水貂链球菌的分离鉴定与防治

水貂链球菌的分离鉴定与防治（共10篇）

篇1：水貂链球菌的分离鉴定与防治

猪链球菌的分离鉴定与生物学特征研究

从河南洛阳和甘肃兰州的某屠宰场采集猪鼻液和颌下淋巴结等样品共791份,分离出13株链球菌.经细菌分离培养、生化试验、兰氏分群A-G诊断试剂鉴定,其中发现C群链球菌5株,D群链球菌7株,F群链球菌1株.药敏试验结果表明,分离菌对氨苄西林、万古霉素、氯霉素和菌必治高度敏感;对庆大霉素、丁胺卡那霉素、红霉素、奥复星、丙氟哌酸中度敏感;对青霉素、复方新诺明、链霉素、氟哌酸、氯洁霉素、四环素等药物有耐药性.

作 者：刘博涛 宋昌军 刘翊中 LIU Bo-tao SONG Chang-jun LIU Yi-zhong  作者单位：西北民族大学,生命科学与工程学院,甘肃,兰州,730030 刊 名：西北民族大学学报(自然科学版) 英文刊名：JOURNAL OF NORTHWEST UNIVERSITY FOR NATIONALITIES (NATURAL SCIENCE) 年，卷(期)：2009 30(1) 分类号：Q939.94 S851.33 关键词：猪链球菌   分离   鉴定   生物学特征  

篇2：水貂链球菌的分离鉴定与防治

羊猝死症的病原分离鉴定及其防治

羊猝死症是近年来发生的`一种新病,该病往往没有任何前驱症状,突然发病死亡,以全身实质器官及消化道出血、小肠分段性坏死为特征.给养羊业造成了巨大的经济损失.

作 者：于立业 李国锋  作者单位：于立业(梅河口市动物卫生监督所,吉林,梅河口,135000)

李国锋(梅河口市动物疫病预防控制中心,吉林,梅河口,135000)

刊 名：吉林畜牧兽医 英文刊名：JILIN ANIMAL HUSBANDRY AND VETERINARY MEDICINE 年，卷(期)：2009 30(10) 分类号：S858.26 关键词： 

篇3：水貂肺炎双球菌的分离与鉴定

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株

来自于山东诸城一水貂养殖场, 养殖水貂3000只, 咳嗽、口鼻出血, 发病水貂经解剖无菌条件分离肺脏、气管, 获得一株细菌。

1.1.2 其他材料

营养琼脂、SS琼脂、麦康凯琼脂等购自青岛海博生物技术有限公司;微量生化试剂管购自北京路桥技术有限责任公司;药敏纸片购自杭州天和微生物试剂公司;其他实验室常规试剂。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养与镜检

无菌条件下取水貂的肺脏, 切开后在血清营养琼脂涂抹, 37℃恒温培养箱培养24h, 将分离菌接种于血清营养琼脂、鲜血平板、麦康凯琼脂、SS琼脂, 37℃恒温培养箱培养24h观察生长情况。取血清平板上典型的菌落, 进行革兰氏染色, 油镜镜检。

1.2.2 细菌的生化试验

将分离菌接种于加血清的马丁肉汤培养基37℃恒温摇床震荡培养24h, 取培养液0.2ml接种于乳糖、葡萄糖、麦芽糖、菊糖、棉实糖、海藻糖、梨醇、甘露醇、触酶试验、七叶苷、胆盐等微量生化反应管, 培养24h记录各种生化管的反应情况。

1.2.3 细菌的分子生物学鉴定

16S r RNA:无菌挑取平板上的菌落加入到1ml无菌水中, 震荡混匀后沸水浴7min, 冰浴5min, 离心上清作为基因扩增的模板, 设计引物:F1-5’AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’, R1-5’ACG GCT ACC TTG TTG TTA CGA CTT-3’, PCR反应体系 (50ul) :10*PCR Buffer (含Mg Cl215mmol/L, KCl500mmol/L) 5ul, 2.5mmol/L d NTP 4ul, 引物 (20umol/L) 各1ul, 模板2ul, dd H2O36.8ul, Taq酶 (5U/ul) 0.25ul。PCR反应条件:94℃5min;94℃1min, 56℃30s, 72℃1.5min, 30个循环;72℃10min。取PCR产物5ul用1%的琼脂糖凝胶电泳检测, PCR产物送交上海基因测序公司进行测序, 将测序结果提交Genbank进行比对, 构建系统发育树, 判定细菌的系统发育地位, 以97%相似性为界限判定为何种菌。

1.2.4 细菌的药敏试验

无菌取血清平板上的典型菌落, 在平板上均匀涂抹, 将标准化的药敏片贴在平板上, 37℃恒温培养箱培养24h, 使用直尺测量抑菌圈的直径, 观察细菌对各种药敏片的敏感程度。

1.2.5 细菌的毒力试验

在无菌条件下使用接种环挑取单个菌落, 接种于马丁肉汤培养基, 37℃恒温摇床震荡培养24h, 100倍稀释后腹腔注射小白鼠, 0.3ml/只共计5只, 连对照组2只一起饲养, 注射后观察7日。

2 结果与分析

2.1 细菌培养与镜检结果

分离菌在血清平板上生长为密集的细小的露珠样透明菌落, 鲜血平板可见灰白色细小菌落呈现明显的溶血环, 麦康凯琼脂、SS琼脂不生长。在显微镜下可见细菌较纯, 呈现革兰氏阳性球菌, 细菌呈矛头状, 多两两成对, 也有的连接成4个或者双排。

2.2 细菌的生化结果

取0.2ml细菌液体培养液接种于微量生化反应管, 可见细菌分解乳糖、葡萄糖、麦芽糖、菊糖、棉实糖、海藻糖, 不分解山梨醇、甘露醇, 触酶试验阴性, 七叶苷阳性, 胆盐溶解阳性。具体结果见表1。

注:“—”表示阴性, “+”表示阳性

2.3 细菌的分子生物学鉴定结果

根据上海测序公司的测序结果, 采用Bioedit软件参照正反向序列图谱对序列进行校对, 然后输入Genbank用Blastn软件进行相似性比较, 最后利用构建系统发育树, 与肺炎链球菌相似性为99.9%, 最终确定为肺炎链球菌。

2.4 细菌的药敏试验结果

使用药敏纸片法测量分离菌对各种药物的敏感性, 可见头孢喹肟、头孢哌酮、头孢噻呋、阿莫西林、青霉素高敏, 万古霉素、强力霉素、阿米卡星、安普霉素、替米考星中度敏感, 左氧氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氟苯尼考低度敏感, 林可霉素、复方新诺明、粘杆菌素不敏感。具体药敏结果见表2。

2.5 毒力试验结果

100倍稀释后的细菌培养液注射5只小白鼠第3天全部死亡, 对照组观察7日, 全部健活。死亡小白鼠心血分离到革兰氏阳性双球菌。该双球菌有较强的毒力。

3 讨论

3.1 肺炎双球菌的分离鉴定

此次水貂发病为激素水貂, 天气比较热, 正值换毛期间, 换毛引起的机体抵抗力差, 呼吸道的正常菌群大量繁殖成为致病菌, 造成了大量的死亡, 主要症状急性死亡、死亡水貂营养状况良好、口鼻有的出血, 解剖可见肺部严重出血肿大、气管环内大量血沫, 之前按照绿脓杆菌引起的出血性肺炎投服氟苯尼考3d未见明显改善。

3.2 肺炎双球菌的症状

水貂感染肺炎双球菌主要症状为大群精神、食欲正常, 发病的水貂急性死亡, 有的几分钟, 有的几个小时, 突然发病, 有的突然尖叫口鼻流血死亡, 病程长的可见精神沉郁、不吃食, 逐渐后肢瘫痪、弓背、呻吟, 步态蹒跚或者地上打滚, 最后呼吸急促, 全身瘫软死亡。剖检可见肺脏肿大出血呈现黑色, 气管内有大量的血液或者血样泡沫, 有的肝脏、肾脏出血。

