大豆活性肽（精选七篇）
大豆活性肽 篇1
有研究报道称,大豆肽还具有增加体能、耐力的作用,但服用剂量较大,为20g/60kg人·d[13]。本实验以小鼠为实验研究对象,以武汉天天好生物制品有限公司生产的高活性大豆肽为受试样品,参考《保健食品功能学评价程序和检验方法》[14]中抗疲劳实验规定的方法,验证高活性大豆肽在1.2g/60kg人·d剂量下抗疲劳的作用。
1 实验材料
1.1 样品
高活性大豆肽由武汉天天好生物制品有限公司生产,主要质量指标为多肽含量≥80%,蛋白质含量≥90%,相对分子质量≤2000的肽段占80%以上。
1.2 药品
三氯醋酸、葡萄糖、浓硫酸、蒽酮、硫脲、硫酸铜、氟化钠、钨酸钠、对羟基联苯均为分析纯(AR)级。
1.3 仪器
恒温水箱、电子天平、铅皮、721型分光光度计、离心机、匀浆器、振荡器。
1.4 实验动物
从华中科技大学实验动物中心购置清洁级昆明小鼠(雄性)120只,体重18～22g。检测环境条件,温度范围20℃～25℃,相对湿度范围40%～70%。
2 实验方法
2.1 实验分组及剂量选择
将动物适应性喂养3天,空腹12小时后称体重,参照体重随机分组。实验分四个组,大豆肽10倍组、大豆肽20倍组、大豆肽30倍组及对照组。将高活性大豆肽按成人推荐剂量(1.2g/60kg人.d)的10倍、20倍和30倍配成溶液按小鼠的体重灌胃。对照组给予同等容积的蒸馏水。实验共进行30天。实验期间每周测体重一次,并根据体重状况灌胃。
2.2 实验检测项目及方法
2.2.1 负重5%游泳实验
取雄性小鼠40只,随机分4组,每组10只,按剂量设计连续给样品30d,于末次灌胃后30min,在小鼠尾根部绑上相当于体重5%的铅皮,放入25℃±0.5℃水中,迫使其在水深30cm的恒温水箱中负重游泳,记录其自游泳开始至死亡的游泳时间。
2.2.2 血乳酸含量
取雄性小鼠40只,随机分4组,每组10只,按剂量设计连续给样品30d,于末次灌胃后30min,让其进行10mmin的游泳运动(水温为25℃±0.5℃),安静30min后采其尾血并离心得血清,用对羟基联苯法测其血乳酸含量。
2.2.3 肝糖元含量
取雄性小鼠40只,随机分4组,每组10只,按剂量设计连续给样品30d,于末次灌胃后30min,将其杀死立刻取其肝脏,经0.85%的生理盐水处理后冷冻保藏。用蒽酮法检测其肝糖元含量。
3 实验结果
3.1 负重5%抗疲劳游泳实验
实验数据统计结果见表1所示。
注:*与对照组比较,p<0.05;**与对照组比较,p<0.01。
小鼠负重5%抗疲劳游泳实验统计分析显示,通过给予小鼠高活性大豆肽灌胃30d,灌胃组负重5%游泳时间明显都长于对照组,且大豆肽20倍组和大豆肽30倍组差异显著,具有统计学意义,初步说明该产品对延长小鼠游泳时间具有显著效果。
3.2 血乳酸含量
实验数据统计结果见表2所示。
注:*与对照组比较,P<0.05;**与对照组比较,P<0.01。
高活性大豆肽抗疲劳小鼠血乳酸含量结果统计分析显示:高活性大豆肽三个剂量组的血乳酸含量均显著低于对照组,并且经t检验,均具有统计学意义,说明高活性大豆肽对增强小鼠的抗疲劳能力有显著效果。
3.3 肝糖元含量
实验数据统计结果见表3所示。
注:*与对照组比较,P<0.05;**与对照组比较,p<0.01。
高活性大豆肽抗疲劳小鼠肝糖元含量结果统计分析显示:高活性大豆肽三个剂量组的肝糖元含量均显著高于对照组,并且经t检验,均具有统计学意义,说明高活性大豆肽对增强小鼠的耐受疲劳能力有显著效果。
4 讨论
疲劳是机体复杂的生理生化变化过程,是机体生理过程不能将其机能持续在一特定水平或器官不能维持其预定的运动强度。由于运动引起机体生理生化改变而导致机体运动能力暂时降低的现象,称为运动性疲劳[15]。对抗体力(运动)性疲劳包括延缓体力性疲劳产生和促进体力性疲劳消除两大方面[16,17]。
游泳时间延长表明运动耐力提高,它是延缓体力性疲劳产生最直接的表现。运动后能量代谢产生的血乳酸含量的多少能从一定程度上反应机体疲劳程度:产生的血乳酸越少,提示动物的促进体力性疲劳消除能力就越强。肝糖元是能量代谢中主要的能量来源,动物自身肝糖元的多少可反映延缓体力性疲劳产生的能力,肝糖元越多,动物耐受疲劳的能力就越强。
通过对负重5%抗疲劳动物实验、血乳酸含量、肝糖元含量这三项指标数据的统计分析,高活性大豆肽20倍组、30倍组实验小鼠负重游泳时间明显高于对照组;肝糖元含量明显高于对照组;血乳酸含量明显低于对照组,并且经t检验具有统计学意义。因此根据《保健食品功能学评价程序和检验方法》中抗疲劳实验结果判定规则可以判定,高活性大豆肽具有提高小鼠抗疲劳能力的作用,而且显著延缓体力性疲劳产生的同时促进体力性疲劳的消除。
摘要：目的:通过小鼠动物实验验证高活性大豆肽的抗疲劳作用。方法:以小鼠为实验对象,研究高活性大豆肽对小鼠游泳时间、血乳酸、肝糖元等生化指标的影响。结果:高活性大豆肽能显著延长小鼠负重游泳时间;提高肝糖元含量;降低小鼠运动后的血乳酸含量。结论:高活性大豆肽具有抗疲劳的功效。
大豆活性肽 篇2
本实验分别以小鼠及大鼠为实验研究对象,以武汉天天好生物制品有限公司生产的高活性大豆肽为受试样品,参考《保健食品功能学评价程序和检验方法》[13]中增强免疫力和减肥实验规定的方法,验证高活性大豆肽增强免疫力和减肥的作用及相互关系。
