人类P53下游基因一致性序列研究

人类P53下游基因一致性序列研究（通用3篇）

篇1：人类P53下游基因一致性序列研究

人类P53下游基因一致性序列研究

人类P53蛋白是一种通用转录因子,通过调控一系列下游基因的转录来影响许多细胞功能.p53下游基因含有P53蛋白结合序列,收集已报道的63条人类P53蛋白结合序列并与El-Deiry等定义的.一致性序列进行比较,发现这些P53蛋白结合序列与一致性序列特征并不严格一致,对这些偏差规律的分析有利于建立p53下游基因预测模型,进而利用计算机方法预测p53下游基因,研究其基因互作网络.

作 者：白明泽 谭军 舒坤贤 BAI Ming-ze TAN Jun SHU Kun-xian  作者单位：白明泽,谭军,BAI Ming-ze,TAN Jun(重庆邮电大学,生物信息学院,重庆,400065)

舒坤贤,SHU Kun-xian(重庆邮电大学,生物信息学院,重庆,400065;中南大学,湘雅医学院,湖南,长沙,410065)

刊 名：重庆邮电学院学报(自然科学版)  ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF CHONGQING UNIVERSITY OF POSTS AND TELECOMMUNICATIONS(NATURAL SCIENCE) 年，卷(期)： 18(4) 分类号：Q78 关键词：p53基因   p53下游基因   一致性序列  

篇2：人类P53下游基因一致性序列研究

本实验研究中,我们采用食管癌p53功能失活的检测方法—p53功能测定法[5]来分析食管鳞癌p53功能有无失活。p53功能失活的原因除了基因突变之外,有无p53结合蛋白MDM2和HPV16/18-E6的参与,也正是为了回答上述问题而设计了本研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选择我院1998～1999年施行手术治疗的部分食管鳞癌病例共45例,年龄36～72岁,平均年龄56岁。其中男性31例,女性14例。根据1997年UICC食管癌TNM分期标准,ⅡA期13例,ⅡB期15例,Ⅲ期16例,Ⅳ期1例。根据肿瘤组织学分级,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级各15例。

1.2 p53功能失活检测(p53功能测定法)[5]

1.2.1 标本处理和细胞收集

取0.5～2g大小的术后新鲜食管鳞癌组织和正常食管组织(肿瘤边缘5cm以上、病理检查无瘤),分别以眼科剪剪碎后用网握法制备成单细胞悬液,取2份单细胞悬液各10mL,分别作为加药组和对照组。加药组中加入DNA损伤剂(阿霉素2μg),对照组不加入药物,然后将2组分别培养过夜,经细胞裂解,蛋白质的印迹转移和显影之后进行判断。

1.2.2 实验结果判定

(1)p53功能正常:对照组(不加阿霉素组)p53蛋白低表达,加药组(加阿霉素组)p53蛋白表达较对照组增强;而加药组p21WAF1/CIP1蛋白表达较对照组增强(图1)。(2)2p53功能失活:加药组p21WAF1/CIP1蛋白表达和对照组一致(图2)。(3)p53基因突变检测(传统PCR-SSCP法,略)。(4)MDM2和HPV16/18-E6表达测定(传统免疫组化SP法,略)。

1.3 统计方法

采用SPSS 10.0统计软件包进行χ2检验(α=0.05)。

2 结果

2.1 食管鳞癌p53基因突变率和p53功能失活率比较

在45例食管鳞癌患者中,p53基因突变者22例(49%),p53功能失活者29例(64%)。在p53基因突变者22例中,p53功能失活者21例,p53蛋白功能正常者1例。在p53功能失活者29例中,p53基因突变者21例,p53基因无突变者8例。p53功能失活率高于p53基因突变率,二者差异具有统计学意义(表1)。

2.2 MDM2与p53功能失活的关系

45例食管鳞癌患者中,p53功能正常者16例(设定为A组),p53功能失活者29例。29例中p53基因突变者21例(72%,设定为B组),p53基因无突变者8例(28%,设定为C组)。

45例食管鳞癌患者中,MDM2表达者13例(29%)。其中A组16例患者中共2例(13%),B组21例患者中共7例(33%),C组8例患者中共4例(50%)。A、B、C3组间MDM2表达率差异不具有统计学意义(P=0.169),表明p53功能失活过程中不存在MDM2的参与(表2)。

