，已经分离到的这些基因都存在于性染色体上，但是，对其功能分析发现这些基因并不是性别决定的关键基因，而是其性别决定控制系统中的成员之一。Delichere等利用染色体微分离的方法从白麦瓶草雄花建立的cDNA文库中筛选出了与性别控制相关的基因SLY1。Moore等从白麦瓶草中，还分离得到了另一个染色特连锁的基因DD44（differential display44）。Matsunaga等通过差异筛选雌雄花蕾的cDNA文库，发现了4个MROS基因。它们在植物的雄性器官中特异性表达。Okada等从地钱中也发现了Y染色体上的雄性特异基因，其编码的162个氨基酸的蛋白质包含一个环指区，并且，该基因只在雄性性别器官中特异性表达，且这些序列是独立的。但是，上述基因都缺乏有力证据证明其是植物性别发育的起决定性作用的关键基因。

2 植物雌雄同株的性别决定分子机制

在雌雄同株植物中，黄瓜和甜瓜是其典型代表，也是进行性别决定研究的模式植物，它们的性别受到基因型、环境条件以及植物激素等影响。下面针对黄瓜及甜瓜的性别决定分子机制，进行简要分析。

黄瓜是一种常见蔬菜，不仅是我国首要保护的蔬菜作物，还是农村致富及农民增收的重要产业之一。农作物高产优质的主要原动力，就是新品种的培育，想要达到黄瓜优势育种的目的，一个重要的途径就是全雌系或者强雌系品种。黄瓜具有丰富多彩的性型表现，从而使它成为研究高等植物性别决定的模式植物，其中黄瓜的性型主要有以下几种：雌雄异花同株；纯雌株；两性株；雄花两性花同株；三性株。然而，在葫芦科中，甜瓜是一种重要作物，其性别遗传也相对比较复杂，有以下几种：雄花两性花同株；雌花两性花同株，简称雌全同株；雌雄同花同株；全雌性花株；雌雄异株及三性花同株等。此外，植物性别决定机制有多种因素，即遗传、环境因子、植物生长物质（激素）。比如黄瓜，其遗传因素、长日照以及赤霉素等可促进雄花产生，而短日照、低温和生长素等可促进雌花产生等。

3 甜瓜及黄瓜的性别决定分子机制

3.1 甜瓜性别决定分子机制

甜瓜的性别决定机制主要受到两对基因控制，即Andromonoecious（A/a）和Gynoecious（G/g），两者之间相互作用，进而形成多种多样的性别类型，如雌雄单性同株（A-G-），雄花两性花同株（aaG），全雌株（AAgg），两性花株（aagg）等，Martin等对甜瓜中2个性别决定基因之间的关系进行研究，其中基因为CmACS-7及CmWIPI，结果发现CmWIPI基因能够调控CmACS-7的表达，其中CmACS-7是Boualem等通过相关研究而命名的，即利用图位克隆的方法，在14kb的区段内放入两性花基因A（a），在此区段中仅有一个基因，并且该基因能够编码一个ACC合成酶，此酶是乙烯合成的关键酶，进而将其命名为CmACS-7。在甜瓜性别决定过程中，CmACS-7位于CmWIPI下游，综合相关试验结果，Marin等提出这样一个观点，即一个甜瓜性别决定的调控模型。花原基中心皮的发育可受到CmWIPI抑制，并且CmWIPI也能够间接抑制CmACS-7基因的表达，促进雄蕊的发育，从而使植株产生雄花。此外，甲基化失活的mWIPI基因，或者功能缺失突变的CmWIPI基因，不仅能够促进花原基中心皮的发育，而且也可以将CmACS-7基因的抑制进行解除，而雄蕊的发育也会受到CmACS-7基因表达的抑制，最终使植株产生雌花。然而，根据这种情况，倘若CmACS-7基因出现功能突变现象，则可解除对雄花的抑制作用，进而产生两性花。