1 材料
1.1 受试物
高活性大豆肽由武汉天天好生物制品有限公司生产,主要质量指标为多肽含量≥80%,蛋白质含量≥90%,相对分子质量≤2000的肽段占80%以上。
1.2 试验动物
清洁级昆明小鼠,雄性,200只,18～22g;SD大鼠,雄性50只,100～180g;均购自华中科技大学实验动物中心。
1.3 主要仪器与试剂
5 mm直径打孔器、显微镜、微量血凝试验板、离心机、酶标仪、96孔培养板、5%CO2培养箱、200目筛网、DNFB、丙酮、麻油、脱毛剂、SRBC、生理盐水、鸡红细胞、甲醇、Giemsa染液、YAC-1细胞、Hanks液(pH7.2～7.4)、RPMI1640完全培养液、乳酸锂、碘硝基氯化四氮唑(INT)、吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)、NAD、Tris-HCL缓冲液(pH8.2)、1%NP40、台盼兰、1mol/L盐酸等。猪胆盐和胆固醇为北京海淀区微生物培养基制品厂生产,蛋黄粉和猪油购自市场。
2 实验方法
2.1 免疫功能实验
2.1.1 分组
设三个剂量组:大豆肽10倍组、大豆肽20倍组、大豆肽30倍组及对照组。将高活性大豆肽按成人推荐剂量(1.2g/60kg人·d)的10倍、20倍和30倍配成溶液按小鼠的体重灌胃。对照组给予同等容积的蒸馏水。小鼠灌胃体积为0.2mL/10g·bw。
2.1.2 体重及脏器/体重比值测定
实验前及实验结束进行空腹12小时体重测量。小鼠称重后,颈椎脱臼处死,解剖动物,取出脾脏及胸腺,用滤纸吸干血迹后称重。测定脏器/体重比值。
2.1.3 迟发型变态反应(DTH)
小鼠连续灌胃30天后,每鼠腹部皮肤用脱毛剂进行脱毛处理,范围约3cm×3cm,后用DNFB溶液50μL均匀涂抹致敏;5天后,再用DNFB溶液10μL均匀涂抹于小鼠右耳两面,进行攻击;24小时后,颈椎脱臼处死小鼠,剪下左右两耳,用打孔器取下直径5mm的耳片称重。
2.1.4 半数溶血值(HC50)的测定
小鼠连续灌胃30天后,每只鼠腹腔注射2%(v/v) SRBC的细胞悬液0.2mL进行免疫。5天后,将小鼠摘除眼球取血于离心管中,放置约1小时,使血清析出,2000r/min离心10min,收集血清。用生理盐水稀释血清(300倍),将稀释后的血清1ml置试管内,依次加入10%(v/v) SRBC0.5mL,补体1mL(用生理盐水按1:10稀释),另设不加血清的对照管(以生理盐水代替),置37℃恒温水浴中保温15～30min后,冰浴终止反应。2000r/min离心10min,取上清液1mL,都氏试剂3mL于试管内,同时取10%(v/v) SRBC0.25mL加都氏试剂至4mL,于另一支试管内,充分混匀,放置10min后,于540nm处以对照管作空白,分别测定各管光密度。
2.1.5 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)
小鼠连续灌胃30天后,每鼠腹腔注射20%鸡红细胞悬液1mL。30min后,颈椎脱臼处死动物,仰位固定于蜡板上,正中剪开腹壁皮肤,经腹腔注入生理盐水2mL,转动鼠板1min,然后吸出腹腔洗液1mL,平均分滴于2片载玻片上,放入垫有湿纱布的搪瓷盒内,于37℃孵箱温育30min。孵毕,在生理盐水中漂洗,除去未贴片细胞。晾干,以1:1(v/v)丙酮甲醇溶液固定20min,4%(v/v) Giemsa-磷酸缓冲液染色3min,再用蒸馏水漂洗晾干,于显微镜下计数巨噬细胞。
2.1.6 小鼠NK细胞活性测定(乳酸脱氢酶LDH测定法)
小鼠连续灌胃30天后,颈椎脱臼处死,无菌取脾,置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中,用镊子轻轻将脾撕碎,经200目筛网过滤,制成单细胞悬液,用Hanks液洗三次,每次离心10min (1000r/min),然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中,台盼兰染色计数活细胞数(应在95%以上),用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为5×106个/mL;试验前24小时将靶细胞传代培养,应用前以Hanks液洗3次,用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为1×105个/mL;靶细胞和效应细胞各100μL(效靶比50:1),加入96孔培养板中;靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL、靶细胞最大释放孔加靶细胞和1%NP40各100μL,上述各项均设三个复孔,于37℃,5%CO2培养箱中培养4小时,然后将培养板离心(1500r/min) 5min,每孔吸取上清液100μL置96孔培养板中,同时加入LDH基质液100μL,反应3min,每孔加入1mol/L的HCl 30μL,在酶标仪490nm处测定密度值(OD)。
2.2 减肥功能实验
2.2.1 高脂饲料配方
将基础饲料粉末75.3%、蛋黄粉12%、胆盐0.2%、胆固醇0.5%、猪油12%共7kg混合均匀,加适量的水制成高脂饲料。
