科学探索肿瘤临床论文提纲

2022-11-15

论文题目：PLK4抑制剂CFI-400945在弥漫大B细胞淋巴瘤中的抗肿瘤作用及机制研究

摘要：弥漫大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）是一类起源于B淋巴细胞的恶性肿瘤,在形态学、遗传学、免疫表型及临床疗效等方面具有显著异质性。尽管利妥昔单抗联合环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、强的松（R-CHOP）化疗方案显著提高大多数DLBCL患者的缓解率及长期生存率,仍有约1/3的患者因难治或复发而不能治愈。因此,如何在R-CHOP治疗方案基础上进一步提高和改善DLBCL患者疗效及预后成为研究热点。近年来,随着对肿瘤发生发展的分子生物学及细胞遗传学特征研究的深入,DLBCL已进入靶向精准治疗时代。包括布鲁顿酪氨酸激酶（Bruton’s tyrosine kinase,BTK）抑制剂伊布替尼、免疫调节剂来那度胺、组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase,HDAC）抑制剂西达本胺、B细胞淋巴瘤-2（b cell lymphoma-2,bcl-2）抑制剂venetoclax在内的多种新型靶向治疗药物联合R-CHOP为部分难治复发DLBCL患者带来希望,但仍有部分患者由于年龄、合并症、毒副作用等原因未能从联合治疗中受益,临床亟待新型分子标志物的建立及新型靶向治疗与联合治疗来有效改善DLBCL患者预后。细胞周期是受特定蛋白活性严密调控的高度保守的过程,包括遗传物质复制和细胞分裂。细胞周期调控异常引起细胞分裂异常及过度增殖,从而导致肿瘤发生,因此靶向细胞周期成为肿瘤药物开发的热点。微管靶向类药物（如紫杉醇、长春新碱等）通过结合及干扰微管动力学过程来抑制肿瘤细胞有丝分裂,是目前广泛应用于临床的抗肿瘤药物,但由于缺乏对肿瘤细胞的特异性,这类药物存在严重毒副作用及耐药性。因此,探究与肿瘤细胞分裂密切相关的细胞周期调节因子,开发新型靶向治疗方法成为细胞周期靶向治疗研究中的重要课题。近来研究发现,多种参与细胞分裂过程的调节激酶,包括周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinases,CDK）,极光激酶（Aurora kinase）及 Polo 样激酶（polo-like kinases,PLKs）在多种肿瘤组织中异常表达,成为目前靶向治疗的研究重点。Polo样激酶4（Polo-like kinase 4,PLK4）是PLK家族的一员,其主要通过磷酸化调控下游靶蛋白活性,参与中心粒复制及细胞周期调控。PLK4表达失调导致细胞中心体完整性丧失,从而促进基因组不稳定性和肿瘤发生。研究发现,PLK4在多种实体肿瘤中高表达,且与肿瘤分期、转移、预后及化疗敏感性显著相关。PLK4在肿瘤发生发展中具有多重作用:通过与Arp2/3复合物相互作用调控肌动蛋白细胞骨架,进而影响肿瘤细胞侵袭及转移;参与PI3K/Akt信号通路活化调节肿瘤细胞上皮-间充质转化;通过与IKBKE相互作用调控NF-κB转录活性介导肿瘤细胞抗凋亡作用等。因此,PLK4成为预后不良的生物标记物和肿瘤治疗的潜在靶点。PLK4的高效靶向抑制剂CFI-400945是一种口服小分子抑制剂,其在细胞中选择性抑制PLK4,而对其他PLK家族成员没有显著抑制作用。CFI-400945通过抑制PLK4激酶活性使肿瘤细胞出现中心体数量异常,导致有丝分裂灾难,诱导细胞发生周期阻滞及死亡。CFI-400945的抗肿瘤作用在体内研究中也得到证实,其在多种小鼠移植瘤模型中耐受性良好,口服后可快速吸收且作用持久。目前,多项CFI-400945相关临床试验正在展开。然而,最新研究结果显示,尽管CFI-400945在临床试验中显示了良好的安全性和耐受性,并在晚期实体瘤患者中观察到了肿瘤应答,但单药治疗响应率低,亟需评估疾病特异性人群及探索新型联合治疗方案。