一株嗜热菌的分离鉴定及其苯酚降解特性

一株嗜热菌的分离鉴定及其苯酚降解特性（精选7篇）

篇1：一株嗜热菌的分离鉴定及其苯酚降解特性

一株嗜热菌的分离鉴定及其苯酚降解特性

从油田地层水中分离到一株嗜热并高效降解苯酚的BF80菌株,其最适生长和降解苯酚的温度为60℃～65℃.利用API 50 CHB/E系统和16S rDNA序列分析对菌株BF80进行了分类鉴定,该菌株的形态和生理生化特性与Geobacillus thermoglucosidasius基本相同,其16S rDNA序列与Geobacillus thermoglucosidasius BGSC W95A1(=ATCC 43742)的相似性为99.22%.在接种量为1%的条件下,该菌在20 h内能完全降解3 mmol/L的苯酚;在pH值5.5～9.0范围内能保持对苯酚良好的降解能力,并在12 mmol/L苯酚的.无机盐培养基中也能生长和降解苯酚,表明该菌能耐受高浓度苯酚并可用于高温含酚废水的生物处理.

作 者：唐S 刘沐之 梁凤来 冯露 刘如林 TANG Yun LIU Mu-Zhi LIANG Feng-Lai FENG Lu LIU Ru-Lin 作者单位：唐S,TANG Yun(南开大学生命科学学院,天津,300072;西华师范大学生命科学学院,南充,637002)

刘沐之,梁凤来,冯露,刘如林,LIU Mu-Zhi,LIANG Feng-Lai,FENG Lu,LIU Ru-Lin(南开大学生命科学学院,天津,300072)

刊 名：微生物学通报 ISTIC PKU英文刊名：MICROBIOLOGY年，卷(期)：33(5)分类号：Q93关键词：Geobacillus thermoglucosidasius 嗜热菌 苯酚 生物降解

篇2：一株嗜热菌的分离鉴定及其苯酚降解特性

摘要：通过选择性富集培养,从沈抚灌区石油污染土壤中分离到1株菲降解细菌.试验证明该菌株能以菲为唯一碳源和能源生长.经形态学、生理生化鉴定和16S rRNA基因序列比对分析,确定该菌株属于不动杆菌属,命名为Acinetobacter sp. L2. 系统发育进化分析发现,L2菌株与Acinetobacter sp. DG880[AY258108]亲源关系最近.L2菌株培养7 d后对菲的降解率达96.3%.邻苯二酚2,3-双加氧酶活力测定表明,L2菌株可能含有菲降解基因.作 者：祝儒刚 钟鸣 周启星 刘海宁 李玉双 ZHU Rugang ZHONG Ming ZHOU Qixing LIU Haining LI Yushuang 作者单位：祝儒刚,钟鸣,刘海宁,李玉双,ZHU Rugang,ZHONG Ming,LIU Haining,LI Yushuang(沈阳农业大学辽宁省农业生物技术重点实验室,沈阳,110161)

周启星,ZHOU Qixing(中国科学院沈阳应用生态研究所陆地生态过程重点实验室,沈阳,110016)

篇3：一株嗜热菌的分离鉴定及其苯酚降解特性

生理盐水中, 置37 t恒温水浴锅中加热3 h�然后取处理液按10倍比进行稀释, 3个合适稀释度的稀释液分别取100 (jl L分别涂布于3个MRS琼脂培养基上, 每个处理3个重复, 放置20min后倒置, 于37 T生化培养箱中培养24 h, 进行平板活菌计数, 计算存活率。1.5.2耐人工肠液分别取1 m L培养菌液, 加人9 m L的人工肠液和灭菌生理盐水中, 置37 t恒温水浴锅中加热3 h�然后取处理液按10倍比进行稀释, 同1.5.1耐人工胃液处理, 计算存活率。1.5.3耐胆盐在含0%、0.03%、0.1%、0.2%、0.3%猪胆盐的MRS培养基中, 分别按5%接种量接种菌液, 37 1、160 r/min摇床培养4 h, 后取处理液按10倍比进行稀释, 同1.5.1耐人工胃液处理, 计算存活率。1.6采用生化鉴定与16Sr DNA序列分析1.6.1生化鉴定硝酸盐还原试验、产H2S试验、吲哚 (靛基质) 试验、明胶液化试验、乙酸氧化试验、糖酵解等, 参照《伯杰细菌鉴定手册》151及《常见细菌系统鉴定手册》|6) 鉴别。1.6.2 16S r DNA的扩增与序列分析取lm L菌液离心获得菌体, 采用细菌基因组DNA提取试剂盒 (百泰克公司) 提取细菌总DNA�并对其进行16Sr DNA序列扩增, 所用的引物为16S通用引物�27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'�1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3', 由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。PCR反应体系为50 m-L体系�Premix Taq™ (Ta Ka Ra Taq™Version 2.0) 25 (jl L, 弓丨物F 1 jjl L�弓|物R 1 (jl L�模板DNA 2 (jl L, 超纯水21 (x L0 PCR扩增条件:95 t预变性3 min;95 T变性30 s, 55"C退火30s�72 T延伸1.5 min�共34个循环, 72 T后延伸10 min, 4 t保存。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后, 检验是否有目标条带, 将有目标条带的PCR产物送生工生物工程 (上海) 股份有限公司进行测序。1.6.3系统进化树的构建将测得的序列使用Chromas 2.22处理, 通过DNAMAN 6.0进行拼接后, 登录Genbank (http://www.ncbi.nim.nih.gov/) , 对于菌株16S r DNA测序的结果, 利用Blast进行比对, 用相邻计算法构建系统进化树。1.7生长曲线取l m L种子液, 接种于50m LMRS培养基的250 m L三角锥形瓶中, 置37 t摇床中160r/min培养, 每2 h取样一次, 用未接种的MRS培养基作空白对照, 测定菌液在波长为600 nm的0D值, 以培养时间为横坐标, 以0D值为纵坐标, 绘制生长曲线, 分析菌株生长的各个阶段。1.8抑菌性能待灭菌后的LB琼脂培养基冷却至45加人培养过夜的E.coli K88�K99 (每毫升培养基中加入1 jjl L菌液) , 震荡混匀, 适量倒人灭菌平板中。待充分凝固后, 在每个琼脂平板上轻轻放置灭菌牛津杯, 在牛津杯中加人200 JJLL待测菌液, 每个处理3个重复, 盖好皿盖, 静置1 h�移至37 T生化培养箱中培养20 h后, 打开皿盖, 移去牛津杯, 用卡尺测量抑菌圈直径。2结果与分析从健康仔猪肠道内容物中分离得到15株乳酸菌, 经过分离、纯化、筛选得到一株各方面性能都较理想的乳酸菌株, 编号为LYP06-2�该菌株特性描述如下。2.1菌落形态菌落圆形, 淡黄色, 表面光滑、湿润, 中间凸起, 边缘整齐 (见图1) ;显微镜检:革兰氏阳性, 圆端直杆状, 单个、成对或成短链状 (见图2) ;接触酶反应阴性。图1 LYP06-2的菌落形态图2 LYP06-2的菌体形态2.2产酸试验结果菌株LYP06-2的产酸试验结果见表1, 其透明圈直径 (H) 与菌落直径�C) 比值达到1.88, 说明菌株LYP06-2具有较强产酸能力。

