食品营养学论文提纲

论文题目：基于“外周CTSL-中枢5-HT”环路构建抗脂肪沉积食品天然产物体内筛选平台的研究

摘要：饮食能量营养过量摄入,是导致机体脂肪组织过度积累,进而诱导肥胖及相关代谢疾病发生发展的重要因素。因此,利用模式动物研究脂肪沉积调控机制,并基于这些机制构建食品天然产物抗脂肪沉积作用筛选平台,不仅可以丰富机体脂肪沉积调控的基础理论,而且可以为抗肥胖及其相关代谢疾病食品研发提供新的思路和筛选手段。溶酶体及其所含水解酶,曾长期被视为是细胞中的清道夫,参与细胞内外大分子物质及无功能细胞器的降解和循环利用。近年来的研究进一步显示,溶酶体可以作为细胞营养感受器,参与细胞代谢稳态的调控。但是,目前关于溶酶体营养感应作用的研究,主要处于体外细胞水平,尤其是细胞饥饿状态下,溶酶体作为一个营养感知和脂肪吞噬中心,控制着细胞脂质的分解代谢,而溶酶体及其水解酶在活体水平参与营养过剩条件下脂肪沉积的调控作用尚不清楚。因此,本论文旨在利用秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans,C.elegans）和小鼠等模式动物,从溶酶体营养感受入手,研究其组织蛋白酶L（Cathepsin L,CTSL）调控机体脂肪代谢的机制,并在此基础上探索构建基于相关机制的食品天然产物抗脂肪沉积作用体内筛选平台。本研究共分为三个部分。在第一部分,我们从溶酶体营养感受入手,揭示了“外周CTSL-中枢血清素（serotonin,5-HT）”脂质沉积调控环路。在这一部分中,首先利用C.elegans,通过短期给予葡萄糖或棕榈酸等营养物质,建立了不影响其生长发育的C.elegans脂肪沉积诱导模型。进一步,我们发现营养诱导脂肪沉积期间,溶酶体生物合成逐步增加,而溶酶体抑制剂处理可以显著降低C.elegans基础和营养诱导脂肪沉积,说明溶酶体营养感受调控了C.elegans的脂肪沉积。接下来,我们细致研究了 C.elegans溶酶体组织蛋白酶在营养感受后的表达改变,发现上述营养物质诱导了哺乳动物ctsl同源基因cpl-l剂量依赖性的表达增加,而cpl-l RNAi和突变可以显著降低C.elegans脂肪沉积和溶酶体生物合成,说明CPL-1可以参与溶酶体营养感受调控C.elegans的脂肪沉积。然后,通过C.elegans脂肪沉积相关突变体的研究,我们发现cpl-l的功能失活增强了C.elegaans 5-HT水平、信号分子表达及其相关行为学特性,肠道和表皮等外周储脂组织的组织特异性cpl-l RNAi显著升高了 C.elegans ADF神经元中5-HT合成基因tph-l的表达,而5-HT信号受体mod-1和ser-6的突变能够逆转cpl-1 RNAi所致的脂肪沉积降低,说明一个“外周CPL-1-中枢5-HT”环路调控了C.elegans的脂质沉积。最后,利用ctsl基因敲除小鼠和CTSL抑制剂,我们发现“外周CTSL-中枢5-HT”的环路也保守地调控了小鼠WAT的脂肪沉积,进而影响了小鼠饮食诱导的肥胖。