可吸入颗粒物生物活性及其微观特征分析

可吸入颗粒物生物活性及其微观特征分析（精选6篇）

篇1：可吸入颗粒物生物活性及其微观特征分析

颗粒溶素的表达纯化及生物学活性分析

目的:采用原核表达系统对颗粒溶素(granulysin,GNLY)进行体外表达,纯化及活性鉴定.方法:以体外培养的`人外周血单个核细胞(PBMC)为模板,RT-PCR扩增编码GNLY的cDNA片段,插入pMD-18-T 载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a(+) 中,构建重组表达质粒pET28a(+)-GNLY,转化大肠杆菌BL21(DE3) plysS,IPTG诱导表达融合蛋白,包涵体经变复性后用Ni亲和层析纯化,CFU法测定蛋白活性.结果:成功地将GNLY cDNA片段插入载体pET28a(+)中,构建了表达质粒pET28a(+)-GNLY.经诱导在原核表达系统中以包涵体形式高效表达了相对分子质量为9 000的融合蛋白,变复性纯化后的GNLY蛋白经CFU法检测,发现其具有细胞毒活性且细胞毒作用具有剂量依赖性.结论:本实验利用原核表达系统成功地表达了具有生物学活性的GNLY,为研究其功能、作用机制及临床应用奠定了基础.

作 者：钱b 陈孙孝 周晔 王燕 谷明莉 陈波 陈燕 邓安梅 仲人前 QIAN Cheng CHEN Sun-xiao ZHOU Ye WANG Yan GU Ming-li CHEN Bo CHEN Yan DENG An-mei ZHONG Ren-qian 作者单位：第二军医大学长征医院实验诊断科,全军临床免疫中心,上海,03刊 名：第二军医大学学报 ISTIC PKU英文刊名：ACADEMIC JOURNAL OF SECOND MILITARY MEDICAL UNIVERSITY年，卷(期)：27(8)分类号：Q786关键词：颗粒溶素 基因表达 生物学活性

篇2：可吸入颗粒物生物活性及其微观特征分析

对油气储层的矿物成因、沉积环境及成岩作用过程进行微观分析,在碳酸盐岩、碎屑岩储层特性及储层质量评价中得到了广泛应用;可以在油气层保护及油田开发中对粘土矿物迁移和变化进行直观分析;环境扫描电镜的出现及性能的提高为油气地质研究开辟了更为广阔的`前景,可以在含油或水的情况下对样品进行直接分析,更准确地反映了矿物岩石的变化.从油气储层成岩作用、粘土矿物的特征、微孔隙成因等方面,探讨了扫描电镜/环境扫描电镜/能谱微观分析作为现代分析测试技术在油气勘探开发中的一些应用.

作 者：刘伟新 承秋泉 王延斌 郭莉 秦建中 Liu Weixin Cheng Qiuquan Wang Yanbin Guo Li Qin Jianzhong 作者单位：刘伟新,Liu Weixin(中国矿业大学,资源与安全学院,北京,100083;中国石油化工股份有限公司,石油勘探开发研究院,无锡石油地质研究所,江苏,无锡,214151)

承秋泉,秦建中,Cheng Qiuquan,Qin Jianzhong(中国石油化工股份有限公司,石油勘探开发研究院,无锡石油地质研究所,江苏,无锡,214151)

王延斌,郭莉,Wang Yanbin,Guo Li(中国矿业大学,资源与安全学院,北京,100083)

篇3：可吸入颗粒物生物活性及其微观特征分析

1材料和方法

1.1材料和仪器

选取进口的不同批次的同一公司的重组人促红素注射液10份,EPO标准品由同一公司提供;全自动网织红细胞计数仪;成像毛细管等电聚焦仪;清洁级BALB/c小鼠,雄性,6-9周龄。

1.2方法

(1)r Hu EPO异构体的分析:采用成像毛细管等电聚焦技术进行r Hu EPO异构体的分析,具体条件如下在r Hu EPO样品中加入浓度4mol/L的尿素来促进其在缓冲液中的溶解,两性电解质的p H控制在2.5-5之间,聚焦电压为3k V,聚焦时间定为7min,以此条件来对不同批次的r Hu EPO进行异构体成分分析。

(2)r Hu EPO生物学活性的分析:采用网织红细胞计数法对r Hu EPO的生物学活性进行分析,量反应平行线法计算其生物学活性。标准品和测试品均用牛血清白蛋白生理盐水稀释,稀释至合理浓度,用于注射。对BALB/c小鼠进行随机分组,每组有3只小鼠,分别皮下注射稀释好的标准品和测试品,每只小鼠注射0.5m L,连续注射3天,注射周期完成后眼眶采血,对网织红细胞和红细胞进行计数,计算相对值。

(3)不同批次r Hu EPO中唾液酸含量检测:间苯二酚显色法测定。

1.3观察指标

(1)r Hu EPO异构体监测的指标:经过成像毛细管等电聚焦电泳分析后得到特异性的蛋白图谱,可得到每个批次测试品中的异构体的大致含量和种类。

(2)r Hu EPO生物学活性的指标:通过计算网织红细胞和红细胞的相对值,再与标准品相比较,从而得到不同批次r Hu EPO的生物学活性。

(3)唾液酸含量与r Hu EPO生物学活性的关系。

1.4统计学方法

采用SPSS13.0统计学软件包进行实验数据的处理分析,各项参数以(均数±标准差)(x±s)表示,采用t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1 r Hu EPO异构体检测