3.2 黄瓜性别决定分子机制

3.2.1 基因

影响黄瓜性别的因素主要有基因、植物激素和环境条件等。黄瓜性别不仅受到基因的影响，而且还会决定基因模型。（1）影响黄瓜性别决定因素。其基因主要有F、A、M，其中F基因是半显性的，同时，发挥着重要的作用，即加强雌性，使雌性能够快速发育，并让雌花向低节位发育。而M基因的作用是抑制雄花的发育，但是，M基因在抑制过程中，不会影响花在植株上的排列以及分布。A基因能够增强雄性，抑制雌花的发育，可在F基因上产生上位效应。黄瓜性别决定由于受到F、M、A基因的影响，从而产生各种性别表型，如全雌花基因型为F-M-AA/Aa/aa，雄花两性花为mm ff A-，雌雄异花同株为ff M-A-，纯雄株为ff M/Mm/mm aa。（2）黄瓜性别决定基因模型。对黄瓜性别决定机制的研究，其起步相对比较早，同时早已具有大量研究资料显示其关键的调节因子就是乙烯。据Yin、Quinn及Ya ma saki等将“一种激素调节假说”进行提出，并不断完善，换言之，将全雌性状的F基因进行有效控制，并将植物内源乙烯水平进行调节，进而促进雌蕊原基的发育。显性M基因主要控制单性花性状，即利用乙烯进行抑制雄花原基的发育，当植株以mm作为纯合基因型的时候，则就不能顺利传导乙烯的信号，无法有效抑制雄蕊的发育，进而产生两性花。按照此假说，大多数的人们均认为F基因参与了乙烯的合成途径，同时，也可能成为乙烯合成途径中的一种重要酶基因；而M基因也参与乙烯信号传导过程中，且可能成为乙烯受体。endprint

但是，随着F基因以及M基因相继被克隆，相关研究人员发现其产物均为一种ACC合成酶，两者都参与于乙烯合成过程中。由此可见，这些研究进展给予“一种激素调节假说”带来新的挑战，并提出一些问题，就是两者之间是如何相互作用，从而实现黄瓜性别决定。针对这一问题，Li等进行相关研究，把CsACS2基因转化为烟草，当利用35S启动子过量表达CSACS2基因的时候，则把转化株体内乙烯的产量进行增加，进而使节间缩短以及开花推迟等。但是当利用CsACS2自身启动子连接基因，且成功转化之后，在转化株中，则无法检测出CsACS2转录本，而植株内源乙烯的含量也没有发生任何变化；此外，当利用外源乙烯处理转化株之后，则可以将CsACS2基因的表达进行检测；同理，当利用乙烯处理黄瓜时，也能够将CsACS2基因的表达进行诱导，反之，利用乙烯抑制物AgNO3以及氨基乙氧基乙烯甘氨酸处理黄瓜，能够把CsACS2基因的表达进行降低。据Li等进一步分析CsACS2基因启动子，可知，其包含两个乙烯相应原件，由此可推测出这两个顺式作用元件参与乙烯对CsACS2基因表达调控的概率相当高，且表明黄瓜性别决定基因模型，具体如下：一是F基因和M基因均能编码ACC合成酶，两者之间相互作用，并以此产生雌花、雄花及两性花。二是雌花在发育过程中，当F基因首先被激活后，可产生乙烯，而此乙烯可促进雌蕊原基的发育，并且乙烯能够将M基因进行正反馈调节和激活，同时M基因在表达中产生的乙烯，可抑制雄蕊原基的发育，进而产生雌花。三是在雄花发育过程中，F基因无法被激活，则就不能产生足够的乙烯，同时也不能通过正反馈调节来促进M基因的表达，使雌花原基难以发育，当无法抑制雄花原基时，则可发育成雄花。四是针对F-mm基因型植株，其F基因能够被正常激活和表达，其中产生的乙烯可促进雌花原基的发育。但是，由于m基因发生突变，失去ACC合成酶的功能，进而不能产生足够的乙烯，也就无法抑制雄花原基的发育，最终产生两性花。