2.2.2 分组
大鼠随机分为5组:即正常对照组;肥胖模型组;大豆肽10倍剂量组;大豆肽20倍剂量组;大豆肽30倍剂量组。高活性大豆肽按成人推荐剂量(1.2g/60kg人·d)的10倍、20倍和30倍配成溶液按大鼠的体重灌胃,正常对照组和肥胖模型组给予相应体积蒸馏水。正常对照组喂基础饲料,其它组喂高脂肪高营养饲料,动物自由进食、饮水。连续30天,处死动物。
2.2.3 观察指标
体重、体内脂肪重量、体脂/体重比和副作用。
2.3 实验数据统计
实验所得数据采用SAS软件进行分析。
3 结果
3.1 免疫功能实验
3.1.1 高活性大豆肽对小鼠体重的影响:连续灌胃30天,实验前后体重值见表1所示。
经统计分析,高活性大豆肽三个剂量与对照组之间试验前、后体重无显著性差异,p>0.05。
3.1.2 高活性大豆肽对小鼠非特异性免疫功能的影响
小鼠连续灌胃高活性大豆肽30天后,免疫脏器/体重比值和巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验的测定结果见表2所示。
注:**与对照组比较,p<0.01。
经统计分析,高活性大豆肽各剂量组的脾脏/体重比值与对照组之间均无显著性差异,p>0.05;三个剂量组的胸腺/体重比值与对照组之间均有极显著性差异,p<0.01;高活性大豆肽20倍、30倍剂量组吞噬率与吞噬指数与对照组相比较,p<0.01有极显著性差异。
3.1.3 高活性大豆肽对小鼠细胞免疫功能的影响
小鼠连续灌胃高活性大豆肽30天后,小鼠迟发型变态反应(DTH)及NK细胞活性的测定结果见表3所示。
经统计分析,三个剂量组的耳肿程度与对照组比较,p<0.01,有极显著性差异。高活性大豆肽30倍剂量组的NK细胞活性与对照组相比有较显著性差异,p<0.05。
注:*与对照组比较,p<0.05;**与对照组比较,p<0.01。
3.1.4 高活性大豆肽对小鼠体液免疫功能的影响
小鼠连续灌胃高活性大豆肽30天后,小鼠半数溶血值的测定结果见表4所示。
注:*与对照组比较,p<0.05;**与对照组比较,p<0.01。
经统计分析,高活性大豆肽各剂量组与对照组比较,半数溶血值有极显著性差异p<0.01。
3.2 减肥功能实验
3.2.1 高活性大豆肽对大鼠体重的影响
连续灌胃30天,实验前后体重值见表5所示。
与正常对照组比较具有显著性差异.**:p<0.01。
与肥胖模型组比较具有显著性差异,#:p<0.05;##:p<0.01。
经统计分析,从表5可见,实验结束以后,喂饲高脂肪高营养饲料的大鼠,其体重显著高于正常对照组(p<0.01),说明肥胖动物模型成功。各实验组灌胃不同剂量的受试物30天后,三个剂量组动物体重显著低于肥胖模型组(p<0.01或p<0.05)。实验期间未见腹泻、脱毛等副作用。说明高活性大豆肽可减少动物的体重。
3.2.2 高活性大豆肽对大鼠体脂指标的影响
连续灌胃30天,大鼠体脂湿重及体脂/体重比的检测结果见表6所示。经统计分析,由表6可见,实验结束后,肥胖模型组的体脂重量和体脂/体重比显著高于正常对照组(p<0.01),说明肥胖动物模型成功;实验结束后,高活性大豆肽10倍剂量组和20倍剂量组动物的体脂重量显著低于肥胖模型组(p<0.01或p<0.05)。说明高活性大豆肽可降低动物的体脂重量,且与剂量呈一定的剂量依赖关系。
与正常对照组比具有显著性差异,**:p<0.01。与肥胖模型组比具有显著性差异,##:p<0.01,#:p<0.05。
4 讨论
本文进行高活性大豆肽对小鼠免疫功能影响的动物实验。结果表明,高活性大豆肽三个剂量组与对照组比较,未见对动物体重及体重增长有明显的影响。三个剂量组的胸腺/体重比值与对照组比较,均有显著性差异。免疫功能检测结果证实,迟发型变态反应实验耳肿程度与对照组比较,10倍、20倍、30倍剂量组差异极显著;小鼠半数溶血值测定,10倍、20倍、30倍剂组的HC50值与对照组比较有极显著差异;小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验,20倍、30倍剂量组的吞噬率和吞噬指数均极显著高于对照组;NK细胞活性测定实验表明,与对照组比较,30倍剂量组显著升高,呈阳性结果。根据《保健食品功能学评价程序和检验方法》判定高活性大豆肽具有显著增强小鼠免疫功能的作用。
本文同时对高脂肥胖模型大鼠进行高活性大豆肽预防肥胖观察,肥胖模型组动物的体重、体脂重和体脂/体重比均显著高于正常对照组(p<0.01);高活性大豆肽三个剂量组动物的平均体重及体脂均显著低于肥胖模型组,说明高活性大豆肽对营养性肥胖具有一定的预防作用。
肥胖与脂肪细胞分泌的瘦素有关,而瘦素具有一定的增强免疫功能作用,调节炎症反应,在体内和体外均刺激大鼠吞噬细胞的吞噬活性[15]。高活性大豆肽的减肥作用可能与高活性大豆肽显著的增强免疫力有关,高活性大豆肽可能通过提高瘦素的分泌,调节脂质代谢,从而预防营养性肥胖。此项推理还需进一步实验证实。