3.3 肺炎双球菌的诊断

多种细菌都可以感染水貂引起肺炎, 呈现比较严重的急性死亡、口鼻流血、肺脏肿大出血的比较常见的是绿脓杆菌, 另外还有巴氏杆菌、克雷伯氏菌、侵肺型大肠杆菌、肺炎双球菌等, 这几种细菌引起症状基本相同, 但是治疗和传染性不同, 因此需要细菌分离鉴别诊断。肺炎双球菌在显微镜下直接涂片镜检见革兰氏阳性双球菌即可诊断, 其他细菌镜检都为阴性, 及时诊断有助于选择对症的药物, 及时控制疾病。绿脓杆菌细菌分离可见平板绿色菌落, 大肠杆菌在麦康凯培养基呈现红色, 巴氏杆菌在镜检下可见两极浓染的小杆菌、麦康凯和SS培养基不生长, 克雷伯氏菌呈现粘稠的拉丝菌落, 这些特征在实验室条件下通过简单的检测都可以区别于肺炎双球菌。

3.4 肺炎双球菌的防制

肺炎双球菌现在没有有效的疫苗进行防疫, 只能从饲料、环境卫生方面进行控制, 不要饲喂变质的饲料, 疑似变质饲料全部熟制, 发病后及时诊断, 及时采用敏感性高的药物进行治疗。本次病例, 发病后每天使用聚维酮碘全群带动物消毒, 饲料全部熟制, 第2天开始投服敏感药物阿莫西林, 发病严重的注射头孢噻呋, 第3天死亡减少, 第5天停止死亡, 有效的控制了疫情。

参考文献

[1]周庭银.临床微生物学诊断与图解第2版[M].上海:上海科学技术出版社, 2006, 97-98.

篇4：猪链球菌病的诊断与防治

一、临床症状及表现类型

1. 败血型

多见于流行初期的最急性病例，往往头晚未见任何症状，次晨即已死亡；或者停食1～2餐，体温41～43℃，精神委顿，废食，震颤，耳、颈、下腹部出现紫斑，如治疗不及时，死亡率较高。此类型多发生于架子猪、育肥猪和怀孕母猪。

2. 脑膜炎型

病初体温升高，不食，便秘，有浆液性或黏液性鼻液，继而出现神经症状，磨牙，空嚼，转圈运动失调，仰卧，直至后躯麻痹，侧卧于地，后期四肢划水样动作，最后昏迷死亡。部分病例出现多发性关节炎，病程1～2天。

3. 心内膜炎型

此型生前不易发现和诊断，多发于仔猪，突然死亡或呼吸困难，或瘫软卧地不能行走，皮肤苍白或体表发疳，很快死亡，往往与脑膜炎型并发。

4. 关节炎型

由脑膜炎型和心内膜炎型病变而来，或从发病起即呈现关节症状，表现一肢或几肢关节肿胀、疼痛、有跛行，甚至不能站立。病程2～3周。该型与脑膜炎型、心内膜炎型很少单独发生，常常混合存在，或先后发生。在临床上单独发生关节炎型的多见于仔猪，表现为跛行和关节肿大，有的呈现高度跛行，不能站立，体温升高，被毛粗乱，逐渐消瘦。

5. 化脓性淋巴结炎（淋巴结脓肿）型

常发生于架子猪，多见于颌下淋巴结；其次是咽部和颈部淋巴结。受害淋巴结脓肿，坚硬，有热有痛，可影响采食、咀嚼吞咽，后期病灶中央变软，皮肤坏死，自行破溃流脓，以后全身症状好转，局部逐渐愈合，病程一般2～5周。

二、诊断

为了确诊应进一步做实验室细菌检查，可采取病猪或死猪的脓汁，血、脑、肝、脾等组织做抹片，染色，镜检，如发现呈链状排列的革兰氏阳性球菌，即可确诊。

急性病猪应注意与猪丹毒、猪肺疫、猪水肿（特别是致病性大肠杆菌引起的）等病相区别。猪链球菌病以高热、呼吸困难、神经症状和关节炎明显；初发常呈暴发，流行迅速，死亡率高；尸体剖检以全身出血及浆膜炎和脑膜出血为特征。猪肺疫虽也出现呼吸困难症状，但咽喉部可见肿胀、不具神经症状及跛行。猪丹毒口鼻无红色泡沫液体，跛行不及猪链球菌病明显，以架子猪发病多见。

三、防治

（1）防治猪链球菌病应着眼于减少应激因素，不使猪过度拥挤，加强通风。保持猪舍和场地环境清洁卫生，坚持猪舍和环境的定期消毒制度。

（2）清除传染源，病猪隔离治疗，带菌母猪尽快淘汰，污染的用具和畜舍环境用3%来苏儿液消毒。

（3）免疫接种疫苗，每头肌注2～3头份，4周后加强一次。当规模猪场发生本病后，如果暂时不能进行免疫注射，可用药物紧急防治，以控制本病发生，一般每100公斤饲料中加入四环素12.5克，连喂3天；也可用阿莫西林粉混于饲料中饲喂。同厩猪没有病状的可肌注青霉素来作紧急预防。

（4）败血型及脑膜炎型早期应大剂量使用抗生素，用安痛定、柴胡、地塞米松、青霉素混合使用，每天2次，可迅速缓解症状；或用环丙沙星效果更好。为了巩固疗效，应连续用药5天以上。对体质虚弱不能采食的，可补充能量，维生素C、抗生素、退烧液混合滴注。对淋巴结脓肿的，待病灶成熟后，切开排脓，用3%双氧水或0.1%高锰酸钾液冲洗后，涂以碘酊。

四、注意事项

（1）本病初期使用青霉素治疗，如果效果不好，可能是对青霉素已经产生了耐药性。

（2）本病的发病率和死亡率相当高，危害大，建议在疫区使用猪链球菌疫苗对仔猪进行免疫接种。

（3）本病的临床表现极易与致病性大肠杆菌引起的猪水肿病相混淆，应严格注意区分。

河北省承德县农牧局

篇5：水貂链球菌的分离鉴定与防治

长春地区某鸡场150 日龄肉用种鸡鸡群出现跗关节肿大,个别鸡趾部肿胀行走提跳,肿胀部位手触发热有波动感,严重者不能站立,行走时两翅扑打地面,羽毛松乱,食欲废绝,饮水量减少。笔者对该鸡场的疑似金黄色葡萄球菌性关节炎病鸡进行了金黄色葡萄球菌的分离鉴定,以及糖发酵试验、过氧化氢酶试验、凝固酶试验、V. P. 试验、药物敏感试验和免疫接种研究,旨在为更好地应用疫苗及抗生素防治肉鸡葡萄球菌性关节炎提供依据。

1 材料

1. 1 病料

150 日龄发病鸡趾关节关节囊中的脓汁,采自吉林省长春地区某肉种鸡饲养场。

1. 2 主要试剂与药品

肉汤、普通琼脂培养基、糖发酵管( 卫矛糖、麦芽糖、甘露糖、葡萄糖、肌醇、蔗糖、果糖、山梨醇、鼠李糖、单奶糖、山梨糖、乳糖、木糖、菊糖、甘露醇、阿拉伯糖) ,由吉林大学动物医学院临床附属医院检验科提供。

药敏纸片( 氨苄西林、羧苄青霉素、复方新诺明、青霉素、红霉素、卡那霉素、诺氟沙星、氧氟沙星、氯霉素、链霉素、庆大霉素、麦迪霉素、环丙沙星、新霉素、利特灵等) ,购自卫生部北京生物制品药品检验所。

2 方法

2. 1 病原菌的分离

用注射器抽取150 日龄发病鸡趾关节囊中的脓汁,接种到普通琼脂培养基上,于37 ℃ 恒温培养48 h。

2. 2 病原菌的鉴定

2.2.1涂片检查

将普通琼脂培养基上的培养物直接涂片,革兰氏染色后显微镜下观察形态。

2.2.2糖发酵试验

将葡萄球菌的肉汤培养物分别接种于果糖、卫矛糖、肌醇、甘露糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、山梨糖、甘醇、木糖、鼠李糖、山梨醇、菊糖、单奶糖、阿拉伯糖发酵管中,于37℃恒温培养24 h,观察葡萄球菌对各种糖的分解情况。

2.2.3过氧化氢酶试验

取干净的载玻片,在上面滴1滴3%过氧化氢溶液,挑取一环斜面培养的试验菌在过氧化氢溶液中混匀。若有气泡出现则为过氧化氢酶试验阳性,无气泡产生则为阴性。

2.2.4凝固酶试验

在一张洁净载玻片中央滴1滴生理盐水,用接种环挑取菌落与其混合制成菌悬液,观察20 s无自凝现象发生,然后加入兔新鲜血浆1环,与菌悬液混合,观察结果,以5~10 s内出现凝集者为阳性。