经过成像毛细管等电聚焦分析后,r Hu EPO中的异构体得到较好的分离,分理出9个峰,每个峰代表了1种同分异构体,每个峰的峰面积代表了其在r Hu EPO混合物中的含量,编号为2、3、6、8批次的r Hu EPO混合物中峰2、3、5为主要特征峰。

2.2 r Hu EPO生物学活性分析

经过网织红细胞法检测后,不同批次的r Hu EPO具有不同的生物学活性,编号为2、3、6、8批次的r Hu EPO具有较高的生物学活性。

2.3唾液酸含量与r Hu EPO生物学活性关系分析

编号为2、3、6、8批次的r Hu EPO具有较高的生物学活性,同时其唾液酸含量较高,均达到了8.3mol/mol r Hu EPO。相关性分析显示,r Hu EPO生物学活性与唾液酸含量呈正相关,y=0.5739x-0.0183,R2=0.917(P<0.05)。

2.4 r Hu EPO异构体成分与r Hu EPO生物学活性关系分析

相关性分析显示,当r Hu EPO成分中以峰2、3、5为主要特征峰时,该批次的r Hu EPO会体现出较高的生物学活性。

3讨论

r Hu EPO是一种蛋白类激素,主要用于因肾透析导致的恶性贫血的治疗,但此种药物结构上糖基化程度足够高才可达到较好的体内生物学活性[4]。周勇等研究发现r Hu EPO中唾液酸含量较高时可表现出较高的体内生物学活性,与本文的研究结果相同[5]。本研究通过对r Hu EPO异构体分析、唾液酸含量分析及其生物学活性分析,结果发现当r Hu EPO成分中以峰2、3、5为主要特征峰时,该批次的r Hu EPO会体现出较高的生物学活性。且r Hu EPO生物学活性与唾液酸含量呈正相关,y=0.5739x-0.0183,R2=0.917(P<0.05)。

综上所述,当r Hu EPO异构体中以峰2、3、5为主要特征峰,同时其唾液酸含量达到8.3mol/mol r Hu EPO时,r Hu EPO会体现出较高的体内生物学活性。

参考文献

[1]边蕾,石屹峰.蛋白质药物长效化技术的现状和进展[J].中国生物工程杂志,2009,29(2):114-118.

[2]祝强,黄志华,黄玉良,等.rh EPO-L-Fc融合蛋白的表达、生物活性和初步药动学分析[J].生物工程学报,2008,24(11):1874-1879.

[3]王丽,周勇,王军志.城乡毛细管等电聚焦技术分析重组人促红素异质性[J].药物分析杂志,2014,34(6):1049-1056.

[4]张素慧,王巧旭,徐超,等.重组人促红素在2种品系小鼠体内的生物学活性的比较[J].药物分析杂志,2013,33(5):779-784.

篇4：绿原酸的生物活性及其应用

关键词：绿原酸,分布及存在,理化性质和结构,生物活性,应用

绿原酸类是植物在有氧呼吸过程中经桂皮酸途径 (Cinnamic acid pathway) 所产生的一类苯丙素类化合物, 是许多中药材和食品 (如金银花、咖啡豆、杜仲、茵陈等) 的有效成分。绿原酸 (Chlorogenic acid) 是由咖啡酸 (Caffeic acid) 与奎尼酸 (Quinic acid) 组成的缩酚酸, 异名咖啡单宁酸, 化学名3-O-咖啡酰奎尼酸 (3-O-caffeoylquinicacid) 。

1 绿原酸分布及存在

绿原酸广泛存在植物中, 如葵花籽、水果 (如苹果、梨、葡萄) 、蔬菜 (如土豆) 、咖啡豆、可可豆、大豆、小麦等。因此, 人们在日常生活中, 都能从食用的粮食、蔬菜、水果、茶和果汁中或多或少地摄取绿原酸类物质。绿原酸主要存在于忍冬科忍冬属、菊科嵩属植物中, 但含量较高的植物不多, 其中包括杜仲、金银花、向日葵、菊花、咖啡、可可树。绿原酸是金银花、杜仲的主要有效成分之一。金银花中绿原酸含量最高的当属大花毛忍冬花, 最高可达11.14%, 其次是红腺忍冬花, 最高达7.1%, 含量较稳定者当属贵州忍冬花, 其含量约5.3%~5.7%。其中金银花越冬老叶中绿原酸含量是普通叶1.41倍。不同时期杜仲叶中绿原酸含量差异显著, 在年周期中, 杜仲叶绿原酸含量以6月份最高, 其次是11月份, 而5月份最低[1]。表1为常见植物花、果或叶中绿原酸含量。

2 绿原酸理化性质和结构

绿原酸类化合物是含有羟基和邻二酚羟基的有机物, 除极易溶于乙醇外, 还易溶于水、甲醇和丙酮等溶剂, 微溶于乙酸乙酯等极性溶剂, 难溶于氯仿、乙醚等弱极性溶剂。因此, 利用这一性质可将绿原酸从植物中提取出来。