摘要：目的:研究高活性大豆肽对免疫功能的调节作用及对营养性肥胖的预防作用。方法:测定高活性大豆肽剂量组动物的细胞免疫和体液免疫两项功能,综合考察高活性大豆肽的免疫功能。建立大鼠高脂肥胖模型,高活性大豆肽灌胃,以大鼠体重、脂/体比为标准,观察高活性大豆肽的预防肥胖作用。结果提示:高活性大豆肽剂量组动物的迟发型变态反应试验、小鼠半数溶血值测定实验、小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验及自然杀伤细胞(NK cell)活性测定实验均有显著增强作用,说明高活性大豆肽对实验小鼠的机体具有免疫增强作用。高活性大豆肽剂量组动物的平均体重及体脂均显著低于肥胖模型组,说明高活性大豆肽对实验大鼠具有减肥作用。
大豆活性肽 篇3
本实验采用大豆分离蛋白经复合酶水解后,得到分子量范围分别为240～1000Da和150～800Da的两种大豆低聚肽,通过动物实验,比较大豆分离蛋白、不同分子量大小的大豆低聚肽在体内抗氧化功能与抗运动疲劳功能的强弱差异,并由此探求抗氧化与抗疲劳之间的相关性。
1 材料与方法
1.1 实验材料
大豆肽:分子量与肽质量分数见表1;大豆分离蛋白(蛋白质质量分数88%);药品如邻苯三酚、蒽酮、尿素、葡萄糖、三氯乙酸、CuSO4等均为分析纯。
1.2 实验器材
722光栅分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);722紫外分光光度计(上海尤尼柯有限公司);Multiskan Mk3 酶标仪(美国Thermo公司);电热恒温水浴箱(上海跃进医疗器械厂)
1.3 实验设计与方法
昆明种雄性小鼠80只,平均体重18～24 g ,购于浙江省动物实验中心。按体重分为A、B、C、D 4组,每组20只。预饲养后,分别按每千克体重0.5g/d给予大豆肽A、B ,大豆蛋白、生理盐水,日一次。饲养采用基础日粮。3周后进行负重游泳实验。从各组中取10只实验小鼠尾部捆绑重量为体重5%的铁丝,于30℃恒温水浴缸中游泳,水深≥30㎝,记录小鼠头部没入水中7 s不再上浮为力竭游泳时间[5]。其余小鼠自由游泳90 min后屠宰。
测定质量分数2%大豆肽溶液清除自由基能力。清除羟自由基能力测定采用邻二氮菲法[6]。清除DPPH自由基能力测定参见参考文献[7]。
乳酸脱氢酶活力测定采用2,4-二硝基苯肼比色法[8]。
肝糖原含量测定采用蒽酮法[9]。肌乳酸平均生成量测定方法见参考文献[10]。
血浆尿素氮(BUN)测定采用二乙酰一肟比色测定法[10]。
SOD活力测定采用邻苯三酚自氧化法[11]。并对原实验方法进行改良。
1.4 数据处理
数据以平均值±标准差表示,采用SAS软件进行处理。P<0.05 为差异显著, P<0.01为差异极显著。
2 实验结果
2.1 大豆肽清除自由基能力
通过体外实验,质量分数2%大豆肽溶液对羟自由基、DPPH自由基的清除效果较好,并且肽B清除自由基能力明显强于肽A。结果见表2。
2.2 大豆肽对小鼠力竭游泳时间的影响
与D组相比,A组力竭游泳时间延长101%,差异显著(P<0.05),B组延长155%,差异极显著(P<0.01);C组游泳时间比对照组延长34%,差异无显著性。B组比A组延长27%。结果见表3。
注:同行不同小写字母表示差异显著P<0.05;不同大写字母表示差异极显著P<0.01,以下各表同。
2.3 大豆肽对小鼠血浆乳酸脱氢酶含量影响
乳酸脱氢酶存在于组织细胞中,在血液中含量极低,因此血浆中乳酸脱氢酶的含量可视为组织细胞损伤程度的评价指标。B组小鼠血浆乳酸脱氢酶含量显著低于其他各组。结果见表4。
2.4 大豆肽对小鼠肝糖元、肌乳酸、血浆尿素氮含量影响
实验证明,B组小鼠定时游泳后肝糖元含量最高,单位时间内肌肉乳酸平均生成量最低,血液尿素氮含量也低于其他组。见表5。
注:同列不同小写字母表示差异显著P<0.05,不同大写字母表示差异极显著P<0.01,下表同。*单位时间肌肉乳酸量mg·kg-1·min-1
2.5 大豆肽对小鼠肝脏组织SOD活力影响
如表6所示,力竭游泳后B组小鼠肝脏SOD活力低于A组,但仍高于其他两组,这与该组游泳时间最长有关。定时90 min游泳后B组SOD活力最高。可知小分子大豆肽对提高机体抗氧化酶系相关机能有良好的效果。
2.7 抗疲劳与抗氧化关系
以小鼠游泳时间为横坐标,代表抗氧化作用的肝脏组织SOD酶活力为纵坐标作图,可以得到小鼠力竭游泳时间与SOD酶活力的显著线性关系,如图1所示,相关系数为0.8298。经F检验,显著水平为0.01。
3 讨论
疲劳是机体活动到达一定程度后产生的一种自我保护的生理机制,可以防止威胁生命的过度机能衰竭。疲劳的产生是由于能源物质消耗、代谢产物堆积、内环境稳定性失调、自由基影响等原因[12] 。赵杰修等研究发现[13],运动剧烈时自由基大量生成,会导致生物膜的机能被破坏,当线粒体受到自由基攻击时,ATP的生成量和供给量就会减少,肌肉工作能力下降。因此,氧化应激是运动疲劳产生的重要诱因之一。本实验中采用的两种大豆肽都具有体外清除自由基的能力,并且分子量小的肽B清除羟自由基与DPPH自由基的能力都强于肽A。这说明在体外小分子大豆低聚肽的抗氧化活性更强。体内试验方面,由于SOD广泛存在于机体细胞中,是细胞膜系统结构与功能完整性的保护性酶,可催化生物体内超氧自由基(O-2 ·)产生歧化反应,清除体内产生的过量的超氧阴离子自由基,保护DNA、蛋白质和细胞膜免遭O2-·的破坏,对机体细胞起保护作用[14] 。因此,检测实验动物的肝脏组织中SOD的活力,可以体现出受试物在代谢调控过程中所起到的抗氧化作用。本实验中灌喂大豆肽B的实验组小鼠肝脏中SOD含量显著提高,证实小分子大豆低聚肽B在体内可以起到更好的抗氧化作用,其效果优于分子量稍大的低聚肽A,以及其母体蛋白。