0«I I——L==l——I0.03 0.1 0.2 0.3胆盐浓度八图3菌株LYP06-2的耐人工肠液试验结果2.6菌株LYP06-2的生化鉴定菌株LYP06-2的生化反应结果见表4, 根据《伯杰细菌鉴定手册》及图4菌株LYP06-2的PCR扩增后电泳图 (M:Marker DL2000;1:菌株1_丫卩06-2;2:阴性对照) 将菌株LYP06-2的16S r DNA序列上传至NCBI进行BLAST同源性比对分析, 发现其与Lactobacillus plant arum的同源性为99%, 在网页中点击“Distance tree of results", 选择Neighboringjoining方法构建系统进化树, unknown (菌株LYP06-2) g Lactobacillus p/o/Uonxm属于同一分枝 (见图5) 。综合菌株LYP06-2的生理生化特性及100100-2000—1000—750—500—250—注:“+”表示反应为阳性, “-”表示反应为阴性。2.7菌株LYP06-2的16S r DNA序列分析以27F和1492R为上下游引物、细菌总DNA为模板进行PCR扩增, 菌株16S r DNA PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图见图4, 条带在1 000�2 000 bp�约1 500 bp�M 1 2《常见细菌系统鉴定手册》, 初步鉴定菌株LYP06-2为植物乳杆菌plantarum) 。表4菌株LYP06-2的生化反应结果生化反应菌株LYP06-2接触酶试验-硝酸盐还原试验-产H2S试验-吲哚试验-明胶液化试验-蔗糖+葡萄糖+麦芽糖+果糖+甘露糖+乳糖+半乳糖+鼠李糖-山梨醇+表1菌株LYP06-2的产酸试验结果植物乳杆f透明圈直径 (H) 菌落直径�C�比值�H/C) 产酸试验4.93±0.25 2.62±0.16 1.882.3耐人工胃液试验结果动物胃中p H较低, 成年猪胃内p H—般为1�2, 断乳仔猪胃的p H变异较大, 一般为2.60~5.83, 食物通过胃的排空时间为2�6W�试验将配好的人工胃液PH调为2.0、3.0、4.0, 处理时间为3 h�菌株LYP06-2的耐人工胃液试验结果见表2。菌株LYP06-2在PH2.0�3.0�4.0的人工胃液中的存活率分别为31.3%、41.6%、87.0%, 随着p H减小, 菌株LYP06-2的存活率下降, 但其在p H2.0的人工胃液中, 存活率仍可达到31.3%, 说明其对于人工胃液具有较强的耐受性。表2菌株LYP06-2的耐人工胃液试验结果p H活菌数[log (CFU/m L�存活率 (%) 2.0 8.0 31.33.0 8.1 41.64.0 8.4 87.0对照8.5/2.4耐人工肠液试验结果菌株LYP06-2的耐人工肠液试验结果见表3。菌株LYP06-2在人工肠液中的存活率为33%, 说明其可以耐受人工肠液。表3菌株LYP06-2的耐人工肠液试验结果肠液活菌数[log (CFU/m L]存活率 (%) 人工肠液8.0 33.0对照8.5/2.5耐胆盐试验结果菌株LYP06-2的耐人工肠液试验结果见图3。菌株LYP06-2在含0.03%、0.1%、0.2%、0.3%猪胆盐的MRS培养基中存活率随着胆盐含量升高而降低, 在胆盐浓度0.2%时其存活率为25.7%, 说明其能够耐受一定浓度胆盐环境;胆盐浓度0.3%时菌株LYP06-2存活率为3.7%。80604020

16Sr DNA序列分析结果, 确定该菌株为乳杆菌属的态观察、菌体染色镜检选择革兰氏阳性、接触酶反应植物乳杆菌plantarum) 0阴性等初步得到15株乳酸菌, 经过筛选得到一株抗•Lactobacillus ruminis ATCC 27782 (ref INC_OI5975.1) —i-•Lactobaci Uus saiivarius UCC1!8 (refl NC_007929.!) unluiown (lci|7477息>Lactobacillus pbntiirum WCFSI (ref]NC_0Q45672) Lactobacilhis&anfrancisoensis TMW 1.1304 (re f]NC_015978.1) ^Lactobacillus reuteri DSM 20016 (rer]NC_009513.1) -^Lactobaci Ui Ls fernientum IPO 3956 (refl NC_0l06l0.l) R:diococcus claus&enii ATCC BAA-344 (ref|NC_016605.I) l^diococcus pentosjkoeus ATCC 25745<refl NC_008525.1) -^Lactobacillus brevis ATCC 367 (ref INC_008497.l) -^Lactobacilluii buduieri NRRL B-30929 (refl NC_0!5428.1) -^Lactobacillus sakei subsp.sakei 23K (refl NC_007576.1) kctohucilluii rhamnosus GG (ref]NC_0I3198.1) k Lactobaciltus casei ATCC 334 (ref]NC_008526.1) >Lact<Li K图5菌株LYP06-2的系统进化分析2.8抑菌试验结果菌株LYP06-2对大肠杆菌K88�K99的抑制结果见表5, 抑菌效果十分明显。表5菌株LYP06-2对大肠杆菌K88�K99的抑制结果指示菌K88 K99抑菌圈直径 (mm) 18.60±0.47 15.43±0.842.9菌株LYP06-2的生长曲线LYP06-2生长曲线见图6, 在0~6 h菌体缓慢生长, 为迟缓期;6h后可以看到曲线上升的坡度很陡, 进入对数生长期;8-18 h增长逐渐变缓, 18~20 h进人稳定期;20 h以后0D值逐渐减小, 说明其开始进入衰退期。在后期发酵培养时, 最适的种龄一般都选在生命力极为旺盛的对数生长期, 此时的菌种量尚未达到最高峰, 能很快适应环境, 生长繁殖快, 可大大缩短其在发酵罐中的调整期, 缩短在发酵罐中的非产物合成时间, 提高发酵罐的利用率, 节省成本, 故选择培养时间为18 h的菌液作为种子液。图6菌株LYP06-2的生长曲线3结论与讨论本研究从健康仔猪肠道内容物中分离目标菌, 先富集培养, 利用菌液稀释涂布法分离, 经过菌落形逆性较好、产酸能力及抑菌较强的菌株LYP06-2, 结合其生理生化特性及16S r DNA序列分析, 鉴定该菌株为乳杆菌属的植物乳杆菌 (^Lactobacillus plantarum) 0目前, 微生态制剂在动物生产中得到广泛的应用, 主要有芽孢杆菌制剂、乳酸菌制剂和酵母菌制剂等。研究发现, 在饲料中添加一定量的制剂, 可以调整肠道微生态平衡、提髙动物生长性能、降低料肉比、提高动物机体免疫力、降低发病率等, 但是在生产实际中, 微生态制剂会出现使用效果不稳定的情况, 除了宿主动物的年龄、生理状态和所处环境等因素影响外, 菌种本身的特性是发挥作用效果的关键。植物乳杆菌p Zarafaruni) 是动物肠道中常见的乳杆菌之一, 具有调节肠道、促进消化等功能, 被认为是生产益生菌剂的理想菌株、益生菌随着食物进入动物消化道, 首先到达胃部, 进人一个酸性、含有胃蛋白酶的环境中, 然后到达机体最重要的吸收器官小肠, 经受胰蛋白酶、胰脂肪酶等各种消化酶和胆盐的消化作用, 只有能在胃肠道中存活并达到一定数量, 益生菌才能够有发挥作用的可能。因此, 益生菌需要能够耐受胃肠道环境, 包括胃酸、胃蛋白酶、肠液、胆盐等, 本试验筛选的菌株LYP06-2在p H为2.0时的人工胃液中处理3 h后存活率为31.3%, 人工肠液中存活率为33.0%, 胆盐浓度为0.3%时存活率为3.7%, 说明其具有较强的抗逆性;在MRS培养基中培养18 h即可作为种子液, 进行

摘要：从健康仔猪肠道内容物中分离筛选得到一株抗逆性较好、产酸及抑菌能力较强的菌株LYP06-2, 结合其生理生化特性及16S rDNA序列分析, 鉴定该菌株为乳杆菌属的植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum) 。菌株LYP06-2在pH2.0的人工胃液中处理3h后存活率为31.3%, 人工肠液中存活率为33.0%, 胆盐浓度为0.3%时存活率为3.7%, 对大肠杆菌K88、K99具有较强的抑制作用, 也有较强的产酸能力, 这为将来规模化生产有效的微生态制剂产品奠定了基础。