3.2.2 植物激素

在黄瓜性别决定过程中，除了基因之外，还有植物激素，植物激素和黄瓜性别之间存在一定的联系。植物的基因型能够受到赤霉素和乙烯或者它们的抑制剂的影响而发生改变，赤霉素主要的作用是促进雄性，而乙烯是促进雌性。利用两性系及雄全同株系黄瓜进行处理不同组合的乙烯与赤霉素，Yin与Quinn认为黄瓜性别决定的主要因素就是乙烯，同时，赤霉素可能是内源乙烯产生的抑制因子之一，如此一来，他们又提出一个性别决定产生的模型，即乙烯不仅能够促进雌性，而且也能够抑制雄性。这种模型的具体内容如下：F基因可能会编码一种物质，而这种物质可将内源乙烯在植株上的生成量和分布进行决定，并且能在植物体上发挥一定的作用，该作用就是促进雌性，然而，M基因也能编码一种物质，这种物质属于乙烯敏感的雄性受体因子，可通过感知乙烯信号而抑制雄蕊的发育。植物的“性激素”实质指乙烯，而其他激素生长素或者油菜素内酯，则被认为是影响乙烯信号传递或者合成的因素，其影响具有直接性和间接性等特点，且也可利用这些激素进行调控植物性别的分化。

4 结语

植物性别发育研究是一门具有生产实践意义的研究方向，也是研究植物性别决定机制的重要思想。如甜瓜和黄瓜等。此外，随着植物性别决定机制的研究不断深入，某些关键基因已经实现克隆，同时也提出性别决定基因互作模型，但是，由于性别决定具有一定的复杂性，所以还需要深入研究。

篇7：拟南芥在植物抗病性分子机制研究中的作用

关于水杨酸与植物抗逆的研究始于20世纪70年代, 进入20世纪90年代后, SA应用于植物抗生物胁迫的研究逐渐成为植物抗逆性的热点。近十多年来, 关于SA对植物抗病的诱导及其作用机制、SA转导途径等方面的研究业已取得重大进展。此外, SA用于植物抵抗非生物胁迫的研究也开始受到广泛关注。因此, 深入研究SA在抗逆境胁迫方面的作用与机理, 具有重要的理论与实际意义。

1 水杨酸与植物抗生物胁迫

SA在植物抗病反应中作为信号分子, 当植物受到病原微生物侵染后, 会诱发SA的形成, 同时在被侵染部位以局部组织迅速坏死的方式来阻止病害的扩散, 即发生过敏性反应 (HR) ;在一定时期内, 当该植物体内再次经受同种病原微生物侵害时, 不仅是侵染部位, 未侵染部位也获得了对此种病原及一些类似病原的抗性, 即产生系统获得性抗性 (SAR) [1], 同时形成致病相关蛋白抵抗病原微生物, 提高抗病能力。

SA在植物抗病过程中起着重要的作用, 主要体现在以下几个方面:

1.1 外源SA可诱发植物积累致病相关蛋白 (PRs) 并产生抗病性。

PRs是一类逆境蛋白, 被认为在植物的抗病中起重要作用。实验证明, 外施SA于烟草, 浓度越高, 致病相关蛋白质产生就越多, 对花叶病病毒的抗性越强。

1.2 SA诱导植物产生SAR。

以坏死型病原微生物接种或其他诱抗因子处理植株下部叶片, 上部未处理叶片也能获得对2次接种病原物的抗性, 这种抗病性即为SAR。把细菌中编码水杨酸羟化酶的nah G基因转入烟草和拟南芥细胞后发现, 病原物侵染后, 这两种转基因植物的SA积累受到了抑制, 从而削弱了它们限制病原物扩展和产生SAR的能力。[2]

1.3 SA促进叶片中木质素含量的增加。

植物受到病原物刺激后, 会产生一种较为明显的防卫反应--木质素沉积, 这导致细胞壁的木质化, 从而加强机械保护, 阻止病害的进一步渗透。实验证明, 这种防卫反应的发生与SA水平的升高密切相关, 如用0.01mmol/L SA处理后, 叶片中木质素含量会迅速增加, 抗病能力等到了显著的提高。[3]

1.4 SA诱导植物保卫素 (PA) 的产生。

PA是受病原侵染或某些非生物制剂处理后由植物合成的, 并在植物组织内积累起来的对病原物有毒性的低分子量物质。PA的快速合成与积累是植物重要的抗病防卫反应。目前已在17种植物中发现并鉴定了200多种PA。一般抗病及感病植株中均可积累PA, 但在抗病植株中形成速度快、数量大, 均能起到及时防止病原侵染的效果。

