生物实验三生教育论文提纲

论文题目：养血润肠方干预血虚功能性便秘大鼠AQP-3mRNA及AQP-3在Lipid Raft上表达的研究

摘要：慢传输型功能性便秘（Slowly Transmitting Functional Constipation,STFC）是慢性便秘中最常见的类型,也是临床上常见疾病且多发,往往是呈现为持续性排便困苦艰难、排便次数减少或排便不尽感的一种功能性肠病。近年来随着人类生活方式和生活结构的改变,STFC发病率呈上升趋势,并已经严重影响人们的生存和生活质量。STFC的发病与饮食、遗传、精神心理、肠道神经功能障碍、消化道激素水平、盆底肌肉障碍、排便动力学异常、和其他调节因子异常等方面有关,针对这些发病因素,临床上不断研究其病理机制,日臻完善STFC的诊疗技术。便秘的发病机制复杂,且临床症状个体差异大,故其治疗方案尚处于完善、探索。现代医学对STFC的治疗主要以口服西药为主,手术治疗为辅。临床中首先是采取非手术治疗,做好疾病科普宣传,让患者通过调理起居饮食、改变生活方式、加强锻炼、养成良好排便习惯,使其更符合肠道、排便生理,必要时给予心理疏导教育;适时结合药物治疗,如容积性、刺激性泻药、润滑性通便药、促肠动力药、促分泌剂等来改善便秘症状;目前也有采用骶神经（八髎穴区域）刺激、生物反馈疗法联合神经、生物电生理刺激等方法。至于外科手术治疗,要相对谨慎,因手术后遗症也是困扰患者和医者的疑难问题。目前STFC的现代医学治疗方法虽然运用较常见,但临床效果不理想、不够持久,而且副作用大,易产生耐药性、后遗症等,故临床医生正积极研究与探讨如何能使便秘的诊疗方案达到更为理想的状态。现代中医继承传统诊治便秘脉络,并结合现代医学对便秘的认识理论和科学诊疗技术,采用中西医结合治疗STF便秘,可以明显缓解便秘症状,消减并发症,降低便秘复发率,相比较其他方式,可较好的解决便秘问题。那么如何充分发挥中医药优势,实现现代中医与现代医学各自特色融合、交叉,是现代中医努力的方向。继承传统中医药特色,基于中医基础理论,不失辨证论治诊治思路的同时,将中医证候和现代医学技术指标相匹配,从微观、整体角度出发,阐释中医药诊治便秘的功效机制,势必有利于现代中医和现代医学的进一步交叉融合,推进便秘的诊治水平。养血润肠方是李国栋主任多年诊治便秘经验的效验方。组方以养血活血、润肠通便功效为主,治疗便秘兼变生之症。本研究通过临床观察,再次确认该方剂治疗血虚STF便秘的临床效果,并按照循证医学方法系统评价中草药治疗慢性功能便秘的疗效趋势,之后依据文献方法建立稳定可靠、符合临床表现特征的动物模型,研究本方治疗STFC的实验结果,包括本方对AQP-3mRNA的影响,从基因、细胞膜功能蛋白水平出发,再回归到组方养血润燥、润肠通便的整体功效上来阐述方药的作用机制,并观测AQP-3是否在Lipid Raft上有表达,为进一步研究养血润肠方治疗STFC的作用机制和STFC发病机制提供新的思路。临床观察目的:观察养血润肠方治疗血虚型STF便秘的临床疗效。方法:收集我科门诊治疗病例81例,利用随机数字表分为三组,每组27例,养血润肠组采用此方为主,辨证加减药味,麻仁润肠丸组患者口服麻仁润肠丸,普芦卡比利组患者口服琥珀酸普芦卡比利。观察治疗四周后各组患者的.中医证候积分变化、以及Cleveland便秘评分变化,并计算各组总有效率。并在3个月时进行随访,再次评价Cleveland分值变化。结果:四周后普芦卡比利的治疗总有效率优于养血润肠方组,同时养血润肠方组的总有效率优于麻仁润肠丸组,统计学差异明显（P＜0.05）。随访时养血润肠方组的治疗总有效率优于普芦卡比利,但二者的便秘评分改善程度相差不多,同时养血润肠方组的总有效率优于麻仁润肠丸组,统计学差异明显（P＜0.05）。结论:养血润肠加减方治疗血虚型STF便秘疗效稳定、可靠,安全,副作用少。中草药内服治疗功能性便秘临床疗效观察的系统评价目的:检索、总结现有已发表、有关中草药治疗功能性便秘的临床观察报道,采用荟萃分析方法系统评价其临床疗效趋势。方法:检索中国期刊全文数据库（CNKI,1989～2016.10）、中国生物医学文献数据库（CBM,1989～2016.10）、中国科技期刊全文数据库（VIP,1989-2016.10）和外文数据库PubMed、MEDLINE、EMBASE、CINAHL、OVID等,纳入中药与中成药、或与西药对照治疗慢性功能性便秘的随机和半随机对照临床试验,按照Cochrane Handbook和GRADE系统标准评价文献质量、提取数据,使用RevMan 5.3软件进行分析。