关键词：植物乳杆菌,鉴定,抗逆,益生

参考文献

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篇4：一株嗜热菌的分离鉴定及其苯酚降解特性

摘要:从某农药厂污泥中筛选分离出一株高效降解甲氰菊酯(Fenpropathrin)的光合细菌,研究了其降解特性及生物学特性。根据分离菌株的细胞形态结构、活细胞光吸收特征、生理生化特征及其16S rDNA序列同源性鉴定降解菌;气相色谱法测定该菌降解甲氰菊酯的能力;采用超声波破碎法提取该菌降解粗酶,利用(NH4)2SO4分段盐析并测定酶活性。结果表明:PSB07-14属红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.);该菌以共代谢方式降解甲氰菊酯,对甲氰菊酯的最高耐受浓度为800 mg/L,降解最佳条件为:30～35 ℃、pH6～7,光照培养15 d对600 mg/L甲氰菊酯降解率达48.41%。降解酶测定结果表明:30%～60%(NH4)2SO4沉淀的蛋白降解活性最高。

关键词:甲氰菊酯;红假单胞菌;生物降解;降解酶

中图分类号:X172文献标识码:A文章编号:1006-6500(2009)02-0001-05

Isolation, Identification of Fenpropathrin-degrading Strain PSB07-14 and Preliminary Analysis of Its Degradation Crude Enzyme

LUO Yuan-hua1,ZHANG Zhan-hong3,LIU Yong1,2,ZHANG Song-bai1,2,ZHANG De-yong1,2,LUO Xiang-wen1, CHENG Fei-xue1

(1.Hunan Plant Protection Institute,Changsha,Hunan 410125,China;2. Branch of Longping,Graduate College,Central South University,Changsha,Hunan 410125,China;3. Hunan Vegetable Institute,Changsha,Hunan 410125,China)

Abstract:A photosynthetic bacterial strain PSB07-14, with degradability of fenpropathrin, was isolated and identified as Rhodopseudomonas sp. based on its morphology, physiology and homology of 16S rDNA sequence. The degrading characteristics showed the optimum conditions of degrading fenpropathrin were 30～35 ℃, pH 6～7, respectively. This strain could grow in the media supplied with fenpropathrin up to 800 mg/Land degrade fenpropathrin by co-metabolic way. The degradation rate of fenpropathrin was up to 48.41% in a concentration of 600 mg/L within 15 d. The degradation crude enzyme was extracted and subsided by (NH4)2SO4, the results of subsiding enzyme activity showed the highest enzyme activity appeared in the subsiding of 30%～60%(NH4)2SO4.

Key words: fenpropathrin;Rhodopseudomonas sp. PSB07-14;biodegradation;degradation enzyme

甲氰菊酯,化学名称2-氰基-3-苯氧基苄基-2,2,3,3-四甲基环丙烷酸酯,商品名灭扫利,对鳞翅目、同翅目、半翅目、双翅目、鞘翅目等多种害虫有效,同时对多种害螨的成螨、若螨和螨卵有一定的防治效果[1],适用于棉花、蔬菜、果树、玉米、大豆、烟草、茶叶等作物以及林木、家畜、卫生和仓储等害虫防治,对一些农作物还有促进生长、增加产量、改善品质的作用。

虽然甲氰菊酯对高等动物毒性中等,在试验剂量内对试验动物未发现致畸、致突变和致癌作用。但是,对鱼类等水生生物、蜜蜂、家蚕等高毒,对光、热、潮湿稳定,在环境中的半衰期较长,长期使用,环境中大量残留,会带来严重的环境污染和生态风险。这迫使我们寻找一种切实有效的方法来解决这一难题 [2,3]。以生物修复(Bioremediation)为理论基础的农药残留降解菌技术为降低农产品和农业生产环境中的农药残留物提供了希望,该技术具有高效、无毒、无二次污染的特点,而且经济实用,操作简便,目前已成为去除农药残留污染的一种重要方法。国内外有很多关于农药残留降解菌研究的报道,由于菊酯类农药在20世纪80年代才在我国广泛使用,对该类农药的研究起步较晚,对拟除虫菊酯类农药的降解菌报道相对较少[3,4]。因此,筛选更多类型的甲氰菊酯高效降解菌,对甲氰菊酯残留的生物修复研究和应用具有十分重要的意义。

笔者从某农药厂污泥中分离到一株能降解甲氰菊酯的光合细菌PSB07-14,对其降解甲氰菊酯的特性进行了研究。该研究为利用光合细菌降解甲氰菊酯残留及其降解机理、克隆降解酶基因打下了基础。

1材料和方法

1.1培养基、试剂和主要仪器

光合细菌(PSB)培养基:MS培养基添加0.15%酵母膏,参照文献[5];选择培养基:在PSB培养基中加入一定浓度的甲氰菊酯;固体培养基:在培养基中加入1.5%的琼脂。

主要试剂:40 %甲氰菊酯乳油,海南正业化工有限公司惠赠;98 %甲氰菊酯标准品购自天津东方绿色技术发展有限公司;其它农药残留检测试剂均为色谱纯。

主要仪器:农药残留检测在湖南省植物保护研究所农药残留检测室进行。6890N气相色谱仪 (Agilent, USA)、扫描电子显微镜(JEXL-230,日本电子公司)、分光光度计(Tu-1901,北京普析通用仪器有限责任公司)、光照培养箱(GZP-350,上海精宏实验设备有限公司)。

1.2培养条件

光合细菌培养采用130 mL的血清瓶。培养条件(除特别说明外):厌氧光照培养,(30±2)℃,2 000 lx光照培养6～7 d;黑暗好氧培养,黑暗条件下,(30±2)℃,培养6～7 d。每天摇瓶混匀1次。

1.3降解菌的分离、筛选

将采自某农药厂的污泥2.0 g加入120 mL PSB培养基中,光照培养7 d后,取1%菌液接种到含甲氰菊酯100 mg/L的选择性液体培养基中,光照培养7 d,取300 μL菌液稀释涂布到选择性固体培养基中,挑取菌落形态不同的菌,分别接种到含甲氰菊酯100 mg/L选择性液体培养基中,光照培养7 d,取1%分别接种到含甲氰菊酯200,400,600,800,1 000 mg/L选择培养基中,15 d后检测培养基农药浓度,以含相同浓度的甲氰菊酯,相同培养条件不接种细菌的培养基为对照。选择降解率最大的细菌进行后续研究,命名为PSB07-14,后续试验中1 mL菌液中约含活细胞109个。

1.4菌种的鉴定

1.4.1电镜样品制备及观察将活的细菌滴到具膜载网上,然后进行磷钨酸染色,TEM(transmission- scanning electron microscope)观察拍照。

1.4.2吸收光谱的测定取1.5 mL培养5 d的光合细菌培养液,8 000 r/min离心洗涤3次,用0.9 %生理盐水重悬浮,在分光光度计上于200～900 nm扫描。

1.4.3菌株的生理生化特征的测定见参考文献[6]。

1.4.4菌体16S rDNA序列的测定及同源性分析细菌基因组提取采用UNIQ-10柱式基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)。以所提的细菌总DNA为模板,采用细菌16S rDNA通用引物扩增[5],PCR反应体系(50 μL):10×PCR Buffer 2.5 μL;MgCl2(25 mmol/L) 2 μL;dNTP(10 mmol/L) 2 μL;引物Bpf/Bpr(25 μmol/L) 各0.5 μL;Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL;双蒸水 43 μL。PCR反应条件:94 ℃ 4 min;94 ℃ 1 min,50 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,循环30次;72 ℃ 10 min。反应完成后,经1%琼脂糖电泳,检测扩增片断的大小和特异性。PCR产物纯化后,委托上海生工生物工程公司测序。将PSB07-14测得的16S rDNA序列在Genbank中利用blast进行比对,比较不同细菌间的相似性。