绿原酸分子式为C16H18O9, 分子量为354.3, 它的半水化合物为白色或微黄色针状结晶, 110℃变为无水化合物, 熔点208℃, 在25℃水中溶解度为4%, 热水中溶解度更大, 且溶解度随温度而变化。

绿原酸由奎尼酸和咖啡酸缩合而成, 为极性有机酸, 不太稳定。在提取过程中, 通过水解和相继分子内酯基迁移而发生异构化[2]。绿原酸与异绿原酸分子中都含有邻二酚羟基, 受热、见光易氧化, 因而供试液要在50℃以下浓缩, 并在阴凉、避光下保存备用。绿原酸的邻二酚羟基结构不稳定, 高温加热易氧化分解。因此, 高温及长时间加热不利于绿原酸提取。在碱性条件下, 绿原酸可发生水解, 碱性及高温时会氧化成为绿色醌类。植物体内存在的绿原酸往往是混合物而非单一组分, 从葵花籽仁和金银花中提取的绿原酸均含有不同数量异构体。

3 绿原酸生物活性

绿原酸具有广泛的生物活性, 现代科学对绿原酸生物活性的研究已深入到食品、保健、医药和日用化工等多个领域。据文献报道[3], 绿原酸具有以下活性:抗氧化作用, 对心血管作用, 抑制突变及抗肿瘤, 清除体内自由基, 保肝利胆, 抗菌抗病毒。咖啡酸、咖啡酸苯乙酯、阿魏酸、阿魏酸苯乙酯及绿原酸等作为羟基肉桂酸化合物的代表, 羟基肉桂酸化合物主要以有机酸酯和多糖苷的形式广泛存在于植物体内。

3.1 抗氧化活性

绿原酸是一种有效的酚型抗氧化剂, 其抗氧化能力要强于咖啡酸、对羟苯酸、阿魏酸、丁香酸、丁基羟基茵香醚 (BHA) 和生育酚。绿原酸之所以有抗氧化作用, 是因为它含有一定量的R-OH基, 能形成具有抗氧化作用的氢自由基, 可以消除羟基自由基和超氧阴离子等自由基的活性, 从而保护组织免受氧化作用的损害。

3.2 抑制突变和抗肿瘤活性

蔬菜、水果中的多酚类如绿原酸、咖啡酸等可通过抑制活化酶来抑制致癌物黄曲霉毒素和苯并芘的变异原性;绿原酸还可通过降低致癌物的利用率及其在肝脏中的运输来达到防癌、抗癌的效果。绿原酸对大肠癌、肝癌和喉癌具有显著的抑制作用[4], 被认为是癌症的有效化学防护剂。

3.3 对心血管的作用

异绿原酸B对大鼠具有较强促进前列腺环素 (PGI) 的释放和抗血小板凝集作用;对豚鼠肺碎片感应的抗体诱导SRS-A释放抑制率为62.3%。异绿原酸C也有促进PGI的释放作用。另外, 异绿原酸B对血小板血栓素的生物合成和氢过氧化物诱发的内皮素细胞损伤有极强的抑制作用[3]。

3.4 对透明脂酸酶及葡萄糖-6-磷酸酶的抑制作用

透明脂酸酶 (HAase) 是裂解粘多糖的酶之一, 可催化透明脂酸 (HA) 的分解, 关系到血管系统的通透性和炎症反应。HA是由糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖组成的一种粘多糖, 具有多种功能, 如治愈创伤、使皮肤润湿健康、润滑关节和防止炎症等。因此, 从天然产物中发现多种抑制HAase激活的活性成分, 同时又具有较强的抗变态反应活性, 有望作为先导化合物, 进一步开发为新的抗变态反应药物。从狭叶紫锥花根的乙酸乙酯提取物中发现3, 5-二咖啡酰奎尼酸和绿原酸有较强的抑制HAase激活的作用[5]。葡萄糖-6-磷酸酶体 (Gl-6-Pase) 在体内平衡血糖调控中发挥重要作用。它承担着由糖原异生和糖原分解产生内源性葡萄糖的形成。最近, 绿原酸被确认为是大鼠肝微粒体中葡萄糖-6-磷酸位移酶 (Gl-6-P-translocase) 第1个新型特异性抑制剂。通过测定正常大鼠肝微粒体中Gl-6-Pase水解程度, 测定绿原酸及其合成类似物对位移酶活性的抑制强度。

3.5 保肝利胆活性

据文献报道[6], 国内有人从金银花水溶性部分经乙酰化后获得绿原酸四乙酰化物, 经药理实验表明, 该物质对四氯化碳引起的小鼠肝损伤有明显的保护作用, 这为证明金银花具有保肝利胆的功效提供了理论依据。

3.6 抗菌、抗病毒等活性

有文献报道[5], 绿原酸和异绿原酸对多种致病菌和病毒有较强的抑制和杀灭作用, 对急性咽喉炎症及皮肤病有明显疗效, 临床上用于治疗急性细菌性感染疾病。绿原酸的水解产物咖啡酸也具有升白、止血、利胆及抑制单纯疱疹病毒的功效。最近报道, 德国Free大学Eich教授在研究有些植物次生代谢物作为抗逆转录病毒剂时, 根据其试验结果推理认为:绿原酸是有希望的抗艾滋病毒 (HIV) 先导化合物。