2.2.5 V-P试验

取葡萄球菌的肉汤培养物2mL,加入6%奈酚乙醇溶液1 mL,再加入40%氢氧化钾0.4 mL,充分振荡,在2~4 h内出现深红色或红色者为阳性反应。

2. 3 免疫原性试验

2.3.1免疫抗原的制备

将从患处分离得到的葡萄球菌接种到肉汤中,于37℃培养24 h;将培养好的菌液倒入含有琼脂的挈型瓶中,37℃培养24 h;收获固体菌,使其与肉汤培养菌混合;取36%甲醛,按照0.3%的比例对固液混合菌进行灭活,37℃培养48 h;用生理盐水稀释至浓度为60亿cfu,备用。

2.3.2免疫接种

菌液灭活完全后用其分别制作每毫升含100亿cfu葡萄球菌的油苗和水苗,皮下注射发病鸡,0.5 mL/羽,先注射水苗,隔2周后再注射油苗,共注射6 000羽。

2. 4 药敏试验

将从患处分离得到的葡萄球菌接到肉汤中,于37 ℃ 恒温培养24 h; 用无菌吸管吸取培养液0. 1 m L,接种到普通琼脂培养基上并涂匀; 再用无菌镊子夹取药敏纸片平整地贴在已接种葡萄球菌的普通琼脂培养基上,各药敏纸片间的距离相等,继续于37 ℃恒温培养24 h后观察结果。

3 结果

3. 1 病原菌的分离培养

经37 ℃ 恒温培养24 h,在普通琼脂培养基上可见直径约为2 mm的金黄色菌落,该菌落表面光滑、潮润,边缘整齐,呈不透明的圆形凸起。

3. 2 病原菌的鉴定

3.2.1涂片检查

经革兰氏染色、镜检可见革兰氏阳性球菌,大小均匀,数量众多。

3.2.2糖发酵试验

结果见表1。

注: ⊕代表既产酸又产气; + 代表只产酸不产气; - 代表既不产酸又不产气。

3.2.3过氧化氢酶试验

经检测,结果为阳性,在过氧化氢溶液中有气泡产生。

3.2.4凝固酶试验

经检测,结果为阳性,载玻片上的细菌凝集成块。

3.2.5 V-P试验

经检测,结果为阳性,溶液颜色变红。

3.2.6药敏试验

结果见表2。

mm

由表2可知:该菌对氯霉素、新霉素、利特灵和复方新诺明高度敏感;对氨苄西林、麦迪霉素、红霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星具有一定的耐药性。

3. 3 防治情况

根据药敏试验结果,确定新霉素为首选药,对鸡群投药后可有效控制疫情的蔓延。采用自家菌株制成的两种苗免疫6 000 羽肉种鸡后,临床保护率在90% 以上。

4 讨论与结论

通过实验室诊断,鸡场以跛行和脚软为主要症状的鸡病是由金黄色葡萄球菌引起的葡萄菌性关节炎。目前,由于抗菌药物和饲料添加剂中药物的滥用,许多细菌产生了耐药性,且耐药性可以通过质粒转移[4]。疫苗只能降低金黄色葡萄球菌的流行性和发病的严重程度,但不能根除疾病的发生[5]。鸡一旦出现跛行或关节肿胀,就很难治愈,肉种鸡在生产中就必须淘汰,因此该病的综合防治就十分重要,防治的要点可归纳为: 加强饲养管理,做好消毒工作; 制订正确的免疫程序,防止免疫抑制病的发生; 尽量减少应激,排除一切外伤的因素。

参考文献

[1]张庆桥.鸡金黄色葡萄球菌对21种常用抗菌药物的敏感性研究[J].贵州农业科学,2010,38(6):155-156.

[2]谷长勤,程国富,胡薛英.鸡葡萄球菌病的研究进展Ⅰ鸡葡萄球菌病的病原学、发病学和流行病学[J].动物医学进展,2000,21(4):40-42.

[3]孙惠芳.鸡葡萄球菌病的防治[J].畜牧与饲料科学,2011,32(7):114-115.

[4]王丽华,吕殿红,张荟,等.质粒介导的喹诺酮耐药基因在动物源金黄色葡萄球菌的流行分布[J].中国兽医学报,2014,34(4):606-612.

篇6：猪链球菌病的诊断与防治

关键词：猪链球菌病；临床症状；防治方法

中图分类号：S859.79文献标识码：A文章编号：1674－0432(2011)－05－0302－2

1猪链球菌病的临床症状和病理变化

1.1临床症状

1.1.1猪链球菌性败血症突发性强，通常头天晚上未见任何症状，次日便死亡。减食或停食，体温41－42℃，精神萎靡，眼结膜潮红、流泪，有浆液性鼻汁，呼吸浅表而快，时有便秘或腹泻症状，腹下或四肢有紫红色斑，跛行。最急性时1日死亡，一般2－4日死亡。

1.1.2猪链球菌性脑膜炎主要见于脑炎型神经症状，四肢麻痹，不能站立，呈坐卧或瘫卧姿态，或四肢游泳状划动，共济失调，转圈运动，空嚼，磨牙。最急性时1－2日后死亡，慢性时1－5日死亡。

1.1.3猪链球菌性多发性关节炎发病呈关节炎症状，表现肢关节肿胀，疼痛，跛行，甚至不能站立，不能走动，有时眼皮浮肿，后期发烧。慢性病程2－4周，急性2－7日。

1.1.4猪链球菌性淋巴结脓肿常伴有呼吸道疾病，淋巴结肿胀，多见于颌淋巴结，其次是咽部和颈部淋巴结，进食、呼吸不正常，咳嗽，流鼻汁。一般病程较久，有时达2－4周。

1.2病理变化

(1)猪链球菌性败血症的病理变化主要呈现败血症变化，各器官充血，出血明显，血液增量，脾肿大，各浆膜有浆液性炎症变化等。

(2)猪链球菌性脑膜炎主要是脑膜充血、出血，脑髓液浑浊、增量，有多量的白细胞，脑实质有化脓性脑炎变化。

(3)猪链球菌性多发性关节炎，关节周围肿胀，充血，滑液浑浊，重者关节软骨坏死，关节周围组织有多发性化脓灶。

(4)猪链球菌性淋巴结脓肿呈现淋巴肿胀，充血、出血，切面潮红多汁。

2猪链球菌病的诊断

2.1临床综合诊断

主要综合病例的流行病学史、临床症状、动物年龄、肉眼病理变化、剖检变化等，排除其他明确病因进行初步诊断。流行病学史主要了解当地是否有猪等家畜疫情存在、病例发病前是否有与病死猪等家畜的接触史等。

由于该病病变比较复杂，通过临床初步综合诊断后，需要给合实验室检查进行确诊。

2.2细菌学诊断

2.2.1样本采集及镜检无菌操作，采取相应病猪的病料，如化脓灶、脾、肝、肾、血液、关节液、脑组织等制作成涂片，用碱性美蓝液或革兰氏染色液染色，显微镜检查，可见革兰氏阳性，单个、成对和链状排列的球菌。

2.2.2细菌分离培养采取相应病猪的病料，接种于兔血液琼脂平板，37℃培养36个小时，可见β－溶血的细小菌落。选取菌落抹片，染色，镜检，可见单个的革兰氏阳性球菌。

2.2.3动物实验例如小白鼠发病试验，将病猪内脏病料磨碎，制成8倍乳剂，给小白鼠皮下注射0.3mL／只，小白鼠均于24－48h内死亡。将病料涂片，革兰氏染色，镜检，同样可见单个的革兰氏阳性球菌。

2.3生物学诊断

生物学诊断方法已广泛应用，其特点是快速、特异性强，如PCR检测法是目前最快速的检测链球菌的方法。

PCR检测法，是针对猪链球菌致病菌株利用荚膜生物合成基因的DNA序列特性建立了血清型特异性PCR(聚合酶链式反应)，利用根据特异性的荚膜多糖基因设计的三种引物，鉴定出猪链球菌。利用基因组CPS2J引物可检测出2型和1／2型，利用基因组CPSII引物可检测出1型和14型，利用基因组CPS9H引物可检测出9型。