1.5甲氰菊酯含量的测定

整瓶培养液,用正己烷萃取3次,每次用量分别为40,40,30 mL。氮吹仪上吹干,然后用正己烷溶解并定容至10 mL,接着加入无水硫酸钠脱水。气相色谱测定其含量[4]。以98 %甲氰菊酯标样定性定量,所有数据为3次重复平均值。

测试条件:气相色谱仪型号Agilent 6890N,色谱柱型号为HP-5 (30 m×0.32 mm×0.25 μm),采用程序升温法:毛细管柱起始温度160 ℃,保持5 min,10 ℃/min升至200 ℃,保持1 min,10 ℃/min升至280 ℃,保持8 min,检测器(μECD)温度320 ℃,进样口温度250 ℃,载气为N2(纯度99.999 9 %),流量1 mL/min。进样量均为1 μL。

降解率的计算方法:降解率=(1-C1/C0)×100%

其中,C1为降解菌处理甲氰菊酯残留浓度(mg/L),C0为对照处理甲氰菊酯残留浓度(mg/L)。

1.6 降解酶的提取与盐析

15 mL离心管加入10 mL培养7 d的PSB07-14菌液,8 000 r/min离心2 min,倒去上清液,重复1次,收集菌细胞,倒去上清液,加入等体积的PBS(pH7.2)缓冲液,降解粗酶的提取采用超声波破碎仪破碎菌体细胞[7],12 000 r/min离心10 min,上清液即为粗酶液,考马氏亮蓝法测定蛋白的浓度[8],用PBS缓冲液调整蛋白浓度为10 mg/L做后续实验。取50 mL粗酶液,加入(NH4)2SO4盐析,静置10 min,离心收集沉淀,PSB(pH7.2)缓冲液溶解,并调整蛋白浓度为1 mg/mL[8]。酶活力测定参照文献[7],本试验的1个酶活力单位(U)定义为在本试验条件下1 min内甲氰菊酯减少的微摩尔数。

2结果与分析

2.1菌株鉴定

2.1.1培养特征和活细胞光吸收特征培养结果表明,PSB07-14最佳生长温度为30～35 ℃、pH6.5～7.5,具有红色培养物、黑暗好氧生长慢以及耐盐低于3%的Rhodopseudomonas的特征[6]。活细胞光吸收结果表明(图1),该菌含有细菌叶绿素a及类胡萝卜素[5],表明该菌属于紫色非硫细菌。

2.1.2形态结构和生理生化特征图2的电镜结果表明,PSB07-14为杆状,大小为0.6～1.0 μm×2.4～3.1 μm,端生鞭毛,以二分裂方式繁殖。生理生化分析结果表明(表1):G-,V-P反应阴性,甲基红反应阴性,不能利用淀粉,H2S反应阴性;可以利用多种小分子的有机酸生长,也能利用部分氨基酸和醇类化合物进行生长。PSB07-14的形态结构和生理生化特征与Rhodopseudomonas基本一致[6]。

2.1.316S rDNA序列分析PSB07-14测定的16S rDNA序列长度为1 429 bp (Genbank accession No.FJ798824),Blast结果表明,在Genebank中,与Rhodopseudomonas palustris strain HZ-1 (EU703955)和Rhodopseudomonas sp. TUT3625 (AB250616) 的同源性分别为98%和97%。

2.1.4鉴定结果根据Bergeys Manual of Determinative Bacteriology[6],将PSB07-14鉴定为Rhodopseudomonas sp.。

2.2菌株对甲氰菊酯的降解

2.2.1对甲氰菊酯的耐受浓度在120 mL PSB液体培养基中,加入5 mL菌液和适量甲氰菊酯,使培养基中甲氰菊酯终浓度为200,400,600,800,1 000 mg/L,光照培养,第15 天观察PSB07-14的生长情况。结果如表2示,PSB07-14耐受甲氰菊酯的最大浓度为800 mg/L。

2.2.2对甲氰菊酯的降解120 mL的PSB液体培养基中加入5 mL PSB07-14和适量甲氰菊酯,使其最终浓度为600 mg/L,光照培养15 d取样测定甲氰菊酯的残留量,以含600 mg/L甲氰菊酯培养液为对照。甲氰菊酯在光照下,经过15 d有一定量的降解,可见光照对甲氰菊酯有一定的降解效果,但作用并不是很大(4.13%)。PSB07-14在600 mg/L甲氰菊酯培养液中培养15 d,对甲氰菊酯的降解率为48.41%(表3)。

2.2.3最佳降解条件在pH为5,6,7,8,9,10的120 mL的PSB培养基中,加入5 mL的PSB07-14菌液和适量甲氰菊酯,其最终浓度600 mg/L,光照培养15 d后取样,样品经萃取后检测甲氰菊酯残留量。结果表明(图3),pH在6～8之间,PSB07-14的降解效能都比较好,最适pH为7。

在120 mL含甲氰菊酯600 mg/L的PSB培养基中,加入5 mL的PSB07-14菌液,不同温度下,光照培养15 d后测定甲氰菊酯残留量。图4表明,PSB07-14在25～35 ℃之间,具有良好的甲氰菊酯降解能力,在35 ℃降解能力最好。温度过高或过低都显著影响菌株的降解能力,当温度低于25 ℃或高于45 ℃,菌株几乎丧失降解能力。

2.2.4菌株对甲氰菊酯的共代谢特点PSB07-14在以甲氰菊酯为唯一碳源的PSB培养基中不生长(表4),但在有其他碳源(酵母膏)存在时可以降解甲氰菊酯,表明PSB07-14是以共代谢的方式降解甲氰菊酯[9]。

2.3分段盐析粗蛋白降解活性

分段盐析粗蛋白降解活性表明,30%～60%(NH4)2SO4沉淀出的粗蛋白活性为38.27 U/L,大大高出0～30%、60%～80%(NH4)2SO4沉淀出的粗蛋白的活性(表5)。

3讨 论

通过富集培养法分离出甲氰菊酯降解菌PSB07-14,生理生化方法和16S rDNA序列同源性将其鉴定为Rhodopseudomonas sp.。在农药残留的降解菌研究中,光合细菌的研究报道相对较少;光合细菌(Photosynthetic Bacteria, PSB)是地球上最早出现的具有原始光能合成体系的原核生物。近年来,对光合细菌的应用研究获得了很大的进展。研究表明,光合细菌在种植、养殖、新能源开发利用以及医药方面具有十分广阔的前景[10-13]。在环境治理方面,光合细菌可以有效地处理有机废水[14],净化水质[15],降解芳香族化合物[13]。在农药降解方面,光合细菌可以有效地降解有机磷农药[5]、 硫代磷酸酯类农药[16]。而且光合细菌具有很好的促进作物生长和提高作物抗逆性的作用[17],因此,筛选光合细菌降解菌具有良好的应用前景。

PSB07-14对高浓度的甲氰菊酯具有良好的降解效果,在600 mg/L甲氰菊酯培养液中培养15 d,对甲氰菊酯的降解率为48.41%。高于丁海涛等[18]分离的降解菌降解速率以及笔者先前分离的光合细菌株PSB07-19[19],与洪源范等[9]分离的降解菌降解速率相当。PSB07-14降解甲氰菊酯的最佳条件与该菌生长的最佳条件基本一致,表明该菌具有潜在的实际应用价值。

PSB07-14不能以甲氰菊酯作为唯一碳源,只能以共代谢的方式降解甲氰菊酯。表明PSB07-14对甲氰菊酯的降解作用是一种酶促反应,该结果与洪源范等[9]的研究结果一致。

PSB07-14降解酶分段盐析结果表明,在30%～60%(NH4)2SO4沉淀出的粗蛋白活性为38.27 U/L,该研究为降解酶的分离纯化提供了参考。其降解酶的研究以及降解酶基因的克隆是下一步的工作方向。