4 绿原酸的应用

4.1 食品工业

绿原酸具有利胆、抗菌、抗病毒、止血、增加白血球、缩短血凝和出血时间及兴奋中枢神经系统的生理功能, 可用绿原酸制作保健食品或饮料。绿原酸具有增香和护色作用, 可用于食品和果品保鲜。绿原酸用于果汁保鲜, 可有效防止饮料和食品的腐败变质。研究还发现, 绿原酸大大可提高草莓等果汁稳定性[6]。随着天然食品抗氧化剂越来越受消费者欢迎, 绿原酸作为一种新型高效的酚型天然抗氧化剂, 在某些食品中可取代或部分取代目前常用的人工合成抗氧化剂。在猪油中, 若添加少量绿原酸, 可提高猪油氧化稳定性, 增长贮存期;将少量绿原酸加到天然色素溶液中, 对色素颜色有稳定作用。因此, 绿原酸又是一种良好的食品添加剂。目前, 日本将葵花籽粕中提取的绿原酸成功开发成水溶性天然抗氧化剂。

4.2 医药工业

卫生部《药品标准》收录了具有清热解毒、抗菌消炎的中成药170种, 均含有绿原酸且为主要成分。目前, 在银黄制剂、双黄连制剂等药品的生产中, 已将绿原酸作为质量控制的重要指标之一, 从植物中提取纯的绿原酸, 可作为二类新药[7]。绿原酸还是很重要化学试剂, 在生理生化分析和化学工业中具有广泛应用, 开发医用甚至化学纯绿原酸具有巨大的社会和经济效益。

4.3 日用化妆业

研究发现, 以绿原酸为代表的天然多酚物质, 它们可以保护胶原蛋白不受活性氧等自由基伤害, 并能有效防止紫外线对人体皮肤产生伤害。现已有多项添加绿原酸用于抗脲酶化妆品、皮肤防晒霜和防止紫外线和染发剂对头发损伤洗发水的欧洲专利。

参考文献

[1]武雪芬.金银花越冬有效成分测定[J].中药材, 1997, 20 (1) :6-7.

[2]DORRELL D G.Chlorogenic acid content of meal from cultivatial su-nflower[J].Crop science, 1976 (16) :422-426.

[3]刘军海, 裘爱勇.绿原酸极其提取纯化和应用前景[J].粮食与油脂, 2003 (9) :44-46.

[4]陈少洲, 吕飞杰, 台建祥.葵粕中绿原酸的研究进展与应用前景[J].食品与发酵工业, 2002, 28 (11) :51-55.

[5]高锦明.绿原酸分布、提取与生物活性研究综述[J].西北林学院学报, 1999, 14 (2) :73-82.

[6]国家医药管理局中草药情报中心站.植物药有效成分手册[M].北京:人民卫生出版社, 1986.

篇5：可吸入颗粒物生物活性及其微观特征分析

关键词：茶多糖,提取,纯化,生物活性

多糖由糖苷键结合而成, 是天然高分子化合物。多糖及其复合物参与多种生命现象的调节。从茶叶中提取的茶多糖具有降血糖、血压和血脂, 抗血栓、抗动脉粥样硬化等作用, 还可增强机体免疫功能。本文将对多糖的提取和纯化, 茶多糖的生物活性等方面的研究现状进行综述, 以期为茶多糖的研究与开发提供一定的理论参考。

1 多糖的提取纯化研究

1.1 多糖的提取

多糖提取常用溶剂提取的方法, 包括:热水浸提法, 酸、碱浸提法。提取活性多糖应尽量避免酸性环境, 以免糖键断裂。利用微波、超声波等辅助手段可有效提高多糖提取效率。黄艳峰[1]采用响应曲面法确定茶多糖的最佳提取条件为:温度90.0℃、时间88.2 min、液料比33.3, 最高提取率为1.99%。

超声波的振动作用加强了细胞内有效物质的释放。聂少平[2]采用微波技术提取茶多糖, 确定最佳提取条件为:茶叶与水的质量比为1:15, 微波强度100%, 时间75 s。微波提取茶多糖, 时间短、产率高, 是茶多糖提取的优选方法。

1.2 多糖的纯化

粗多糖中常混有色素、蛋白质或低聚糖等杂质, 影响多糖的生物活性。另外, 给多糖的定性、定量分析和结构测定造成困扰。因此, 多糖的纯化是多糖开发过程中的关键环节。

1.2.1 蛋白质的去除

脱蛋白的常用方法有Sevage法, 三氯乙酸、三氟三氯乙烷法, 酶法, 盐酸法等, 其中Sevage法的使用最广泛。该方法的不足之处是需反复进行多次, 造成多糖样品的大量损耗。另外, 耗时长、有机溶剂消耗大。何传波[3]使用多种方法对铁观音茶多糖的脱蛋白效果进行测试, 结果表明:三氯醋酸法可以简单高效地去除蛋白质, 且不会造成多糖的过多损失。

