玉米杂交制种高产分析论文提纲

论文题目：玉米C型不育恢复基因Rf4恢复机理与miRNA调控穗下节间长遗传机制研究

摘要：玉米是重要的粮食与饲料作物,在保证国家粮食安全中发挥了重要作用。杂交种子的生产是保证玉米高产稳产的关键,而细胞质雄性不育系的利用是简化种子生产程序,降低生产成本的一条有效途径,而明确玉米细胞质雄性不育的恢复机理可以为不育化制种技术的应用提供重要的理论与技术支撑。倒伏是影响玉米产量的一个重要因素,而由穗下节间过长引起的穗位过高是引起倒伏的一个重要原因。本课题组在前期研究的基础上,对玉米C型胞质雄性不育恢复基因Rf4的遗传机理进行了研究,并对玉米穗下节间长相关的miRNA及其靶基因进行了分析。主要研究结论如下:1.利用全基因组关联分析对玉米C型胞质雄性不育恢复基因Rf4进行了定位,在第8染色体的短臂上检测到9个显著关联的SNP位点,均位于一个编码转录因子transcptfactorSBPbox的基因内,该基因含有SBP结构域和ANK结构域,结合前期精细定位的结果将其确定为恢复基因Rf4的候选基因。2.根据B73的序列,发现候选基因有3个不同的转录本。对不同的转录本进行验证后发现Rf4-T1包含1个外显子,Rf4-T2不存在,而Rf4-T01包含有11个外显子。结合前期研究结果,说明这个转录本不是恢复基因Rf4。3.利用RACE技术获得Rf4-T01转录本的cDNA全长,序列分析结果表明,不育系和恢复系四分体时期扩增片段都比Rf4-T01短,而且不育系中扩增片段r-RACE有1条,长2043bp;而恢复系中扩增片段有两条,分别是R-RACE-1长1942bp,R-RACE-2长1794bp。经ORF预测发现r-RACE 的 ORF（1545bp）与 R-RACE-2 的 ORF 长度一致,都是 1548bp,都比 R-RACE-2 的 ORF（996bp）多出549bp。说明不育系和恢复系中存在Rf4-T01以外的新转录本。结构域预测发现Rf4-T01有两个结构域,分别是SBP结构域和ANK结构域,而r-RACE、R-RACE-1和R-RACE-2的ORF都只含有一个ANK结构域。4.qRT-PCR分析结果表明,R-RACE-2在87-1三系不同时期表现为组成型表达,但是在不同材料相同时期或者同种材料不同时期表达有差异,其中在不育系的小穗和小花期表达量最高,而在恢复系四分体时期的表达量比其它两个材料四分体时期的表达量高2倍以上,在恢复系单核期的表达量也明显高于其它两个材料对应的时期。说明与不育系相比,恢复基因在四分体时期和单核期是上调表达。5.主要针对两个结构域和Rf4-T01的5’端设计了多抗抗体,分别选87-1不育系CMS-C（rf4rf4rf5rf5）、87-1恢复系CMS-C（Rf4Rf4rf5rf5）、87-1保持系N（rf4rf4rf5rf5）以及单基因Rf5恢复系6233 CMS-C（rf4rf4Rf5Rf5）和CMS-C（Rf4rf4Rf5rf5）的四分体前期、四分体和单核期样品进行Western blot。针对Rf4-T01 5’端设计的多抗抗体,根据对Western blot杂交条带的大小和强弱分析,说明Rf4-T01这个转录本可能不翻译,也不是恢复基因Rf4。对于SBP结构域的多抗抗体,根据对杂交条带的大小,有无和强弱分析,说明含有SBP结构域的转录本有两个,但由于70KD和90KD的杂交带强弱在不同材料不同时期差异不明显,所以编码这两个蛋白的转录本都不是恢复基因Rf4。而对于ANK结构域的多抗抗体,结合RACE获得的结果,说明R-RACE-2是恢复基因Rf4编码蛋白的序列,而且从杂交带强弱可以看出该转录本编码的蛋白在四分体时期和单核期对rf4rf4基因的表达具有掩盖作用。6.选用我国生产上的玉米骨干自交系浚928和浚9058（浚单20的亲本）的穗下第7、第8、第9节间作为研究材料,对其分别进行了 miRNA测序和降解组分析。在自交系浚9058的3个节间材料中共检测出45个两个节间之间表达量差异显著的miRNA;同样在自交系浚928中共检测出54个差异表达的miRNA,在两个自交系中共检测出31个差异显著表达的共同miRNA。根据降解组测序的数据,对属于zma-miR160,zma-miR167、zma-miR164、zma-miR169和zma-miR393 家族的20个miRNA进行了分析。通过降解组测序结果发现其靶基因分别编码生长素应答因子、NAC蛋白、NFY核转录因子和生长素信号分子AFB2。结合前人研究结果,发现差异表达miRNA的靶基因主要在ABA和IAA信号应答中起重要作用,通过应答激素信号调控调节玉米穗下节间生长和发育。

