碱度对杀菌剂去除生物膜的影响

前言

用来冷却工艺介质的系统称作冷却水系统。冷却水系统通常有两种:直流冷却水系统和循环冷却水系统。因为循环冷却水系统可以节约大量的冷却水, 且排污水也相应减少, 所以在工业系统中循环冷却水系统得到了广泛的应用。

然而由于冷却水在循环系统中不断循环使用, 导致水温升高, 蒸发, 各种无机离子和有机物质的浓缩, 以及灰尘中蛋白质和碳水化合物的累积。而冷却水中的细菌利用这些条件进行大量繁殖, 产生一种胶状的、黏泥状的、附着力很强的黏性物质。这些黏性物质与水中的悬浮物、沙粒、藻类等物质黏附在一起, 会形成生物膜[1]。而这种生物膜覆盖在金属的表面上, 会显著降低冷却水的冷却效果, 并阻碍杀菌剂对其附着部位下层微生物的杀灭作用, 此外, 生物膜也会使金属表面形成差异腐蚀电池而发生沉积物下腐蚀[2]。同时生物膜所含的致病细菌, 会通过冷却循环水在冷却塔喷淋降温时所产生的水雾传播到周围环境中, 从而造成健康隐患[3]。因此, 为了保证工业循环冷却水稳定, 安全的运行, 必须对生物膜进行严格控制。目前通常采用的生物膜处理方法是使用具有一定生物膜穿透能力的非氧化性杀菌剂 (如异噻唑啉酮、溴硝基丙二醇、季胺盐和十二烷基胍盐酸盐等) 和具有生物膜剥离效果的表面活性剂[4], 但是循环冷却水投加杀菌剂的过程中, 一般根据微生物种类来选择不同的杀菌剂, 却往往忽略了水质本身对杀菌剂效果的影响, 从而造成杀菌剂的过量叠加使用。而过量使用杀菌剂不仅会为生产企业带来经济上的负担, 而且残余的杀菌剂毒性较大、不易生物降解, 会影响循环冷却水排污水的后续处理[5]。

碱度是冷却循环水中一个非常重要的指标。碱度是指水中含有能接受H+离子的物质的量。对于循环冷却水系统, 总碱度应为CO32-, HCO3-, OH-之和, 用等值的Ca CO3表示[mg (Ca CO3) /L]。1979年帕科拉兹 (Puckorius) 认为水的总碱度比水的实际测定p H值能更准确地反映冷却水的腐蚀与结垢倾向[6]。然而, 碱度的影响对生物粘泥的形成和杀菌剂的使用尚无研究报导。

本研究通过在培养体系中添加不同浓度的Na HCO3来调节总碱度, 研究不同水体总碱度下荧光假单胞菌形成生物膜的情况, 以及生物膜分泌物的变化。同时在不同总碱度下, 研究目前常用的几种杀菌剂对荧光假单胞菌所形成生物膜的杀菌效果, 并分析水的总碱度可能对杀菌剂药效的影响机理。从而为工业冷却水系统更加有针对性地选择相应的高效杀菌剂, 降低运行成本, 并为后续研发绿色、环保的生物膜控制技术提供理论依据和技术保障。

一、材料与方法

1.试验材料

(1) 菌株荧光假单胞菌ATCC 13525。

(2) 主要仪器及试剂

自动电位滴定仪, 万通862;酶标仪, Perkin Elmer VICTOR3;培养箱, 精宏HWS-400;恒温培养摇床, 福玛QYC-200;8道排枪, BIOHIT;96微孔板, Greiner 655090;0.22μm过滤器, Corning431096。

葡萄糖;营养肉汤 (Nutrient Broth, NB) , OXOID CM0001;胰蛋白胨大豆肉汤 (Tryptone Soya Broth, TSB) , OXIOID CM0129;胰蛋白胨大豆琼脂, (Tryptone Soya Agar, TSA) , OXOID CM0131;碳酸氢钠, 无菌盐水 (0.85%氯化钠, 121℃灭菌15min) , 刃天青, 316不锈钢挂片, BCA (bicinchoninic acid asssy) Protein Assay Kit, Pierce#23225。

2.试验方法

(1) 培养基的配置及其碱度的调节

0.1%葡萄糖营养肉汤培养基的配置:在1L超纯水中加入13g NB, 121℃灭菌15min。5g超纯水中加入1g葡萄糖, 0.22μm孔径过滤器过滤, 然后加至已灭菌的1L NB中混合, 得到0.1%葡萄糖培养基溶液。