1.2.2 色素的去除

多糖脱色常采用活性炭法、树脂法、双氧水法和反胶束溶液法等。活性炭吸附脱色耗时长、多糖损耗大且活性炭很难过滤。双氧水氧化脱色可导致多糖结构被破坏。目前, 研究较多的是大孔树脂的吸附脱色。该法脱色成本低、效果好, 且具有一定辅助脱蛋白的效果。王黎明[4]系统探索了茶叶粗多糖的初步纯化工艺, 使用Sevage方法脱蛋白, 聚酰胺柱脱色, 得到多糖的纯度可达89%。

1.2.3 无机盐、低聚糖等小分子杂质的去除

去除小分子杂质和低聚糖常采用透析法。多糖分子量较大, 不易通过透析膜, 而盐、低聚糖等杂质则可通过自由扩散穿过透析膜而被去除。

1.2.4 纤维素纯化

纤维素的纯化常采用阴离子交换柱层析法, 该方法可分离多种多糖。范嘉龙[5]研究了苦丁茶多糖的分离纯化, 其粗品通过DEAEESepharose Fast Flow阴离子交换柱层析分离可得到IKPS-1、IKPS-2、IKPS-3和IKPS-4 4个纯化组分。

1.2.5 凝胶纯化

凝胶柱层析法根据多糖形状和分子量的不同, 利用凝胶的分子筛作用达到分离纯化的目的。常用凝胶为琼脂糖凝胶和葡聚糖凝胶, 洗脱液选用不同浓度的盐溶液或缓冲液。周鹏[6]采用SephadexxG-100凝胶色谱法从江西产的粗老茶叶中提取得到均一组分的茶多糖蛋白。

2 茶多糖的生物活性

活性多糖参与有机生命体的多种生理活动, 如细胞的生长、识别、代谢, 细胞癌变、免疫应答及病毒感染等。关于茶叶活性多糖的研究主要集中于降血脂、降血糖、抗肿瘤、抗病毒、增强免疫调节等方面。

2.1 降血脂作用

茶叶多糖可降低血浆总胆固醇含量。王丁刚和王淑如[7]得到了分子量均一的茶叶多糖, 动物实验表明:其具有显著的降血脂作用。吴文华[8]等利用动物实验研究得出普洱茶多糖在抑制高脂饮食小鼠血脂升高方面存在量效关系。韦璐[9]采用超声波浸提法得到金花茶多糖。动物实验表明金花茶多糖具有明显的降血脂功效, 且效果优于血脂康胶囊。

2.2 增强机体免疫功能作用

夏道宗[10]等研究了安吉白茶多糖的体外抗肿瘤活性, 结果表明, 安吉白茶多糖能显著抑制S180细胞的生长, 且具有剂量依赖关系。段博文[11]等研究了柳茶多糖对免疫低下小鼠免疫功能的影响, 结果显示其能明显改善免疫低下小鼠的脾淋巴细胞增殖反应, 对非特异性免疫、体液免疫及细胞免疫均有明显的促进作用。

聂少平[12]从江西老绿茶叶中提取茶多糖, 采用人体结肠癌细胞增殖抑制模型研究该茶多糖对人体结肠癌细胞的增殖抑制活性。研究发现, 该茶多糖在较低浓度下 (7.0μmol/L) 表现出良好的增殖抑制活性。张运芳[13]研究了不同提取途径的茶叶多糖对佐剂性关节炎大鼠免疫指标的影响。结果显示, 几种茶叶多糖均能提高大鼠过低的脾淋巴细胞增殖反应, 其中P2途径提取的茶叶多糖对脾淋巴细胞增殖反应的促进作用最为明显。

2.3 抗氧化作用

吴晓鹏[14]等研究表明, 苦丁茶多糖对羟基自由基、超氧阴离子自由基具有一定的清除作用, 对H2O2诱导红细胞氧化溶血反应和红细胞自氧化溶血反应均有显著的抑制作用。聂少平等[15]从婺源粗老绿茶叶中提取得到茶叶多糖, 研究结果表明, 茶叶多糖对超氧自由基和DPPH自由基有较好的清除作用, 对β-胡萝卜素-亚油酸氧化体系有较明显的抑制作用。

2.4 抗凝血作用

谢亮亮[16]研究的体外抗凝血实验显示TPS-4通过内源性途径影响凝血, 可延长活化部分凝血酶时间。梁进[17]选用硫酸化、乙酰化和羧甲基化的方法分别对纯化后的乌龙茶多糖进行化学修饰, 结果表明经过化学修饰的茶多糖, 其抗凝血活性进一步增强。化学修饰试剂的选择与多糖的比例及修饰反应的时间在一定范围内影响茶多糖分子结构的改变程度, 相应地影响抗凝血活性。

2.5 降血糖作用

周斌星[18]从普洱茶中提取茶叶多糖, 动物试验表明普洱茶多糖可帮助恢复糖尿病小鼠体重且能有效降低糖尿病小鼠的血糖值。另外, 高剂量的普洱茶多糖降血糖效果更佳。吴建芬[19]的研究表明茶多糖对四氧嘧啶高血糖小鼠表现出显著的降血糖作用。廖森泰[20]探究了桑宁茶多糖对糖尿病小鼠的降血糖作用。结果表明所得3种桑宁茶多糖对链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠均有明显的降血糖效用, 且初步纯化的多糖降血糖效果最好, 优于格列苯脲。