结果:共纳入10个研究,合计研究对象共1227例,男性550例、女性677例,Meta分析结果显示:①中草药内服能改善STF便秘患者的症状,其合并疗效效应量优于西药和中成药的合并后疗效的效应量,有效率RR合并=1.37,95%CI[1.10,1.71]。②中草药内服治疗STF便秘疗效的合并后效应量要优于只有西药的疗效合并后的效应量,差异有统计学意义(RR合并=1.36.95%CI[1.18,1.57]。③中草药内服治疗功能性便秘疗效的合并效应量与单纯中成药的疗效合并效应量之间的差异无统计学意义（RR合并=1.29,95%CI[0.85,1.96]）。结论:结合已查阅的相关领域的大量RCT研究,均能较确切中草药内服治疗便秘的疗效不劣于西药或中成药,具有比较好的疗效趋势。但因本研究的局限,尚不能给出更为确切的结论。实验研究实验一血虚型慢传输型功能性便秘大鼠模型复制目的:复制血虚型STF便秘Wsitar大鼠。方法:采用洛哌丁胺经胃灌服法结合尾部放血进行血虚型STF便秘大鼠模型的建立和复制。随机分5组:空白组、模型空白组、养血润肠方中剂量组、养血润肠方低剂量组、普芦卡比利组。按文献提示予模型组大鼠灌服洛哌丁胺溶液10天,空白组给予等体积盐水。每次剪去尾尖端2.5-3mmm,后浸入37-38℃恒温水浴中放血3 min,每两天1次,共4次,从而制作成大鼠的血虚型的便秘模型。造模期间观察大鼠的一般体征变化、3小时和6小时排便粒数,以及24小时粪便重量和含水量,造模结束后,采用生物染色碳黑墨水灌胃法测定肠道墨水推进率。结果:造模的各组与空白组比较,体征有显著血虚证特征;与空白对照组比较3小时和6小时排便粒数,以及24小时粪便重量和含水量,造模各组均不及空白组的数据（P＜0.05）。结论:本实验采用洛哌丁胺灌胃结合尾部放血进行血虚型STF便秘大鼠模型造模,基本符合中医血虚证的STFC的临床特点,模型稳定可靠,可供接下来的动物试验使用。实验二养血润肠方对血虚型慢传输型功能性便秘大鼠结肠AQP-3mRNA的影响目的:RT-PCR测定养血润肠方对血虚型STF便秘大鼠结肠AQP-3mRNA的影响方法:采用洛哌丁胺经胃灌服结合尾部放血进行血虚型STF便秘大鼠模型造模。随机分为空白组、模型空白组、养血润肠方中、低剂量组以及普芦卡比利组。用药治疗14天,末次治疗1天后,脱颈处死各组大鼠,采集标本,液氮冰冻。采用RT-PCR测定各实验组动物标本中的AQP-3mRNA的表达。结果:经方差分析,养血润肠方中剂量治疗组、养血润肠方低剂量治疗组、空白对照组、模型对照组与普芦卡比利治疗组比较,AQP-3mRNA表达结果的差异有意义（P＜0.05）。结论:①养血润肠方治疗血虚型STF便秘,通过下调AQP-3mRNA的表达,可能是其治疗慢传输便秘的作用机制之一。②印证了洛哌丁胺通过提高AQP-3mRNA的表达量,增加肠道内的水分吸收,形成便秘,且其对于雌性和雄性Wistar大鼠的影响效果相同,可以稳定造模。③普芦卡比利在促进胃肠蠕动治疗便秘之外,尚可抑制AQP-3mRNA表达而减轻便秘症状。实验三AQP-3在大鼠结肠粘膜上皮细胞的Lipid Raft上的表达目的:AQP-3是否在大鼠结肠粘膜上皮细胞的Lipid Raft上有表达。方法:采用灌胃针灌服洛哌丁胺结合尾部放血进行血虚型STF便秘大鼠模型造模。随机分空白组、模型组、养血润肠方中剂量、低剂量组、普芦卡比利组。末次治疗1天后,脱颈处死各组大鼠,采集标本,液氮冰冻。选择空白组和模型组标本,按照文献取材结肠粘膜细胞,提取脂筏,进行蔗糖密度梯度超高速离心,采用Western Blot检测AQP-3蛋白在大鼠结肠粘膜上皮细胞Lipid Raft上是否有表达。再次重复实验,选择空白对照组、模型对照组、养血润肠方中剂量治疗组、养血润肠方低剂量治疗组、普芦卡比利治疗组各组样本,重复实验步骤。结果:预实验,经检测在可能含有脂筏的组分中,空白组AQP-3表达很微弱,模型组AQP-3大量表达;得出空白组和模型组大鼠的结肠粘膜上皮细胞的脂筏上,脂筏标记蛋白和AQP-3都有表达。再次重复扩大实验显示各组大鼠结肠粘膜上皮细胞的脂筏中AQP-3均无表达。结论:预实验证实经洛哌丁胺灌胃结合断尾放血造模的方法,可以使大鼠结肠上皮细胞脂筏组分中AQP-3表达增高,从而成功建立便秘模型;AQP-3在Wistar大鼠结肠粘膜上皮细胞的Lipid Raft上有表达。经重复扩大实验尚不能明确证实Wistar大鼠结肠粘膜上皮细胞上的AQP-3和Lipid Raft存在共定位关系。并对相关实验结果的因素进行分析讨论,下一步将继续完善实验操作,观测二者的共定位关系。