2.3 HPV16/18-E6蛋白与p53功能失活的关系

45例食管鳞癌患者中,HPV16/18-E6蛋白表达者共16例(36%)。其中A组16例患者中5例(31%),B组21例患者中4例(24%),C组8例患者中7例(88%)。A、B、C3组间HPV16/18-E6蛋白表达率差异具有统计学意义(P=0.002)。经两两比较,C组HPV16/18-E6蛋白表达率明显高于A组和B组,差异具有统计学意义(P值分别为0.028、0.001)。A、B组间HPV16/18-E6蛋白表达率差异不具有统计学意义(P=1.000)。将p53蛋白功能失活的原因分为p53基因突变和非基因突变原因,前者占72%;后者占28%。C组HPV16/18-E6表达率高于A组和B组,表明在非基因突变原因中可能存在HPV16/18-E6蛋白的参与(表3,4,5,6)。

3 讨论

3.1 p53的检测方法

目前对p53突变检测的方法很多,能够从DNA水平、RNA水平和蛋白质水平各个层次检测p53基因有无突变。其中PCR-SSCP(聚合酶链反应-单链构象多态性分析)、PCR-RFLP(聚合酶链反应-限制性内切酶长度多态性分析)、DNA直接测序法、p53蛋白免疫组化检测法等几种方法应用得相当广泛。p53蛋白功能状态测定法[5]是一种功能检测方法,它是针对p53对下游基因的影响来评价其功能的一种方法。本研究中p53功能测定法检测出p53功能失活率(64%)高于传统方法检测的p53基因突变率(49%),说明p53功能测定法检测p53异常的敏感性高于p53基因突变检测。同时提示p53功能失活的原因不仅仅是p53基因突变,还包括其它因素的影响。

3.2 MDM2在食管鳞癌中的研究

有关MDM2在软组织肉瘤、骨肉瘤的扩增和表达已得到大多数学者的肯定,但在食管鳞癌中有关MDM2的报道还不多见。黄永高[6]报道食管癌组织中mdm2蛋白阳性率为63.8%,高于mdm2癌旁正常组织mdm2的表达,同时发现;mdm2蛋白的表达与淋巴结转移和病理分级有相关性,而与肿瘤浸润深度无关。秦艳茹等[7]对食管组织采用免疫组化ABC法分析mdm2和p53蛋白的表达情况。结果发现随着病变发展(从正常食管上皮→基底细胞过度增生→不典型增生→原位癌组织→鳞状细胞),mdm2和p53的表达逐渐增高。提示p53、mdm2的高表达可能是导致病变持续向癌方向发生发展的机制之一。Takahashi K[8]等发现Akt-Mdm2通路在食管癌发生过程中可能通过影响p53的表达而影响食管癌的发生。

注:P=0.046

注:P=0.169

注:P=0.002

P=0.028注:

P=0.001注:

注:P=1.000

本研究中食管鳞癌MDM2表达率为29%,在p53功能失活过程中MDM2表达率无明显升高,提示MDM2在食管鳞癌中存在表达,但未参与食管鳞癌p53功能失活过程。

3.3 HPV16/18-E6在食管鳞癌中的研究

杨兰等[9]报道HPV18在食管癌中阳性率分别为25.3%(80/316)6 HPV18型是新疆哈族食管癌的主要高危亚型之一,其基因型分布与食管癌分化程度有关。何保昌等[10]报道高危型HPV16感染可能是食管癌高发区的危险因素,Arg/Arg基因型可能是安阳地区食管癌的易感基因型,携带p53Arg/Arg基因型的个体更容易发生HPV相关的食管癌。Qi ZL等[11]报道食管癌中HPV16/18 E6表达明显增高,并影响p53表达从而影响食管癌的发生。

食管鳞癌HPV16/18-E6蛋白如何导致野生型p53蛋白功能失活,其机理尚不完全清楚。可能与E6蛋白和E6-AP结合,在泛激素激活酶作用下导致野生型p53蛋白的降解有关[12]。另外,尚有报道HPV可通过减少局部的Langerhans细胞,破坏机体局部的免疫监视系统,并与其它致病因素协同作用,进而导致食管癌的发生[13]。