2 水杨酸与植物非生物胁迫

2.1 水杨酸与植物抗盐性

SA与植物抗盐性有关。盐胁迫引发氧化胁迫, 引起细胞代谢紊乱, 最终抑制植物生长。在植物抗病研究中发现, SA及其类似物往往能诱导植物产生抗盐性状, 如诱导气孔关闭, 降低叶片蒸腾强度, 提高SOD、POD等抗氧化酶的活性, 降低膜脂过氧化水平, 改善细胞的代谢, 最终缓解盐胁迫对种子发芽、幼苗生长的抑制作用。时丽冉等[4]对玉米的研究证实了这一点。

2.2 水杨酸与植物抗寒性

在低温胁迫下, 植物体内产生大量的超氧阴离子自由基, 使植物膜系统受到伤害。由于植物体内SA受体蛋白基因与过氧化物酶基因高度同源, 因此, 外源SA进入体内能够激活SOD和POD的活性, 如外源施加SA及其类似物均能减轻玉米幼苗遭受低温胁迫的毒害症状。冷害条件下外源SA能提高水稻种子和玉米种子发芽率、发芽指数和活性指数, 降低低温胁迫对细胞膜的伤害。[5]

2.3 水杨酸与植物抗旱性

膜脂过氧化是造成水分胁迫下细胞膜系统受损伤的主要因素, 与盐胁迫类似。SA作为植物内源信号分子组成部分, 在植物细胞信息传递和代谢中, 特别是干旱条件下, 降低植物体自由基含量、减轻细胞膜脂过氧化、保护生物大分子、提高水分利用效率方面有重要作用。陶宗娅等[6]对小麦的研究表明, 渗透胁迫下1.0mmol/L SA能起到一定的缓解干旱的作用。

2.4 水杨酸与植物抗热性

高温使植物硫代巴比妥酸水平升高并降低植物的存活率, 外源SA等可以提高植物的耐热性, 降低硫代巴比妥酸水平, 提高植物的存活率。詹妍妮等[7]研究了外源SA对高温胁迫下葡萄细胞中细胞膜脂过氧化的影响。结果表明:高温胁迫下葡萄叶肉细胞的MDA含量显著降低, SOD、CAT活性都明显升高, 说明SA处理可提高植物的耐热性, 可能通过降低膜脂过氧化水平来诱导植物体对热胁迫产生抗性。

2.5 水杨酸与植物抗重金属、铝毒、铁毒特性

外施SA有助于缓解重金属毒害, 增强植物的抗性反应。重金属可诱导植物体内抗氧化系统保护酶活性升高, 触发热激蛋白、Dnaj-like蛋白、几丁质酶、PRP、GRP和PR蛋白等防卫基因的表达, 提高植物的抗重金属能力。重金属胁迫后植物内源SA水平升高, 外施SA也诱导内源SA含量升高, 同时增强了植物对重金属的耐性。研究表明, SA被用于缓解铝毒、铁毒也收到了明显的效果。[8、9]

2.6 水杨酸与植物抗紫外辐射和臭氧能力

紫外辐射可诱使DNA形成二聚体, 从而抑制复制和转录。植物受到紫外胁迫时内源SA及其葡萄糖苷水平升高, 对烟草的研究证明了这一点。同时, 经紫外线照射的烟草叶片有PRs积累, 增强了其对后续TMV侵染的抗性, 表明紫外线和TMV激活了一条共同的信号转导途径, 导致SA和PRs的积累和抗病性的增强。[10]烟草经臭氧处理后积累SA, 对TMV侵染的抗性增强。

3 讨论

近几年来, 许多科学家和学者对水杨酸与植物胁迫抗性进行了研究, 而且已经取得了相当大的进展。SA作为一种新的植物激素, 可能通过多种途径来调节植物的生理代谢过程, 从而达到不同的生理效应。SA在诱导植物胁迫抗性方面起着重要的生理作用, 不同植物或相同植物的不同组织SA诱导植物抗性的机制均可能不同, 要全面了解SA诱导植物抗性机制, 有待进一步深入研究。

参考文献

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[4]时丽冉, 杜军华.水杨酸对盐害下玉米幼苗质膜稳定性及K+/Na+比的影响[J].青海师范大学学报 (自然科学版) , 2001, 1:50-52.