碱度的调节:循环冷却水总碱度范围一般从100到1000[mg (Ca CO3) /L]不等。通过添加不同量的碳酸氢钠至上述0.1%葡萄糖营养肉汤培养基, 配置不同碱度的培养基, 用氢氧化钠和盐酸调节p H值至6.8, 选定总碱度值180 (培养基碱度) 、300、598、976[mg (Ca CO3) /L]作为实验条件, 总碱度值用电位滴定仪测得。

(2) 荧光假单胞菌的培养

将荧光假单胞菌甘油管划线接种于TSA平板活化后, 以V (菌液) :V (培养基) =1:1000接种于质量分数为3%TSB培养基, 30℃, 120rpm过夜培养至活菌数量达到约10^9CFU/ml。10000rpm离心10min, 去除上清液, 重新悬浮于NB, 备用。

(3) 生物膜增殖实验

分别取100μl重新悬浮的菌液接种至9.9ml碱度为180、300、598、976[mg (Ca CO3) /L]的0.1%葡萄糖营养肉汤培养基中, 振荡摇匀后, 吸取200μl至96孔板中, 每碱度接种20孔。同一培养板设空白对照 (等体积不含菌液的不同碱度的培养基) 各4孔。30℃恒温静置培养24小时后, 倒出培养液, 无菌盐水洗板3次, 吸取200μl 2.5μM刃天青至96孔, 30℃恒温静置培养2小时后, 用酶标仪测定其激发光波长530nm及发射光波长590nm的数值。

(4) 挂片生长生物膜及其胞外聚合物 (EPS) 含量测定

316不锈钢挂片预处理:在去离子水中加入洗洁精, 超声30min去油污, 用去离子水润洗后, 用异丙醇浸泡30min消毒, 再用无菌水润洗, 悬挂于无菌烧杯中。

生长生物膜:分别取8ml重新悬浮的菌液接种至792m L碱度为180、300、598、976[mg (Ca CO3) /L]培养基中, 分别置于标有不同碱度的烧杯中, 以500rpm速度磁力搅拌培养。室温培养24小时后, 分别取出挂片, 用无菌盐水润洗挂片上的悬浮菌液, 并用无菌刮刀分别将挂片上的生物膜刮入2ml无菌盐水中。

EPS测定[7]:分别取上述2ml菌液中的700μl加至含有6μl37%甲醛的1.5m L离心管中, 振荡混匀, 静置4℃1小时。加入400μl 1M Na OH, 振荡混匀, 静置4℃3小时后, 在14000g、4℃的条件下离心10min。取得上清液, 并测得上清液中蛋白质和多糖的含量, 以蛋白质和多糖两者之和作为EPS的含量。蛋白质含量测定用BCA kit的方法, 多糖含量测定用苯酚-硫酸法[8]。

(5) 不同碱度对杀菌剂去除生物膜效果的影响

在同一96孔板中, 接种相同浓度的菌液分别至四组不同碱度的培养基中 (每组两行, 24孔) , 在30℃静置培养24小时后, 倒出悬浮液, 并用无菌水润洗3次, 并加入相应碱度的培养基100μl/孔。分别配制杀菌剂异噻唑啉酮, 复配异噻唑啉酮和溴硝基丙二醇, 季胺盐, 复配季胺盐和十二烷基胍盐酸盐的4倍原液于不同碱度的培养基中。在培养好生物膜的96孔板中, 每块板的第一列加入同一种杀菌剂, 对应于各碱度下各加100μl, 然后对半稀释至第10列, 并移除100μl。第11、12列不添加杀菌剂, 作为空白对照。再补充100μl不同碱度的培养基至相应的碱度, 最终体积为200μl/孔。放置30℃培养箱静置24小时后, 倒去悬浮液, 用无菌水润洗3次后, 加入200μl/孔2.5m M刃天青染料, 再放置30℃培养箱静置2小时后, 用酶标仪测定其激发光波长530nm及发射光波长590nm的数值。数据用Graph Pad Prism 6软件分析IC50值。

二、结果与讨论

1.碱度对荧光假单胞菌形成生物膜的影响

从图1可知, 随着总碱度值的增加, 对生物膜的抑制率逐渐提高, 当总碱度为300、598、976[mg (Ca CO3) /L]时, 其抑制率分别为25%、45%、50%左右。

由此可见, 碱度对荧光假单胞菌的生物膜形成有明显的抑制作用。当总碱度达到598[mg (Ca CO3) /L]时能明显抑制生物膜的形成, 但碱度598[mg (Ca CO3) /L]与碱度976[mg (Ca CO3) /L]无明显的差异。