本实验证实,抗氧化能力越强,抗疲劳作用越明显。两者具有显著的相关性。灌喂分子量较小的大豆肽B组小鼠力竭游泳时间最长,A组其次,且都显著长于大豆蛋白组和生理盐水组。可知大豆低聚肽可以有效改善小鼠运动耐力,而小分子大豆低聚肽可以更快地进入到人体吸收体系,参与营养代谢,具有速度快、耗能低、并可以消除以游离氨基酸形式吸收时氨基酸之间的相互竞争的特点。因此宏观上表现为经口给予大豆肽B的实验组小鼠耐力更为持久。从各项生理指标上看,给予大豆肽B的实验小鼠力竭游泳后能源物质消耗最少,肌肉中乳酸的生成量最低,组织损伤程度也最轻,抗疲劳的效果最好;大豆低聚肽A组次之,但也强于大豆蛋白组和生理盐水组。可知小分子大豆肽在清除自由基、抗疲劳、抗氧化方面效果更为显著。
4 结论
大豆生理活性成分 篇4
1. 大豆多肽是指以优质大豆蛋白为主要原料, 经过水
解、分离、精制等过程而获得的低肽混合物, 通常由3～10个氨基酸组成, 相对分子量低于1千道尔顿, 主要分布在300～700道尔顿范围内, 其中还含有少量的游离氨基酸、糖类、无机盐等成分。大豆多肽氨基酸结构几乎与大豆蛋白一样, 必需氨基酸平衡良好, 含量丰富, 具有很高的营养价值。大豆多肽与传统大豆蛋白相比较, 具有易消化吸收、能迅速给机体提供能量、无蛋白变性、无豆腥味、无残渣、分子量小、易溶于水、且在酸性条件下也不产生沉淀、溶液粘性小和受热不凝固等特性, 是一种比较理想的新型产品。具有抗氧化、抗疲劳和调节免疫, 降血压、降胆固醇, 调节脂肪代谢, 抗肥胖, 抗癌和抑制血小板聚集等功能, 在食品工业、医药工业及动物养殖方面具有广阔的开发应用前景。
2. 大豆蛋白主要是指大豆分离蛋白, 它是在低温下将豆
粕除去大豆油和水溶性非蛋白成分后, 得到的一种蛋白质含量不少于90%的混合物, 大豆分离蛋白可分为2S、7S、11S和15S 4种组分, 其中7S组分占35%, 11S组分占52%, 7S组分中的β-大豆伴球蛋白和11S组分中的大豆球蛋白是大豆分离蛋白的主要成分。
3. 大豆低聚糖是从大豆籽粒中提取出可溶性寡糖的合
称, 主要由水苏糖、棉籽糖、蔗糖等组成。成熟后的大豆约含有10%低聚糖, 其中1%是棉籽糖, 4%是水苏糖。具有稳定性高、安全性好、甜度低、热值低等良好的功能特性。大豆低聚糖不能被人体消化吸收, 属于水溶性膳食纤维, 具有膳食纤维的部分生理功能, 如降低血清胆固醇和预防结肠癌等。
4. 大豆磷脂是一种混合磷脂, 它是由卵磷脂、脑磷脂、肌
醇磷脂、磷脂酰丝胺酸磷脂等成分组成, 其中最典型的是前三种。是人体细胞 (细胞膜、核膜、质体膜) 的基本成分, 并对神经、生殖、激素等功能有重要关系, 具有很高营养价值和医用价值。食用卵磷脂能显著降低高血脂、高胆固醇, 从而预防动脉硬化、老年痴呆症的发生。
5. 大豆异黄酮是大豆生长中形成的一类次级代谢产物,
结构与雌激素相似, 因此称为植物雌激素。大豆异黄酮的雌激素作用影响到激素分泌、代谢生物学活性、蛋白质合成、生长因子活性, 是天然的癌症化学预防剂。食用可预防妇女更年期综合征、改善骨质疏松、预防癌症,
6. 大豆皂甙属于三萜类齐墩果酸型皂甙, 是由一列物质
组成的一类混合物。国内外的研究已经证明, 大豆皂甙具有抗脂质氧化、抗自由基、增强免疫调节、抗肿瘤和抗病毒等多种生理功能。目前已经在食品、药品、化妆品上有了初步的应用。
鸡小肠抗菌肽的抗菌活性研究 篇5
1 鸡小肠抗菌肽的提取纯化
1.1 鸡小肠抗菌肽粗制品的提取
鸡的肠黏膜取自本实验室饲养的60日龄海兰蛋鸡。取新鲜小肠, 去脂、浆膜和内容物, 称重, 冷冻剪碎, 组织捣碎机捣碎3次, 2~5min, 再用超声波细胞粉碎机破碎10次, 5s/次。匀浆后, 隔水煮沸15min, 然后冰水浴, 使其迅速冷却, 按1:1 (V/V) 加入5%乙酸, 于4℃条件下搅拌浸提24h。次日, 将混合物于4℃条件下, 8000rpm离心30min, 取上清, 4℃保存。将沉淀物用等体积5%乙酸混合, 再次于4℃条件下搅拌浸提24h, 重复上述离心过程, 取上清, 合并2次上清液, 调整p H为7.0, 再次离心, 弃沉淀, 上清液即为抗菌肽粗制品。
1.2 样品除酸、浓缩
将上步所得的上清液注入透析袋 (MWCO为3500Da) 中, 扎紧袋口, 然后将其放入烧杯, 再向烧杯中倒入去离子水, 去离子水液面要超过透析袋, 4℃下透析除酸, 每12h换水一次, 直至透析袋外去离子水p H值大于6.0, 此时, 将透析袋放入瓷盘中, 撒上PEG-20000, 透析浓缩约3~4h后即可将透析袋取出, 将浓缩的溶液取出低温冻干, 转移至灭菌的青霉素小瓶中, 密封-20℃保存。
2 抗菌活性的检测
2.1 菌种的复苏
将已灭菌的琼脂培养基趁热倒入直径9cm培养皿中, 每个培养皿15.0m L, 凝固后放入37℃恒温培养箱培养12h, 检查有无菌落生成, 剔除被污染、不平整的培养板。将合格的培养板放入0~4℃条件下保存, 在1个月内使用。将试验用菌株接种于普通琼脂培养基, 37℃过夜培养后挑取单个菌落接种于M-H肉汤培养基, 37℃恒温摇床中培养6~8h, 与标准比浊管比较确定菌液浓度, 用空白肉汤或生理盐水调节使其相当于0.5麦氏标准比浊管, 浓度约为1~2×106CFU/m L。