[5]谢玉英.水杨酸与植物抗逆性的关系[J].生物学杂志, 2007, 24 (4) :12-15.

[6]陶宗娅, 邹琦, 彭涛, 等.水杨酸在小麦幼苗渗透胁迫中的作用[J].西北植物学报, 1999, 19 (2) :196-302.

[7]詹妍妮, 郁松林, 陈培琴, 等.热锻炼与外源水杨酸对葡萄叶肉细胞膜脂过氧化的影响.石河子大学学报 (自然科学版) , 2005, 23 (5) :597-600.

[8]张芬琴.铝胁迫与小麦叶片的内肽酶活性及活性氧的产生[J].农业环境保护, 2000, 19 (2) :79-81.

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篇8：植物黄酮抗病毒作用的研究进展

关键词：植物黄酮,抗病毒,作用机制

病毒是一类严重危害人畜健康的病原体,具有很强的传染性,由其引起的传染病(如:病毒性肝炎、流感、脑炎、肺炎、疱疹、腮腺炎等)一直威胁着人类健康和生产活动。病毒为细胞内寄生,它的基本结构仅为核酸和蛋白质外壳,必须利用活细胞宿主的各种生物化学机制进行复制增殖。抗病毒的药物要求在抑制或杀灭病毒时对细胞的正常代谢无影响。病毒以其特殊的生物学特性和致病机理,致使许多病毒性疾病至今仍缺少效果确切的防治方法。目前对病毒病的防治方法主要有疫苗防治、抗病毒的化学合成药物及外源性细胞因子治疗等。疫苗防治为最常用的方法,但由于病毒的种属多、血清型多、抗原易发生变异,为疫苗的应用带来困难,而且疫苗防治能加速抗原的变异;在使用抗病毒西药时,往往对宿主细胞造成一定程度的损伤,并且存在耐药性和药物残留的缺点[1],临床效果不理想,且多年来一直没有新的抗病毒合成药物产生;医用外源性干扰素、白细胞介素-2等能抑制病毒复制,提高机体细胞免疫功能,治疗前景良好,但费用昂贵,目前仍停留在基础研究和临床试验阶段。现代药理学研究表明,许多植物成分有良好的抗病毒作用,且抗病毒谱广、毒副作用小、无耐药性产生,大多数药物还具有增强机体免疫力的作用[2]。近年来,国内外研究者已从植物成分中筛选出了大量抗病毒药物,其中有很多已被开发应用到临床[3]。植物成分治疗病毒感染性疾病,不是单纯着眼于直接的抗病毒作用,而是重视“病毒-机体-药物”三者的关系;不仅直接杀灭病毒,阻止病毒的吸附、穿入、复制、转染,更重要的是还能增强机体免疫力,阻止病毒致细胞病变,改善临床症状,激发调动机体的一切免疫防御系统发挥抗病毒作用。多途径、多环节的改善病毒所致机体的不良反应和症状,这正是植物成分抗病毒所具有的独特优势。

从植物中发现天然抗病毒活性化学物质是开发抗病毒药物的重要途径,而经过大量的研究证明黄酮类化合物具有良好的抗病毒作用。黄酮类化合物(flavonoids),又称生物类黄酮(bioflavonoids),为一类低相对分子质量的广泛分布于植物界的天然成分,其基本骨架具有C6-C3-C6的特点,即由两个芳香环,通过中央三碳链相互连结而成的一系列化合物。黄酮类化合物是自然界中存在的酚类物质,属植物次级代谢产物[4],数量之多列天然酚化合物之首,大多具有颜色。植物黄酮类是从植物中提取出来的一类具有相似化学结构的化合物,主要分为黄酮醇、黄酮、二氢黄酮、异黄酮等。黄酮类化合物广泛存在于蔬菜、水果、牧草和药用植物中,许多植物的叶、皮、根和果实中都含有大量的黄酮类化合物,如银杏叶、茶叶、葛根、大豆、芹菜、黄瓜、小麦等[5]。根据所提取植物的不同,黄酮类物质有几千种之多,包括槲皮素、山奈黄素、柚皮素、染料木黄酮、茶黄素、杨梅黄酮、万寿菊黄素、漆树黄酮、表没食子儿、水飞蓟素等。大量研究表明,黄酮类化合物具有清除自由基、抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗菌、抗病毒和调节免疫、防治血管硬化、降血糖等功能[6]。黄酮类化合物以纯天然、高活性、见效快、作用广泛等特点日益受到人们的关注。本文就植物黄酮类化合物抗病毒活性的最新研究进展及其抗病毒作用机制进行综述,以期找到抗病毒活性强,毒性低的天然产物,为植物黄酮类抗病毒药物的开发和利用提供参考。