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篇5：一株嗜热菌的分离鉴定及其苯酚降解特性

摘要：用以苯酚为唯一碳源和能源的无机盐驯化液对沈阳某煤气厂土壤进行驯化培养,从中分离筛选到1株苯酚降解菌,编号为MW-1.该菌株最高可耐受1600 mg/L苯酚,其降解性能研究表明:该菌具有较强的苯酚降解能力,在30℃,pH 5.5～7.5,装液量为60 mL,接种量20%,摇床振荡速度120 r/min的条件下,振荡培养6 h后可使400mg/L的苯酚降解率达80%以上.虽然葡萄糖对该菌体的生长及降解苯酚均有一定的抑制作用,但有葡萄糖(600 mg/L)存在的`情况下,该菌对苯酚的降解率仍接近60%.这对处理含有其它碳源的含酚废水具有一定的意义.作 者：刘长风 刘桂萍 刘学贵 张月澜 王丽多 LIU Chang-feng LIU Gui-ping LIU Xue-gui ZHANG Yue-lan WANG Li-duo 作者单位：刘长风,LIU Chang-feng(东北大学,资源与土木工程学院,辽宁,沈阳,110004;沈阳化工学院,环境与生物工程学院,辽宁,沈阳,110142)

刘桂萍,刘学贵,张月澜,王丽多,LIU Gui-ping,LIU Xue-gui,ZHANG Yue-lan,WANG Li-duo(沈阳化工学院,环境与生物工程学院,辽宁,沈阳,110142)

篇6：一株嗜热菌的分离鉴定及其苯酚降解特性

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

泥样来自我国湖南省长沙段湘江底泥,降解菌分离来自所采泥样。

1.1.2 试剂

DBP购自湖南长沙汇虹试剂有限公司,分析纯。甲醇为HPLC级,购自淮阴汉邦科技有限公司;色谱用水为自备双蒸水;蛋白胨为生化试剂,购自上海市宝典化工有限公司;酵母膏为生化试剂,购自中科院上海昆虫科技开发有限公司康乐培养基厂;其余无机盐试剂均为分析纯,购自长沙安泰精细化工实业有限公司。

1.1.3 仪器

DYY-Ⅲ2稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂);Tgradient Thermocycler PCR仪(Biometra公司);725N型紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);Elite高效液相色谱仪(大连伊利特公司)。

1.1.4 培养基

无机盐培养基:K2HPO4·3H2O 1 000mg/L, KH2PO4 200mg/L,NH4NO3 1 000mg/L, NaCl 1 000mg/L, MgSO4·7H2O 400mg/L,CaCl2·2H2O 20mg/L,FeSO4 1mg/L,pH 7.0。

富集培养基:牛肉膏3g/L,蛋白胨5g/L,NaCl 5g/L,pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 品来源及菌株的分离纯化样

泥样按1%(W/V)的接入量接种于无机盐液体培养基中,以梯度压力式驯化法驯化,DBP浓度梯度依次为100、200、400、700和1 000mg/L。驯化结束后在固体培养基平板(由浓度为100mg/L DBP的无机盐液体培养基加入琼脂粉而制成)上接种培养,多次平板涂布法分离直至得到纯的单菌落。

1.2.2 菌株的鉴定

1.2.2.1 形态学、生理生化鉴定及(G+C)mol%测定

形态学分析采用扫描电子显微镜(JEOL JSM-6380LV),生理生化实验参考文献[9,10]。(G+C)mol%测定采用高效液相色谱法,DNA提取和色谱条件参考文献[11]。

1.2.2.2 16S rDNA扩增和序列测定

离心收集菌体,使用UNIQ-10柱式基因组抽提试剂盒(Sangon)提取基因组DNA,以其作为扩增模板在PCR仪上进行16S rDNA扩增,所用引物以及PCR程序参考文献[12]。PCR产物采用E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit(OMEGA)纯化回收后由测序由北京三博远志生物公司完成。获得菌株16S rDNA序列,用NCBI-Blast软件将测序结果在Genbank等数据库中进行同源性分析,采用Clustal X 1.8多重比对后, 用Mega3.1进行系统发育树构建。

1.2.3 生长与降解实验

为考察不同初始pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)、温度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃)和摇床转速(0、50r/min、100r/min、150r/min、200r/min)对DBP降解菌株XJ1的生长及降解性能的影响,在150mL的三角瓶中装入50mL的无机盐液体培养基,DBP的初始浓度为100mg/L,接种量为2%(接种后的细胞浓度为1.2×106 cells/mL),降解时间为48h。实验基本条件为初始pH 7.0,温度30℃,摇床转速为150r/min,实验中固定其中两个条件,改变另一个条件进而确定最佳的生长和降解条件。以上试验处理均为3次重复。

1.2.4 分析方法

1.2.4.1 DBP的测定

采用高效液相色谱仪测定邻苯二甲酸二丁酯的含量。HPLC分析条件:色谱柱Hypersil BDS C18(4.6mm×200mm×5μm),柱温35℃,流动相甲醇∶水=90∶10, 流速为0.5mL/min,检测器波长为228nm,进样量为20μl。

1.2.4.2 代谢产物的分析

调节样品的pH为2.0, 流动相为甲醇∶磷酸溶液(0.02mol/L)=90∶10,检测波长为210nm,除此之外,色谱条件同章节1.2.4.1所述。采用与已知标准化合物的保留时间相比较的方法进行代谢产物初步鉴定。

1.2.4.3 生物量测定

采用725N型紫外可见分光光度在600nm下测量培养基的OD值定量。

2 结果与分析

2.1 菌株的形态学、生理生化特征和(G+C)mol%值

通过富集驯化、分离和纯化得到了多株以DBP为唯一碳源和能源的菌株,其中菌株XJ1降解能力最强,以后实验皆采用该菌株。菌株XJ1的形态学特征为:在固体平板上的菌落大小为1～2mm,圆形,表面光滑,呈亮黄色,刚形成的菌落边缘整齐,超过一定的培养时间菌落边缘呈放射状。扫描电镜观察(如图1所示),菌株XJ1呈杆状,大小为(1.5-1.7)μm×(0.54-0.57)μm,单端端生鞭毛(如图1中的箭头所示)。(G+C)mol %测定的结果为 65.18%。菌株XJ1生理生化特征见表1。

2.2 菌株的16S rDNA分析

测序后,得到长度为1371 bp的菌株XJ1的16S rDNA序列。菌株XJ1的GenBank序列登录号为:DQ672266。序列对比的结果表明,所分离的菌株XJ1与GenBank中的Sphingomonas xenophaga QYY和Sphingomonas xenophaga BN6T相似性水平分别为100%和99%。为确定该菌株的系统发育位置,选取了一些鞘氨醇单胞菌及与其相似的菌株构建系统树,并选择Escherichia coli(M25588)作为外群,各菌株名称及序列号见图2。

2.3 初始pH、温度以及摇床转速对细菌生长和DBP降解的影响

由图3可知,菌株XJ1生长和DBP的生物降解最适初始pH均为7.0,48h后检测不到残留的DBP。在初始pH为5.0～7.0的偏酸性条件下,DBP的降解效果明显比初始pH为7.0～9.0的偏碱性条件下的差。原因可能是在降解过程中会生成诸如邻苯二甲酸等中间产物,从而酸化培养基,抑制DBP的进一步的降解[13]。

图4显示了温度对菌株XJ1生长和DBP生物降解的影响,菌株XJ1的最适生长温度为35℃,48h后检测不到残留的DBP,在30℃的条件下,本实验也未检测到残留的DBP,原因可能在于降解时间(48h)比较长,综合考虑细菌生长和DBP降解两个过程,选择35℃作为最佳温度。