PCR检测法能直接从病料组织中检测到相应的病原菌，不必进行细菌的纯分离培养，简便、快速，有效提高病菌鉴定的效率。

2.4鉴别诊断

猪链球菌易与多种呈现高热症状的猪病相混淆，要注意区别。

2.4.1病原鉴别猪链球菌属于革兰氏阳性球菌，呈链状排列；弓形体在油镜下呈月芽形，附红细胞体为圆环形，猪丹毒为革兰氏阳性细小杆菌。

2.4.2临床症状鉴别猪瘟从病猪肝钻草窝、脓性眼屎、公猪包皮积尿、先便秘后拉稀等方面容易识别；猪丹毒区别在于皮肤的特殊性充血疹块。

2.4.3病理变化鉴别猪瘟的病变淋巴结横切面呈大理石样花纹、盲肠呈钮扣状溃疡；猪丹毒可见有红肿的樱桃大脾脏，剥皮后皮肤反面疹块；猪肺疫见肝变及大理石样切面花纹。

3猪链球菌病的防治

3.1建立和健全生物安全体系

3.1.1改善环境养殖场的布局结构、设施设备应符合防疫要求和管理要求。场内所需猪肉及其制品由本场供应，不得外购。

3.1.2做好消毒工作消毒要经常化，建立健全消毒制度，实行规范科学的消毒方法，配备多种消毒剂。有针对性地进行全面大消毒、局部小消毒、猪体消毒、空气消毒。病、死猪要无害化处理。

3.1.3改被动防疫为主动防疫实行全进全出的管理制度，发病猪只实行隔离治疗，制定科学的免疫计划。及时消灭场内已有的疫源，努力阻止新的疫病传入。

3.1.4做好猪群的体检定期或针对性地对猪群进行检查，及时找出各种隐患和携带病原体的个体。

3.1.5群防群治通过个体检疫，发现群体中可能存在的问题或隐患，采取必要的应对措施对全场猪群进行控制。

3.1.6做好人员的防护工作

3.2制定科学的药物防治方案

3.2.1服药预防一般在饲料中添加土霉素(或四环素、金霉素任选一种)，连续饲喂4－6周，可达到较好的预防效果。

3.2.2對症治疗猪链球菌病应在前期进行及时对症治疗。局部脓肿处理，可涂鱼石脂软膏，切开排脓，用双氧水冲洗脓腔，涂上碘酊，同时防止继发感染。

对败血症型及脑膜脑炎型，应大剂量使用抗生素或磺胺类药物。用青霉素与地塞米松、庆大霉素联合使用有良好效果。磺胺类药物对链球菌有比较好的疗效，但是对肝脏副作用比较大。因此在治疗的同时需饮水或注射配用清肝利胆的药物辅助。

对于关节炎型，前期可选用大剂量的青霉素类药物治疗，慢性关节炎型需要长期治疗和调理。

3.2.3应考虑猪链球菌病对抗生素的耐药性可通过药敏试验，有针对性地用药，用药要有足够的剂量和过程。

3.3制定合理的免疫程序

根据本场的实际情况，慎重制定出免疫程序。内容包括疫苗的种类、用量、用法、被接种猪的日龄、次数、间隔的时间等。任何一种疫苗由于种种因素都不可能获得100％的保护率，因此，免疫前后要及时进行必要的抗体滴度检测。

参考文献

[1]李军.猪链球菌病研究进展[J].动物医学进展，2004(25)：31－33

[2]祝小平.人感染猪链球菌病最新进展[J].预防医学情报杂志，2008(1)：38

[3]拜延阳.猪致病性链球菌的分离鉴定[J].动物医学进展，2007(11)：34

[4]铎亚娟.猪链球菌病的综合防治[J].畜牧兽医杂志，2007(03)：110－111

篇7：水貂链球菌的分离鉴定与防治

国外对目前ADV和AD的研究较为深入, 主要集中在ADV分子病原学及AD分子水平的发病机理的探讨。目前国外已报道从不同地区分离到的多株ADV毒株, 如ADV-G、DV-Utah1、ADV-K等[3~7]。通过对这些毒株的基因进行对比分析, 发现ADV具有高度的遗传多样性[7,8,9]。国内对AD的研究起步晚, 研究内容比较局限, 尤其是基因水平的研究较少。笔者应用对流免疫电泳和聚合酶链式反应2种方法对辽宁某水貂养殖场的水貂进行ADV检测, 对PCR产物应用序列分析的方法证实分离到一株ADV病毒, 命名为LN-1。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 感染阳性病料样品的采集和处理

从辽宁某水貂养殖场具有水貂阿留申病临床症状并且应用对流免疫电泳检测阳性水貂肺、肝、肾、肠系膜淋巴结。

1.1.2 主要试剂

CIEP检测试剂, 购自吉林左家特产研究所;Taq DNA聚合酶、d NTP、等均购自宝生物 (大连) 工程有限公司;组织/细胞DNA抽提试剂盒为上海华舜生物工程有限公司的产品。

1.1.3 菌种与质粒

大肠杆菌DH5α感受态细胞、p MD-18T载体购自于大连宝生物工程公司。

1.1.4 引物

根据Genbank上发表的ADV标准毒株ADV-G的LORF的基因序列设计了一对引物, P1:5’-AAC CAA GCA AGG TGG AAA G-3’ (1459-1477) , P2:5’-ATT CTT CGT GGC AGT TGT G-3’ (2067-2085) , 预期的扩增片断为627bp。

1.1.6 仪器设备

System9700型常规PCR扩增仪购自美国ABI公司、UVP Gel Doc-lt凝胶成像系统。

1.2 方法

1.2.1 样品中DNA提取

样品中总DNA的提取按照组织DNA抽提试剂盒说明书提供的方法进行;质粒提取按文献方法进行[10]。

1.2.2 PCR条件的设置

(1) PCR反应体系:c DNA3μl, 10×PCR缓冲液2.5μl, 25mmol/LMg Cl22μL, 10mmol/L d NTP1μl, P1 (20pmol) 0.5μl, P2 (20pmol) 0.5μl, Taq酶 (5U/μl) 0.25μl, 加H2O补至20μl。 (2) 反应条件:96℃变性4min, 96℃30s, 50℃1min, 72℃30s, 35个循环;72℃延伸5min。反应完毕, 取PCR产物6μl, 置15%琼脂糖凝胶上电泳检测, 紫外线灯下观察。

1.2.3 胶回收、连接以及酶切鉴定

选择肝脏和肠系膜淋巴结样品扩增的PCR产物用Ta Ka Ra Agarose Gel DNA Purification Kit切胶回收, 使用Ta Ka Ra DNA Ligation Kit中的Solution I, 将回收的PCR产物连接至p MD18-T载体上后命名为CTA544, 热转化至E.coli Competent Cell JM109中, 涂布平板过夜培养菌体。从转化平板上挑选单菌落使用RV-M/M13-47引物对进行PCR扩增, 检测菌落中插入片段的长度, 琼脂糖凝胶电泳, 选择阳性克隆使用M13-47、RV-M引物测序。

1.2.4 序列测定及分析

将含有目的基因的阳性菌液送大连宝生物公司测序, 将所得的病毒株的基因序列与Gen Bank中检索到的美国ADV的代表株ADV-Utah1、无致病力的ADV-G及欧洲的代表株ADV-K相对应序列及基于这些基因预测的氨基酸序列利用DNASTAR分析软件进行同源性分析, 并构建相应的系统发育进化树。

2 结果

2.1 PCR试验结果

从图1中可以看出P1/P2引物能够特异的扩增ADV基因长度约为600bp片段, 而空白对照为扩增出任何条带, 见图1。

2.2 序列测定及分析

序列测定结果从图2中可以看出P1/P2引物扩增产物的长度为627bp, 与预期扩增产物的大小一致, 将含有目的基因的阳性菌液送大连宝生物公司测序, 将所得的基因序列与Gen Bank中检索到的美国ADV的代表株ADV-Utah1、无致病力的ADV-G及欧洲的代表株ADV-K相对应序列及基于这些基因预测的氨基酸序列利用DNASTAR分析软件进行同源性分析, 并构建相应的系统发育进化树。同源性结果显示:扩增得到的基因片段与ADV-Utah1的同源性最高, 高达95.4%, 与ADV-G, ADV-K的同源性分别为95.2%, 87.2% (图3) 。