1 植物黄酮抗病毒活性

1.1 抗流感病毒活性

由流感病毒引起的流行性感冒是严重危害人类健康的急性呼吸道传染病,它具有传染性高、传播速度快,易爆发流行等特点,寻找有效的抗流感病毒药物目前已成为人们广泛关注的问题。据文献报道[7],黄酮类物质是抗流感病毒的活性成分之一,其可以抑制流感病毒唾液酸酶的活性和抑制膜融合作用。野漆树双黄酮乙对甲型流感病毒和乙型流感病毒的抑制活性很高,EC50分别为2.0、0.2μg/m L,选择性指数为16、454;穗花杉双黄酮和贝壳杉黄酮也能显著抑制甲型流感病毒和乙型流感病[8]。黄芩中的异黄芩素-8-甲醚能显著抑制流感病毒[9];黄芩水煎对亚洲甲型流感病毒有较好的抗病毒作用,其所含药效成分黄酮类化合物对流感病毒唾液酸酶有很强的抑制作用[10]。芦丁黄酮类化合物具有抗流感病毒、脊髓灰质炎病毒的感染和复制能力[11]。石钺等[12]用色谱技术进行分离,波谱等方法鉴定结构,结果从银翘散抗流感病毒有效部位群中分离得到6种黄酮类成分,为醉鱼草苷、金合欢素、橙皮苷、异甘草素、异甘草苷和金丝桃苷。推断黄酮类成分可能是银翘散抗流感病毒作用的主要物质基础之一。

1.2 抗人免疫缺陷病毒(HIV)活性

HIV感染已成为威胁人类健康的致命杀手之一。研究发现许多黄酮类化合物被证明有抗HIV病毒活性[13,14]。在寻找天然抗病毒化合物的过程中,从菊花中得到1个新的黄酮葡萄糖醛酸苷,并分析了其结构和抗HIV活性。新化合物为芹菜苷元7-O-β-D-(4-咖啡酰)-葡糖醛酸苷。其活性很强,抑制HIV-1整合酶的IC50为7.2μg/m L,抗HIV活性的EC50为41.86μg/m L[15]。黄腐醇是从蛇麻草中分离得到的黄酮类化合物,发现有抗HIV-1作用,EC50为0.82μg/m L[16]。山奈黄素3-O-B-D吡喃葡萄糖苷,有抑制白血病和抗HIV病毒的作用[17]。原花青素是植物中广泛存在的一大类多酚类化合物的总称,为双黄酮的衍生物。Nair等[18]研究表明,葡萄籽提取物原花青素能够抑制HIV-1病毒在外周血单核细胞中的复制和表达。现代药理研究证明,甘草素与异甘草素有很强的抑制HIV病毒的能力。甘草香豆素属于异黄酮类的衍生物,甘草吡喃香豆素等多种甘草黄酮类成分可抑制HIV诱导的巨细胞形成,且未见细胞毒性。甘草查尔酮A在质量浓度为20μg/m L时,能抑制HIV诱导的巨细胞形成[19]。据日本学者报道,从甘草活性成分研究中所得到的黄酮类成分,能加强HIV对ATL2IK(来源于成人T细胞性白血病患者的细胞株)的拮抗作用,其中2种新甘草查尔酮低浓度时显示出对HIV增殖的抑制作用[20]。

