LC-MS/MS法测定大鼠血浆中的叶黄素含量

2022-11-01

叶黄素是一种具有多种生物学功能的重要类胡萝卜素, 自然界中大多存在于水果、花卉和蔬菜中。商品化的叶黄素是万寿菊花经提取、皂化制备得到。叶黄素具有多种生理功能, 抗氧化和消除自由基[1,2]、过滤蓝光作用使眼睛和皮肤避免光损伤[3]、优越的着色作用等等。但是人体不能自己合成叶黄素, 必须从饮食中摄入或额外补充, 因此评价其营养价值并测定其在血浆中浓度和生物利用情况具有现实意义。类胡萝卜素的测定方法有紫外可见分光光度法和高效液相色谱法[4,5,6], 但尚少见测定血浆中叶黄素含量和预处理LC-MS/MS法。本文意在建立一种高效可行的LC-MS/MS法, 测定血浆中的叶黄素浓度, 为进一步研究其分布及代谢提供实验依据和理论参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

美国Agilent 1290-6460串联四极杆LC/MS/MS液质联用仪:美国Agilent公司;AB204-A电子分析天平:梅特勒-托利多上海仪器公司;XW-80A微型涡旋混合仪:上海精科实业有限公司;离心机:上海手术器械厂。

1.2 试剂和药品

甲醇和叔丁基甲醚均为色谱纯, 分别购自美国Merck公司和阿拉丁试剂 (上海) 有限公司。蒸馏水, 购自广州屈臣氏食品饮料有限公司。叶黄素工作对照品, 新昌制药厂提供。内标:麦角甾醇, 购自百灵威科技有限公司。

1.3 动物

清洁级SD大鼠, 体重230~280 g, 购自浙江省实验动物中心。

1.4 方法

1.4.1 色谱条件

色谱柱:Agilent Eclipse Plus C18柱 (2.1 mm×50 mm×1.8mm) ;流动相:甲醇-0.1%甲酸溶液 (87:13) ;流速:0.45 m L/min;柱温:35℃;进样量:5μL。

1.4.2 质谱条件

离子源:大气压电离源 (APCI) ;气体温度:300℃;APCI加热器温度:350℃;气体流速:4 L/min;喷雾器压力:30 psi;检测方式:正离子模式;扫描方式:多反应监控扫描;内标法定量 (麦角甾醇为内标) 。

1.4.3 对照品溶液和内标溶液的配制

对照液的配制:称取一定量的叶黄素对照品溶于DMSO中配制成浓度为10.0 mg/m L标准储备液, 临用前用甲醇稀释成相应浓度。

内标液的配制:称取一定量的内标麦角甾醇用甲醇溶解配制成浓度为0.4 mg/m L储备液, 临用前用甲醇稀释成500 ng/m L的内标液。

1.4.4 血浆样品处理

量取100μL血浆样品于1.5 m L的离心管中, 加入5μL麦角甾醇内标液和100μL乙醇, 涡旋振荡3 min, 加入800μL叔丁基甲醚, 旋涡振荡5 min, 13200 r/min离心10 min, 取上清液真空抽干, 残渣用100μL流动相旋涡振荡3 min复溶, 13200 r/min离心15 min。取上清液5μL, 进样进行LC-MS/MS测定。

2 结果

2.1 色谱行为

空白血浆、叶黄素血浆标准品以及大鼠血浆样品LC/MS/MS色谱图见图1。由图1可知, 在本实验条件下, 叶黄素和内标分离效果良好, 血浆中内源性物质不干扰叶黄素和麦角甾醇的测定。叶黄素和内标的保留时间分别为2.78 min和3.57 min。

图1 LC-MS色谱图 (1*—叶黄素, 2.78 min;2*—内标, 3.57 min) A:空白血浆;B:空白血浆加叶黄素对照;C:大鼠口服100 mg/kg叶黄素制品4h血浆样品