鉴于降解菌株XJ1为好氧菌,培养基中的溶解氧将作为关键的电子受体对DBP的生物降解产生重要影响[2]。本实验考察了不同的转速条件下的DBP生物降解规律,从而间接反应溶解氧对DBP的降解影响。本实验考察了不同的转速条件下的DBP生物降解规律,从而间接反应溶解氧对DBP的降解影响。由图5可知即使在静止的条件下,菌株XJ1仍然显示出对DBP较强的降解能力,仅有38.06±1.50mg/L的残留,当转速大于100r/min时,检测不到残留DBP,转速为150r/min是菌株XJ1生长的最佳条件,综合考虑两个过程,选择150r/min为最佳转速。在pH7.0、温度35℃和转速为150r/min的最佳条件下,细菌生长和DBP的降解状况如图6所示。在前16h,DBP降解比较快,细菌生长达到对数生长期。16h至40h,DBP降解趋缓,40h时检测不到残留DBP,菌体生长达到稳定期。

2.4 DBP代谢产物分析

图7为DBP在菌株XJ1降解32h的代谢色谱图,其中保留时间为9.88min为母体化合物DBP。通过与被怀疑为中间产物的化合物如邻苯二甲酸单丁酯(MBP)、邻苯二甲酸(PA)和原儿茶酸(PCA)等[7,14]的保留时间相对照,初步判定保留时间为5.11min和6.06min所对应的代谢产物为邻苯二甲酸和邻苯二甲酸单丁酯。更准确的鉴定需要进一步的化学分析。

2.5 底物广谱性实验

为考查菌株XJ1对芳香族衍生物代谢的多样性,选取邻苯二甲酸二甲酯等为代表的邻苯二甲酸酯类化合物及其代谢中间产物邻苯二甲酸和原儿茶酸[7,14]以及苯、萘等常见的芳香族化合物及其代谢中间产物邻苯二酚或水杨酸[15]进行测试。测试方法为在基础无机盐培养基加入底物使其最终浓度为100mg/L,培养48h后考察菌株XJ1在含有这些底物培养基中的生长情况。

由表2可知,菌株XJ1并不能利用苯、萘及萘的代谢中间产物水杨酸等,但能够利用邻苯二甲酸二甲酯等邻苯二甲酸酯类化合物及其中间代谢产物如邻苯二甲酸和原儿茶酸。该菌株也能够利用邻苯二酚,预示菌株XJ1含有邻苯二酚环断裂的双加氧酶[16]。另外在对邻苯二甲酸酯类化合物的利用上,菌株XJ1较易利用烷基含碳数低的邻苯二甲酸二甲酯和邻苯二甲酸二乙酯,而不易利用烷基含碳数高的邻苯二甲酸二辛酯,这可能是后者分子量和体积的增加,增大了分子对生物反应的位阻效应[5]。

3 讨论

从湘江底泥中筛选到一株能够高效降解DBP的菌株XJ1, 将该菌株的16S rDNA序列与GenBank中已公布的序列进行同源性分析, 发现菌株XJ1与鞘氨醇单胞菌属中多种菌株具有较高的相似性, 如与Sphingomonas paucimobilis 20006FA和Sphingomonas yanoikuyae Q1同源性分别为96%和95%, 其中与模式菌株Sphingomonas xenophaga BN6T同源性为99%, 与Sphingomonas xenophaga QYY同源性可达100%。在通常情况下, 16S rDNA序列同源性低于97%可认为不属于同一种, 同源性低于93%～95%可认为不属于同一属[16], 因此16S rDNA序列表明菌株XJ1属于鞘氨醇单胞菌属。另外(G+C)mol%为65.18%,位于鞘氨醇单胞菌属的(G+C)mol%值的范围之内[10]。生理生化指标上,与模式菌株Sphingomonas xenophaga BN6T在碳源的利用上方面具有较高的相似性[17];另外,菌株XJ1和Sphingomonas xenophaga QYY在生理生化指标上也存在较高的相似性[16]。经形态学并通过以上16S rDNA序列、(G+C)mol%和生理生化指标分析,可将菌株XJ1归属于鞘氨醇单胞菌属。

++生长较好; +可以生长; -不能生长。

在最佳的降解条件下,菌体生长也达到稳定期,40h后检测不到DBP的残留,表明菌株XJ1具有较强的降解能力。目前利用鞘氨醇单胞菌属细菌以纯培养物进行邻苯二甲酸二丁酯降解研究尚未多见,台湾学者Chang Bea Ven等[18]分离并鉴定了一株降解DBP的细菌Sphingomonas sp. O18,在温度为25℃的条件下,初始浓度为100mg/L的DBP降解7d后仍有25.3±1.4mg/L的残留。

目前关于邻苯二甲酸酯类化合物的好氧生物降解初始途径的认识如下[7,14]:邻苯二甲酸酯首先在脱酯化酶的作用下水解为邻苯二甲酸单丁酯和相应的醇,然后邻苯二甲酸单丁酯水解为邻苯二甲酸和相应的醇;对于邻苯二甲酸的好氧代谢,G+细菌和G-细菌的采用不同的代谢方式生成原儿茶酸。本实验在前人的基础上,针对G-细菌Sphingomonas sp. Strain XJ-1对DBP的降解途径做了粗略的研究,根据代谢谱图随时间的变化和代谢产物物质分子结构提出以下降解途径(图8),关于邻苯二甲酸转化为原儿茶酸的方式需要进一步研究。

鞘氨醇单胞菌属的细菌通常能够降解苯、甲苯以及高分子的化合物如多环芳烃和聚乙烯醇(PVA)等,近年来倍受重视,有望成为一种新型的微生物资源[16,19,20,21]。本实验室所筛选的菌株XJ1能够利用邻苯二甲酸二甲酯等一系列邻苯二甲酸酯类化合物,预示菌株XJ1在处理含有邻苯二甲酸酯类化合物污染的生物修复方面具有独特的应用价值。

4 结论

4.1 从湘江底泥筛选到的菌株XJ1能以DBP为唯一碳源和能源生长;经形态学、生理生化、(G+C)mol%及16S rDNA鉴定该菌株为Sphingomonas sp.。

4.2 菌株XJ1对DBP降解的最佳条件为温度35℃,初始pH为7.0,转速为150r/min,在DBP初始浓度为100mg/L条件下,DBP在40h内可完全降解,表明菌株XJ1对DBP具有很强的降解能力。

4.3 在菌株XJ1的作用下,DBP首先水解为MBP,继而水解为PA,最终完全降解为CO2和H2O。

4.4 菌株XJ1在处理含有邻苯二甲酸酯类化合物污染的生物修复方面具有独特的应用潜力。

摘要：目的:从湘江底泥筛选分离出能够高效降解邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的菌株,对其进行鉴定和降解特性研究。方法:采用DBP为唯一碳源和能源的无机盐培养基,通过富集培养、平板划线分离得到一株优势菌,编号为XJ1。采用形态学、生理生化、(G+C)mol%和16SrDNA序列分析进行鉴定。采用高效液相色谱测定菌株XJ1在摇瓶中对DBP的降解能力,并进行DBP代谢产物的分析和底物广谱性测试。结果:鉴定该菌株为Sphingomonsasp.。摇瓶实验结果表明:最佳降解条件为温度35℃,初始pH为7.0,转速150r/min;在最佳的降解条件下,40h之内DBP可完全降解。HPLC-UV检测出的中间代谢产物为邻苯二甲酸单丁酯(MBP)和邻苯二甲酸(PA)。底物广谱性实验表明菌株XJ1能够利用邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯等邻苯二甲酸酯类化合物。结论:菌株XJ1对DBP具有高效的降解能力,在处理含有邻苯二甲酸酯类化合物污染的生物修复方面具有独特的应用潜力。

篇7：一株嗜热菌的分离鉴定及其苯酚降解特性

摘 要：从三亚市大东海分离出1株有较强溶藻活性的细菌，命名为L-D1，并对该菌株进行形态和生理生化鉴定。L-D1的菌悬液对中肋骨条藻的生长有很强的抑制作用。试验发现，L-D1是通过直接和间接的方式共同作用影响中肋骨条藻的生长的；L-D1的溶藻效果在温度为25 ℃时优于其他温度，盐度为20‰时优于其他盐度，全黑暗条件下的溶藻效果优于其他光照条件下的。