1.3 抗单纯疱疹病毒(HS V)活性

单纯性疱疹病毒能引起口唇疱疹、生殖器疱疹、脑炎及内脏器官的感染,这些都严重威胁着人类的健康。阿福豆苷和槲皮素3-O-α-D-吡喃阿拉伯糖苷具有非常强的抑制HSV-1活性[21],槲皮素抑制HSV-1具有显著的量效关系,EC50为22.6mg/L,质量浓度在60.0 mg/L时抑制率接近100%[22]。穗花杉双黄酮、贝壳杉双黄酮对HSV-2也有中等抑制作用,IC50分别为48.0、8.5μg/m L[23]。黄芪黄酮治疗HSV-1感染的豚鼠效果与阿昔洛韦相近[24]。黄蜀葵花总黄酮对HSV-1和HSV-2均有一定的抑制作用,IC50分别为1.01、1.21mg/L[25]。王志杰等[24]用人疱疹病毒HSV-1、HS-1株感染豚鼠皮肤,结果显示黄芪总黄酮具有较好的治疗效果。从白花丹科植物中华补血草根中分离的左旋儿茶素-3-O-没食子酸具有显著的抑制单纯疱疹病毒复制的活性,且没有细胞毒性。它的抗HSV-1活性比阳性对照药阿昔洛韦更高[26]。

1.4 抗柯萨奇病毒活性

柯萨奇病毒属于肠道病毒,在消化道细胞内繁殖释放,再通过血液循环侵犯其他器官,引起各种综合病症。从紫草科紫珠草属植物东方紫珠草中分离得到的3-甲氧基黄酮有抗柯萨奇病毒B3的能力[27]。Tait等[28]报道了一类高异黄酮在体外对一系列肠道病毒的抑制作用,发现该类黄酮有显著的抗柯萨奇病毒B1、B3、B4、A9的活性,其IC50在4.0~200μmol/L。木犀草素在0.30~9.75μg/m L内对柯萨奇病毒B3均有显著的抑制细胞病变的作用[29]。

1.5 抗呼吸道合胞病毒(RS V)活性

呼吸道合胞病毒是婴幼儿下呼吸道感染的最主要病原,发病率高,可导致严重的毛细支气管炎和肺炎,还会造成免疫功能紊乱,给儿童的身体健康带来严重的影响。目前,从七叶树种子中分离得到2个新的黄酮类化合物,活性测试显示出强的抗RSV活性,IC50分别为4.5、6.7μg/m L[30]。金莲花总黄酮对RSV有一定的抑制作用[31,32]。槲皮素体外具有很强的抗RSV的活性,其IC50仅为2.5μg/m L[33]。穗花杉双黄酮也有很强的抑制RSV活性,其IC50为5.5μg/m L[34],而汉黄芩素、木蝴蝶素、黄芩素、高黄芩素、甘黄芩素和黄芩苷等黄酮类化合物抑制RSV活性相对较弱,其IC50在7.4~83.3μg/m L[35]。野葛花乙醇提取物提取的染料木素和鸢尾苷元对RSV有较好的抑制作用,两者的IC50分别为12.5、30μg/m L[36]。

1.6 抗轮状病毒(RV)活性

轮状病毒是引起人和动物急性非细菌性腹泻的主要病原之一,它是婴幼儿急诊和死亡的第二大疾病,严重威胁着人类健康,是世界卫生组织和我国重点防治的疾病之一。临床上采用番石榴叶治疗RV感染性腹泻,疗效显著。夏仁飞等[37]对黄酮类物质体外抗轮状病毒的研究表明:番石榴叶黄酮可增强MA-104细胞的抗RV感染作用,对RV感染MA-104细胞有显著的治疗效果,可降低RV的毒力,削弱其感染能力。其IC50为23.33μg/m L。但目前对番石榴叶黄酮的有效成分抗RV的机制还不明了,尚待进一步研究。

2 植物黄酮抗病毒作用机制

抗病毒药物的作用目的是对病毒特有的步骤进行干扰,根据病毒在其生命周期中所处场所不同,病毒首先必须吸咐与穿入致敏细胞才能引起感染,利用药物来扰乱这些识别与吸咐过程,就可以起到抗病毒作用;病毒进入细胞后要进行DNA的复制、蛋白质的表达以及核酸与蛋白质外壳的装配等一系列复杂的生物化学反应,筛选的药物如果能抑制这些步骤中的某一反应,就能抑制病毒的复制与增殖。

