养兔技术研究论文

山西省农科院畜牧专家介绍养猪专家贺东昌山西省农科院畜牧兽医研究所所长，中国畜牧兽医学会理事，山西省畜牧兽医学会副理事长。从事猪育种、饲养管理、动物营养、猪病预防等研究与技术推广工作，培育的“晋阳白猪母本系”获山西省科技进步一等奖。可为养猪场提供包括猪场设计、饲养管理、猪病预防等综合系列技术服务。下面是小编精心推荐的《养兔技术研究论文(精选3篇)》，欢迎阅读，希望大家能够喜欢。

养兔技术研究论文 篇1：

我国首株兔出血症病毒2型的致病性及病理学初步研究

摘要：为深入研究国内首次发现并鉴定的兔出血症病毒2型（RHDV2）四川分离株SC2020/04的致病性，用SC2020/04 RHDV2分离株，以皮下注射方式感染25日龄仔兔和4月龄成年兔，记录家兔发病情况，对病死兔进行剖检，并取肝脏样品进行血凝（HA）和核酸检测，取心、肝、脾、肺、肾、十二指肠等组织制作病理切片，进行病理学研究。试验结果显示，感染后仔兔18 h出现死亡，成年兔40 h出现死亡，死亡率均为5/5;感染后试验兔出现典型兔瘟临床症状，濒死时四肢抽搐、角弓反张，部分死亡兔可见口鼻流出红色血液;剖检主要病变为肝脏肿大并伴有明显的小叶样改变，脾肿大，肺、肝、脾和肾出现充血和弥漫性瘀点出血，腹腔内有血样渗出物;血凝试验结果显示，病死仔兔和成年兔肝脏血凝效价没有明显差异;采用鉴别经典RHDV/RHDV2的RT-PCR方法检测攻毒死亡兔肝脏样品，结果显示为RHDV2阳性;病理学观察可见多脏器严重出血、肿胀，淋巴细胞和中性粒细胞大量浸润，病死仔兔十二指肠组织严重糜烂，成年兔十二指肠病变较轻。本研究对我国首个RHDV2毒株进行了致病性初探和病理学观察，研究结果可以为RHDV2疫苗研发和致病机理研究奠定基础。

关键词：兔出血症病毒2型;临床症状;剖检病变;病理学观察

收稿日期：2020-05-20

基金项目：国家重点研发计划（编号：2018YFD0502203）;现代农业产业技术体系建设专项资金（编号：CARS-43-C-1）。

作者简介：范志宇（1982—），男，山西太谷人，博士，副研究员，主要从事家兔疫病防控技术研究，E-mail：fanzhiyu2007@163.com;共同第一作者：陈萌萌（1987—），女，江苏连云港人，博士，助理研究员，主要从事家兔疾病防治与兽医生物技术研究，E-mail：moonchen2010@yeah.net。

通信作者：王 芳，博士，研究员，主要从事家兔重要疫病致病机制及防控技术研究。E-mail：rwangfang@126.com。  兔出血症（rabbit hemorrhagic disease，简称“RHD”）俗称“兔瘟”，是由兔出血症病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，简称“RHDV”）引起的一种急性、烈性、高致死性传染病。经典RHDV只感染家兔，2月龄以上家兔易感，病死率可达90%，常于感染后48～72 h死亡，死亡兔以呼吸系统和肝、脾、肾、心等实质脏器瘀血、肿大和出血为特征，幼兔不易感[1]。2010年，在法国首次发现了RHDV的新毒株，命名为RHDV2或RHDVb，随后该毒株蔓延到意大利、西班牙、葡萄牙、英格兰、苏格兰和德国，在欧洲RHDV2取代经典RHDV的趋势正在扩大[2-3]。在澳大利亚和亚速尔群岛也有检测到RHDV2的相关报道[4-5]。2020年4月，我国四川省发生疑似病例，经多种检测方法确定病原为RHDV2[6]，这是我国首次发现RHDV2型毒株[7]，由此可见，RHDV2的流行趋势正在世界范围内逐步扩大。据OIE数据报道，当感染RHDV2时，7～15日龄的幼龄动物中也可以观察到明显的临床症状和死亡，病死率可达90%。为了掌握我国首次发现的RHDV2型毒株的致病性和攻毒动物发病特征，本研究以25日龄仔兔和4月龄成年兔为攻毒对象，观察攻毒后试验兔的临床症状、剖检病变以及病理学变化，以期为RHDV2疫苗研发和致病机理研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料

含兔出血症病毒2型病死兔肝脏由江苏省农业科学院兽医所兔病学科团队鉴定并保存[6]，命名为SC2020/04（GenBank登錄号：MT383749）;经典兔出血症病毒对照RHDV皖阜株由笔者所在实验室保存;阴性肝脏来自邳州市东方养殖有限公司的SPF兔。实验兔购自江苏省明天农牧科技有限公司，合格证号NO.202004338。

1.2 分离株感染试验

1.2.1 感染用病毒制备 在生物安全柜中，剔除含RHDV2病死兔肝脏上结缔组织，取少许肝脏，加入PBS后匀浆，使匀浆中含肝脏质量（g） ∶ PBS的体积（mL）为1 ∶ 10，反复冻融3次，以8 000 r/min离心30 min，取上清用0.22 μm滤器进行除菌，标记为SC2020F1备用。