2.2 抗菌活性的检测
在直径为10cm的平皿内倾倒一层营养琼脂培养基以及调整好浓度的处于对数生长期的大肠杆菌O78, 使琼脂内的细菌终浓度为106CFU/m L, 倾注厚度为1.5mm, 待琼脂冷却凝固后, 在琼脂板上打直径为3mm的圆孔, 在孔中加入上述分离过程所得到的不同阶段的抗菌肽, 每孔上样量为15μL, 将平皿倒置于37℃过夜培养, 以确定不同分离阶段样品的抗菌活性。
3 抗菌肽的抗菌活性研究
3.1 鸡小肠抗菌肽对不同细菌的抗菌活性测定
在直径为10cm的平皿内倾倒一层琼脂培养基以及调整好浓度的处于对数生长期的各株细菌, 使琼脂内的细菌终浓度为106CFU/m L, 倾注厚度为1.5mm, 待琼脂冷却凝固后, 在琼脂板上打直径为3mm的圆孔, 在孔中加入鸡小肠抗菌肽 (80μg/m L) , 每孔上样量为15μL, 将平皿倒置于恒温培养箱中37℃培养18h, 测量各组的抑菌圈直径, 用以表示抗菌活性单位。
抗菌活性单位= (抑菌圈直径-3) ×10
3.2 活菌计数法测定鸡小肠抗菌肽的杀菌率
将上述各株细菌培养至对数生长期并调整细菌浓度为2.0×105CFU/m L, 分别吸取每株细菌培养物100μL至无菌Eppendorf管中, 共两管, 一管为试验管, 一管为对照管。试验管中加入抗菌肽, 使其终浓度为80μg/m L, 终体积为200μL;对照管中加入灭菌PBS溶液, 使终体积为200μL。将各管中液体混匀后, 于37℃条件下振荡孵育30min后将各管样品分别作10、102、103、104倍稀释, 每个稀释度分别取10μL滴种于2个营养琼脂平板上, 37℃孵育18h后, 观察并记录每个营养琼脂平板上的菌落数量, 取相同稀释度的2个营养琼脂平板菌落的平均值作为该稀释度样品的菌落数量。根据稀释度和滴种量计算出每管原液中的细菌数量, 按下述公式计算杀菌率。
杀菌率= (对照管细菌数量-试验管细菌数量) /对照管细菌数量×100%
3.3 与其他抗菌药进行抗菌活性比较
采用琼脂孔穴法进行试验, 将抗菌肽与常见抗菌药以大肠杆菌O78为检测菌作抑菌对比试验。
4 实验结果
4.1 鸡小肠抗菌肽对不同细菌的抗菌活性测定结果
在细菌浓度为1×106CFU/m L, 加样量为15μL的条件下, 鸡小肠抗菌肽对大肠杆菌O78、鸡白痢沙门氏菌有较好的杀灭或抑制作用, 对巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O2的作用较弱 (表1) 。
4.2 活菌计数法测定鸡小肠抗菌肽的杀菌率试验结果
在抗菌肽浓度为80μg/m L、细菌浓度为1×105CFU/m L的条件下, 鸡小肠抗菌肽对大肠杆菌O78、鸡白痢沙门氏菌、巴氏杆菌的杀菌率较高;对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O2的杀菌率较低 (表2) 。
4.3 鸡小肠抗菌肽与常见抗菌药抗菌活性比较
采用琼脂孔穴法将抗菌肽与常见4种抗菌药以为检测菌作抑菌对比试验。结果表明, 80μg/m L的抗菌肽对大肠杆菌O78的抗菌活性较1000U/m L青霉素和4%SD-Na强, 略比0.4%链霉素和0.5%四环素差。结果见表3。
本研究试验结果表明, 鸡小肠抗菌肽对兽医临床上常见的一些致病菌有较强的抑制和杀灭作用。与传统的抗生素和化学合成抗菌药物相比, 抗菌肽具有抗菌谱广、抗菌活性强、在动物体内无残留和毒性低等明显的优点。
参考文献
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大豆中的生物活性物质 篇6
大豆的营养成分非常丰富, 其蛋白质含量高达40%, 含油20%, 除此之外还含有大豆异黄酮、大豆低聚糖、大豆皂苷、大豆磷脂等保健功能成份, 另含有钙、磷、铁和维生素E、B1、B2等人体必需的营养物质, 可以增强体质和机体的抗病能力, 具有预防和治疗人类的心脑血管疾病、癌症、糖尿病和延年益寿、降压降脂、益智健脑及减肥的功效, 还有预防老年耳聋等保健作用[1]。
大豆中营养素以外的保健功能成分统称“非营养素植物化学物”。最具代表性的是异黄酮, 它可存在于用水提取的分离大豆蛋白中。因其结构与雌激素相似, 所以也称“植物雌激素”, 有降血脂、抗动脉硬化、抗肿瘤、抗骨质疏松等保健作用。
一、大豆异黄酮
大豆异黄酮是大豆中含有黄铜类化合物的总称。大豆异黄酮是以大豆为原料提取制成的植物性雌激素, 结构与雌激素相似, 具有类雌激素和抗雌激素双重作用[2], 能够减轻女性更年期综合征症状、延迟女性细胞衰老、使皮肤保持弹性、养颜、减少骨丢失, 促进骨生成、降血脂等。临床已经证实大豆异黄酮能够降低血液中的胆固醇, 提高雌激素、防止机体衰老、调整机体内分泌平衡、提高机体的免疫力。大豆异黄酮具有很强的抗氧化作用, 能够有效地消除人体内的过氧化自由基[3]。大豆异黄酮在预防心脑血管疾病、延缓衰老方面有良好的作用, 也是目前用于替代治疗更年期综合症和中老年骨质疏松症所用雌激素的最理想的药物。大豆异黄酮能预防、治疗乳腺癌、乳腺癌、直肠癌、结肠癌等, 具有抗癌功效。另外, 大豆异黄酮不仅可抑制骨骼再吸收, 促进骨骼健康, 而且对防治更年期妇女骨质疏松症具有显著作用, 美国最新研究表明, 在6个月内每天摄56~90毫克异黄酮, 可以使骨密度明显增加, 防止骨质疏松症的发生。