由于碱度不同, 即使p H相同, 也会由于Na+导致电导有所差异, 实验测得选定碱度的电导分别为12.55、12.59、12.69、12.81ms/cm。为了检测是否由于电导的变化导致生物膜形成的变化。实验用Na Cl代替Na HCO3, 来调节电导, 并使p H值一致。如图2所示, 电导对荧光假单胞菌形成生物膜的抑制率为6~10%, 无明显差异。

2.碱度对EPS生成的影响

EPS是细菌分泌的粘性物质, 其主要成分是蛋白质和多糖。EPS在生物膜形成的过程中扮演重要的角色, 促进细菌粘附在固体表面。EPS可以降低细菌对杀菌剂的敏感性, 在生物膜-EPS矩阵中担当细菌的避难所[9]。图3显示了6天内不锈钢挂片上不同碱度EPS形成的变化趋势。

由图3结果可知, 随着时间的增加, EPS的含量呈递增的趋势。6天时, 成熟的生物膜分泌的EPS含量比第2天增长了40%以上。

随着碱度的增加, EPS的含量随之减少。生物膜在不同的生长时期, 碱度在976[mg (Ca CO3) /L]时分泌的EPS含量最少, 碱度180[mg (Ca CO3) /L]分泌的EPS含量最多, 与碱度越高, 形成的生物膜越少相一致。

3.不同碱度对杀菌剂去除生物膜的影响

如表1所示, 随着碱度的增加, 抑制生物膜所需的杀菌剂量都有不同程度的减少。在最高碱度下, 异噻唑啉酮、复配异噻唑啉酮和溴硝基丙二醇、季胺盐、复配季胺盐和十二烷基胍盐酸盐的有效剂量相对于其最低碱度分别减少了40%、52%、62%、58%。换言之, 在工业循环冷却水水质碱度为976[mg (Ca CO3) /L]时, 相对于碱度为180[mg (Ca CO3) /L]时, 其杀菌剂有效剂量减少约40%-62%。

碱度对季胺盐、复配季胺盐和十二烷基胍盐酸盐的影响效果, 相比异噻唑啉酮、复配异噻唑啉酮和溴硝基丙二醇更为明显。

结论

碱度对生物膜的形成有很大影响, 碱度越高, 生物膜形成越少, 生物膜分泌的EPS含量也越少。

碱度对不同作用机理的非氧化型杀菌剂, 影响不同。异噻唑啉酮、复配异噻唑啉酮和溴硝基丙二醇是属于代谢抑制作用机理的杀菌剂, 通过与蛋白发生不可逆反应而阻断其正常功能。季胺盐、复配季胺盐和十二烷基胍盐酸盐是属于表面活性剂作用机理的杀菌剂[10]。碱度越高, 季胺盐、复配季胺盐和十二烷基胍盐酸盐所需的有效剂量越少。由于其在水中电离后带正电荷, 是阳离子表面活性剂, 与细胞壁所带的负电荷形成电价键导致细胞壁的通透性改变, 引起细胞的渗透压改变, 也可使蛋白变性, 从而导致细胞死亡。

碱度在976[mg (Ca CO3) /L]时, 能很好抑制生物膜的形成, 同时能很好降低杀菌剂剂量, 但是高碱度水质在冷却水系统中有结垢倾向。因此, 更适合控制碱度在598[mg (Ca CO3) /L], 与碱度976[mg (Ca CO3) /L]相比, 在控制生物膜形成时无明显差异, 且对杀菌剂效果影响类似。

摘要：本文研究不同碱度下生物膜形成差异, 以及碱度对不同类型杀菌剂去除生物膜效果的影响.运用Na HCO3调节不同的碱度, 在不锈钢挂片上生长生物膜, 分析其胞外聚合物 (extracellular polymeric substances, EPS) 生成含量, 同时考察电导对生物膜形成的影响。结果表明:高碱度时, 实验系统生物膜形成量显著降低, EPS含量也相应减少。随着碱度升高, 抑制生物膜生长所需的杀菌剂量逐步减少。但碱度对不同作用机理的杀菌剂的影响程度不一, 其中对于季胺盐 (Quat) 和-十二烷基胍盐酸盐 (DGH) 表面活性剂类杀菌剂的去除生物膜效果的影响较为明显, 达到同样的IC50时, 该类杀菌剂在碱度976[mg (Ca CO3) /L]中投加量比在碱度180[mg (Ca CO3) /L]中减少接近60%。

关键词：碱度,生物膜,杀菌剂

参考文献

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