本研究通过检测PLK4在DLBCL中的表达情况并探讨其临床意义,研究靶向小分子抑制剂CFI-400945在DLBCL的生物学作用和分子机制,为DLBCL的发病机制及新型靶向治疗提供理论依据和实验基础,同时进一步探索CFI-400945与多柔比星联合用药在DLBCL中的抗肿瘤作用及潜在作用机制,探讨基于有丝分裂的肿瘤治疗靶点及联合化疗增敏策略,为新型靶向药物联合传统化疗提供新思路,有望推动CFI-400945及相关联合治疗在DLBCL及其他肿瘤中的临床应用。第一部分:PLK4在弥漫大B细胞淋巴瘤中的生物学功能及临床意义目的:本研究旨在检测PLK4在弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞株及肿瘤组织中的表达水平,并结合DLBCL患者临床病理特征,进一步探究PLK4在DLBCL发生发展中的临床意义;同时结合公共数据库,分析PLK4表达水平与DLBCL患者临床预后相关性;分析PLK4的基因表达谱数据,预测PLK4在DLBCL发生发展中的生物学作用;研究PLK4基因敲减对DLBCL细胞药物敏感性的作用及潜在机制。材料与方法:1.临床标本收集;2.外周血单个核细胞（PBMCs）分离及收集;3.细胞复苏、培养及冻存;4.RNA提取与实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）;5.蛋白提取及免疫印迹实验（Western Blot）;6.免疫组织化学染色;7.公共数据库高通量测序数据下载及生物信息学分析;8.PLK4 shRNA敲减慢病毒转染DLBCL细胞株;9.Cell Counting Kit-8（CCK-8）检测细胞增殖;10.统计学分析。结果:1.RT-PCR 和 Western Blot 检测 PLK4 在 DLBCL 细胞株（LY1、LY3、LY8、U2932、VAL）中的表达水平。结果显示,以正常人PBMCs为对照组,DLBCL细胞株中PLK4的mRNA和蛋白表达量均明显增高。2.纳入65例初治DLBCL患者标本和20例淋巴结反应性增生标本进行免疫组织化学染色。结果显示,PLK4阳性表达率为75%（49/65例）,显著高于PLK4在对照组的阳性表达率（35%,7/20例）。结合DLBCL患者临床特征进行统计分析,结果显示,PLK4表达水平增高与DLBCL患者IPI评分呈统计学相关。3.对公共数据库中DLBCL基因组数据进行生物信息学分析。生存分析结果显示,PLK4高表达与接受R-CHOP治疗的DLBCL病人下降的生存率显著相关。PLK4相关基因的GO分析结果显示PLK4与DLBCL细胞核小体装配、DNA复制、DNA损伤修复及有丝分裂核分裂相关;GSEA基因富集分析结果显示PLK4与DLBCL细胞DNA复制,G2/M周期调控、DNA损伤修复及有丝分裂核分裂等功能相关。4.使用PLK4敲减慢病毒（shPLK4）转染LY8细胞并构建稳定转染细胞株。与对照组相比,转染shPLK4的DLBCL细胞对多柔比星的药物敏感性增加,同时,Western Blot结果显示DNA损伤标志蛋白γ-H2AX表达增加。结论:PLK4在DLBCL细胞株及肿瘤组织中表达异常增高,其表达水平与DLBCL患者IPI评分呈统计学相关。对于接受R-CHOP标准治疗的DLBCL患者,PLK4高表达与病人下降的生存率显著相关。PLK4可能通过参与细胞周期调控、细胞分裂及DNA损伤等生物学过程影响DLBCL疾病进展。PLK4基因敲减使DLBCL细胞对多柔比星药物敏感性增高,且增加多柔比星引起的DNA损伤。本研究结果有望阐明PLK4在DLBCL发生发展中的作用,为DLBCL的诊断、预后提供新的预测指标,也为靶向PLK4作为DLBCL的新型生物靶向治疗提供科学依据。第二部分:CFI-400945在弥漫大B细胞淋巴瘤中的抗肿瘤作用及机制研究目的:本研究旨在探索CFI-400945对弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞增殖、凋亡、周期及细胞分裂等生物学功能的影响,进一步深入研究CFI-400945在DLBCL中发挥抗肿瘤作用的分子机制,并研究其与致DNA损伤类药物多柔比星联合用药的协同抗肿瘤作用,探讨基于靶向细胞有丝分裂的联合化疗策略。