在第二部分中,我们研究了木犀草素（luteolin,LU）等饮食黄酮类化合物对于C.elegans基础水平脂肪沉积的影响,发现LU可以基于“外周CTSL-中枢5-HT”环路抑制C.elegans基础水平的脂肪沉积。根据我们之前的报道,饮食添加LU可以降低小鼠脂肪组织CTSL表达和活性并改善小鼠饮食诱导的肥胖,为了明确这一作用与“CTSL-中枢5-HT”环路的联系,我们评估了6种具有5,7-二羟基黄酮基本骨架的常见饮食黄酮类化合物LU、白杨素、芹菜素、槲皮素、山奈酚和杨梅素对C.elegans脂肪沉积的抑制作用,发现上述6种黄酮类化合物在100 μM水平都可以显著抑制C.elegans脂肪沉积,而在25 μM水平仅LU具有抑制C.elegans脂肪沉积的活性,提示LU可能通过某种独特的机制抑制C elegans脂肪沉积。进一步,我们发现5-HT合成关键基因tph-l突变可以完全逆转LU对C.elegans脂肪沉积的抑制作用,LU对野生型C.elegans的处理提升了tph-1及5-HT脂肪沉积调控相关受体基因mod-1和ser-6的表达,并且mod-1和ser-6突变也可以逆转LU对C.elegans脂肪沉积的抑制作用。然而,上述5-HT信号相关的脂肪沉积表型和基因表达改变,并不发生在其它5种黄酮类化合物处理的C.elegasn中,说明LU可以通过活化C.elegans 5-HT信号而抑制其脂肪沉积。最终,我们也确定了 LU处理可以提高C.elegans ADF神经元中tph-1表达,促进C.elegans的脂解和脂肪酸β-氧化。在第三部分中,基于前两部分研究的成果,我们分析了 24种食品天然产物对C.elegans中葡萄糖短期添加所诱导脂肪沉积的影响,探索构建食品天然产物抗脂肪沉积作用体内筛选平台。在这一部分中,我们首先将可激发红色荧光的CPL-1::mChOint C.elegans与可激发绿色荧光的TPH-1::GFP C.elegans杂交,建立双荧光表达系统。进一步,基于“外周CTSL-中枢5-HT”环路,通过双荧光表达系统,我们分析了 24种食品天然产物对C.elegans脂肪沉积的影响,监测了伴随脂肪沉积抑制作用时C.elegans CPL-1和TPH-1相关荧光强度的变化,筛选发现大豆苷等10种天然产物可以通过“外周CTSL-中枢5-HT”环路而抑制C.elegans中葡萄糖短期添加所诱导的脂肪沉积作用。因此,基于“外周CTSL-中枢5-HT”环路的C.elegans双荧光表达系统,可以作为一种快速高效的食品天然产物抗脂肪沉积作用体内筛选平台。总之,本论文利用C.elegans等模式生物,从溶酶体营养感受入手,揭示了“外周CTSL-中枢5-HT”环路调控脂肪沉积的保守机制,并基于这一保守环路研究了 LU等饮食黄酮调控C.elegans脂肪代谢的作用机制,建立了基于这一环路的双荧光食品天然产物抗脂肪沉积作用体内筛选平台。这些成果,将为针对肥胖及其相关代谢疾病的食品营养学研究,提供了新的思路和技术手段。