进化树分析显示:本次分离到的此株病毒基因与美国ADV的代表株ADV-Utah1、无致病力的ADV-G病毒基因处在比较近的进化分支上, 而与欧洲的代表株ADV-K的基因的系统关系相对较远 (图4) , 因此可以鉴定此株细小病毒。

3 讨论

水貂阿留申病在水貂饲养场普遍存在, 临床上主要表现的症状为水貂产仔量降低、死胎、流产、肾小球肾炎、动脉血管炎和肝炎, 并导致成年水貂的免疫系统紊乱, 仔貂突发严重肺炎而死亡。病理剖检常见的是肾肿大、充血而呈红色, 后变灰褐色或淡黄褐色, 有的表面可见斑点状出血, 间有灰白色坏死灶。水貂阿留申病的发病率和死亡率都很高, 同时病貂毛皮质量下降, 对水貂养殖业造成巨大的经济损失, 是世界上公认的养貂的三大疫病之一。

目前国内外尚未研制出有效预防AMD的疫苗, 仍只能通过检疫淘汰病貂来实现对本病的控制和根除, 对流免疫电泳 (CIEP) 是现今世界公认的并且是应用最为广泛的检测方法。目前, 应用PCR方法检测水貂阿留申病毒的方法的研究也比较少, 国内还没有应用荧光定量PCR检测水貂阿留申病的报道。

本试验主要对水貂群进行了ADV的检测并分离到了一株水貂阿留申细小病毒株并进行了鉴定, 也对其进行了基因的初步分析, 这对将来进一步开展针对该病的诊断和防治研究奠定了基础, 对今后深入研究我国AMDV遗传多样性、抗原变异情况以及水貂阿留申病的预防和控制都具有重要意义。

摘要：本试验根据Genbank发表的水貂阿留申病毒 (ADMV) 的高度保守序列, 设计了一对特异引物ADV-P1/P2, 建立ADV的PCR检测方法。应用对流免疫电泳和聚合酶链式反应2种方法对辽宁某水貂养殖场的水貂进行ADV检测。结果表明, PCR产物应用序列分离到一株ADV病毒 (LN-1) , 水貂群中流行阿留申病。应用建立的检测方法加强水貂群的检测, LN-1毒株的致病性需要进一步研究。

关键词：水貂阿留申病毒,PCR方法,检测,LN-1

参考文献

[1]Bloom, M.E., S.Alexandersen, C.F.Garon, S.Mori, W.Wei, S.Perryman, and J.B.Wolfinbarger.1990.Nucleotide sequence of the 5’-termial palindrome of Aleutian mink disease parvovirus and construction of an infection of an infectious molecular clone.J.Virol.64:3551-3556

[2]Bloom, M.E., S.Alexanderson, S.Perryman, D.Lechner, and J.B.Wolfinbarger.1988.Nucleotide sequence and genomic organization of Aleution mink disease parvovirus (ADV) :sequence comparisons between a nonpathogenic and a pathogenic strain of ADV.J.Virol.62:2903-2915

[3]Oie K L, Durrant G, Wolfinbarger J B, et al.The relationship between capsid protein (VP2) sequence and pathogenicity of Aleutian mink disease parvovirus (ADV) :apossible role for raccoons in the transmission of ADV infections[J].J Virol, 1996, 70 (2) :852-861.

[4]Gott schalck E, Alexandersen S, Cohn A, et al.Nu2cleotide sequence analysis of Aleutian mink disease parvovirus shows that multiple virus types are present in infected mink[J].J Virol, 1991, 65 (8) :4 378-4386.

[5]van Dawen S, Kaaden O R, Roth S.Propagation of Aleutian disease parvovirus in cell line CCC clone 81[J].ArchVirol, 1983, 77 (1) :39-50.

[6]Aasted B, Avery B, Cohn A.Serological analyses ofdifferent mink Aleutian disease virus st rains[J].ArchVirol, 1984, 80 (1) :11-22.

[7]Bloom M E, Alexandersen S, Perryman S, et al.Nucleotide sequence and genomic organization of Aleutian mink disease parvovirus (ADV) :sequence comparisons between a nonpathogenic and a pathogenic strain of ADV[J].J Virol, 1988, 62 (8) :2 903-2 915.

[8]Olof sson A, Mittelholzer C, Treiberg Berndt sson L, et al.Unusual, high genetic diversity of Aleutian mink disease virus[J].J Clin Microbiol, 1999, 37 (12) :4145-4149.

[9]Gott schalck E, Alexanderson S, Storgaaard T, et al.Sequence comparision of the nonstructural genes of four different types of Aleutian mink disease parvovirus indicates an unusual degree of variability[J].Arch Virol, 1994, 138:213-231

篇8：栀子内生真菌的分离与鉴定

关键词：栀子；内生真菌；分离；鉴定

中图分类号： S567.1+90.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）02-0298-03

收稿日期：2013-07-18

基金项目：江西省教育厅科技计划（编号：GJJ12537）；江西中医药大学博士启动基金；江西中医药大学重点学科青年教师扶持项目。

作者简介：林贵兵（1981—），男，四川自贡人，博士，讲师，主要从事中药资源研究。E-mail：linguibing897@gmail.com。栀子为茜草科栀子属植物栀子（Gardenia jasminoides Ellis.）干燥成熟的果实，是一种常见的中药，也是江西省道地药材之一，具有泻火除烦、清热利湿、凉血消毒等功效，外敷可治扭伤瘀肿，主要用于治疗黄疸型传染性肝炎、胆囊炎等症。栀子主要生于海拔1 000 m以下的低坡红壤土地，不耐寒[1]。目前关于栀子的研究主要集中在地理环境、气候条件、采收期不同对栀子药材品质的影响方面[2～6]，栀子内生菌群对其品质的影响研究还未见报道。可以采用组织学方法、严格进行表面消毒的植物组织块分离方法，以及植物组织直接扩增微生物DNA方法来证明内生菌的内生性[7]。内生菌群可以通过产生生长素、增进宿主植物营养元素吸收来促进宿主生长，增强宿主抗旱、抗高温、抗虫害等抗逆性，部分内生真菌能够促进药用植物次生代谢产物的合成，产生与宿主相同或相似的药用活性成分[8]。本研究分离纯化栀子新鲜果实中的内生真菌，用插片法观察菌种的菌丝、孢子囊以及孢子等特征，探讨栀子内生真菌群落的多样性。

1材料与方法

1.1材料

2012年10月采自江西中医药大学神农园药用植物栀子的新鲜果实，经刘勇副教授鉴定为茜草科栀子属植物栀子。江西省南昌市属中亚热带湿润季风气候，气候湿润温和，日照充足，年均气温17.0～17.7 ℃，年均降水量1 600～1 700 mm，年均相对湿度为78.5%。

1.2方法

1.2.1内生真菌的分离采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）与混合抗生素（80万单位青霉素钠与硫酸庆大青霉素注射液4万单位混合溶解）培养分离栀子果实的内生真菌。将新鲜健康的栀子果实用自来水冲洗干净，再用无菌水洗 2～3次，用0.1%次氯酸钠溶液浸泡 1 min，再用75%乙醇处理5 min，对果实表面进行消毒，再用无菌水冲洗4～5次。削去外皮，取少量果肉置于培养基中，28 ℃ 下恒温培养 7～10 d。待组织块周围长出白色菌丝后，用接种针挑起，纯化菌种。

1.2.2内生真菌鉴定将菌种置于PDA培养基中，采用插片法在28 ℃下恒温培养7～10 d，观察其产孢结构、分生孢子梗着生情况、孢子形态与颜色，参考《真菌鉴定手册》[9]鉴定内生真菌。

2结果与分析

2.1内生真菌种群

2.1.1交链孢霉属（Alternaria spp.）菌落生长迅速，初期为黑色，随后有灰白色棉絮状菌生长，背面灰黑色。营养菌丝有分隔。分生孢子梗暗色，通常较短，单生或分枝简单，直或略弯曲，有隔。分生孢子暗色，横隔1～6个，纵隔0～5个，倒棍棒形、椭圆形或卵形，顶端常延长为喙状，经常向顶着生成链（图1）。