1.2.2 实验兔饲养管理 实验兔饲养于负压强毒攻毒动物房，试验过程中注意人员的防护，产生的垃圾和动物尸体等经高压灭菌后无害化处理，试验结束后对环境进行彻底消毒。动物处理详见《病害动物和病害动物产品生物安全处理规程》（GB 16548—2006）。

1.2.3 感染试验观察及取样 将5只25日龄仔兔和5只4月龄成年兔分别颈部皮下注射SC2020F1，1 mL/只，使用监控设备观察发病死亡情况，及时剖检死亡兔并无菌取相关组织器官备用。

1.3 微量血凝试验

取病死兔少许肝脏样品，剪碎，按1 g ∶ 10 mL加入PBS后匀浆，反复冻融3次，以8 000 r/min离心 30 min，取上清进行微量血凝试验，具体参照《兔病毒性出血病血凝和血凝抑制试验方法》（NY/T 572—2016）。

1.4 死亡兔核酸鉴定

将死亡兔肝脏样品与DEPC水按1 g ∶ 10 mL比例研磨成悬液，离心取上清，按照Trizol法提取RNA，利用反转录试剂盒获得病毒cDNA，用笔者所在实验室建立的鉴别经典RHDV/RHDV2的RT-PCR方法，以cDNA为模板，进行兔出血症病毒VP60基因片段的扩增。经典RHDV扩增产物大小为193 bp，RHDV2扩增产物大小为829 bp。

1.5 病理学观察

将无菌采集的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠等组织器官浸入4%多聚甲醛溶液中固定，经石蜡包埋、切片，进行H.E染色，在光学显微镜下观察病理学变化并拍照;以无菌采集安乐死后健康25日龄仔兔和4月龄成年兔正常组织制作病理切片作为对照。

2 结果与分析

2.1 临床症状

通过监控观察发现，攻毒兔在注射病毒后12 h内有少量的采食和饮水行为，之后攻毒仔兔食欲、饮欲基本废绝，成年兔采食和饮水次数比仔兔稍多，但采食量明显下降，直至死亡。攻毒兔死亡前几小时精神沉郁、呼吸困难、反应迟钝，最紧急的病例在症状出现后1～2 h内迅速死亡，濒死前表现有短暂的兴奋，突然倒地，划动四肢呈游泳状，濒死时四肢抽搐，用力蹬后肢，角弓反张，部分死亡兔可见口鼻流出红色血液（图1），肛门松驰，肛周有少量淡黄色黏液和粪便附着。

2.2 剖检病变

剖检可见各脏器有不同程度的肿胀、充血、出血，尤其是胸腺、肺脏、肝脏出现严重出血。鼻腔、喉头和气管黏膜、气管环瘀血、出血，气管和支气管内有泡沫状血液;胸腺出血，散在针头大出血点;肺有不同程度充血、瘀血、水肿，切开肺脏流出多量红色泡沫状液体;肝脏瘀血、肿大、质脆，表面发黄，切面粗糙，切开流出大量暗红色血液;脾脏瘀血、肿大，呈暗红色;肾脏肿大，并见有大小不等的出血点，呈黑紫色;膀胱积尿，内充满黄褐色尿液，部分病例尿液中混有絮状凝块。血液凝固不良，攻毒兔死亡后肺脏、肝脏等依然出血，胸腔和腹腔可见有未凝固的血液，死亡时间较长的在胸腔和腹腔有血凝块（图2）。

2.3 微量血凝试验

颈部皮下注射SC2020F1毒株的10只家兔全部在72 h内死亡。用微量血凝试验测定不同时间死亡的攻毒兔肝脏样本血凝效价。结果显示仔兔死亡时间明显早于成年兔，死亡更快，病死仔兔和成年兔肝脏血凝效价没有明显差异（表1）。

2.4 核酸鉴定

以病毒cDNA为模板，使用经典RHDV/RHDV2鉴别引物进行扩增，结果显示，10个攻毒死亡兔肝脏样品在829 bp位置均出现单一的RHDV2的特异

性条带，在193 bp位置未出现经典RHDV特异性条带（图3）。说明本试验攻毒死亡兔全部由于感染RHDV2死亡，且没有污染经典RHDV。

2.5 病理变化

对死亡仔兔和成年兔各脏器做石蜡切片，染色观察结果见图4和图5。

攻毒死亡仔兔肝脏组织肝小叶结构不甚清晰，肝细胞索排列紊乱，肝细胞胞核染色质边集，较多肝细胞胞质中可见大小不一的脂肪空泡（图4-E 绿色箭头）; 较多肝细胞点状坏死，胞核碎裂、消失;个别汇管区周围可见结缔组织增生（图4-E 蓝色箭头）。脾脏组织白髓数量明显减少，残留的白髓体积大小不一（图4-D 黑色箭头）;红髓正常结构消失，大量纤维组织增生（图4-D 绿色箭头），缺少红细胞和淋巴细胞。肺脏组织局部支气管黏膜可见水肿和毛细血管充血，伴散在的炎性细胞浸润;可见

少数几处肺泡腔出血（图4-C黑色箭头）。肾小球毛细血管瘀血，少量毛细血管袢玻璃样变（图4-B绿色箭头）;少量肾小管坏死（图4-B红色箭头）;多数肾小管可见刷状缘脱落（图4-B黄色箭头）。十二指肠组织严重糜烂，黏膜上皮细胞坏死、脱落（图4-A 绿色箭头），固有层裸露，毛细血管充血扩张（图4-A黑色箭头）;较多腺体结构消失（图4-A蓝色箭头）;固有层底部可见少量炎性细胞浸润（图4-A 黄色箭头），心脏未见明显病变。仔兔与成年兔主要组织病理学差异是仅在仔兔中发现肠道病变。

