超声预处理虾下脚料制备抗氧化肽工艺研究

目前, 研究人员已从很多动植物来源的蛋白质酶解产物中提取获得具有抗氧化活性的生物活性肽, 证实具有消除自由基能力, 具备一定的抗氧化活性。虾仁在加工过程中产生了约占85%的虾头和虾壳下脚料。这些下脚料中含粗蛋白36-40%。陈晓明[1]、林丽英[2]等通过实验证明龙虾下脚料的酶解液具有一定的抗氧化活性, 并对制备抗氧化肽的工艺进行了研究。

超声波具有空化作用, 产生的气泡经挤压破裂, 可以瞬间产生极强的机械剪切力, 使蛋白质降解, 或者改变蛋白质构象, 提高酶解效率[3]。康永锋[4]等通过实验证明超声波辅助酶解制备鲑鱼抗氧化肽, 可以提高其提取效率, 侯利霞[5]等也采用超声辅助酶法制备了花生抗氧化肽。而国内外采用超声波辅助酶解虾蛋白制备抗氧化肽的研究还未见报道。

笔者采用超声波预处理虾下脚料, 再进行酶解制备抗氧化肽, 对其工艺进行研究, 并进一步研究其酶解产物的抗氧化能力, 为虾副产物的深度开发利用提供研究基础。

一、材料与方法

1. 材料

(1) 原料。虾下脚料购于武汉市凤凰花园集贸市场。样品用水冲洗后放入55℃干燥箱中烘干28小时, 用高速粉碎机粉碎, 过20目筛保存备用。

(2) 试剂。碱性蛋白酶 (江苏锐阳生物科技有限公司) 、甲醛、氢氧化钠、无水硫酸铜、酒石酸钾钠、三氯乙酸、三氯化铁、硫酸亚铁等均为分析纯。

(3) 仪器。SK3300H超声波清洗仪:上海科导超声仪器有限公司;SHY-2水浴恒温振荡器:江苏金坛市佳美仪器有限公司;紫外可见分光光度计UV-1750:岛津仪器有限公司;PH计 (520) :梅特勒-托利多仪器 (上海) 有限公司

2. 实验方法

(1) 抗氧化肽的工艺流程

经超声波预处理的虾粉, 在一定的条件下, 加碱性蛋白酶, 进行酶解, 酶解液在90℃灭酶10min, 放冷在3500r/min条件下, 离心15min, 得到抗氧化肽水解液。

(2) 超声波预处理条件的工艺优化。

以水解液中多肽含量为评价指标, 根据单因素试验, 选取超声时间 (10、20、30min) 、超声温度 (40、50、60℃) 、料液比 (1:2、1:4、1:6) , 进行3因素3水平的正交试验, 得到最优化超声波预处理条件。

(3) 酶水解工艺的优化。

以水解液中多肽含量和FRAP还原能力为评价指标, 在超声波最佳料液比的基础上, 加入一定的碱性蛋白酶, 并进行单因素试验, 分别考察酶解时间、加酶量、PH、酶解温度对评价指标的影响, 再在此基础上, 进行3因素3水平 (酶解时间2、3、4h、加酶量1.5、2.0、2.5%、酶解温度40、50、60℃) 的正交试验, 获取最佳水解工艺条件。

(4) 水解液中多肽含量测定

双缩脲法[6], 测得线性回归方程为y=0.3544X+0.0131, R 2=0.9982

(5) FRAP抗氧化能力测定

取0.1m L样品, 加入4.9m L10mmol/LTPTZ工作液, 混匀后37℃反应10min, 593nm测定吸光度。以1.0mmol/L硫酸亚铁为标准, 样品抗氧化活性以达到同样吸光度所需的硫酸亚铁的毫摩尔数表示。

二、结果与分析

1. 超声波预处理条件的工艺优化

由正交试验可知:超声波预处理虾粉, 各因素对酶解效果影响的主次顺序为C (料液比) ﹥B (超声温度) ﹥A (超声时间) , 酶解效果最优的方案为C1B3A2。