2.1.2青霉属（Penicillium spp.）菌落灰色或灰白色，绒毛状、蛛网状或棉絮状，背面黑色，菌丝有隔。分生孢子梗从菌丝中垂直生出，无足细胞，暗色，有横隔膜，菌丝单个发生或成束。分生孢子串生，孢子光滑，单胞，褐色，球形或卵圆形 （图2）。

2.1.3曲霉属（Aspergillus spp.）菌落为褐色或黄色颗粒状， 背面黄色或棕色。菌丝无色、淡色或表面凝集有色物质，有隔膜。分生孢子梗从壁厚而膨大的菌丝细胞（足细胞）中垂直生出，大多数无隔膜，光滑或粗糙，上部较粗大，顶端膨大成球形、椭圆形、半圆形或棍棒形的泡囊，从泡囊的表面以放射状生出小梗或仅在泡囊顶部产生小梗，小梗单层或在顶部再分枝成2个或多个小梗。分生孢子串生于小梗顶端，呈辐射状排列或丛集成柱形，着色、形状、大小、纹饰变化很大（图3）。

2.1.4轮枝霉属（Verticillium spp.）菌落生长早期呈灰色，绒毛状，周围有褐色颗粒物长出，后期有白色棉絮状菌长出，背面接种处黑色，周围浅黄色。或菌落生长早期呈灰色，后渐暗，棉絮状，背面黑色。分生孢子梗细长，轮生分枝。分生孢子为梗孢子，卵圆形或椭圆形，褐色，单胞，单生或顶生成小的潮湿簇，成向基的链（图4）。

2.1.5瓶梗青霉属（Paecilomyces spp.）菌落生长早期呈灰绿色，凝聚灰绿色粉状物质，后有灰白色棉絮状菌长出。或菌落暗灰色，棉絮状，背面黑色，菌丝有隔。分生孢子梗从菌丝中垂直生出，无足细胞，暗色，有横隔膜，菌丝单个发生或成束。分生孢子串生，孢子光滑，单胞，褐色，球形或卵圆形，成向基的链，有2种形态（图5）。

nlc202309040833

2.1.6穗霉属（Spicaria spp.）菌落生长早期呈青灰色，粉状，后期有白色棉絮状菌生长，背面黄色，菌丝有隔。分生孢子梗分枝多，顶部生轮辐射状排列且松散的小梗。分生孢子串生，暗色（图6）。

2.1.7头孢霉属（Cephalosporium spp.）菌落生长早期呈橙黄色，黏稠状，背面也是橙黄色，菌丝有隔。分生孢子梗从菌丝中生出，直立，短小，顶端生球形、长椭圆形或卵形的分生孢子。分生孢子相继断脱，由分泌的胶状物黏着成小球形，无色，单细胞（图7）。

2.1.8粘帚霉属（Gliocladium spp.）菌落生长早期呈灰色，绒毛状，背面黑色，菌丝有隔。分生孢子梗从菌丝中垂直生出，无足细胞，暗色，有横隔膜，菌丝单个发生或成束，分生孢子串生，孢子光滑，褐色，球形或卵圆形，该属形态与青霉属相似，但分生孢子结集于子实体所分泌的黏液中（图8）。

2.1.9双曲孢霉属（Nakataea spp.）菌落生长早期呈白色，棉絮状，生长局限，后期分泌无色透明油状物，背面黄色，

菌丝无隔。分生孢子梗单生或丛生，榄褐色，有隔膜，单生或偶尔在顶部分枝，细长。分生孢子生于顶端，梭形，向一方或作“S”形弯曲，两端细胞小而尖，无色或淡色，中部细胞暗褐色（图9）。

2.2内生真菌种群统计分析

本研究共分离出42株菌，初步鉴定为1目1科9属，交链孢霉属1株，占2.38%；青霉属3株，占7.14%；曲霉属3株，占714%；轮枝霉属3株，占7.14%；瓶梗青霉属2株，占4.76%；穗霉属2株，占4.76%；头孢霉属1株，占238%；粘帚霉属1株，占238%；双曲孢霉属26株，占61.9%。其中双曲孢霉属Nakataea spp.为优势菌群。

3结论与讨论

本研究用PDA培养基分离栀子新鲜果实内生真菌，得到内生真菌种群，共分离出42株菌，其中双曲孢霉属为优势菌群，反映了栀子中内生真菌生物多样性。但本方法具有一定的局限性，目前许多学者用植物提取液加入培养基中分离内生真菌群落。内生真菌种群受植物种类、不同生长发育阶段、生态环境等因子的作用，对药用植物特别是药材的品质形成具有重要影响，与植物的生长发育、抗逆性、化学组分有密切关系[10]。

参考文献：

[1]罗光明，陈岩，张晓云，等. 不同品种及产地栀子水溶性成分指纹图谱研究[J]. 中成药，2008，30（4）：475-479.

[2]奉延旗，李磊，刘冰. GAP基地与普通产地栀子中栀子苷的含量比较[J]. 中南药学，2007，5（4）：339-341.

[3]段启，庄义修，陈华师. HPLC法测定不同产地栀子中栀子苷含量[J]. 亚太传统医药，2009，5（6）：20-21.

[4]韩建萍，陈士林，张文生，等. 不同产地栀子药材HPLC指纹图谱研究[J]. 世界科学技术：中医药现代化，2007，9（4）：56-60.

[5]唐灿，李云鹏，张彦燕，等. 不同采收期对江西栀子熊果酸含量的影响[J]. 时珍国医国药，2008，19（8）：1927-1928.

[6]赵静，游国钧，李辉. 不同采收时期栀子中栀子苷的含量测定[J]. 中医药导报，2007，13（7）：102，127.

[7]胡凤，程玉鹏，王振月，等. 药用植物内生真菌研究现状及其应用前景[J]. 生物技术通讯，2008，19（5）：781-783.

[8]华永丽，欧阳少林，陈美兰，等. 药用植物内生真菌研究进展[J]. 世界科学技术：中医药现代化，2008，10（4）：105-111.

[9]魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 上海：上海科学技术出版社，1979.

[10]江曙，钱大玮，段金廒，等. 植物内生菌与道地药材的相关性研究[J]. 中草药，2008，39（8）：1268-1272.

篇9：水貂链球菌的分离鉴定与防治

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株来自于山东临沂一水貂养殖场水貂病料尸体。解剖后从肝脏、肺脏、心血分离一株细菌。

1.1.2 其他材料

营养琼脂、SS琼脂、麦康凯琼脂、气单胞菌琼脂培养基等购自青岛海博生物技术有限公司;微量生化试剂管购自北京路桥技术有限责任公司;药敏纸片购自杭州天和微生物试剂公司;PCR试剂购自大连宝生物工程有限公司;其他实验室常规试剂。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养[3]

对发病水貂进行解剖, 无菌条件下取肝脏、肺脏、心血分菌, 接种于血清营养琼脂, 在37℃恒温培养箱培养24h, 培养出的细菌挑取单个菌落进行纯化, 同时接种麦康凯琼脂、SS琼脂、兔血营养琼脂、气单胞菌鉴别琼脂、马丁肉汤, 观察菌落生长情况和菌落形态。

1.2.2 细菌的16S r RNA分子生物学鉴定

无菌挑取平板上的菌落加入到1ml无菌水中, 震荡混匀后沸水浴7min, 冰浴5min, 离心上清作为基因扩增的模板, 设计引物:F1-5’AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’, R1-5’ACG GCT ACC TTG TTG TTA CGA CTT-3’, PCR反应体系 (50l) :10*PCR Buffer (含Mg Cl215mmol/L, KCl500mmol/L) 5l, 2.5mmol/L d NTP 4l, 引物 (20umol/L) 各1l, 模板2l, dd H2O36.8l, Taq酶 (5U/l) 0.25l。PCR反应条件:94℃5min;94℃1min, 56℃30s, 72℃1.5min, 30个循环;72℃10min。取PCR产物5l用1%的琼脂糖凝胶电泳检测, PCR产物送交上海基因测序公司进行测序, 将测序结果提交Genbank进行比对, 构建系统发育树, 判定细菌的系统发育地位, 以97%相似性为界限判定为何种菌。

1.2.3 细菌的生化试验[4]