攻毒死亡成年兔肝脏组织肝小叶结构不甚清晰，较多肝细胞点状坏死（图5-E黑色箭头），胞核碎裂、消失;少量肝窦可见瘀血、出血;汇管区局部可见结缔组织增生，伴散在的炎性细胞浸润（图5-E绿色箭頭）。脾脏组织白髓数量明显减少，残留的白髓体积减小（图5-D黑色箭头）;红髓正常结构消失，可见大量嗜酸性纤维样物质。肺细支气管中可见巨噬细胞浸润（图5-C 蓝色箭头）;广泛肺泡腔轻度增厚（图5-C黑色箭头）;小血管周围可见少量炎性细胞浸润（图5-C绿色箭头），有的可见血栓形成（图5-C黄色箭头）。肾小球毛细血管瘀血，少量毛细血管袢玻璃样变（图5-B绿色箭头）;少量肾小管坏死（图5-B红色箭头）;多数肾小管可见刷状缘脱落，少量肾小管中可见嗜酸性细颗粒状物质。十二指肠（图5-A）和心脏（图5-F）未发现明显病变。

3 讨论

在本研究中，中国分离株SC2020/04（RHDV2/GI.2）引起的临床症状和剖检病变与GI.1毒株引起的经典RHD非常相似，主要区别是40日龄以下家兔对经典RHDV不易感，哺乳仔兔不发病[8]，而RHDV2可引起仔兔发病死亡，OIE出版的《陆生动物疫苗和诊断手册》指出7～15日龄的幼龄动物中可以观察到明显的临床症状和死亡率，Dalton KP等[9]研究发现，RHDV2对11日龄及以上家兔即可感染致死，死亡兔伴有黄疸症状，但是SC2020/04毒株攻毒死亡兔并未发现有黄疸症状，可能与毒株致病力相关。与GI.1毒株相比，Dalton KP等[9]和le Gall-Recule等[10]研究指出GI.2可引起幼兔死亡，死亡率可达50%，OIE官方数据病死率可达90%。本研究结果显示，仔兔和成年兔均在72 h以内全部死亡，仔兔平均死亡时间为25.6 h，成年兔平均死亡时间为54.8 h，死亡率均为5/5，说明SC2020/04毒株比欧洲较早报道的GI.2菌株致病性更强。因此，可以推测，SC2020/04毒株一旦在中国流行，将对养兔业产生严重危害甚至造成毁灭性打击，相关疫苗研究刻不容缓。

RHDV作为一种嗜肝病毒，对肝脏组织具有明显的致病作用。与以往所有关于RHD的研究一致，肝脏是SC2020/04的靶器官，表现出严重的病理损伤，组织肝小叶结构不甚清晰，较多肝细胞点状坏

死，胞核碎裂、消失。总之，在仔兔和成年兔引起了与GI.1病毒相同的肝损伤。在成年兔和仔兔脾脏组织白髓数量明显减少，残留的白髓体积大小不一，这可能与病毒感染造成的淋巴细胞减少有关。Marques等发现感染兔肝脏和脾脏的淋巴细胞明显减少[11]，Teixeira等也发现成年兔急性RHDV致死性感染中调节性T细胞也减少[12]。另外，仔兔和成年兔组织病理病变的主要差异是仔兔的十二指肠有明显的病理损伤，而成年家兔不明显，这可能与病毒受体表达、仔兔先天性免疫和肠道功能的改变有关[13-15]。

参考文献：

[1]Abrantes J，van der Loo W，le Pendu J，et al. Rabbit haemorrhagic disease （RHD） and rabbit haemorrhagic disease virus （RHDV）：a review[J]. Veterinary Research，2012，43（1）：12.

[2]le Gall-Recule G，Zwingelstein F，Boucher S，et al. Detection of a new variant of rabbit haemorrhagic disease virus in France[J]. Vet Rec，2011，168（5）：137-138.

[3]王 芳，陈萌萌，宋艳华，等. 兔出血症病毒新毒株RHDV2 的流行与控制（综述） [J].江苏农业科学，2016，44（ 9）：1-3.

[4]Strive T，Piper M，Huang N，et al. Retrospective serological analysis reveals presence of the emerging lagovirus RHDV2 in Australia in wild rabbits at least five months prior to its first detection[J]. Transbound Emerg Dis，2020，67（2）：822-833.

[5]Rouco C，Abrantes J，Serronha A，et al. Epidemiology of RHDV2 （Lagovirus europaeus/GI.2） in free-living wild European rabbits in Portugal[J]. Transbound Emerg Dis，2018，65（2）：e373-e382.

[6]魏后军，胡波，范志宇，等. 兔出血症病毒2 型的分离鉴定与序列分析[J]. 江苏农业学报，2020，36（ 2）：404-409.

[7]Hu B，Wei H J，Fan Z Y，et al. Emergence of rabbit hemorrhagic disease virus 2 in China in 2020[J]. Authorea，May 06，2020. DOI：10.22541/au.158880187.76685134.

[8]王 芳，范志宇，薛家宾. 兔病图鉴[M]. 北京：中国农业科学技术出版社，2019：68-84.