关键词：溶藻细菌；中肋骨条藻；溶藻；赤潮

随着水体富营养化的不断加剧，海洋开发活动的日益增加，世界航运的不断发达，以及沿海工业、农业、海洋养殖业以及旅游业的快速发展，导致赤潮发生的频率增高、范围扩大，已经成为一种全球性的海洋灾害[1]。引发赤潮的生物有很多种，其中海洋浮游微藻是引发赤潮的主要生物。在四千多种海洋浮游微藻中有260多种能形成赤潮，其中有70种产生毒素[2]。溶藻细菌可以通过直接或间接的方式，抑制藻类生长或杀死藻类，而且具有经济、安全、特异、特效、维持水体生态平衡等特点[3]。本研究通过对固体平板溶藻方法的改良，从三亚大东海分离出一株对中肋骨条藻具有溶藻效果的细菌，命名为L-D1，同时针对L-D1溶藻的特性，溶藻的方式以及环境因子对其溶藻效果的影响进行研究。

1 材料

1.1 藻种来源及培养

研究所用中肋骨条藻（Skeletonema costatum）为本实验室分离保存。藻种经活化后，在25 ℃，光照强度为3 000 lx及光暗比为12 h∶12 h条件下培养。

液体培养基配方[4]如下：NaNO3 75 mg，NaH2PO4•H2O 5 mg，Na2SiO3•9H2O 20 mg，Na2EDTA 4.36 mg，FeCl3•6H2O 3.16 mg，CuSO4•5H2O 0.01 mg，ZnSO4•7H2O 0.023 mg，CoCl2•6H2O 0.012 mg，MnCl2•4H2O 0.18 mg，Na2MoO4•2H2O 0.07 mg，维生素B1 0.1 mg，维生素B12 0.5 mg，生物素 0.5 mg，陈海水 1 L。

固体培养配方如下：1 000 mL 上述液体培养基中加入10～15 g琼脂。

1.2 细菌培养基

细菌固体培养基：蛋白胨10 g，肉浸粉 3 g，NaCl 5 g，琼脂 15 g，1 000 mL 蒸馏水。

细菌液体培养基：蛋白胨 10 g，牛肉粉 3 g，NaCl 5 g，1 000 mL 蒸馏水。

1.3 样品采集

2012年于海南省三亚市大东海采集海水用于溶藻细菌的分离。所采集样品在低温下保存并在4 h内送回实验室进行分离。

2 方法

2.1 溶藻细菌的分离

将采集的海水水样用无菌陈海水进行梯度稀释后，采用涂布法获得细菌单菌落。然后进行溶藻细菌的筛选，把冷却至45 ℃以下含有中肋骨条藻的固体培养基快速摇匀倒平板，待培养基凝固后，用无菌打孔器将从海水中分离得到的细菌单菌落打下，并倒置在中肋骨条藻平板上，在26 ℃，光照强度为3 000 lx下培养，以无菌的营养琼脂块作为对照，每天观察细菌单菌落周围是否出现抑藻圈。

将产生抑藻圈的琼脂块取下，采用平板划线法进行该菌的纯化，并观察记录菌落形态特征。将纯化的菌株接种于试管斜面培养基上，培养48 h后置4 ℃冰箱保存备用。

2.2 溶藻细菌的鉴定

对分离出的菌株进行革兰氏染色、氧化酶，接触酶，葡萄糖、甘露醇发酵，硝酸盐还原，MR-VP，7.5% NaCl培养液等生理生化鉴定，其方法参照文献[5]。

2.3 溶藻细菌在液体培养基中的溶藻效果

在液体培养基中将L-D1培养48 h后，加入到藻液中，进行液体溶藻试验。按照1∶9的比例将菌液加入到中肋骨条藻藻液中，连续7 d观察藻液变化情况。

2.4 溶藻细菌溶藻方式的探讨

按照1∶9的比例在中肋骨条藻藻液中加入以下细菌培养物：细菌原液、高温高压处理后的菌液、高速离心沉降后的菌液、0.22 μm膜过滤后的菌液，同时设对照组。7 d后，分别测试它们对中肋骨条藻叶绿素a含量的影响。

2.5 环境因子对其溶藻效果的影响

光照是藻类生长繁殖的重要生态因子，本研究选择了全黑暗、光循环、全光照三个光照条件，以探讨光照对L-D1溶藻效果的影响。每天定时取样，以叶绿素a含量变化为检测指标。

温度是影响生物体生长的重要环境因子，本实验设置15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃，5个温度梯度进行溶藻实验，以研究温度对溶藻细菌L-D1的影响。

盐度是水生生物生存的限制因子，本研究分别以盐度为15‰、20‰、25‰、30‰、35‰，5种不同盐度的培养液进行细菌溶藻实验。

3 结果与分析

3.1 溶藻细菌的筛选

在中肋骨条藻平板中（如图1），带有细菌菌落的琼脂块（b）周围出现了直径约为20 mm的抑藻圈，而对照琼脂块（a）周围的藻生长正常。

3.2 溶藻细菌生理生化鉴定结果

菌株L-D1为革兰氏阳性菌，菌落呈圆形、乳白色半透明、表面光滑，在液体培养基里呈直杆状，具芽孢，可运动带鞭毛。氧化酶阴性，接触酶阳性，发酵葡萄糖只产酸不产气，可利用甘露醇产酸，可还原硝酸盐，MR阳性，VP阴性，在7.5%的NaCl中不能生长。

a为无菌琼脂块作对照，b为带菌落的琼脂块产生的抑藻圈

图1 溶藻细菌在固体培养基中对中肋骨

条藻的溶藻效果

3.3 溶藻细菌在液体培养基中对中肋骨条藻生长的影响

培养7 d后，与对照组相比，加入溶藻细菌的中肋骨条藻藻液出现大量土黄色絮凝状沉淀（如图2），显微镜观察大量藻细胞凝聚集成团状，且藻细胞周围聚集了大量的细菌，只有极少数的藻细胞单个独立存在。因此，溶藻细菌在液体培养基中也能抑制中肋骨条藻的生长。

图2 添加菌悬液7d后，中肋骨条藻液照片

3.4 溶藻细菌的溶藻方式

溶藻细菌菌液经高温处理、高速离心沉降、0.22 μm滤膜过滤后，加入到中肋骨条藻的藻液中进行共同培养，均可显著抑制其叶绿素a的含量（P＜0.05），其中细菌原液对中肋骨条藻叶绿素a的合成抑制作用最强，其叶绿素a含量比对照组减少了73.80% ，表明菌株L-D1对中肋骨条藻叶绿素a含量的影响是通过直接和间接方式共同作用的。经高温处理后的菌液对叶绿素a的含量仍有较强的抑制作用，表明菌株L-D1分泌的代谢物为非蛋白类物质，如图3所示。

D1菌原液组，D2高温灭菌组，D3离心沉降组，D4滤膜过滤组

图3 经不同方式处理后的菌液对中肋骨条

藻叶绿素a含量的影响

3.5 环境因子对其溶藻效果的影响

3.5.1 光照对细菌溶藻效果的影响 三个光照条件下，菌株L-D1对中肋骨条藻叶绿素a的含量影响显著（P＜0.05）。6 d后，全黑暗条件下藻的叶绿素a含量最少，为0.019 mg/L，与其相应的对照组比减少了67.74%；全光照条件下藻的叶绿素a含量最多，为0.064 mg/L。如图4所示，Duncan多重比较结果表明，全黑暗条件下溶藻细菌对中肋骨条藻生长的抑制效果最好。

nlc202309041033

图4 6 d后，不同光照条件下溶藻细菌对中肋骨

条藻叶绿素a含量的影响

3.5.2 温度对细菌溶藻效果的影响 不同温度条件下，菌株L-D1对中肋骨条藻叶绿素a的含量影响显著（P＜0.05）。25 ℃时中肋骨条藻叶绿素a的含量为0.049 mg/L，与30、35 ℃时相比叶绿素a的含量分别减少了75.62%、85.92%。如图5所示，通过Duncan多重比较，表明溶藻细菌在25 ℃下对中肋骨条藻生长的抑制效果最好。