二、大豆皂苷
大豆皂苷 (soyasaponins) , 又称大豆皂甙或皂素, 是由大豆及其它豆类植物种子中提取出来的, 由低聚糖及齐墩果烯三萜缩合形成的一类化合物[4]。豆类植物种子中大豆皂苷的含量一般在0.62%~6.16%之间[5,6]。人们对大豆的认识和利用有很久远的历史, 但对大豆皂苷的研究起步较晚, 直到20世纪90年代中期DDMP大豆皂苷的发现, 才引起人们的重视。大豆皂甙是具有重要研究价值和广泛应用价值的皂甙之一。大豆皂苷是一种具有药疗食养双重效果的天然生物活性物质, 具有对人体有益的多种功能和良好药理作用。除用作药物外, 大豆皂苷还可以作为高级化妆品、食品添加剂和表面活性剂应用于化学工业, 揭示了大豆皂苷广阔的市场开发潜力和社会应用价值[7]。目前已应用于食品、药品、化妆品等领域, 具有广阔的市场前景。
国内外的研究已经证明, 大豆皂苷具有抗脂质氧化、抗自由基、增强免疫调节、抗肿瘤、抗病毒等多种生理功能。大豆皂苷在降低血液中胆固醇、甘油三脂、抗氧化及抑制肿瘤细胞生长、提高机体免疫力、抗病毒 (包括艾滋病毒) 方面的研究都获得可喜的成果[8]。科学家经过深入研究发现, 大豆皂甙具有显著降低血及肝中过氧脂质及心肌中脂褐素的作用。并有抑制脑中单胺氧化酶及皮肤中羟脯氨酸含量的作用 (防止老年斑形成的因素) , 具有延缓细胞衰老过程、延长生命的作用, 大豆皂苷可延长细胞寿命的原因是可使细胞增殖力下降速度减慢。按照自由基学说分析, 大豆皂苷在清除过氧化物方面的作用, 完全可作为是一种抗衰老作用较好的活性因子。大豆皂苷通过增加SOD的含量, 清除自由基, 具有抗氧化和降低过氧化脂质的作用。大豆皂甙可以抑制血栓的形成、血清中脂类的氧化和过氧化脂质生成, 可在肠道中诱使大豆纤维素吸附胆汁酸排出体外, 损失的胆汁酸再经肝脏中的胆固醇转变来相抵, 降低人体血浆中胆固醇的含量, 减少血液凝固。大豆皂甙能促进脂肪代谢, 减少过氧化脂质的产生, 可以预防动脉硬化, 防止血小板凝聚形成血栓等。因此, 经常食用大豆可使患心血管疾病的危险性降低18%~28%。大豆皂苷具有抑制肿瘤细胞生长的作用, 其抑制癌机理可能是:直接对毒细胞作用, 免疫调节作用, 破坏肿瘤细胞膜的结构或抑制DNA的合成。大豆皂苷可抑制血小板减少和凝血酶引起的血栓纤维蛋白形成, 具有抗血栓作用。大豆皂苷还对人类艾滋病病毒的感染有一定的抑制作用, 同时还表现出对被病毒感染的细胞有很强的保护作用。
三、植物固醇
动物性食物中含胆固醇, 植物性食物中含植物固醇。大豆中所含的植物固醇抑制了人体对胆固醇的吸收, 减少了胆血脂、高血压等疾病。人体摄人胆固醇后分解的主要产物是胆汁酸, 有害健康。植物固醇进入人体后, 在肠道同胆固醇竞争中能较多地被肠道吸收, 从而使人体胆固醇降低, 这样不仅可抑制结肠癌, 而且对防治心脏病也有好处。
四、蛋白酶抑制素
豆类、谷类与马铃薯这些农作物中, 含有一种被称为“蛋白酶抑制素”的物质, 如果当饲料被动物生吃, 会影响蛋白质消化。美国纽约大学一位学者通过实验, 发现大豆中的蛋白酶抑制素可以抑制皮肤癌、膀胱癌, 对乳腺癌的抑制效果更明显, 可达50%。另有报告指出, 蛋白酶抑制素对结肠癌、肺癌、胰腺癌、口腔癌亦能发挥抑制功效。大豆中含有一种抑制胰酶的物质, 对糖尿病有治疗作用。
参考文献
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大豆活性肽 篇7
关键词：黑斑蛙,抗菌肽 (AMPs) ,纯化,抑菌活性
抗菌肽 (antimicrobial peptides, AMPs) 是20世纪70年代由瑞典科学家H.G.Boman[1]在果蝇体内发现的。AMPs分子质量比较小, 氨基酸数目少于100个, 是一类具有生物活性的小肽, 是生物体抵御外界入侵的病原体而产生的具有抵御作用的物质[2]。AMPs不但可以杀伤细菌、真菌、肿瘤细胞、病毒和寄生虫, 而且不良反应很小[3], AMPs不会诱发产生抗菌株[4]。在畜禽养殖中, 为了预防和治疗各种动物疾病, 动物饲料中常加有大量抗生素, 各种耐药菌乃至超级菌频繁出现, 这给人类带来了极大的安全隐患, AMPs特有的性质使其可能成为抗菌药物的候选材料。蛙类皮肤分泌物中包含多种具有复杂功能的活性物质, 其中主要成分是活性多肽。研究以黑斑蛙为材料, 通过对其皮肤分泌物进行分离、纯化, 以期获得抑菌活性较强的AMPs, 为抗菌新药的研制与开发提供候选材料。
1 材料
1.1 试验材料
黑斑蛙, 属脊索动物门两栖纲无尾目蛙科蛙属, 捕获于吉林省白山市靖宇县。
金黄色葡萄球菌 (ATCC25923) 、大肠杆菌 (ATCC25922) , 均购于中国国家菌种冷藏中心。
1.2 试剂与仪器
三氟乙酸 (TFA) , Sigma公司生产;乙腈, Merck公司生产;HCCA (α-氰基-4-羟基肉桂酸) , 美国ICN生物医学公司生产;抗菌肽药敏试验用纸片, Oxoid公司生产。