篇3：抑癌基因P53与肿瘤的研究进展

【关键词】P53；肿瘤；表达

【key words 】P53；cancer；expression

【中图分类号】R734.2 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2015）02-0776-02

随着社会的发展，人类生活习性的改变，恶性肿瘤的发病率在逐年升高，其对人类生命的威胁仅次于心血管疾病。恶性肿瘤又称癌，是由于机体内的原癌基因及抑癌基因突变，表达异常致细胞生长、凋亡异常所致。P53基因作为重要的抑癌基因，其表达异常对多数肿瘤的形成起重要作用。P53基因具有阻滞细胞周期，促进细胞凋亡，维持基因组稳定，抑制肿瘤血管生成的作用。其突变后，由于其空间构象发生改变，失去了对细胞生长、凋亡和DNA 修复的调控作用，从而转变为癌基因，导致肿瘤发生。P53与诸如肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、软组织肉瘤、卵巢癌、脑瘤、淋巴细胞肿瘤、食道癌、肺癌、成骨肉瘤等多种癌症的发生有关。目前针对癌症基因治疗的研究越来越受到科研工作者的重视。P53基因是目前所知研究最透彻，功能最强大的一种抑癌基因。研究表明，P53具有抑制并杀灭肿瘤细胞及防止肿瘤复发、转移，提高自身免疫力的作用，其对受照射、细胞毒制剂、热疗打击的癌细胞，具有更大的杀伤作用，从而增强放化疗杀灭癌细胞的功效，达到1+1大于P53的效果。对P53的研究将为肿瘤的发生发展和治疗提供新的思路和方法。

P53的基因结构及功能

人类P53基因位于17P13.1，全长约20kb，由11个外显子和10个内含子组成。第1个外显子不编码，外显子2、4、5、7、8分别编码5 个进化上高度保守的结构域， P53基因转录成2.5kbmRNA，编码由393个氨基酸组成的肽链核蛋白，分子量为53kd。P53基因的表达至少受转录及转录后两种水平的调控。P53基因的转录由P1、P2二个启动子控制.P1启动子位于第一外显子上游100～250bp， P2位于第一内含子内，在启动子中包含1个NF1蛋白结合位点和一个转录因子AP1相关蛋白的结合位点，对正常P53基因的转录，不仅需要二个启动子的平衡作用，而且P53 基因内含子也起作用，内含子中有正调控作用，其调控有组织特异性。 野生型P53 基因的N-末端的转录激活结构域（activtiondomain， AD）AD1，AD2位于氨基酸1-50位，与通用转录因子TF11D 结合而发挥转录激活功能。TF11D 是由TBP（TATAbinding protain）和TAF（TBP associatedfactor）结合而成的复合物，P53与TF11D中的TAF结合，作用于下游基因启动子中的TATA box ，达到转录激活功能。P53基因生长抑制结构域位于氨基酸60-94位，富含脯氨酸，含5个重复的pxxp序列，可与含SH3 结构域的蛋白质相互作用，将P53与信息传递途径连接起来。

P53基因还有：序列特异的P53结合结构域，位于氨基酸100-290位间；核定位信号NLS位于氨基酸残基313-323；四聚体寡聚化结构域，定位于氨基酸残基323-355；C-末端非专一DNA调节结构域，定位于氨基酸残基370-393。这些结构域与具有激活靶基因、抑制癌细胞生长、阻止基因错配等功能。P53与DNA的结合能力并非特异性地与DNA 结合，参与核心区与DNA 结合的别构调节，同时在碰到DNA损伤时，P53可能补充其他蛋白质到损伤部位，提供DNA损伤信号。

P53的功能主要表现在阻滞细胞周期、促进细胞凋亡、维持基因组稳定，抑制肿瘤血管生成等方面。在細胞周期中，P53的调节功能主要体现在对G1和G2/M 期校正点的监测，与转录激活作用密切相关。P53一方面阻碍肿瘤抑制基因的磷酸化而使转录调节因子不能活化，引起G1期阻滞。另一方面P53 能下调Cyclin B1表达，从而使细胞不能进入M期。P53通过上调Bax的表达水平，以及下调Bcl-2的表达共同完成促进细胞凋亡的作用。P53还可通过死亡信号受体蛋白途径诱导凋亡。同时P53可通过参与DNA的修复，达到维持基因组的稳定，以及刺激抑制血管生成的相关基因表达，从而抑制肿瘤血管生成。