[9]Dalton K P，Nicieza I，Abrantes J，et al. Spread of new variant RHDV in domestic rabbits on the Iberian Peninsula[J]. Vet Microbiol，2014，169（1-2）：67-73.

[10]le Gall-Recule G，Lavazza A，Marchandeau S，et al. Emergence of a new lagovirus related to rabbit haemorrhagic disease virus[J]. Vet Res，2013，44：81.

[11]Marques R M，Teixeira L，Aguas A P，et al. Immunosuppression abrogates resistance of young rabbits to rabbit haemorrhagic disease （RHD）[J]. Vet Res，2014，45：14.

[12]Teixeira L，Marques R M，Aguas A P，et al.Regulatory T cells are decreased in acute RHDV lethal infection of adult rabbits[J]. Vet Immunol Immunopathol，2012，148（3/4）：343-347.

[13]Ruvoen-Clouet N，Ganiere J P，Andre-Fontaine G，et al. Binding of rabbit hemorrhagic disease virus to antigens of the ABH histo-blood group family[J]. J Virol，2000，74（24）：11950-11954.

[14]Kopecky J，Grubhoffer L，Kovar V，et al. A putative host cell receptor for tick-borne encephalitis virus identified by anti-idiotypic antibodies and virus affinoblotting[J]. Intervirology，1999，42（1）：9-16.

[15]Neimanis A，Pettersson U L，Huang N N，et al.Elucidation of the pathology and tissue distribution of Lagovirus europaeus GI.2/RHDV2 （rabbit haemorrhagic disease virus 2） in young and adult rabbits （Oryctolagus cuniculus） [J]. Vet Res，2018，49：46. 陳赛赛，郑亚婷，郭容利，等. 几株伪狂犬病病毒的增殖特性与保存条件[J]. 江苏农业科学，2020，48（11）：148-152.

作者：范志宇 陈萌萌 胡波

养兔技术研究论文 篇2：

专家介绍

山西省农科院畜牧专家介绍

养猪专家贺东昌 山西省农科院畜牧兽医研究所所长，中国畜牧兽医学会理事，山西省畜牧兽医学会副理事长。从事猪育种、饲养管理、动物营养、猪病预防等研究与技术推广工作，培育的“晋阳白猪母本系”获山西省科技进步一等奖。可为养猪场提供包括猪场设计、饲养管理、猪病预防等综合系列技术服务。联系电话：0351-7561990/13703519673

养羊专家毛杨毅 山西省农科院畜牧兽医研究所副所长，山西科元动物胚胎工程中心主任，中国畜牧兽医学会养羊学分会常务理事，山西省畜牧兽医学会养羊研究会副理事长，山西省农学会理事，山西省新世纪学术技术带头人，333人才工程省级人选，山西省雁门关生态畜牧经济区建设专家组成员，山西省农科院党委联系的高级专家。从事养羊及动物胚胎工程技术研究，面向养羊业开展技术培训和指导。联系电话：0351-7561728/13603510638

兽医专家韩一超 山西省农科院畜牧兽医研究所副所长，山西省畜牧兽医学会理事，家畜普通病研究会常务理事，中国兽医外科学会会员，共青团山西省委农村技术顾问，山西省扶贫基金会专家组成员，山西省猪高致病性蓝耳病专家指导组成员，山西省科协农科110专家，山西省岚县科技顾问。从事家畜普通病的科学研究工作，先后主持和承担省级以上科研项目10多项，取得科技成果10项。技术专长为动物疫病防治、动物医学临床诊疗，面向畜牧业生产，开展奶牛、猪、羊疾病诊疗技术方面的服务。联系电话：0351-7561984/13934551656

养兔专家任克良 山西省农科院畜牧兽医研究所副所长、养兔研究室主任，国家家兔产业技术体系太原试验站站长、执行专家组成员，中国兔业协会常务理事、专家组成员，山西省畜牧业协会兔业分会副理事长兼秘书长。从事家兔育种、营养、疾病及胚胎生物工程技术研究。可为养兔场提供包括兔场设计、饲养管理、疾病诊断及预防等技术服务和指导。

联系电话：0351-7561557/13703587119

兽医专家詹丽娥 山西省农科院畜牧兽医研究所预防兽医学研究室主任，中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会理事，山西省传染病学分会副秘书长，山西省委联系的高级专家，山西农科110专家委员会委员。从事预防兽医学、动物传染病学与人兽共患传染病学科研工作。面向养鸡生产，开展动物传染病、人畜共患传染病（如禽流感）等综合防治技术培训与服务，推广鸡IBD弱毒疫苗等鸡猪用疫苗新产品。联系电话：0351-7561767/13603560389

养牛专家杨效民 山西省农科院畜牧兽医研究所养牛研究中心主任，农业部奶牛科技入户工程山西省首席专家，中国良种黄牛育种委员会常务理事、中国西门塔尔牛育种委员会理事，中国畜牧兽医学会养牛学分会理事，山西省农科院党委联系的高级专家。

研究开发、推广应用高产奶牛、现代奶业生产技术和“晋畜乐”肉牛生长促进素、反刍动物“NPN”补充料等无毒、无害、无残留污染、无公害动物生产新技术产品。面向广大养殖园区、场、户，提供包括草料加工生产、日粮配合、繁殖育种、犊牛培育、疫病防治、养殖环境治理及标准化饲养、科学化管理等各方面，开展技术培训和现场指导。联系电话：0351-7561037/13073521159