关键词：溶酶体;外周组织蛋白酶L;中枢血清素;脂肪沉积;木犀草素;食品天然产物;秀丽隐杆线虫;小鼠

学科专业：食品科学

致谢

摘要

Abstract

第一章 绪论

1.1 肥胖

1.1.1 肥胖的定义

1.1.2 肥胖是一种慢性系统性疾病

1.1.3 肥胖的治疗

1.2 溶酶体与营养感应

1.2.1 溶酶体的发现及功能简介

1.2.2 溶酶体在营养感知中的重要作用

1.2.3 溶酶体功能障碍及相关疾病

1.3 组织蛋白酶在生物体中的作用

1.3.1 半胱氨酸组织蛋白酶

1.3.2 半胱氨酸组织蛋白酶抑制剂

1.3.3 半胱氨酸组织蛋白酶在肥胖发生中的作用

1.4 秀丽隐杆线虫

1.4.1 C.elegans—重要的模式生物

1.4.2 C.elegans在肥胖研究中的应用

1.4.3 C.elegans与哺乳动物的保守性

1.5 天然产物减肥的应用前景和主要作用机制

1.5.1 天然活性物质减肥的应用前景和局限性

1.5.2 天然活性物质减肥的主要作用机制

1.6 研究背景、研究内容及研究意义

1.6.1 研究背景

1.6.2 研究内容

1.6.3 研究意义

第二章 材料与方法

2.1 主要试剂

2.2 主要仪器

2.3 C.elegans突变体

2.4 天然产物

2.5 实验方法

2.5.1 C.elegans生长培养基(NGM)配制(1 L)

2.5.2 C.elegans同步化

2.5.3 C.elegans油红染色

2.5.4 C.elegans溶酶体绿色荧光染色

2.5.5 C.elegans发育速率的表型分析

2.5.6 C.elegans DHS-3::GFP荧光拍照及定量

2.5.7 甘油三酯的薄层色谱测定

2.5.8 C.elegans应对病原菌的嗅觉学习能力检测

2.5.9 C.elegans总RNA提取

2.5.10 C.elegans反转录及Real-time PCR

2.5.11 C.elegans蛋白质提取

2.5.12 C.elegans Western blot

2.5.13 HPLC检测色氨酸、犬尿氨酸

2.5.14 小鼠饲料配制

2.5.15 小鼠饲养和饮食

2.5.16 小鼠基础能量代谢检测

2.5.17 小鼠组织总RNA提取及逆转录

2.5.18 小鼠基因定量PCR

2.5.19 小鼠脂肪组织H&E染色

2.5.20 小鼠组织中的总蛋白提取

2.5.21 小鼠组织Western blot

2.6 数据收集与统计分析

第三章 结果与分析

3.1 “外周CTSL-中枢5-HT”环路调控C.elegans和小鼠的脂肪沉积作用机制的研究

3.1.1 溶酶体参与了C.elegans营养物诱导的脂肪沉积

3.1.2 溶酶体CPL-1的功能失活抑制C.elegans脂肪沉积

3.1.3 CPL-1失活通过5-HT信号调控c.elegans脂肪沉积

3.1.4 外周储脂组织中CPL-1失活增加ADF神经元5-HT合成调控C.elegans脂肪沉积

3.1.5 CPL-1失活调控C.elegans脂肪沉积依赖于MOD-1和SER-6受体及脂解和脂肪酸β-氧化作用

3.1.6 C.elegans工作小结

3.1.7 哺乳动物CTSL参与小鼠脂肪沉积调控过程

3.1.8 CTSL通过中枢5-HT信号通路调节小鼠脂肪沉积

3.1.9 外周CTSL通过调节中枢神经系统5-HT合成调控小鼠脂肪沉积

3.1.10 CTSL通过促进脂肪细胞的浅棕脂化提高小鼠的能量代谢

3.1.11 结论

3.2 饮食黄酮类化合物LU通过“外周CTSL-中枢5-HT”环路调节Celegans脂肪沉积

3.2.1 饮食添加6种黄酮类化合物降低C.elegans脂肪沉积

3.2.2 饮食添加6种黄酮类化合物不改变C.elegans生长发育,产卵量和进食速率

3.2.3 LU降低C.elegans脂肪沉积通过中枢神经系统5-HT信号通路

3.2.4 LU提高ADF神经元中5-HT的合成,增加C.elegans脂解和脂肪酸β-氧化

3.2.5 结论

3.3 基于“外周CTSL-中枢5-HT”环路建立降脂天然产物的C.elegans筛选平台

3.3.1 构建“外周CTSL-中枢5-HT”环路双荧光表达系统

3.3.2 筛选通过“外周CTSL-中枢5-HT”环路作用的天然产物

3.3.3 验证通过“外周CTSL-中枢5-HT”环路作用的天然产物的降脂功能

第四章 讨论、展望与创新点

4.1 讨论与展望

4.2 创新点

参考文献

1 参加的科研项目与学术交流

3 获得的学术奖励