稳压稳流电泳仪 (型号为DYY-10C) , 北京市六一仪器厂生产;高速低温离心机 (型号为5810R) , Eppendorf公司生产;高效液相色谱仪 (型号为LC-10A) , SHIMADZU公司生产;C18分析柱 (型号为ACE 5 C18-300) 、C18半制备柱 (型号为ACE 10C18-300) , ACE公司生产;质谱仪 (型号为MALDL-TOF/TOF) , Bruker公司生产。
1.3 培养基
LB液体培养基:称取LB固体培养基9 g溶于纯化水500 m L中, 煮沸至完全溶解, 分装于试管, 121℃高压灭菌15 min, 备用。
MH固体培养基 (MH琼脂平板) :称取MuellerHinton琼脂 (MHA) 3.8 g溶于纯化水100 m L中, 煮沸至完全溶解, 121℃高压灭菌15 min, 冷却至55℃倾注平板, 备用。
1.4 试剂的配制
饱和HCCA基质:乙腈50μL+0.1%TFA溶液50μL, 加足量HCCA配制成饱和HCCA溶液, 超声处理5 min, 瞬离, 取上清液, 每次必须新鲜配制。
流动相A (0.05%TFA水溶液) :TFA 2 m L+纯化水4 L, 超声脱气15 min。
流动相B (0.05%TFA乙腈溶液) :TFA 1 m L+乙腈2 L, 超声脱气15 min。
2 方法
2.1 黑斑蛙皮肤分泌物的提取、制备
用超纯水将试验蛙清洗干净, 并用酒精棉擦拭, 10 V稳压间断性多点刺激蛙耳后腺及背部5~10 min[5,6], 超纯水清洗蛙背部, 收集分泌物, 12 000 r/rim离心15 min, 取上清液, 低温浓缩至20~30 m L, 用10 ku超滤膜超滤, 收集滤液, -20℃低温保存, 备用。
2.2 试验菌悬液的配制
试验菌为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌, 将试验菌接种于LB液体培养基中, 37℃培养14 h, 用LB液体培养基将试验菌稀释成含菌量为5×106cfu/m L的悬液。
2.3 黑斑蛙皮肤分泌物抑菌活性试验
分别取黑斑蛙皮肤分泌物粗提液100μL, 滴加2个空白药敏片, 晾干, 取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌悬液各100μL分别均匀涂布于2个MH琼脂平板。将制作好的药敏片, 一个粘贴在涂有大肠杆菌的MH琼脂平板上, 另一个黏贴在涂有金黄色葡萄球菌的MH琼脂平板上, 倒置于温箱, 37℃培养16~20 h, 采用卡尺测量抑菌环直径 (mm) 。
2.4 黑斑蛙皮肤分泌物粗提液纯化
利用改良后的高效液相色谱仪 (定量环为100μL) 对黑斑蛙皮肤分泌物粗提液进行纯化。检测波长:215 nm;色谱柱:C18分析柱 (250 mm×4.6 mm, 5 mm) ;柱温:25℃;流动相A:0.05%TFA的水溶液;流动相B:0.05%TFA的乙腈溶液;流速:1 m L/min。梯度分离条件, 见表1。上样量为50μL/次, 手动收集样品。多次上样, 合并相同组分, 浓缩, 以大肠杆菌为试验菌检测其活性, 确定活性峰, 同时进行质谱鉴定以确定其纯度和分子质量。
2.5 纯化产物纯度及分子质量的质谱鉴定
取1μL纯化后有活性样品点靶, 晾干, 取1μL饱和HCCA基质点靶 (与样品点靶的位置相同) , 晾干, 将靶放入质谱仪, 采用Flex Control软件进行数据采集, 采用Flex Analysis软件对数据进行分析, 通过质谱峰确定样品纯度, 并测定分子质量。
3 结果与分析
3.1 抑菌活性试验结果
抑菌试验结果显示, 黑斑蛙皮肤分泌物粗提液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有较强的抑制作用, 抑菌环直径分别为20 mm、24 mm。
3.2 黑斑蛙皮肤分泌物粗提液纯化结果
黑斑蛙皮肤分泌物粗提液经高效液相色谱仪分离, 共得到38个具有抑菌活性的组分 (见图1) , 其中31号峰抑菌效果最强 (抑菌环直径为22 mm) 。通过高效液相色谱仪对31号峰进行进一步分离、纯化, 得到31-2 (AMP1) 1种活性物质。
3.3 AMP1纯度和分子质量的质谱鉴定
黑斑蛙皮肤分泌物粗提液经过纯化, 得到了活性较强的组分31-2 (AMP1) , 通过质谱鉴定, AMP1的相对分子质量为2 878.102, 且纯度较高。
4 讨论
蛙类的生活环境温暖、潮湿, 且含有复杂的微生物, 由于其皮肤湿润、裸露, 比较适合微生物生长, 因此蛙类的皮肤成为微生物生存的极好环境。研究发现, 蛙类抵御外来的微生物入侵是通过其皮肤分泌的抗菌肽来完成的[7,8,9]。试验通过对黑斑蛙皮肤分泌物的粗提物进行分离、纯化, 获得了一种纯度较高且相对分子质量为2 878.102的抗菌肽 (AMP1) 。抑菌试验结果显示, AMP1可以有效抑制大肠杆菌。因此, AMP1有望作为研制及开发抗菌新药的候选材料, 由于天然来源的抗菌肽含量较低, 研究有待对抗菌肽的结构进行进一步分析, 并根据一级结构进行抗菌肽的固相合成, 从而获得大量的抗菌肽。
参考文献
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