兽医专家李思源 山西省农科院畜牧兽医研究所办公室主任、工会主席，中国畜牧兽医学会常务理事，山西省畜牧兽医学会副秘书长。主要从事兽医、中兽医药科研和推广工作。

联系电话：0351-7561320

肉鸡养殖专家张李俊 山西省农科院畜牧兽医研究所所科研办公室主任。

从事肉鸡养殖技术研究和生产一线服务指导，主持省攻关“肉鸡规模安全养殖综合技术”项目，可为规模肉种鸡、肉仔鸡养殖提供包括鸡舍设计、饲养管理、疫病防控等提供全程技术培训和服务。

联系电话：0351-7561617/13903469085

蛋鸡育种养殖专家丁馥香 山西省农科院畜牧兽医研究所家禽研究室主任，山西绿原农牧高科技市场负责人，中国优质禽育种委员会常务理事。从事蛋鸡养殖技术研究和生产指导，可为规模蛋种鸡、商品蛋鸡、优质鸡（土鸡、仿土鸡）养殖生产提供包括鸡舍设计、饲养管理、疫病防控等全程技术培训和服务。联系电话：0351-7561967/13513602046

畜产品安全生产专家马启军 山西省农院畜牧兽医研究所畜禽环境与资源研究室主任。从事畜禽舍建筑规划设计、畜禽健康养殖工艺研究及设施设备开发、畜禽养殖环境及控制研究等工作。

联系电话：0351-7561537/13513613999

草坪专家王运琦 山西省农科院畜牧兽医研究所绿原草业研究中心主任。从事牧草栽培育种研究，获各级科技进步奖多项，研究开发的城市绿化科技新产品“草坪卷”，畅销各地。

联系电话：0351-7561971/13835183512

兽医专家薛俊龙 山西省农科院畜牧兽医研究所兽医生物工程技术研究室主任，中国畜牧兽医学会禽病学分会成员，山西省高致病性禽流感防控指挥部专家组成员。从事以动物疫病防控技术为重点的兽医科学研究工作，主持和参加省部级科研项目多项，可提供动物养殖兽医技术服务。

联系电话：0351-7561470/13503518606

牧草专家刘建宁 山西省农科院畜牧兽医研究所绿原草业研究中心副主任。从事牧草栽培育种工作，推广普那菊苣等优质牧草品种，开展牧草栽培、饲用技术培训与服务。

联系电话：0351-7561971/13834647712

养牛专家李军 从事牛的育种、饲养管理、胚胎移植等研究工作。可提供牛育种、胚胎移植、高产高效技术；牛场的设计规划、养牛技术培训等服务。联系电话：0351-7561037/13803498977

养兔技术研究论文 篇3：

兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗安全性及效力试验

摘要：本研究旨在对实验室制备的兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗的安全性和效力进行全面系统的研究。实验室制备了5批次兔出血症病毒杆状病毒载体灭活疫苗，按照现行《中国兽药典》附录对疫苗进行了性状、无菌检验、甲醛残留量、安全及效力试验。结果显示，5批次疫苗无菌检验、甲醛残留量均合格；疫苗对肉兔、獭兔、毛兔3个品种家兔均安全，接种疫苗后30、60 d，剖检注射部位未见炎症反应，疫苗吸收良好，并且疫苗对怀孕母兔、未断奶仔兔、断奶幼兔也安全；对肉兔各项生产性能也没有影响，说明该疫苗具有较好的安全性。疫苗免疫21 d后，易感家兔和母兔均能抵抗兔出血症强毒攻击，说明该疫苗免疫原性良好。

关键词：兔出血症病毒杆状病毒；灭活疫苗；安全性试验；效力试验

收稿日期：2015-07-02

基金资助：现代农业产业技术体系建设兔体系病毒病预防与控制岗位（编号：CARS-44-C-1）；公益性行业（农业）科研专项（编号：201303046）；江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（14）4048]。

作者简介：范志宇（1982—），男，山西太谷人，博士，助理研究员，主要从事家兔疾病防治与兽医生物技术研究。Tel：（025）84390337；E-mail：fanzhiyu2007@163.com。

通信作者：王芳，博士，研究员，主要从事家兔重要疫病的病原学、快速诊断、流行病学、致病机理、疫苗研制、综合防控技术等方面的研究。Tel：（025）84390337；E-mail：rwangfang@126.com。兔出血症，又称兔瘟，是由兔出血症病毒（rabbit haemorrhagic disease virus，RHDV）引起的一种以急性、高度传染性、大面积死亡为特征的兔传染病，主要临床特征为呼吸系统出血、肝变性、实质器官瘀血及出血性变化[1-3]。本病常呈暴发性流行，发病率和病死率极高，感染兔通常于48～72 h死亡，给养兔业造成极大的经济损失。该病自然感染只发生于兔，主要危害40日龄以上幼兔、育成兔和成年兔，40日龄以下幼兔和部分老龄兔不易感，哺乳仔兔不发病[2-4]。带毒兔及病死兔的内脏器官、肌肉、毛、血液、分泌物、排泄物是主要的传染源，带毒兔和被病毒污染的饲料、饮水、用具也是重要的传染源或传播媒介。目前该病的主要预防措施是使用组织灭活疫苗免疫，然而传统组织灭活苗的制备存在诸多的缺陷和不足，因此，需要探索新的生产疫苗的途径[5-6]。