2. 酶解工艺条件研究

(1) 加酶量对酶解效果的影响

从图1中可以看出, 随着加酶量的不断增加, 酶解产生的肽含量增加, 因此所包含的具有功能性肽的含量也增加, 还原力相应增加。当加酶量大于1.5%时, 溶液肽的含量有所下降。这可能是因为当底物的浓度已达到使酶饱和的状态, 酶与酶之间相互水解和抑制, 同时生成的多肽进一步生成了小分子肽或部分氨基酸, 因此虽然溶液中多肽的含量下降, 但由于某些小分子肽或部分氨基酸也具有抗氧化能力, 因此水解液的整体还原力提高。根据上述结果, 选择最佳加酶量为2.0%。

(2) 酶解温度对酶解效果的影响

从图2可以看出, 随着温度的升高, 酶解溶液中的多肽含量和FRAP还原力上升, 当温度大于60℃时, 多肽含量和FRAP还原力变化幅度不大, 并有下降的趋势。因此选择最佳酶解温度为60℃。

(3) 酶解时间对酶解效果的影响

从图3可以看出, 随着酶解时间的增加, 多肽含量和FRAP还原能力也在不断地增加。当时间超过3小时后, 多肽含量和FR AP还原能力呈现平缓趋势。从经济角度出发, 选择最佳酶解时间为3小时。

(5) 正交法优化酶解工艺条件

通过直观的极差分析法分析结果发现, 影响多肽含量的大小因素依次为加酶量﹥温度﹥时间, 与影响FRAP还原力大小的因素排序一致, 酶解效果最优的方案为A2C3B2, 即加酶量2%、酶解温度60℃、酶解时间3h。

结论

1.通过3因素3水平正交试验, 得出虾下脚料超声波处理的最佳工艺参数为:超声波功率160W、超声时间20min、超声温度60℃、料液比1:2;使用碱性蛋白酶进行酶解, 其酶解最佳工艺参数为:加酶量2%、酶解温度60℃、酶解时间3h。在此工艺条件下, 酶解液中多肽含量可达到0.232 mg/m L。与未经超声波处理的相比较, 抗氧化肽的得率提高了15.25%, 抗氧化能力提高了12.87%。。

2.FR AP法测虾蛋白抗氧化肽的抗氧化试验结果表明, 虾蛋白抗氧化肽具有较强的抗氧化能力, 在最佳酶解条件下, FRAP还原力达到最大值 (0.858 nmol/m L) 。通常情况下, 溶液中具有抗氧化能力肽含量与抗氧化能力呈正相关[7]。

摘要：为优化碱性蛋白酶酶解虾下脚料制备抗氧化肽的研究条件, 采用超声波预处理虾下脚料, 研究超声时间、超声温度、料液比对制备抗氧化肽工艺的影响, 同时也研究了其酶解温度、酶解时间、加酶量、酶解PH对抗氧化肽含量与FRAP还原力大小的影响。结果表明:虾下脚料超声波处理的最佳工艺参数为:超声波功率1200W、超声时间20min、超声温度60℃、料液比1:2;使用碱性蛋白酶进行酶解的最佳工艺参数为:加酶量2%、酶解温度60℃、酶解时间3h。在此工艺条件下, 酶解液中多肽含量可达到0.232 mg/mL, FRAP还原力为0.858 nmol/mL。与未经超声波处理的相比较, 抗氧化肽的得率提高了15.25%, 抗氧化能力提高了12.87%。

关键词：超声预处理,虾下脚料,抗氧化肽

参考文献

[1] 陈晓明等.淡水小龙虾下脚料酶解制备抗氧化肽的工艺研究[J].安徽农业科学, 2011 (39) .

[2] 林丽英等.酶解南美白对虾下脚料制备抗氧化酶解液的研究[J].食品工业科技, 2012 (6) .

[3] 贾俊强等.超声预处理大米蛋白制备抗氧化肽[J].农业工程学报, 2008 (8) .

[4] 康永锋等.响应面优化超声波-微波协同酶解制备鲑鱼抗氧化肽[J].中国油脂, 2012 (8) .

[5] 侯利霞等.超声辅助酶解制备花生抗氧化肽的研究[J].河南工业大学学报, 2012 (2) .

[6] 王晓华等.生物化学与分子生物学实验技术[M].北京:化工出版社, 2008.

[7] Chuan Sheih, Tony J.Fang, Tung-Kung Wu.Isolation and characterisation of a novel angiotensin I converting enzyme (ACE) inhibitory peptide from the algae protein waste[J].food chemistry, 2009, 115.