血清平板上挑取单个菌落, 接种于马丁肉汤培养基培养, 在37℃恒温培养箱培养24h, 分别取0.2ml接种于乳糖、葡萄糖、水杨苷、甘露醇、木糖、蔗糖、肌醇、山梨醇等微量生化反应试管, 24h后观察生化反应结果。

1.2.4 细菌的药敏试验

使用药敏纸片法对分离的细菌进行药敏试验, 用接种环挑取单个菌落涂布于血清营养琼脂平板, 将药敏片贴于平板, 37℃恒温箱培养24h后量取药敏片抑菌圈的直径, 判定该菌的耐药性。

1.2.5 细菌的毒力试验

在营养琼脂平板无菌取单个菌落, 接种于马丁肉汤培养基, 37℃恒温摇床培养箱培养24h, 培养后计数, 将细菌原液10倍稀释液、100倍稀释液、1000倍稀释液分别腹腔注射18~22g小白鼠5只, 0.5ml/只, 注射后观察7d, 对照组3只。对死亡的小白鼠解剖进行细菌分离。将分离细菌取最大稀释度再进行动物回归试验。

2 结果与分析

2.1 细菌培养结果

无菌分离病死水貂的心血、肝脏、肺脏, 血清平板上37℃温箱24h培养可见中等大小圆形、稍微隆起、光滑湿润、半透明、灰白色菌落;挑取血清平板上单个菌落, 转接后在麦康凯琼脂上37℃温箱24h培养可见中等大小无色圆形、光滑、隆起的菌落;SS琼脂上37℃温箱24h培养可见中等大小无色圆形、光滑、隆起的菌落;血琼脂平板上37℃温箱24h培养可见中等大小无色圆形、光滑、隆起的菌落, 有明显的β溶血环;气单胞菌鉴别琼脂培养基平板上37℃温箱24h培养可见中等大小圆形、光滑、隆起的红色菌落;马丁肉汤震荡培养24h可见液体混浊, 图片镜检可见革兰氏染色阴性, 两端钝圆杆菌, 形态较小, 有荚膜无芽孢。

22..22细菌1166SS rr RRNNAA的分子生物学鉴定结果

根据上海测序公司返回的测序结果, 采用Bioedit软件参照正反向序列图谱对序列进行人工校对, 然后输入Genbank用Blastn软件进行相似性比较, 最后构建系统发育树, 与气单胞菌相似性为99.7%, 确定为气单胞菌。

2.3 细菌的生化结果

将分离菌进行了微量生化试验, 试验结果表明该菌能发酵蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖, 氧化酶试验阳性, 不发酵乳糖、鼠李糖、肌醇和山梨醇, 硝酸盐还原试验、七叶苷、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶试验阳性, 鸟氨酸脱羧酶试验阴性, 确定为嗜水气单胞菌, 结果见表1。

注:“-”表示阴性, “+”表示阳性

2.4 细菌的药敏试验结果

将嗜水气单胞菌涂布于血清营养琼脂平板, 把标记好的药敏片贴于血清平板, 最终根据抑菌圈的大小判定药物的敏感程度, 其中头孢喹肟、头孢噻肟、头孢噻呋钠高敏敏感, 左氧氟沙星、丁胺卡那、氧氟沙星、环丙沙星、庆大霉素、恩诺沙星中度敏感, 强力霉素、阿奇霉素、粘杆菌素、氟苯尼考低度敏感, 阿莫西林、氨苄西林、壮观霉素、替米考星不敏感, 最终选择左氧氟沙星作为敏感药物拌料、头孢喹肟注射作为治疗。药敏结果见表2。

(mm)

2.5 毒力试验结果

从血清琼脂平板无菌挑取单个菌落接种于马丁肉汤培养基, 37℃恒温培养24h后进行细菌计数, 计数为40亿/ml, 将细菌原液10倍稀释液、100倍稀释液、1000倍稀释液分别腹腔注射小白鼠5只, 0.5ml/只, 注射原液10倍稀释液、100倍稀释液组第2天全部死亡, 1000倍稀释液观察7d未见死亡, 可见2000万细菌对小白鼠较强毒力, 200万细菌对小白鼠无毒力, 分离菌属于中强毒。对死亡小白鼠解剖, 心血、肝脏细菌分离, 血清平板分离到中等大小圆形、隆起、光滑湿润、半透明、灰白色较纯的菌落, 经鉴定为分离的嗜水气单胞菌, 将分离菌接种于马丁肉汤培养基, 37℃恒温培养24h后100倍稀释, 将稀释液腹腔注射小白鼠5只, 0.5ml/只, 第2天全部死亡, 对照组观察7d, 健活。

3讨论

3.1 水貂嗜水气单胞菌的分离与鉴定

该病例发生在9月中旬, 正值天气炎热, 水貂换毛期间, 水貂机体抵抗力较弱, 死亡主要为营养状况良好体况较胖的水貂。主要症状为急性死亡、口鼻出血, 少量减食拒食尖叫痉挛后死亡。畜主在7月份已经免疫过出血性肺炎疫苗, 按照水貂出血性肺炎投药治疗, 采取全群空气环境消毒, 投服抗生素治疗7天效果不佳, 死亡增加。来本处解剖可见口鼻出血, 血凝不良, 气管环内有血液, 肺脏严重出血淤血呈黑色肿胀, 肝脏肿大呈现严重的土黄色、质脆易碎、有出血点, 脾脏肿大淤血呈现大量黑色淤血斑, 肠系膜淋巴结肿大灰白色坏死, 胃内大量食物, 胃黏膜脱落。临床解剖症状与绿脓杆菌引起的出血性肺炎相似, 经实验室分离鉴定为嗜水气单胞菌。

3.2 水貂嗜水气单胞菌的鉴别诊断

此次水貂发病初期养殖户自行诊断为绿脓杆菌感染引起的水貂出血性肺炎, 采取环境消毒与抗生素治疗效果不佳, 经调查养殖户两月前注射过肺炎二价疫苗。水貂嗜水气单胞菌和绿脓杆菌引起的肺炎临床上都是急性死亡、口鼻出血, 解剖都是肺脏严重出血, 临床通过临床症状和解剖症状很难与绿脓杆菌引起的出血性肺炎区别, 养殖户注射过绿脓杆菌二价疫苗, 通过环境消毒和使用治疗绿脓杆菌的抗生素无效, 可以初步排除绿脓杆菌病, 确诊需要细菌分离鉴定, 通过细菌分离, 分离菌进行绿脓杆菌PCR阴性, 进行分离菌16S r RNA分子生物学基因测序确定为气单胞菌, 根据一系列生化试验确定为嗜水气单胞菌。

3.3 水貂嗜水气单胞菌病的诊疗

停止使用淡水鱼, 改用新鲜的海杂鱼, 清洗水罐, 饮水投聚维酮碘消毒, 根据药敏试验选择氧氟沙星拌料, 15mg/只, 使用后3d见效, 发病死亡减少, 5d后控制疫情, 不吃食的注射头孢喹肟, 2mg/kg体重肌肉注射, 另外添加黄芪多糖、紫锥菊、电解多维等添加剂提高免疫力, 按照疗程治疗取得良好的效果。水貂的嗜水气单胞菌报道的比较少, 临床发病症状、解剖症状与绿脓杆菌、巴氏杆菌等引起的出血性肺炎相似, 一般不作为发病诊断致病的主因, 在临床上也不容易确诊, 一般发现急性死亡口鼻出血首先怀疑是巴氏杆菌或者绿脓杆菌, 养殖户按照绿脓杆菌选择敏感的药物和环境消毒效果不佳, 养殖户也注射过绿脓杆菌二价疫苗, 通过试验最终确诊为水貂患嗜水气单胞菌病, 根据其新购进海杂鱼使用5d并从其中分离到嗜水气单胞菌确定是由使用饲料鱼引起的水貂嗜水气单胞菌病, 采取更换饲料鱼、抗生素治疗的方案, 很好地制止了死亡, 减少了损失。

3.4 水貂嗜水气单胞菌病的预防

本病没有疫苗免疫, 预防本病主要是做好基本卫生防疫工作外, 主要是防止饲料鱼的感染, 不使用变质鱼, 久存的鱼及时清理。嗜水气单胞菌主要来源于鱼类, 此次水貂发病就是因为使用了来源不明的饲料鱼, 使用5d后开始发病, 预防本病主要是禁止使用来源不明的、有异味的变质饲料鱼。一旦发生出血性肺炎按照绿脓杆菌治疗无效或已经注射过绿脓杆菌疫苗, 可以考虑是嗜水气单胞菌。若诊断为嗜水气单胞菌果断采取更换饲料, 使用敏感抗生素治疗。

参考文献

[1]陆承平.兽医微生物学[M].第5版.北京:中国农业出版社, 2013, 123-127.