关键词：玉米;雄性不育;恢复机制;穗下节间长;转录组;全基因组分析

学科专业：作物遗传育种

致谢

摘要

第一章 玉米C型不育恢复基因Rf4的遗传机理研究

1 文献综述

1.1 植物雄性不育的概念、分类和作用

1.2 细胞质雄性不育

1.3 细胞质雄性不育的分子机制

1.3.1 线粒体基因和核基因共同参与雄性不育

1.3.2 植物线粒体的主要功能

1.3.3 氧化磷酸化复合体亚基突变体

1.3.4 呼吸系统突变体对花粉合成的影响

1.3.5 不育因子的作用模式与呼吸链组分的关系

1.3.6 引起雄性不育的代谢原因

1.4 细胞质雄性不育的恢复机制

1.4.1 矮牵牛胞质不育的恢复基因

1.4.2 萝卜胞质不育的恢复基因

1.4.3 水稻胞质不育的恢复基因

1.4.4 高粱胞质不育的恢复基因

1.4.5 玉米胞质的恢复基因

1.4.6 育性恢复基因编码未知蛋白

1.5 关联分析

1.6 RACE技术

1.7 选择性剪接

1.8 恢复基因Rf4的前期研究基础

1.8.1 恢复基因Rf4的精细定位

1.8.2 恢复基因Rf4候选基因BAC文库的筛选和序列分析

1.9 本研究的目的和意义

2 引言

3 材料与方法

3.1 试验材料

3.1.1 植物材料

3.1.2 常规菌种

3.1.3 载体

3.1.4 试剂

3.2 实验方法

3.2.1 关联分析

3.2.2 候选基因的转录本预测

3.2.3 候选基因转录产物扩增

3.2.3.1 引物设计

3.2.3.2 实验前的准备

3.2.3.3 RNA提取

3.2.3.4 RNA含量和质量检测

3.2.3.5 cDNA合成

3.2.3.6 PCR扩增

3.2.3.7 PCR产物胶回收

3.2.3.8 PCR胶回收产物与PMD19-T载体连接

3.2.3.9 热激法转化

3.2.3.10 阳性克隆子的筛选

3.2.3.11 菌液PCR检测

3.2.3.12 将检测有目的片段的菌液送公司测序并分析

3.2.4 RACE方法获得候选基因部分片段

3.2.4.1 RNA提取

3.2.4.2 引物的设计

3.2.4.3 cDNA第一链的合成

3.2.4.4 cDNA第二链的合成

3.2.4.5 PCR反应条件

3.2.4.6 PCR扩增后测序分析

3.2.4.7 预测ORF和蛋白分子量

3.2.5 候选基因的qRT-PCR分析

3.2.5.1 qRT-PCR引物设计

3.2.5.2 cDNA的合成方法参考3.2.3

3.2.5.3 PCR检测

3.2.5.4 数据分析

3.2.6 候选基因结构域预测

3.2.7 Western blot检测

3.2.7.1 抗体的制备

3.2.7.2蛋白样品的制备

3.2.7.3 Western杂交步骤

4 结果与分析

4.1玉米C型胞质雄性不育恢复基因的全基因关联分析

4.1.1 恢复基因Rf4的全基因组关联分析

4.1.2 Rf4的候选基因进行关联分析

4.2 对候选基因的转录本进行预测

4.3 Rf4/rf4序列分析

4.3.1 RNA质量检测

4.3.2 Rf4/rf4的序列分析

4.4 Rf4-T01全长RACE

4.4.1 Rf4-T01的3'端RACE

4.5.2 Rf4-T01的5'端RACE

4.4.3 3'RACE和5'RACE拼接产物扩增

4.4.4 对r-RACE和R-RACE的ORF预测分析

4.5 R-RACE-2的qRT-PCR

4.6 Rf4的功能域预测

4.7 Western blot

4.7.1 抗体的制备

4.7.2 蛋白提取

4.7.3 不同抗体的Western blot

4.7.3.1 RF4的Western blot

4.7.3.2 RF4C的western blot

4.7.3.3 RF4-4-KLH-1的western blot

4.7.3.4 RF4-4-KLH-2的western blot

5 结论与讨论

5.1 玉米恢复基因的GWAS分析

5.2 转录本的获得与验证

5.3 恢复基因的结构域分析

第二章 全基因组分析玉米穗下节间发育中的miRNA

1 文献综述

1.1 植物内源miRNA

1.2 植物miRNA表达的转录和转录后调控

1.3 miRNA测序

1.4 降解组测序

1.5 miRNA测序与降解组测序相结合分析miRNA的调控作用

1.6 节间长研究的生物学意义

1.7 本研究的目的和意义

2 引言

3 材料和方法

3.1 植物材料和RNA提取

3.2 小RNA文库的构建和测序

3.3 数据分析

3.4 靶基因预测

3.5 降解组测序

3.6 用qRT-PCR验证小RNA及其靶基因

4 结果与分析

4.1 两个自交系穗下节间长

4.2 玉米小RNA的深度测序

4.3 保守小RNAs和候选小RNAs的确认

4.4 新的miRNA预测

4.5 降解组测序确认小RNA靶基因

4.6 miRNAs和靶基因的表达分析

5 结论与讨论

5.1 玉米穗下节间研究的重要性

5.2 miRNA调控玉米穗下节间发育的代谢网络

参考文献

Abstract