3 前景

篇6：可吸入颗粒物生物活性及其微观特征分析

金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxin,SE)是一类由金黄色葡萄球菌产生的细菌超抗原蛋白质,此类蛋白质分子结构相关,序列具有高度同源性[1]。作为一类典型的细菌超抗原,SE在极低的浓度下便可激活体内大量的T淋巴细胞,释多种细胞因子,并对主要组织相容性复合体Ⅱ类分子(MHCⅡ)阳性的肿瘤细胞产生毒性杀伤。因此SE已经被越来越多地应用于抗肿瘤研究中[2]。

金黄色葡萄球菌肠毒素C2(Staphylococcal enterotoxin C2,SEC2)是肠毒素家族中特殊的一类,因其较好的免疫刺激活性和相对较低的毒性,已经广泛地应用于肿瘤的临床治疗并取得了一定的治疗效果。为了分析SEC2不同结构区域对其活性的影响,并进一步提高其成药性,作者实验室前期对野生型SEC2蛋白分子的氨基端和羧基端分别进行了截短改造。研究发现,截短SEC2的羧基端导致蛋白亲水性严重降低,不利于后续纯化,难以成药。而截短氨基端的蛋白SEC14-239,保持了较好的亲水性,利于成药,但其超抗原活性较野生型SEC2有所降低[3,4]。

已有报道结果对SEC2分子晶体的研究发现,分子中的α3到α5螺旋结构主要决定其超抗原活性,而氨基端α1和α2螺旋及羧基端β11和β12折叠并没有直接参与MHCⅡ或T细胞受体(TCR)的结合[5,6]。在SEC2的α3至α5结构域中,第20、22及26位氨基酸残基对于形成SEC1和SEC2的专一性抗原决定部位十分重要,并且这些氨基酸残基暴露于肠毒素分子表面可能参与了受体的结合[3,6]。王小刚等人将野生型SEC2中20和22位Thr和Gly分别替换为Leu和Glu后,突变蛋白的超抗原活性较野生型SEC2显著增强[7]。

因此,为得到一种分子量较小、可溶性好和超抗原活性高的改构SEC2分子,我们在前期的研究基础上通过基因工程技术对截短蛋白SEC14-239进行改造,利用基因工程方法将SEC14-239中7和9位Thr和Gly分别替换为Leu和Glu,构建一种截短突变蛋白SEC14-239M。体外生物活性分析结果显示,SEC14-239M的超抗原活性明显高于SEC14-239,这表明以定点突变的方式增强SEC2截短蛋白的活性是可行的。并且,SEC14-239M造成的刺激T细胞增殖活性和抑瘤活性增强的程度不同,暗示了超抗原诱导的T细胞增殖和肿瘤细胞抑制作用并不完全关联。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

产SEC2金黄色葡萄球菌0165菌株(CGMCC 0165)由沈阳协和生物制药股份有限公司提供;表达载体pET-28a为Invitrogen公司;小鼠肝癌细胞Hepa1-6细胞株由作者实验室保存[3];野生型 SEC2 蛋白纯品由作者实验室表达纯[8]; 6～8w龄雌性BABL/c小鼠购于辽宁长生生物技术有限公司。

1.1.2 试剂

T4 DNA连接酶为Takara大、Pyrobest DNA聚合酶、核酸限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ及DL2000 DNA分子量Marker均购自Takara大连公司;Ni-NTA亲和层析柱为Novagen公司产品;卡那霉素、异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)、二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑盐(MTT)均为Sigma公司产品;胰蛋白酶为北京索莱宝科技有限公司产品;RPMI-1640细胞培养基和胎牛血清(FBS)为Gibco公司产品;胶回收试剂盒和Super-Bradford蛋白定量试剂盒和购自北京康为世纪生物科技有限公司;引物由上海生工生物工程技术服务公司合成;DNA测序由北京华大技术服务公司完成;其他化学试剂均为国产分析纯试剂。

1.1.3 仪器

PTC-200型PCR仪(美国MJ Research公司);Soniprep 150型超声波破碎仪(日本SANYO公司);NJ-2100型酶标仪(美国InterMed公司);IM型倒置显微镜(日本Olympas公司);WJ-3型加湿CO2培养箱(日本Harasawa公司)。

1.1.4 培养基

细菌培养基:LB培养基;细胞培养基:加10%胎牛血清的 RPMI-1640培养基。

1.2 方法

1.2.1 SEC14-239M表达载体的构建

接种含重组质粒pET-28-sec14-239的工程菌接种于LB液体培养基(含60 μg /ml 卡那霉素)37℃培养过夜,取适量的菌液按照质粒DNA提取试剂盒说明书提取包含有sec14-239 DNA片段的重组质粒pET-28-sec14-239。以质粒pET-28-sec14-239为模板,应用over-lap PCR技术构建获得含有突变位点的sec14-239m基因[7],使用引物见表1,端引物SEC2 F和SEC2R由作者实验室前期设计[4]。将经over-lap PCR构建得到的sec14-239m基因片段经切胶纯化后用EcoRⅠ 和XhoⅠ内切酶进行双酶切,与经同样酶切处理的表达载体pET-28a进行过夜连接,所得连接产物转化感受态细胞 BL21(DE3),LB平板(含60μg/ml卡那霉素)筛选阳性克隆,并将阳性克隆测序。

a氨基酸替换情况;b下划线部分代表氨基酸替换位点。a Amino acid substitution;b The substituted amino acids are indicated underlined.

