微型自由流动电泳芯片的分离模式

2023-02-07

1 简介

由于可以分离生物分子, 电泳技术普遍应用于生物化学中。常用的有凝胶电泳, 毛细管电泳技术 (CE) , 和自由流动电泳技术FFE) 。在自由流动电泳技术中, 压力用来驱动样品流经一个平面分离通道。一个电场被垂直地加到流体流动的方向上, 用来是分析物各自偏转, 实现分流。与毛细管电泳不同, 样品的注射, 分离和采集可以连续不断地进行。自由流动电泳技术的连续性提供了一种产量很高的分离机制, 使得该技术在分离诸如肽, 酵母, 以及蛋白质等物质方面成为一种很有用的预分离技术。目前已有多种商用的预分离式自由流动电泳设备。电泳的多种模式, 比如区带电泳 (ZE) , 等点聚焦 (IEF) , 等速电泳 (ITP) , 和地步电泳已证实也可应用与自由领域。本文主要对这四种模式进行探讨。

2 分离模式

持续的样品分离和检测使得微型自由流动电泳技术优于诸如HPLC或CE等传统的分离技术。与其他电泳方法相同, 已发展出多种µFFE的操作模式, 包括区带电泳 (ZE) , 等电聚焦电泳 (IEF) , 以及等速电泳 (ITP) 。目前大多数关于µFFE的研究处于用概念验证性实验阶段, 而这种技术的应用才刚刚开始。

3 微型自由区带电泳 (µFFZE)

本文总结了多种使用µFFE设备的不同的区带电泳分离模式。第一个µFFE设备就是利用区带电泳模式分离荧光标记的氨基酸。接下来的研究使用相同的设备证明了µFFE能够分离大生物分子, 比如分离缓激肽, 核糖核酸酶A, 以及人类血清蛋白。此设备的限制电场为50V·cm-1, 分离通道中的电压可达2.5V·cm-1。稍后, Kobayashi等人, 在一个拥有大分离通道 (56.5mm宽×35mm长×30mm深) 的全玻璃式芯片上分离了两种蛋白质:细胞色素C和肌球胆白。外加高约285V·cm-1的电压可获得连续性分离。第一个PDMSµFFE芯片分离了荧光染料染色素, 罗丹明110和标记氨基酸。设备分离所用时间为7 2 m s, 所用电场强度为283V·cm-1。稍后的设计改善, 使分离通道中的电压达到了586V·cm-1。

4 微型自由等电聚焦电泳 ()

等电聚焦是另一种常用µ的FF分IE离F模式。该模式普遍用于CE和FFE分离技术中, 已经证明可用于微型自由流动电泳。IEF技术分离分子是基于它们的等电点 (pI) 。当提供外加电场时, 分离通道中会建立起pH值梯度。电极上的电解水和两性电解质缓冲混合液产生了这个pH梯度。带电分析物会随着pH梯度迁移, 直到它们到达与自身pI相等的pH带。任何对这个位置的偏转都会使得分子带电并且重新聚焦。

微型自由流动等电聚焦由Xu等第一次使用在先前介绍过的一个µFFE设备。微型化对IEF很有益, 因为它减少了分子聚焦时必须经过的距离。Xu指出应用于µFFIEF的微型比例定律减小了他们设备的聚焦时间。根据分子质量输送的比例定律, 尺寸减小十倍, 分离速度会加快100倍。相较于传统的自由流动等电聚焦电泳设备, 微型芯片的样品汇聚速度要快400倍。

利用微型自由流动电泳芯片, 已经获得了许多成功的分离。第一个微型自由流动电泳设备聚焦了荧光染料和标记了的血管紧缩素Ⅰ和Ⅱ。Albrecht和Jensen提出了一种在分离通道中使用功能性凝胶的µFFIEF设备。这种功能性凝胶提供了pH值缓冲, 并且阻止了电解气泡进入分离通道。在随后的论文中, Albrecht和Jensen提出了第一个执行内嵌背靠背式分离的微型自由流动设备。

5 微型自由等速电泳 (µFFITP)

等速电泳通过将样品放置在两种迁移率不同的缓冲液中的方法, 来分离和浓缩大量的样品。这种模式被广泛地应用于毛细管电泳, 自由流动电泳和微型自由流动电泳芯片中。考虑到可利用其连续流动的优势与其他微全分析设备整合, 微型自由流动等速电泳是作为一种提前浓缩小样品量的方法被提出的。已经建立相应的数学模型来优化FFITP, 但是目前这些模型对于微型自由流动等速电泳模式的有效性还没有得到实验确认。

Janasek等人在聚焦荧光素, 乙酰水杨酸和曙红G实验中首次使用了µFFITP模式。外加电场强度为525V, 电场在分离室内的停留时间为50s。

6 微型自由地步电泳 (µFFFSE)

自由流动电泳中的最后一种分离模式是地步电泳。在地步电泳芯片中, 高电导绿的缓冲液被加在分离室的边缘处, 在这样品迁移率会减少的位置建立起了一个“墙”, 从而形成了个与ITP中相似的聚焦带。在最近的一篇综述中, Kohlheyer等首次简要地介绍了一种自由流动地步电泳芯片。作者报告说用这种芯片从罗丹明B中分离和聚焦了荧光素, 但是到发稿为止, 还没有进一步的资料报导。