2.2 线性关系及定量下限

分别配制浓度为5 ng/m L, 10 ng/m L, 20 ng/m L, 50 ng/m L, 100 ng/m L, 160 ng/m L, 200 ng/m L叶黄素血浆标准品溶液, 按“血浆样品处理”方法进行处理后, 进样分析检测, 记录色谱图。以浓度为横坐标 (X) , 以A叶黄素与A内标峰的比值为纵坐标 (Y) , 进行线性回归分析, 得叶黄素的线性回归方程为Y=0.003386X+0.01715 (n=3, r=0.997) , 线性范围为5 ng/m L~200 ng/m L, 定量下限为5 ng/m L (n=5;RSD<10%) 。

2.3 回收率试验

用空白血浆分别配制浓度为10 ng/m L、50 ng/m L、160 ng/m L的叶黄素血浆标准质控样品, 按“血浆样品处理”方法进行处理后, 进样分析检测, 记录色谱图。加样回收率用所测定的峰面积带入标准曲线方程得到的对应的浓度与实际浓度比值来表示;提取回收率以提取后所测物质峰面积与对应浓度样品直接进样获得的峰面积的比值来计算。每个浓度平行测定5次。结果见表1。

2.4 基质效应

分别取100μL空白血浆和甲醇, 除不加内标外, 其他按“血浆样品处理”方法处理, 在抽干操作以后, 分别加入浓度为10ng/m L、50 ng/m L、160 ng/m L质控样品、5μL内标溶液及甲醇, 涡旋振荡3 min后, 13200 r/min离心15 min。取上清液5μL, 进样分析测定。每个浓度平行测定5次, 计算基质效应, 结果见表2。从表2可以看出, 纯溶剂和空白血浆两种处理方式的测定结果比值均大于93%, 说明所选定的试验条件有效地避免了基质效应。

2.5 样品稳定性

用空白血浆配制浓度分别为10 ng/m L、50 ng/m L、160 ng/m L的叶黄素血浆质控样品, 每种浓度3份, 按按“血浆样品处理”方法处理后, 分别于0、4、8 h进行测定, 结果如表3所示。试验结果表明, 样品经8 h放置后不稳定, 应尽快分析测定。

2.6 大鼠血浆中叶黄素浓度的测定

6只大鼠单剂量给予100 mg/kg叶黄素制品后, 分别在不同时间点取血, 按照“1.4.4”项方法处理样品后, 对血浆中叶黄素浓度进行测定, 测定结果见表4。

3 结语

本实验建立了一种LC-MS/MS方法测定大鼠血浆中的叶黄素, 并且对该方法进行进行验证。结果表明本法专属性好、定量限低、准确度高、快速, 满足叶黄素在生物样品中的测定要求, 适用于大批量生物样品分析和叶黄素药代动力学研究。

摘要：目的:建立了测定大鼠血浆中叶黄素含量的LCMS/MS法。方法:血浆样品经乙醇沉淀蛋白, 叔丁基甲醚萃取, 真空抽干及流动相溶解等预处理过程后, 进行LC-MS/MS分析。以甲醇-0.1%甲酸水溶液 (87:13, V:V) 为流动相, Agilent Eclipse Plus C18柱 (2.1 mm×50 mm, 1.8 mm) 进行分离。采用大气压化学电离源 (APCI) 、多反应监控 (MRM) 方式进行正离子检测, 内标法定量 (内标为麦角甾醇) 。结果:测定血浆中叶黄素的线性范围为5200 ng/m L, 线性相关系数r=0.997;定量下限为5 ng/m L;低 (10 ng/m L) 、中 (50 ng/m L) 、高 (160 ng/m L) 三个浓度的方法回收率分别为69.7%、94.9%和98.1%;提取回收率分别为75.3%、70.9%和73.4%。结论:本方法分析测试时间短、灵敏度高, 适用于血浆样品中叶黄素的测定。

关键词：叶黄素,液相色谱-串联质谱法,血浆药物浓度