材料与方法:1.细胞复苏、培养及冻存;2.蛋白提取及免疫印迹实验（Western Blot）;3.细胞免疫荧光染色;4.免疫组织化学染色;5.Cell Counting Kit-8（CCK-8）检测细胞增殖;6.Annexin V-PE/7AAD法检测细胞凋亡;7.PI/RNase法检测细胞周期;8.DLBCL动物模型体内检测CFI-400945及阿霉素联合应用的协同抗肿瘤作用;9.统计学分析。结果:1.使用 PLK4 抑制剂 CFI-400945 处理 DLBCL 细胞株（LY1,LY8,LY3）后,对细胞进行增殖、凋亡及周期分析,结果显示,CFI-400945呈时间、浓度依赖性抑制DLBCL细胞增殖;可以诱导细胞凋亡,且凋亡相关蛋白cleaved PARP表达增高;G2/M期细胞显著增多,并引起多倍体形成（DNA＞4N）。2.对不同浓度药物处理组细胞进行免疫荧光染色,结果显示,与DMSO对照组相比,CFI-400945处理LY8细胞后,细胞发生胞质分裂失败。Western Blot结果显示,p53野生型LY3细胞中p-p53及p53表达明显增加,而p53突变型LY8细胞p53无明显变化,p21在两种细胞中表达增加。同时,药物处理后LY8细胞中p-LAST1,p-YAP表达增加,细胞核内YAP表达减低,胞浆YAP表达增加。3.细胞免疫荧光结果显示,与DMSO对照组相比,CFI-400945处理后LY3和LY8细胞γ-H2AX荧光强度增加,焦点数量增多,提示γ-H2AX表达升高。Western Blot结果显示,与DMSO对照组相比,CFI-400945处理LY3和LY8细胞后,p-ATM、p-ATR、p-Chk1、p-Chk2、γ-H2AX 表达明显增加,提示 DNA损伤相关通路活化。4.细胞增殖实验结果显示,与CFI-400945单药处理组和多柔比星单药处理组相比,CFI-400945与多柔比星双药联用组细胞增殖活性明显降低,在携带p53突变,发生有丝分裂异常的DLBCL细胞株LY8中,两药协同指数小于1,提示两药具有良好的协同作用,而在p53野生型、未发生有丝分裂异常的DLBCL细胞株LY3中,两药不具备协同作用。细胞凋亡实验结果显示,与CFI-400945单药处理组和多柔比星单药处理组相比,双药联用组LY3及LY8细胞凋亡数均显著增加。5.构建DLBCL小鼠移植瘤模型进行体内实验。结果显示,与空白对照组相比,CFI-400945处理组小鼠肿瘤体积增长速度显著降低,CFI-400945与多柔比星双药联用组可显著抑制肿瘤生长并延长肿瘤体积倍增时间。对小鼠肿瘤组织进行免疫组织化学染色,结果显示,与空白对照组相比,CFI-400945处理组小鼠肿瘤Ki-67表达明显降低,γ-H2AX表达明显增高;与单药处理组相比,双药联用组小鼠肿瘤组织Ki-67表达明显降低,γ-H2AX表达明显增高,肿瘤细胞形态大小不一,并存在有丝分裂异常。结论:CFI-400945可抑制DLBCL细胞增殖,引起细胞凋亡和G2/M期阻滞。CFI-400945 可导致细胞发生胞质分裂失败,导致多倍体形成。CFI-400945 可通过促进p53及Hippo/YAP信号通路活化发挥抗肿瘤作用。同时,CFI-400945可促进ATM/ATR-Chk1/Chk2信号通路的活化,导致肿瘤细胞发生DNA损伤。CFI-400945 可与多柔比星在体外、体内发挥协同抑制 DLBCL 细胞生长的作用。本研究为揭示PLK4抑制剂在DLBCL中的作用机制及新型联合治疗方案提供新的理论依据。

关键词：弥漫大B细胞淋巴瘤;PLK4;细胞增殖;DNA损伤;CFI-400945;YAP;多柔比星

学科专业：内科学（血液病）

中文摘要

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符号说明

第一部分: PLK4在弥漫大B细胞淋巴瘤中的生物学功能及临床意义

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图表