RHDV是杯状病毒科成员，结构简单，仅有1个主要结构蛋白VP60，在诱导抗病毒感染的免疫反应中起重要作用，是病毒免疫保护性抗原，用杆状病毒系统表达RHDV的VP60能够自发地组装成病毒样粒子（VLPs），其在形态和抗原性上都与天然的病毒粒子无异但不包含病毒RNA基因组。研究发现RHDV VLPs在兔体内可以诱导机体产生很强的体液免疫应答、细胞免疫应答和黏膜免疫应答。此外，RHDV VLPs具有成本低、获取方便等优势，已经成为应用性预防治疗中可靠的分子工具[3-7]。在前期研究的基础上，于实验室用RHDV重组VP60制备了5批次疫苗，并对疫苗开展了系统的研究。

1材料与方法

1.1种毒

重组兔出血症病毒VP60杆状病毒，由江苏省农业科学院兽医研究所构建并保存[5]。攻毒用毒种为兔出血症病毒皖阜株肝毒。Sf9昆虫细胞，由江苏省农业科学院兽医研究所保存。

1.2试验兔

2～3月龄健康易感肉兔、獭兔、毛兔（兔出血症病毒抗体HI效价不高于1 ∶2），健康怀孕20～25 d母兔，20～30日龄未断奶仔兔、35日龄已断奶幼兔（未免疫兔出血症及相关疫苗），均由金陵种兔场提供。

1.3试剂

Sf-900TMⅡSFM 培养基，购自GIBCO公司。硫乙醇酸盐培养基（TG）、酪胨琼脂（GA）、葡萄糖蛋白胨培养基（GP）、氢氧化铝胶溶液由南京天邦生物科技有限公司制备并检验。

1.4抗原制备及红细胞凝集效价的测定

将重组兔出血症病毒VP60杆状病毒接种Sf9昆虫细胞，于27～28 ℃培养，连续观察，待细胞病变达85%以上时，收获细胞培养物。将收获接种种毒的细胞培养物反复冻融3次，取50 μL于50孔板，用PBS作2倍比稀释，加入等体积1%人O型红细胞悬液，振荡均匀，置于2～8 ℃作用45 min，观察结果，检测表达蛋白的HA效价[8-9]。

1.5灭活及灭活检验[9]

向细胞培养物中加入甲醛溶液（终浓度为0.2%），37 ℃灭活24 h。取灭活细胞培养物，接种生长良好的Sf9细胞，于27～28 ℃条件下培养，同时设立未灭活的细胞培养物为阳性对照，按上述方法接种Sf9细胞，连续5 d观察细胞病变，收获细胞培养物，置-20 ℃以下反复冻融3次，接种生长良好的Sf9细胞盲传1代，培养5 d，观察细胞病变，并测定其血凝性。

1.6疫苗制备

将检验合格的细胞培养物和氢氧化铝胶按9 ∶1充分混匀振荡，定量分装，加盖密封，贴签。

1.7成品检验

1.7.1性状取疫苗瓶上下颠倒混匀，观察外观及颜色，然后将疫苗瓶于2～8 ℃静置24 h，再次观察外观及颜色。

1.7.2无菌检验按2010版《中国兽药典》附录进行检验。

1.7.3甲醛残留量测定按2010版《中国兽药典》附录进行检验。

1.8安全试验[10]

1.8.1单剂量安全试验

1.8.1.1单剂量安全试验实验室制备的5批次疫苗（批号：101、102、103、104、105）各用2～3月龄健康易感家兔5只，分别皮下注射1 mL/只，同时以相同条件家兔作为对照，不接种疫苗，观察家兔精神状态、饮食、粪便、局部及全身反应等，连续观察14 d。

1.8.1.2单剂量重复安全试验5批次疫苗各用2～3月龄健康易感家兔5只，分别皮下注射1 mL/只，14 d后，重复皮下注射相同剂量的灭活疫苗，以相同条件家兔作为对照，不接种疫苗，观察家兔精神状态、饮食、粪便、局部及全身反应等，连续观察14 d。

1.8.2超剂量安全试验

1.8.2.1不同品种家兔安全试验实验室制备的5批次疫苗各用2～3月龄健康易感肉兔、獭兔、毛兔各5只，分别皮下注射2 mL/只，同时以相同条件家兔作为对照，不接种疫苗，观察家兔精神状态、饮食、粪便、局部及全身反应等，连续观察60 d，并于30 d每组取2只、60 d每组取3只安乐死后进行剖检，观察疫苗注射部位局部组织疫苗吸收和炎症反应情况。

1.8.2.2怀孕母兔安全试验5批次疫苗各用怀孕20～25 d 母兔5只，分别皮下注射2 mL/只，以相同条件不接种疫苗家兔作为对照，观察精神状态、饮食、粪便、局部及全身反应等，并观察怀孕母兔妊娠、分娩及胎儿健康状况，观察期14 d。

1.8.2.3其他日龄家兔安全试验5批次疫苗各用35日龄断奶未免疫兔出血症疫苗的幼兔5只，并各用20～30日龄未断奶未免疫兔出血症疫苗的仔兔5只进行安全试验，处理方法同“1.8.2.2”节。

1.8.2.4对肉兔生产性能的影响5批次疫苗各用35～40日龄的健康肉兔5只，分别皮下注射2 mL/只，以相同条件家兔作为对照，不接种疫苗，每日10：00测量并记录 14 d 内家兔的体温，观察45 d内家兔生长发育情况，记录注射疫苗时和观察期结束时家兔的体质量，观察期内饲料消耗的重量，观察期结束时出栏家兔数量，并计算家兔增重、饲料报酬（料肉比）、出栏率等。