P53与肿瘤的发生、发展

在细胞周期中，野生型P53 蛋白通过阻止G1期细胞进入S期，使受损的DNA或染色体得以修复；若DNA 或染色体损伤过于严重时，P53 能触发凋亡机制清除受损的细胞，从而达到调节功能。相反，突变型P53 基因则发挥着原癌基因的作用，可促进肿瘤的的发生、发展。在人类50%以上的肿瘤组织中均发现了P53基因的突变，这是肿瘤中最常见的遗传学改变，说明该基因的改变很可能是人类肿瘤产生的主要发病因素之一。突变和缺失是其失活的主要机制，另外还包括重排、插入、基因融合等。P53突变不仅失去抑癌的功能，还能促使细胞恶性转化。

既往研究表明，P53基因与人体各大系统肿瘤的发生、发展密切相关。

呼吸系统：肺癌中P53异常以突变最常见，绝大部分小细胞肺癌（NSCLC）中有P53突变，在非小细胞肺中P53突变也超过一半。一些研究提示，P53多态性是肺癌发生的一个危险因素。Mcchanlc等[1]认为P53基因突变谱的不同可能影响到肺癌的易感性以及相应肿瘤形成。P53不仅可以用于早期肺癌的诊断和高危人群的筛检，同时可以用于肺部原发癌及转移癌的鉴别。外显子4处的第72号密码子编码不同的氨基酸对患者的病情进展和预后具有很大的影响。NSCLC患者中，该密码子编码脯氨酸往往比编码精氨酸的生存期更短，预后更差[2]。毛等证实[3]：P53突变与肺腺癌的分期及预后不良呈正相关（P〈0.01）。Gu等认为P53基因突变也可用于评价肺癌患者淋巴结微小病灶转移及预后。

消化系统：P53突变与消化系统肿瘤的发生发展密切相关P53表达增高，增加大肠癌、小肠癌、胃癌及贲门癌发生发展及转移的风险。研究表明，50%以上的肝癌有P53基因的突变。P53的阳性表达率与细胞分化及预后呈负相关，与肿瘤分期成正相关。P53功能失活与食管癌癌变过程，组织学分级密切相关。

循环系统：Thornton等发现慢性淋巴细胞性白血病（CLL）伴有P53基因缺失的CLL患者，细胞形态多不典型（幼稚淋巴细胞>0.10），血清LDH增高，病程进展快，瘤细胞负荷高，多处于疾病晚期（Binet B/C期），对多种治疗（包括核苷类似物）反应差，生存期短，难治组P53基因缺失的发生率高。多数研究表明p53基因突变的淋巴组织肿瘤治疗效果差，生存期短。淋巴组织肿瘤中突变型P53蛋白的表达率明显增高，复发/难治患者显著高于初治患者，与化疗抗药和预后差有关。

运动系统：Toguchida等认为P53基因异常是骨肉瘤生物演化过程中的重要事件。但目前对P53与骨肉瘤转移和预后的关系， 尚存在争议。有研究证实，P53能够在一定程度上反映眼眶横纹肌肉瘤的生物学特性，有可能成为判断肿瘤预后的指标。

神经系统：在对儿童胶质瘤研究中发现，1/3 病例可检出P53基因突变，并且约50%的胶质瘤组织中P53表达显著。还有报道，激活的P53 基因还具有增强Fas诱导脑胶质瘤细胞凋亡的作用。Nayak 等的研究结果表明，胶质母细胞瘤中P53 蛋白阳性率为50% 。与其相一致的是，也有研究报道，在一项研究中胶质母细胞瘤P53 突变率高达35% ～60%。

泌尿系统：Kwak等证明在前列腺癌中由于P53基因的突变导致血管生成促进因子VEGF的上调及血管生成抑制因子TSP—l的下调，从而引起肿瘤新生血管的生成，为肿瘤的发生、发展、转移提供必需的条件。杨[4]等研究表明P53与膀胱癌的临床分期、病理分级及预后密切相关。而P53的阳性表达与肾癌的病理类型、病理分级无关而与临床分期有关.