关键词：养血润肠方;血虚型;慢传输型功能性便秘;临床观察;动物实验;水通道蛋白3;脂筏

学科专业：中医外科学

中文摘要

Abstract

英文缩略语

前言

第一部分 文献综述

第一章 中医对便秘的认识

1 古典医籍中便秘的论述

2 现代中医有关便秘的诊治

3 总结和展望

参考文献

第二章 现代医学诊疗便秘概况

1 分类

2 发病机制

3 诊断标准

4 诊断

5 治疗

6 水通道蛋白

7 脂筏

8 总结与展望

参考文献

第二部分 临床研究 养血润肠方治疗血虚型慢传输型功能性便秘的临床疗效观察

1 资料与方法

2 统计方法

3 临床研究路线

4 结果

5 结论

6 讨论

7 下一步工作设想

参考文献

第三部分 系统评价 中草药内服治疗功能性便秘临床观察的系统评价

1 方法

2 结果

3 Meta分析

4 结论

5 讨论

参考文献

第四部分 实验研究

实验一 血虚型慢传输型功能性便秘大鼠模型复制

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

实验二 养血润肠方对血虚型STF便秘大鼠结肠AQP-3mRNA的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

5 下一步工作设想

实验三 AQP-3在大鼠结肠粘膜Lipid Raft上的表达

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

5 下一步工作设想

实验总结

参考文献

全文总结

创新点

致谢

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