1.9效力试验

1.9.1易感家兔效力试验实验室制备的5批次疫苗各用2～3月龄健康易感家兔5只，分别皮下注射1 mL/只，21 d后，连同相同条件对照兔5只，各皮下注射兔出血症病毒皖阜株肝毒1 mL，连续观察7 d，记录死亡与保护的动物数量，对死亡兔剖检观察并取肝脏进行人“O”型红细胞凝集试验。

1.9.2怀孕母兔效力试验实验室制备的5批次疫苗各用健康怀孕母兔5只，处理方法同“1.9.1”节。

2结果与分析

2.1抗原红细胞凝集效价

经测定，5批次细胞培养物红细胞凝集效价在1 ∶512～1 ∶1 024 之间，分别为1 ∶1 024、1 ∶512、1 ∶512、1 ∶1 024、1 ∶512。

2.2灭活检验

用甲醛溶液对细胞培养物进行灭活，结果显示，接种灭活细胞培养物的Sf9昆虫细胞及正常Sf9昆虫细胞生长状况良好，细胞分裂正常。收获接毒细胞培养物，于-20 ℃以下反复冻融3次，取适量再次接种生长良好的Sf9细胞，于27～28 ℃ 培养5 d，结果显示，接种灭活细胞培养物的Sf9昆虫细胞及正常Sf9昆虫细胞生长状况良好，细胞分裂正常；而加入未灭活细胞培养物的细胞病变明显，细胞培养物具有血凝性。说明接毒细胞培养物灭活完全。

2.3疫苗配制

按“1.6”节的方法制备试验用疫苗5批次，约4 000 mL/批次，批号为101、102、103、104、105。

2.4性状、无菌检验、甲醛残留量测定

对5批次疫苗进行性状、无菌检验、甲醛残留量测定，结果显示，5批次疫苗（101、102、103、104、105）外观为浅黄色均匀混悬液，静置后上层为浅黄色的澄清液体，下层有少量沉淀。TG小管、GA斜面在37 ℃培养7 d，TG小管、GA斜面、GP小管在25 ℃培养7 d均无菌生长，无菌检验合格。经检验，疫苗甲醛残留量在0.042%～0.087%之间，符合质量标准。

2.5安全试验

2.5.1单剂量安全试验用5批次疫苗对家兔进行单剂量安全试验，连续观察14 d，结果显示，免疫兔和对照兔的精神状态、饮食、粪便等均正常，免疫兔未见疫苗接种引起的异常临床症状，说明疫苗对2～3月龄健康易感家兔单剂量接种及单剂量重复接种均是安全的。

2.5.2超剂量安全试验

2.5.2.1不同品种家兔安全试验用5批次疫苗进行不同品种家兔安全试验，结果显示，观察期60 d，2～3月龄肉兔、獭兔、毛兔3个品种家兔的精神状态、饮食、粪便等均正常；免疫兔未见疫苗接种引起的异常临床症状，疫苗接种后30 d及60 d，剖检注射部位未见炎症反应，疫苗吸收良好，说明疫苗对不同品种的家兔是安全的。

2.5.2.2怀孕母兔安全试验用5批次疫苗进行怀孕母兔安全试验，结果显示，观察期14 d，免疫兔和对照兔的精神状态、饮食、粪便等均正常；免疫兔未见疫苗接种引起的异常临床症状，母兔均正常妊娠、分娩，免疫兔和对照兔生产的仔兔数量没有差异，胎儿健康，未见异常，说明疫苗对怀孕母兔是安全的。

2.5.2.3其他日龄家兔安全试验用5批次疫苗对其他日龄家兔进行安全试验，结果显示，观察期14 d，未断奶仔兔、已断奶幼兔的免疫兔和对照兔精神状态、饮食、粪便等均正常，仔兔正常断奶，并且生长良好；免疫兔未见疫苗接种引起的异常临床症状，说明该疫苗对未断奶仔兔和已断奶幼兔均是安全的。

2.5.2.4对肉兔生产性能的影响用5批次疫苗进行肉兔生产性能影响试验，结果显示，观察期14 d，免疫兔和对照兔体温处于38.5～39.5 ℃的正常范围内，免疫兔与对照兔相比较，体温没有明显差异（图1）。观察期45 d，免疫兔和对照兔生长发育均良好，免疫组各5只家兔共增加体质量分别为6 207、6 367、6 314、5 960、6 068 g，对照组5只家兔共增加体质量6 108 g，由此计算饲料报酬（料肉比），免疫组与对照组相比较，差异不显著（P>0.05）；出栏率均为100%（表1）。结果说明该疫苗对肉兔生产性能没有影响。

2.6效力试验

用5批次疫苗进行效力试验，结果（表2）显示，5批疫苗免疫易感家兔全部健康存活，对照兔死亡5只，死亡兔出现兔出血症典型的病理变化，对死亡兔肝脏悬液作人“O”型红细胞凝集试验，均为RHDV阳性。另一组攻毒结果显示，5批疫苗免疫母兔全部健康存活，对照兔死亡4只，死亡兔出现兔出血症典型的病理变化，对死亡兔肝脏悬液作人“O”型红细胞凝集试验，均为阳性。结果说明该疫苗可以对母兔和易感家兔提供完全保护。

