多样性人源天然噬菌体抗体库的构建及初步应用

多样性人源天然噬菌体抗体库的构建及初步应用（精选3篇）

篇1：多样性人源天然噬菌体抗体库的构建及初步应用

多样性人源天然噬菌体抗体库的构建及初步应用

目的: 构建多样性良好的人源天然噬菌体抗体库.方法: 从正常人外周血中分离淋巴细胞, 以RT-PCR和半巢式PCR扩增重链可变区VH基因和轻链可变区VL基因, 以重叠延伸PCR将VH、VL组装成scFv基因, 并将其克隆入噬菌粒载体pCANTAB-5E中.以pCANTAB-5E电转化大肠杆菌TG1, 构建人源天然噬菌体抗体库, 测序分析抗体基因的家族信息和多样性, 并用多种抗原对其进行筛选.结果: 获得了库容为2×108的人源天然噬菌体抗体库.分别用5种抗原对其进行筛选, 均可获得特异性噬菌体抗体的富集.结论: 成功地构建了一个多样性良好的`人源天然噬菌体抗体库, 可用于制备具有应用前景的人源抗体.

作 者：王晋 罗文新 李利峰 陈瑛炜 王明桥 张军 夏宁邵 WANG Jin LUO Wen-xin LI Li-feng CHEN Ying-wei WANG Ming-qiao ZHANG Jun XIA Ning-shao 作者单位：厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室,福建省医学分子病毒学研究中心,福建,厦门,361005刊 名：细胞与分子免疫学杂志 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY年，卷(期)：200622(6)分类号：Q782关键词：人源天然噬菌体抗体库 单链抗体 多样性

篇2：多样性人源天然噬菌体抗体库的构建及初步应用

全合成人源性噬菌体抗体库的构建

目的:构建全合成人源性噬菌体抗体库.方法:选择部分使用频率较高的人抗体胚系基因家族的框架区基因进行人工合成,同时人工设计合成半随机CDR3,通过重叠拼接延伸PCR的方法合成抗体基因.然后利用限制性内切酶SfiⅠ、NotⅠ分别双酶切抗体基因和噬菌体展示载体.连接后的重组噬粒通过电击转化的`方法转入大肠杆菌TG1,构建抗体库.结果与结论:PCR结果显示,通过优化后的方法能在保证抗体库多样性的前提下,高效地获得抗体基因.经过数十次电击转化构建了库容量为2×109的全合成抗体库,菌落PCR、测序及筛选结果表明,抗体库质量优良,为筛选人源性治疗抗体奠定了基础.

作 者：杜威世 王双 孙志伟 俞炜源 DU Wei-Shi WANG-Shuang SUN Zhi-Wei YU Wei-Yuan 作者单位：军事医学科学院生物工程研究所,北京,100071刊 名：军事医学科学院院刊 ISTIC PKU英文刊名：BULLETIN OF THE ACADEMY OF MILITARY MEDICAL SCIENCES年，卷(期)：30(4)分类号：Q782关键词：噬菌体展示 全合成抗体库 单链抗体

篇3：多样性人源天然噬菌体抗体库的构建及初步应用

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

大肠杆菌Escherichia coli.XL1-Blue、噬菌体SCVM13和质粒pComb3XSS均购自美国Barbas实验室;三只日本大耳兔(Oryctolagus cuniculus)购自福建医科大学动物实验中心;PCR引物均为Invitrogen公司合成。

1.1.2 试剂

明胶和牛血清白蛋白(BSA)购自上海生工生物工程有限公司;TRIZOLreagent试剂为Invitrogen公司产品;cDNA合成试剂盒、MvaⅠ内切酶和sfiⅠ限制性内切酶为Fermentas公司产品;T4 DNA连接酶、胶回收试剂盒和核酸Marker均购自TaKaRa公司;Goat HRP/anti-HA conjugate抗体为南京金斯瑞公司产品;其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器

2720 Thermal Cycler PCR仪(香港,基因有限公司);165-2660电转化仪(美国,BIO-RAD公司);ST-360酶标仪(上海,科华实验系统有限公司)。

1.1.4 培养基

LB培养基:酵母提取物5 g,胰化蛋白胨10 g,NaCl 5 g,蒸馏水定容至1 L,pH为7.4～7.6。

1.2 方法

1.2.1 全套兔源VL和VH基因的扩增与scFv基因的拼接

用TRIZOL试剂提取兔子脾脏中的总RNA,并合成cDNA。共设计10对引物用于克隆兔抗体全套VL基因,4对引物用于克隆VH基因[8]。利用重叠PCR法拼接VL和VH片段获得scFv片段[9]。

1.2.2 单链抗体库的构建及其质量验证

将回收纯化的scFv基因产物经sfiⅠ酶切后克隆进入噬菌粒载体pComb3XSS,连接产物电转化至大肠杆菌XL1-Blue中,所建库即为兔源单链抗体库。将电转化培养液稀释涂布在LB平板上,根据长出的菌落计算库容。

从平板上随机挑取20个菌落,碱裂解法提取质粒并进行PCR,1%琼脂糖凝胶电泳观察750～1 000 bp处的条带,计算scFv基因的重组率。从抗体库中随机挑取10个菌落培养,PCR扩增scFv基因片段,用内切酶MvaⅠ消化scFv基因片段,然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,根据电泳情况分析基因的多样性。