1.2.2 SEC14-239M蛋白的表达纯化

将测序正确的阳性克隆菌E.coli BL21(DE3)接种于LB液体培养基中(含60 μg/ml 卡那霉素),37℃继续培养到菌液OD600约为0.6时,按体积比为1:1 000加浓度为1mol/L 的IPTG,并30℃诱导表达4h。菌液于5 000r/min 离心10min收集菌体,菌体重悬于平衡缓冲液(10mmol/L imidazole,500mmol/L NaCl,50m mol/L NaH2PO4,pH 8.0)中超声破碎,至菌液清亮后10 000r/min离心25min收集上清。上清通过 Ni亲和层析纯化获得SEC14-239M蛋白纯品,于透析液(PBS缓冲液,pH 7.4)中充分透析除盐,收集纯化蛋白,并以SDS-PAGE分析其纯度。纯化后的蛋白按照Super-Bradford蛋白定量试剂盒测定方法测定蛋白浓度。过滤除菌后保存于-70°C待用。

1.2.3 体外诱导小鼠脾细胞增殖活性的检测

6～8w龄的实验小鼠劲椎脱臼处死,75%酒精浸泡消毒min,取脾脏、研磨于200目钢丝网过滤,1 000r/min离心10min离心弃上清。加入无菌红细胞裂解液(Tri-NH4Cl溶液)裂解红细胞,用RPMI 1640 培养液洗涤,离心收集细胞。用RPMI 1640培养液(含10% 胎牛血清)调整细胞密度为1×107个/mL。以100μl /孔加入96孔细胞培养板中。经梯度稀释后的SEC14-239、SEC14-239M蛋白及野生型SEC2以100 mL/孔加入上述各孔,使终浓度分别为10ng/ml、100ng/ml和1 000ng /ml。以10%胎牛血清的RPMI 1640培养基做阴性对照,每个蛋白浓度3次重复。

将上述培养板在37℃、5% CO2 条件下培养72h。待到达培养时间后,向各孔中加无菌的MTT溶液(5mg/ml),孵育4h,离心弃上清,以120μl/孔加 DMSO并在室温振荡10min溶解结晶颗粒。通过酶标仪以测定波长570nm和参比波长630nm 测定各实验孔的吸光值(OD)。计算细胞增殖能力,以增殖指数(proliferation index,PI) 表示:PI =试验组OD值/阴性对照组OD值

1.2.4 体外抗肿瘤活性的测定

将脾淋巴细胞和小鼠肝癌细胞Hepa1-6以20:1的效靶混合(细胞浓度分别为5×105 个/孔和2.5×104个/孔)接种到96孔培养板,每种蛋白分别以不同浓度加入96孔培养板,体积最终为200μl/孔。同时做本底释放组(加入与实验孔相同量的淋巴细胞和蛋白样品),肿瘤细胞对照组(仅加Hepa1-6肿瘤细胞) 及空白对照组(仅加RPMI 1640)。同样方法以牛血清白蛋白(BSA) 为阴性对照,每样3次重复。将96孔细胞培养板置于37℃、 5% CO2 的细胞培养箱中培养72h,然后向各实验孔中加入30μl无菌的MTT溶液(5mg/ml),连续孵育4h,将培养板离心弃上清,以120μl/孔加 DMSO并在室温振荡10min溶解结晶颗粒。

用酶标测定仪于570nm处测定吸光值,蛋白抑制肿瘤生长程度以肿瘤生长抑制率表示。

肿瘤生长抑制率(Tumor growth inhibition %) = 100-[(试验组-本底释放组)/(肿瘤细胞对照组-空白对照组)]× 100。

2 结果与分析

2.1 SEC14-239M蛋白的构建及表达纯化

为了将SEC14-239蛋白的7和9位Thr和Gly分别替换为Leu和Glu,构建SEC14-239M蛋白。本研究先通过PCR技术构建获得了sec14-239m基因片段,并连接表达载体pET-28a,最终构建了含有编码SEC14-239M蛋白基因sec14-239m的重组表达质粒pET-28-sec14-239m。

重组表达质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,用含有卡那霉素抗性培养基筛选和DNA测序,最终确认获得正确的阳性克隆,用于SEC14-239M的表达纯化。纯化后的蛋白经过15%SDS-PAGE电泳检测纯度达到95%以上(图1),可用于后续实验。

1,SEC2;2,SEC14-239M;3,SEC14-239。

M,protein molecular weight standards;Lane 1,SEC2;Lane 2,SEC14-239M;Lane 3,SEC14-239.