[2]钱爱东.兽医全攻略毛皮动物疾病[M].北京:中国农业出版社, 2009, 297-300.

[3]周庭银.临床微生物学诊断与图解[M].第2版.上海:上海科学技术出版社.2007, 193-195.

篇10：水貂链球菌的分离鉴定与防治

一、“鉴定结论”向“鉴定意见”过渡的意义

与“鉴定结论”相比，“鉴定意见”突出强调了其作为证据种类的一种，必须符合证据的一般理论，具备证据的一般属性和特征。具体而言，作为证据，具有客观性、关联性和合法性三大属性。就本次改动而言，需要注意的是证据的客观性和关联性。

所谓的证据客观性，又称为真实性，是指案件事实一旦发生，就独立于办案人员之外而客观存在，不以办案人员的主观意志为转移。同时，证据的客观性必然会受到案件事实过去性的制约，而过去性则指受到时间一维性的绝对制约，任何办案人员都不可能回到过去对已经发生的案件事实进行亲身经历。因为一旦亲临现场目击案件发生，收到证人地位优先性的影响，该人员便只能作为证人，而不能够作为侦查人员或者其他办案人员参与到与该案有关的刑事诉讼活动中。因此所有的证据，包括鉴定结论，都建立在案件发生后，事实已经客观存在的基础之上，证据的目的也就在于通过各种途径和措施，尽可能精确、到位地还原出案件事实，使得刑事诉讼的专门机关以及其工作人员和其他诉讼参与人能够清晰地认识到案件的具体情节，做到精准识别，并依此为基础，做出正确的法律选择和法律适用。

但受到物质条件的制约，并非任何证据都能够准确地反映出客观事实的真实情况。第一，证据本身存在真伪之分，伪证由于天然地缺失证据客观性的属性，自然不能够作为符合标准的证据在刑事案件中得以采信，而应该被排除，这一点似乎不存在较大的争议。但即使证据是真实存在的，也未必每次都能够被刑事诉讼专门机关或者诉讼参与人正确地解读。简而言之，任何证据都存在被错误解读的可能性，鉴定意见自不例外。

因而“鉴定结论”改为“鉴定意见”的主要意义在于强调证据的客观性和人类认识能力的局限性。以往的司法实践中，司法机关自身做出的或者委托专门机构做出的司法鉴定，由于经过专门机构的认定，部分法院便甚少对该类证据进行核实，部分法院甚至对专门机构提交的鉴定结论不再核实，盲目采信，导致错案的风险大为提高。实际上，上述法院的做法便是没有考虑到证据的客观性以及认识的局限性，可以说是一种对案件没有尽到责任的表现。

自新刑诉法实施以来，加强了法院对鉴定方面审查的要求。司法鉴定过去“高高在上”的状态在理论上将不再存在，法院将作为所有证据的最后把关机关。

二、“鉴定意见”对于“控审分离”的影响

新刑诉法对于司法鉴定称呼的更改无疑具有科学性，也更有利于实现实体公正，维护社会公平正义。如前文所述，所有在刑事诉讼中的证据是否被采信，都需要通过法院的审核并最终确认才能够被认定。因而，当今司法实践中往往会出现一种怪异的现象：2012年刑诉法修改前，由于鉴定结论的权威性较高，同时司法实践中存在如上文所述的不当现象，司法鉴定的作出机关在作出鉴定报告时会相对慎重，对于在鉴定过程中的存疑部分，一般会较为负责地核实确认。但在新刑诉法实施后，由于明确了鉴定意见的地位以及法院责任，部分侦查机关认为，既然自行做出或者委托专门机构做出司法鉴定后会有法院把关负责，则自己的责任会得到一定程度的减轻，因此对于本属于自己本职工作的司法鉴定质量也就随之下降了。例如在经济犯罪中，侦查机关将收集到的大量的数据简单罗列或进行司法鉴定，之后便提交给检察机关审查起诉，检查机关提起公诉后，对应的法院却因为核实工作的难度不断加大，加上司法鉴定要求具有较高的专业水准，以至于法院工作的工作总量增加，司法效率自然会难以得到保障。

笔者认为，上述侦查机关的做法明显是对新刑诉法鉴定意见的误解，并且反映出部分侦查机关对于控审分离的认识存在缺陷。对于证据的审查，无论是旧刑诉法时期所称的“鉴定结论”还是新刑诉法的“鉴定意见”，在本质要求上并无明显的差异，“鉴定意见”仅仅是对已经存在的理论进行再一次强调。亦就是说，无论是“鉴定意见”还是“鉴定结论”，法院都有义务审查司法鉴定的真实性、关联性与合法性，而侦查机关对刑事案件进行立案侦查，检察机关对侦查终结移交审查起诉的案件进行审查并最终决定是否提起公诉，都是其本职工作，如果一味推卸给法院，则违反了刑事诉讼法中的基本原则——控审分离原则。

控审分离原则是各国刑事诉讼法普遍采用的刑事诉讼基本原则。该原则对于现代刑事诉讼模式有着严格的要求，主要体现在以下三点：

一是刑事追诉权和裁判权分离，分别由侦察、检查机关和法院独立行使，法院不得实施侦察、起诉等追诉活动，而在法院之外设立的侦察、检查机构则作为专门的控诉机构，对符合法定立案条件的案件展开侦察和提起公诉。侦查机关和检察机关承担刑事追诉职能，担当社会秩序维持者的角色，而法院则专门承担审理和裁判职责，担负维护法律和正义的责任。

二是，法院的审判必须在检察机关提出合法起诉的前提下才能启动。在开启审判程序方面，法院是完全被动的，没有正式的控诉请求，法院不得对任何刑事案件进行审判。第三，法院审理和裁判的对象和范围必须仅限于检察官的起诉书所明确记载的对象和范围，而不得审理任何未经起诉的被告人和行为。

就司法鉴定而言，侦查机关如果认为案件达到立案条件，并且需要通过司法鉴定的证据形式证明犯罪事实的存在，则需要自行鉴定或者委托具有法定鉴定资质的单位，对于复杂的案件证据进行进一步鉴定。当然，辩护一方认为有必要时也可以对案件申请司法鉴定，法院也可以依职权要求有关单位进行鉴定，在本文中不再赘述。但无论如何，不应该将控诉过程中的鉴定义务转移给法院，外以核实之名，内行鉴定之实。否则，刑事诉讼活动终将回到审控一体的“纠问式”诉讼模式之中。根据目前法学界的主流观点，由于“纠问式诉讼”的法官权威被肆意扩大，审控职能被统一行使，几乎不可能平等地对待刑事诉讼中的双方当事人，自然也就谈不上保护辩护方的合法权益了。正如英国法谚所云“任何人不能做自己案件的法官”，这也是“纠问式”诉讼之所以在封建时期大行其道，而在现代民主社会日渐式微的主要原因。现代刑诉法中确立的职权主义、当事人主义和混合主义的诉讼模式，虽然在法官对于诉讼的态度方面存在分歧，但是对于法官在刑事诉讼中处于中立的审判地位却是十分明确的。具体到司法鉴定中，如果法官在审理案件的过程中，还要额外承担本身应该由侦查、检查机关的调查义务，即使法官或者法庭希望以中立的地位依法裁判，也难免受到所从事的工作影响，先入为主。

但是遗憾的是，由于推卸责任的做法可以大幅减轻自身的负担，导致这种不符合刑事诉讼法理论的情况在我国司法实践活动中绝非个案。而只靠在法学理论上指出其不足，难以解决该问题。因此，有必要针对该情形做出相应的措施：建立健全司法鉴定错鉴追责制度，明确公检法之间以及司法鉴定机构的职能和分工，提高司法工作者的职业素养等方法都有助于该问题的解决。新刑诉法中的“鉴定意见”的改动，应该是对我国法律体系进一步完善的积极变更，不允许因为曲解等原因而使得司法改革的不易成果受到破坏。

参考文献：