2.1 抗流感病毒作用机制

目前研究表明,黄酮类化合物抑制流感病毒机制主要是抑制流感病毒复制、直接杀死病毒、抑制流感病毒生长和流感病毒唾液酸酶的活性,以及抑制膜融合的作用。连翘、金银花、野菊花、黄莲、黄芩、大青叶、鱼腥草、柴胡等多数含有大量的黄酮类化合物,这些都具有抑制流感病毒唾液酸酶活性及膜融合的作用[38]。

2.2 抗HIV作用机制

HIV能选择性地感染CD4细胞从而导致机体免疫缺陷,它通过膜蛋白与细胞膜表面的CD4受体结合,病毒核心进入细胞,并在酶作用下脱去蛋白壳,以病毒RNA为模板逆转录合成单链DNA,经细胞的DNA聚合酶合成双链互补DNA(c DNA)。c DNA经环化后整合到细胞染色体上,病毒核酸随细胞的分裂而传至子代细胞。

目前黄酮类化合物抑制HIV病毒的机制大致分为:抑制逆转录酶、抑制整合酶、抑制蛋白酶、阻止病毒与细胞CD4受体结合、抑制糖基化、影响HIV的装配和释放[39]。而植物黄酮类化合物抗HIV主要集中在逆转录酶和整合酶。

在HIV-1逆转录酶试验中多种多羟甲氧基黄酮表现出良好的抗HIV活性[40]。黄芩甙与黄芩素对HIV逆转录酶的活性有抑制作用,并观察到黄芩甙在H9细胞培养中能抑制HIV-1的复制。赵晶的进一步研究发现,黄芩素抑制HIV-RT活性较黄芩甙强。黄芩素是一种强的鼠白血病病毒(MLV)和人免疫缺失病毒(HIV)逆转录酶活性的抑制剂[9]。从黄花夹竹桃分离得到的4个黄酮类化合物对HIV-1逆转录酶中RNA依赖性的DNA聚合酶具有明显的抑制作用,而且对HIV-1整合酶的抑制活性也很高[41]。芹菜素-7-O-β-D-(4’’-咖啡酰)-糖醛酸苷抑制HIV-1整合酶的IC50为7.2μg/m L,EC50为41.86μg/m L[42]。

2.3 抗HS V作用机制

黄酮类化合物抑制HSV作用机制主要集中在3个方面:1)直接杀灭病毒[43],如表儿茶素(EC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、高良姜素和山柰酚;2)阻断病毒感染[43,44],如儿茶素、表没食子儿茶素(EGC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、柚皮素、白杨素、黄芩苷、非瑟酮、杨梅酮和samarangenin B等,其中EGCG和samarangenin B抑制HSV-1复制的效果优于阳性对照阿昔洛韦;3)抑制病毒细胞诱导的细胞病变[44],如EC、ECG、染料木素、柚皮素和槲皮素。

2.4 抗柯萨奇病毒作用机制

黄酮类化合物主要是通过保护细胞功能和增强机体免疫功能来抗柯萨奇病毒的。如黄芩苷可增强心肌组织的SOD活力,从而增强内源性氧自由基清除系统的功能;黄芩苷及茎叶总黄酮对细胞膜上的Na+-K+ATP酶有稳定保护作用,对减轻细胞水肿、保护细胞功能有重要作用[45]。Tait等[29]认为黄酮能够干扰柯萨奇病毒的复制和RNA在细胞内的释放,或阻止病毒RNA的合成。

3 问题与展望

抗病毒药物是病毒病治疗的有力武器之一,尤其是近年来有了长足的进展,在病毒病的防治中取得了令人瞩目的成绩,一改过去无能为力的局面。抗病毒药物的研究范围也不断丰富和扩大,从早期的抗流感病毒的药物金刚烷胺的研究,到抗疱疹病毒的药物,以及近年来的抗艾滋病病毒和抗乙肝病毒的药物研究,足以证明抗病毒药物研究在成果不断扩大的基础上进入了飞速发展期。但仍存在不少缺点,不能满足人民健康的需求。因此,抗病毒药物的研究任务仍然非常艰巨,人们需要高效、低毒、价廉、选择性高的防治病毒病药物。