3讨论

目前，由于兔出血症病毒不能在兔体以外的组织或细胞上增殖，因此，只能通过用强毒接种易感兔，收获含毒组织制成乳剂，用甲醛灭活后制成疫苗[6，11]。这种生产方式主要存在以下缺陷和不足：易感兔来源少、生产成本高、污染物安全处理困难且易造成散毒、动物福利难以保障等。利用基因工程技术开发新疫苗是解决当前传统疫苗问题的有效途径，国内外已经用大肠杆菌、酵母、昆虫细胞等多种表达系统对RHDV的免疫蛋白VP60进行了表达，并且多数表达系统都表现出良好的免疫原性[3，12]。杆状病毒系统表达的RHDV重组衣壳蛋白能够很好地自聚形成能够凝集人“O”型红细胞的病毒样颗粒（VLPs），由于VLPs结构与成熟病毒相似，但不含病毒核酸，不具有感染性，所以在体内这种空壳结构VLPs不会引发感染，因此作为疫苗非常安全[13]。而且VLPs能够在很低剂量的抗体情况下引发有效的保护性反应，这将大大降低疫苗的成本，同时该表达系统具有低成本、高表达和易于规模生产等特点[14，15]。

本研究在完成重组兔出血症病毒VP60杆状病毒毒种的构建及特性研究的基础上，实验室试制了5批次疫苗（批号101、102、103、104、105），共计约20 000 mL。按照现行《中国兽药典》附录对5批次疫苗进行性状、无菌、甲醛残留量检验及安全、效力试验，结果显示，5批次疫苗无菌检验、甲醛残留量均合格。安全性结果表明，该疫苗可以用于怀孕母兔，优于目前市售组织灭活疫苗，并且对20～30日龄未断奶仔兔、35日龄已断奶幼兔都非常安全，对肉兔的各项生产性能也没有影响。本研究的安全性试验是使用5批次疫苗免疫3个品种家兔的多次试验完成的，试验结果说明该疫苗对各个年龄段的家兔均是安全的。疫苗免疫21 d后2～3月龄家兔和母兔用致死剂量的兔出血症病毒攻击保护率都达100%，说明该疫苗免疫原性良好。该疫苗具有较高的安全性和良好的免疫原性，市场前景乐观。

参考文献：

[1]陆承平. 兽医微生物学[M]. 北京：中国农业出版社，2007：457-458.

[2]谷子林，秦应和，任克良. 中国养兔学[M]. 北京：中国农业出版社，2013：509-511.

[3]Abrantes J，van der Loo W，le Pendu J A. Rabbit haemorrhagic disease （RHD） and rabbit haemorrhagic disease virus （RHDV）：a review[J]. Veterinary Research，2012，43：12-21.

[4]Marques R M，Teixeira L，guas A P，et al. Immunosuppression abrogates resistance of young rabbits to Rabbit Haemorrhagic Disease（RHD）[J]. Veterinary Research，2014，45（1）：1-6.

[5]王芳，胡波，任雪枫，等. 兔出血症病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及对家兔的免疫保护效果[J]. 畜牧兽医学报，2008，39（10）：1382-1387.

[6]Huang H B. Vaccination against and immune response to viral haemorrhagic disease of rabbits：a review of research in the People’s Republic of China[J]. Revue Scientifique et Technique，1991，10（2）：481-498.

[7]Marín M S，Martín A J ，Pérez O G L，et al. Immunogenic properties of rabbit haemorrhagic disease virus structural protein VP60 expressed by a recombinant baculovirus：an efficient vaccine[J]. Virus Research，1995，39（2/3）：119-128.

[8]王启明，董亚芳. NY/T572—2002兔出血病血凝和血凝抑制试验方法[S].

[9]中国兽药典委员会. 中华人民共和国兽药典：三部[M]. 北京：中国农业出版社，2011.

[10]唐应华，陆吉虎，吴培培，等. 免疫增强剂对禽流感疫苗免疫持续期、安全性和鸡淋巴细胞转化的影响[J]. 江苏农业学报，2014，30（4）：821-825.

[11]宁宜宝.兽用疫苗学[M]. 北京：中国农业出版社，2008：390-391.

[12]Mikschofsky H，Schirrmeier H，Keil G M，et al. Pea-derived vaccines demonstrate high immunogenicity and protection in rabbits against rabbit haemorrhagic disease virus[J]. Plant Biotechnology Journal，2009，7（6）：537-549.

[13]Ludwig C，Wagner R. Virus-like particles-universal molecular toolboxes[J]. Current Opinion in Biotechnology，2007，18（6）：537-545.

[14]Perez-Filgueira D M，Resino-Talavan P，Cubillos C，et al. Development of a low-cost，insect larvae-derived recombinant subunit vaccine against RHDV[J]. Virology，2007，364（2）：422-430.

[15]Fernández E，Toledo J R，Chiong M，et al. Single dose adenovirus vectored vaccine induces a potent and long-lasting immune response against rabbit hemorrhagic disease virus after parenteral or mucosal administration[J]. Veterinary Immunology and Immunopathology，2011，142（3/4）：179-188.董亚青，朱文斗，王琳琳，等. 鸡α-干扰素在毕赤酵母中的表达及其表达条件优化[J]. 江苏农业科学，2015，43（11

：275-277.

作者：范志宇　魏后军　胡波等