内分泌系统：Olivier等[5]认为P53基因突变可能是甲状腺癌的发生、发展的晚期分子事件，与甲状腺癌的进展、侵袭和转移有关，它对甲状腺癌的分级以及预后有重要的提示作用。P53的异常表达与胰腺癌的分化程度、淋巴结转移有关，其过度表达可能涉及肿瘤的进展及预后[6]。

生殖系统：研究证实P53与上皮性卵巢癌组织的发生、发展及转移有关，可作为判断卵巢癌预后不良的指标。对中国乳腺癌患者P53表达进行meta分析发现，P53表达阳性与淋巴结转移、术后复发、生存时间、肿瘤大小、组织学分级和临床分期有相关性。P53对于判断预后有较好的特异度和敏感度，与临床预后有较好的相关性[7]。P53蛋白表达与子宫内膜癌临床分期、病理类型、组织病理学分级、淋巴结转移、肿瘤肌层浸润及生存率有明显相关性。

其他：研究表明，在皮肤癌、鼻咽癌、头颈部鳞癌中均有P53表达异常，这些肿瘤的发生与P53的表达异常明显相关。

P53与肿瘤的治疗

通过基因治疗可望从根本上杀灭癌细胞已成为研究热点。P53基因突变或缺失，其调节细胞凋亡的功能丧失，从而导致肿瘤的发生。基于P53基因的作用，目前研究最多的是腺病毒-p53基因对肿瘤的治疗作用。P53基因通过P53蛋白作用于细胞周期、DNA修复细胞、细胞分化和凋亡，起到对肿瘤的治疗作用。实验已经证实，将野生型P53导入肿瘤细胞，可以控制细胞周期和诱导细胞凋亡，增加肿瘤对化/放疗的敏感性，还可通过旁观者效应达到杀灭肿瘤细胞的作用[8]。

rAd-p53（重组腺病毒-p53）基因治疗肿瘤已广泛开展。导入途径有呼吸道，肿瘤内，血管内和腹腔内注射。常用经动脉导管引入rAd-p53。基因转导方式由病毒转染、脂质体融合、配体与膜受体结合、基因枪和微注射等多种物理方法。rAd-p53自1995年在美国批准进入临床试验目前有50多项临床试验方案在世界各国实施。采用肿瘤内注射联合放/化疗法治疗头颈部癌和非小细胞肺癌临床试验已进入Ⅲ期，腹腔内注入rAd-p53对卵巢癌的临床治疗试验已进入Ⅱ/Ⅲ期，通过肝动脉灌注rAd-p53治疗肝细胞癌在临床试验中进入了Ⅰ/Ⅱ期。目前利用rAd-p53对胃癌、甲状腺癌、宫颈癌、膀胱癌、软组织肉瘤等的治疗也在积极开展中。rAd-p53感染肿瘤细胞能有效控制肿瘤细胞生長，引起细胞凋亡，患者耐受性良好，无严重毒副作用。它为肿瘤患者提供了一个新的有希望的治疗方法。

参考文献

[1]Mcchanic LE，Marrogi AJ，wclsh JA，et al.Polymorphisms in XPD and Tp53 and mutation in human lung cancer[J]. Carcinogenesis，2005，26（3）：597—604.

[2]Boldrini L，Gisfredi S，Ursino S，et a1.Prognostic impact of p53 Pro72 homozygous genotype in non-small cell lung cancer patients[J].oncol Rep，2008.19：771—773.

[3]陈国平，毛伟敏，赵力，等。nm23和p53基因与肺腺癌生物学特性的关系[J]，中华肿瘤防治杂志，2007，14（14）：1088-90。

[4] 杨立新，张海峰，白淑芬。p53、Ki一67基因表达与膀胱癌相关性的回顾性研究[J]。现代医学，2010，2；38（1）：32-35.

[5] Olivier M，Eeles R，Hollstein M，et a1.The IARC TP53 database：New online mutation analysis and recommendations to users[J].Hum Mutat，2002，19（6）：607—614.

[6]贺斌，胰腺癌组织中Runx3和p53蛋白的表达及临床意义[D]，2013，中南大学。

[7]杜长征，李惠平，马力文，等。中国乳腺癌患者p53表达临床生物学意义的Meta分析[J]。中国癌症杂志，2005，15（6）：514-517。