2.2 体外刺激小鼠脾淋巴细胞活性检测

用MTT法检测各蛋白刺激小鼠脾淋巴细胞增殖能力。研究结果显示,SEC2、SEC14-239M和SEC14-239都可以在体外剂量依赖性的诱导淋巴细胞的增值。蛋白SEC14-239M的刺激T细胞增值能力较SEC14-239显著增强(P<0.05,图2),尽管弱于野生型SEC2,但与SEC2相比没有显著性差异(P>0.05)。结果初步说明通过替换SEC14-239中7和9位氨基酸残基而构建成的SEC14-239M蛋白,其超抗原活性有显著提高。

2.3 体外抑瘤活性

本实验以小鼠脾淋巴细胞和小鼠肝癌细胞Hepa1-6分别作为效应细胞和靶细胞(效靶比为20:1),检测各蛋白在体外诱导淋巴细胞对肿瘤细胞生长的抑制活性。研究结果显示,与阴性对照BSA相比,SEC2、SEC14-239M和SEC14-239均能诱导显著的抑制肿瘤细胞生长活性(P<0.01),并且呈剂量依赖性(图3)。同等剂量条件下,与SEC14-239相比,SEC14-239M的肿瘤细胞抑制活性显著提高(P<0.05),但也显著低于野生型SEC2(P<0.01),进一步说明7和9位氨基酸的定点替换增强了SEC14-239M的超抗原活性,尽管与野生型SEC2完整分子相比仍有显著差异。

3 讨论

Turner T N等人研究发现,SEC1中第20位的Leu和22位的Glu对SEC1与TCR的结合可能起到决定性的作用。而SEC2的第20位和22位氨基酸分别为Thr和Gly,这可能是导致SEC1较 SEC2超抗原活性高的主要原因[9,10]。

Bohach G A等人发现删除SEC1氨基端的1～13位氨基酸残基并不影响其T细胞刺激能力,而进一步的删除则导致SEC1活性的显著降低[11]。在此文献基础上,周隽逸等人利用基因工程技术对SEC2蛋白的氨基端和羧基端分别进行了删除改造。结果显示,截短SEC2的羧基端会导致蛋白的亲水性严重降低,不利于后续纯化,成药性很低。而截短氨基端的蛋白SEC14-239,保持了较好的亲水性,具有相当的可溶性表达能力,但其超抗原活性较野生型SEC2有所降低。主要原因可能是氨基端1～13位的截短影响了与之相邻的α3-螺旋的空间构象,使其发生改变,而α3-螺旋对于SEC2与TCR的结合起关键作用,该区域的结构变化导致SEC2结合TCR的能力降低,进而影响其超抗原活性[3]。

我们推测,增强SEC14-239的TCR结合能力将能够提高其超抗原活性。结合文献报导和前期研究基础,本研究中,我们将SEC14-239的第7位Thr和第9位Gly(即野生型SEC2中的20位Thr和22位的Gly)分别替换为Leu和Glu,得到截短突变蛋白SEC14-239M。生物学活性检测结果表明,SEC14-239M刺激T细胞的增殖能力和抑瘤活性均高于SEC14-239。这与文献报道的研究结果相似,证明通过定点突变技术来增强超抗原活性的方法同样适用于截短后的小型化蛋白。

同时,我们发现虽然SEC14-239M刺激T细胞增殖活性和野生型SEC2相当,但是前者的抑瘤活性却显著低于后者,这暗示了超抗原蛋白刺激T细胞增殖和诱导肿瘤细胞抑制并不完全关联。在T细胞增殖中,起决定作用的T细胞亚群主要为CD4+T细胞,增殖同时伴随大量细胞因子的释放[12]。而在超抗原诱导的肿瘤细胞抑制中,起主要作用的除了CD4+T细胞诱导的细胞因子作用外,还有CD8+T细胞介导的细胞毒性作用。通过CD8+T细胞介导的细胞毒性作用,超抗原可以实现对MHCⅡ阳性的肿瘤细胞产生毒性杀伤[13,14]。我们推测,尽管被删除的1～13位氨基酸不存在已经报道的MHCⅡ分子结合区域,但截短蛋白SEC14-239的MHCⅡ结合能力还是受到一定影响。SEC14-239M较SEC14-239相比,虽然增强了对TCR的结合能力,诱导激活了大量的CD4+T细胞,导致细胞增殖,但是并未增强与MHCⅡ分子的结合能力,因此在体外抑瘤实验中显示出低于野生型SEC2的结果。以上假设还需进一步的研究进行验证。

摘要：目的:分析金黄色葡萄球菌肠毒素C2的截短蛋白SEC14-239中7和9位氨基酸对其超抗原和抗肿瘤活性的影响。方法:利用基因工程方法将SEC14-239中7和9位Thr和Gly分别替换为Leu和Glu后,获得截短突变蛋白SEC14-239M。体外细胞学实验对其超抗原活性和抗肿瘤活性进行分析。结果:突变蛋白SEC14-239M体外刺激小鼠T细胞增值活性较SEC14-239显著增强(P<0.05),与未截短的SEC2相当(P>0.05)。在相同剂量条件下,SEC14-239M诱导的抗肿瘤活性尽管低于SEC2(P<0.01),但要显著高于SEC14-239(P<0.05)。结论:截短蛋白SEC14-239的第7和9位氨基酸突变后能显著增强其超抗原活性和抗肿瘤活性,但二者增强程度有差异。这一结果说明以定点突变改造SEC2截短体的活性是可行的,同时也暗示超抗原的T细胞增殖和诱导肿瘤细胞抑制并不完全关联。