图5 6 d后，不同温度条件下溶藻细菌对中肋骨条

藻叶绿素a含量的影响

3.5.3 盐度对细菌溶藻效果的影响 不同盐度条件下，菌株L-D1对中肋骨条藻叶绿素a的含量影响显著（P＜0.05）。盐度为20‰时中肋骨条藻叶绿素a的含量为0.119 mg/L，与盐度为15‰、30‰、35‰时相比叶绿素a的含量分别减少了24.7%、30.41%、36.02%。如图6所示，溶藻细菌在盐度为20‰时对中肋骨条藻生长的抑制效果最好。

图6 6 d后，不同盐度条件下溶藻细菌对中肋骨条

藻叶绿素a含量的影响

4 讨论

作为防治赤潮的一种可能性生物，溶藻细菌的研究不但具有重要的理论价值还具有潜在的应用价值。国内外对于溶藻细菌的分离有多种途径，裴海燕等[6] 利用海绵固定化微生物系统分离出了对铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）、小球藻（Chlorella sp.）及栅藻（Scenedesmus sp.）具有较强溶解效果的细菌菌株。曹宾霞等[7]用试管法筛选对塔玛亚历山大藻具有溶藻能力的细菌。这两种方法的工作量都较大。王海玉等[8]分离出一株红色溶藻细菌对铜绿微囊藻有很强的溶解效果，该方法采用了果胶分解菌的培养基，所以对溶藻细菌的生存环境具有一定限制，在实际应用中存在局限。本实验通过对固体平板溶藻法的改良，首先通过涂布法获得不同细菌的单菌落，然后利用这些单菌落进行固体培养基溶藻试验，选择产生抑藻圈的菌株进行液体培养基溶藻试验，进一步验证其溶藻的效果。该方法分离周期短且操作简单，是一种分离筛选溶藻细菌的有效途径。

溶藻细菌主要通过以下方式实现溶藻效果：一是与藻细胞竞争营养物质；二是分泌胞外物质如蛋白质、抗生素等作用于藻细胞，导致藻细胞死亡；三是寄生于藻细胞内进行增殖，从而使得藻细胞裂解死亡[9]。在以往的研究中，大部分分离筛选得到的溶藻细菌属于间接性溶藻，只有少部分属于直接性溶藻[10]。为了探讨菌株L-D1对中肋骨条藻的溶解方式，将不同方式处理的菌悬液按照一定比例加入到中肋骨条藻液体培养基中，均能抑制藻细胞的生长，其中菌原液对藻细胞的抑制作用最强，经滤膜过滤的菌液和经离心沉降的菌液对藻细胞有一定的抑制作用，而经高温处理后的菌液仍有较强的溶藻活性，说明细菌分泌物具有很强的溶藻效果，且热稳定性较高。结果表明菌株L-D1的作用方式以间接溶藻为主，同时进行直接溶藻。

光照主要通过光合作用影响藻细胞的生长，而对细菌的影响不大。很多研究表明在无光照的条件下，藻细胞的光合作用几乎无法进行，此时藻细胞很容易受到溶藻细菌的攻击而死亡[11]。本研究得出的结论与其它研究一致，即全黑条件下菌株L-D1对中肋骨条藻生长的抑制效果最强。在光循环条件、全光条件下菌株L-D1的溶藻效果依次减弱。在全黑暗条件下，中肋骨条藻的光合作用无法进行，而菌株L-D1的增殖却不受影响。随着培养时间的增加，溶藻细菌的数量逐渐超过藻细胞的数量呈现出较强的溶藻效果。而在全光照条件下，中肋骨条藻由于光适应周期较长，所以藻细胞可以持续生长。其增长速度不断提高，而细菌增长速度基本不变，所以藻细胞数量呈现增长趋势。

如果某一温度有利于溶藻细菌的生长，而对藻细胞的生长影响很小或者具有一定抑制作用，那么将呈现出明显的溶菌效果，反之，呈现出弱的溶藻效果或无溶藻效果[12]。由于中肋骨条藻为广温的典型代表，其在温度较高时仍能保持很高的生长率。温度在30～35 ℃时藻细胞的生长率超过菌株L-D1的，呈现出较弱的溶藻效果；而温度在20～25 ℃时菌株L-D1的生长率超过藻细胞的，则呈现出较强的溶藻效果。

微藻和细菌都有最适生长盐度，当低于或高于该盐度时，对其生长都会产生影响[13]。中肋骨条藻作为广盐的典型代表，盐度的变化对其生长的影响并不明显，而对菌株L-D1的影响则比较大。在盐度为20‰～25‰时，其比较适宜菌株L-D1的生长，故溶藻效果比较明显。而盐度为15‰、35‰时，其不适宜菌株L-D1的生长，故溶藻效果较弱。

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[2]Zhou M J，Zhu M Y and Zhang J.Status of harmful algal blooms and related research activities in China[J].Chinese Bulletin of Life Science，2001，13(2):54-59

[3] 吴刚，席宇，赵以军.溶藻细菌研究的最新进展[J].环境科学研究，2002，15(5):43-46

[4] Rippka R J，Deruelles J，Waterbury M，et al.Generic assignments，strain histories and properties of pure culttures of cyanobacteria[J].J.Gen.Microbiol，1979，111:1-61

[5]中国科学院微生物研究所细菌分类组.一般细菌常用鉴定方法[M].北京：科学出版社，1978

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[7] 曹宾霞，王耀兵，赵水晶，等.塔玛亚历山大藻溶藻细菌筛选方法的初步研究[J]，海洋环境科学，2008，27(2): 186-189

[8] 王海玉，赵芳，彭谦，等.溶藻细菌W-04的筛选及溶藻效果初探[J]，中国农学通报，2009，25(20): 267-271

[9] 李效字，宋立荣，刘永定.微囊藻毒素的产生、检测和毒理学研究[J].水生生物学报，1999，23(5): 517 -522

[10] Skerratt J H，Bowman JP，Hallegraeff G，et al.Algicidal bacteria associated with blooms of a toxic dinoflagellate in a temperate Australian estuary[J].Mar Ecol Progser，2002，244: 1-15

[11] 史顺玉，沈银武，李敦海，等.溶藻细菌DC21的分离、鉴定及其溶藻特性[J].中国环境科学，2006，26(5):587-590

[12] 阚振荣，王欣伊，李彦芹，等.菌-藻、藻-藻间化感作用初探[J].微生物学杂志，2006，26(5): 14-18

[13] 易齐涛.海洋菌-藻关系及对营养盐的吸收作用研究[D].青岛:中国海洋大学硕士学位论文，2006Isolation ，Identification and Characterization of one algae-lysing bacteria

ZHONG Hong

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gan, LI Pei, SUN Yang

(Sanya Marine and fishery monitoring center,sanya hainan 572000 China)

Abstract：A strain of marine algae-lysing bacteria designated as L-D1 was isolated from Dadonghai in Sanya of China.According to the studies the strain L-D1 could effectively dissolve Skeletonema costatum and lysed algae by drect and inderect ways.The inhibitory effect of chlorophyll a of Skeletonema costatum was better than other grades when temperature was 25 ℃.And the optimal salinity of algae-lysing is 20.In the dark condition，L-D1 was more inhibited on the chlorophylla content of algae.

Key words： Algae-lysing bacteria；Skeletonema costatum；Lysis；red tide

（收稿日期：2013-11-01；修回日期：2013-11-14）