1.2.3 抗肌酸激酶scFv噬菌体抗体库的富集筛选

根据文献[8]提供的方法制备噬菌体单链抗体表面展示文库,并进行scFv噬菌体抗体库的富集筛选。第一、二轮所用肌酸激酶包被抗原浓度20 μg/mL,第三、四轮加入的抗原减少为15 μg/mL和10 μg/mL。洗涤吹打过程中,第一轮吹5下,第二轮10下,第三、四轮15下。

1.2.4 ELISA 法鉴定阳性克隆子

从第4轮筛选的结果中,挑取5株单菌落(A1-A5)培养,并经VCSM13辅助噬菌体拯救获得单个重组噬菌体。应用ELISA方法,以肌酸激酶为包被抗原,HRP-anti-HA为标记二抗。通过测定OD450吸光值,判断阳性克隆子。

另外,选择明胶、牛血清白蛋白(BSA)为包被抗原,进一步验证所挑取的5株单菌落(A1-A5)的阳性反应和初步鉴定克隆子的特异性。在酶标板上加包被抗原50 μL/孔,每个平行做2份,4℃过夜。次日洗涤,用封闭液封闭1 h,加入噬菌体收集液50 μL/孔,37℃温浴2 h。洗涤后,每孔加入50 μL胰蛋白酶消化,37℃培养30 min。将洗脱液移到1 mL的XL1-Blue培养液中,室温培养15 min后,分别取100 μL涂布在含有Amp的平板上。

2 结果与分析

2.1 全套VH和VL基因的扩增与scFv基因的拼接

从未免疫的兔子脾脏细胞提取RNA后立即反转录为cDNA,克隆扩增抗体可变区基因,扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析,分别可见一条特异条带,VH片段长度约为380 bp,VL片段长度约为350 bp,与预期大小相符。通过一段连接片段linker将VL与VH片段连接形成scFv片段。经1%琼脂糖凝胶电泳分析,在750 bp左右有一条清晰条带(图1)。

2.2 抗体库的库容和重组率

scFv拼接扩增后,将其连到噬菌体载体pComb3XSS上,通过电转化导入大肠杆菌XL1-Blue中,构建得到scFv文库。根据稀释平板上长出的菌落数,计算得到抗体库的库容量为4×108,从库中随机挑选20个菌落,用检测引物扩增,有19个菌落扩增出大小为750～1 000 bp的片段,说明重组率为95%(图2)。

2.3 抗体库多样性分析

从抗体库中随机挑取10个菌落培养,9株经PCR扩增出scFv基因片断,电泳回收后的scFv基因片断用限制性内切酶MvaⅠ消化,然后进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳,分析酶切指纹图谱。结果显示抗体库中抗体分子的多样性良好(图3)。

2.4 噬菌体单链抗体的筛选

以肌酸激酶为抗原对兔源性噬菌体单链抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的富集筛选。通过降低目标抗原的包被浓度和加强洗涤力度,逐渐富集与之特异性高亲和力的噬菌体。每一轮筛选的结果均汇总入表1,结果显示抗体库最初的库容量为4×108,经过第一、二轮筛选后,洗脱得到的噬菌体数目明显减少,第三、四轮数目逐渐上升,表明特异性单链抗体得到了富集。

2.5 抗肌酸激酶阳性克隆子鉴定

为了筛选出阳性克隆子,根据噬菌质粒上的HA-Tag表达标签,以肌酸激酶为包被抗原,选择HRP-anti-HA为二抗,测定各个克隆子的OD450值。如表2所示,初步鉴定单克隆子A1-scFv,A4-scFv和A5-scFv为阳性克隆子。选择明胶、牛血清白蛋白为抗原,对挑取的5株单克隆子进一步分析。阳性克隆子理论上对明胶、牛血清白蛋白应没有结合力,用ELISA鉴定时,加入的噬菌体单链抗体会被洗涤除去,吸附的噬菌体数目很少,经宿主拯救后,最终在含Amp的LB平板上长出的菌落数也相应会很少。表3结果显示,A1、A4和A5平板上的菌落数比较少,说明了这三株对肌酸激酶有一定的亲和力和特异性。

3 讨论

目前已报道的非免疫抗体库主要有全合成抗体库、半合成抗体库和天然抗体库。半合成和全合成抗体库在构建过程中,由于采用人工化学合成的方法获得抗体基因,使得抗体库中部分克隆不具备抗体的活性,从而影响抗体库的质量[10]。本研究中,天然单链抗体库是从健康幼兔的脾脏中扩增得到,获得的抗体基因已通过体内的基因重排机制选择,生成的可变区基因均具有活性,并且基因内重链CDR3 具有较大的长度多样性,理论上具有任何抗原的抗体,且能够筛选到高亲和力的抗体。但是由于基因克隆、转化效率的限制,所建抗体库的质量会有所影响。其中抗体库的库容量和多样性是决定抗体库质量的两个重要指标,这两个指标共同影响着目标抗体的筛选几率以及所筛选抗体的亲和力大小[11]。关于解决库容与多样性问题,已有文献报告一些改进方法[12,13]。本研究为克服库容问题,通过改变电转化条件,包括所用电压、时间常数、电转化体系、电极杯、感受态细胞浓度的调整,最终获得了库容4×108的抗体库。经DNA指纹图谱鉴定,所建抗体库的多样性良好。

4 结论