高糖环境

高糖环境（精选十篇）

高糖环境 篇1

关键词：Cajal间质细胞,高糖环境,糖尿病膀胱

目前研究认为ICCs可能是膀胱慢波活动的起搏器和传导者。去除了神经和体液等干扰因素后离体膀胱平滑肌条,仍可以发生自发性兴奋和收缩[1]。因此推测:DCP发病是否与膀胱ICCs样细胞的改变有关。离体的ICCs细胞在高糖环境下变化尚未见报道。本研究通过体外培养、荧光负载的方法来观察高糖环境对ICCs细胞形态学变化,以探讨DCP功能改变的细胞生物学基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

1 2只健康豚鼠。激光共聚焦显微镜ME TA 5 1 0,胶原酶V(Sigma公司),Fluo-4 AM,葡萄糖,标准胎牛血清。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠膀胱ICC s细胞的体外培养

脱臼处死豚鼠,无菌手术取出其膀胱,取肌层并剪成碎块,胶原酶V消化后,制成无糖DMEM细胞悬液,接种于培养皿中,37℃培养箱中静置培养24h,弃去皿中培养液,分别加入含5、10、15mmol/L葡萄糖的高糖DMEM细胞培养液,分别培养24、72h。

1.2.2 激光共聚焦显微镜观察

Fluo-4AM工作液加入培养好ICCs细胞培养皿中,入培养箱内孵育40min,除去细胞外荧光染料,室温下避光静置10min。染色好Cajal间质细胞置于激光共聚焦显微镜下观察。每个样本随机选60个ICCs细胞,扫描记录成象。用META自带分析软件测量细胞长度,获得荧光背景下每个细胞长度值。

1.3 统计学处理

荧光强度数据用(x-±s)表示,采用SPSS 16.0软件进行t检验和方差检验。P<0.05为有差异,P<0.01为有显著差异。

2 结果

2.1 ICCs细胞形态学观察

胶原酶消化后的细胞贴壁生长,倒置显微镜下可见典型的ICCs细胞,形态基本一致,以胞体为中心的向相反方向延伸的两个长突起,可有分枝(图1)。

2.2 免疫荧光染色

ICCs细胞Fluo-4 AM荧光染色,共聚焦显微镜下4 00倍视野可见不同葡萄糖浓度、不同培养时间段的ICCs细胞,随葡萄糖浓度的增加和培养时间的延长,ICCs细胞明显出现胞体缩小的现象(图2)。

2.3 ICCs细胞形态结果

参照McClosky[2]的方法,激光共聚焦扫描记录ICCs细胞图片,用META自带分析软件测量细胞长度值,统计学分析。组间比较:24h组和72h组对比,随葡萄糖浓度增高,ICC细胞长度明显缩短(P<0.01)。组内比较:5mmol/L组细胞长度无差异(P>0.05)。10mmol/L组随培养时间延长细胞长度增长(P<0.01)。15mmol/L组随培养时间延长细胞长度缩短(P<0.01)。

注:▲▲P<0.01同一浓度间比较;★★P<0.01同一时间间比较

3 讨论

糖尿病造成多系统病变。DCP是其最常见症状。该病病因复杂,研究发现DCP存在逼尿肌肌细胞[3]病变、神经退化,突触和神经递质改变、多种因子、受体分布和含量异常[4]等,但仍无法合理解释DCP的发病机制。众多研究结果显示ICCs是膀胱慢波活动的起搏器和传导者,为我们研究DCP发病机制提供了新的思路。活体内高糖对豚鼠膀胱ICCs的数量、形态及其超微结构有影响我们前期已经证实,但离体的豚鼠膀胱ICCs在单因素高糖环境中的改变目前尚未见报导。

本研研究通过对离体的豚鼠ICCs细胞培养,观察高糖环境下ICCs细胞形态的变化。结果显示5mmol/L浓度环境下ICCs细胞长度无明显差异。当葡萄糖浓度升高和培养时间延长,ICCs细胞长度明显缩短,只有10mmoL/72h组细胞长度增长。数据分析显示:正常生理浓度的葡萄糖对ICCs并无影响。10mol/L组24h细胞长度明显缩短,72h又增长,可能是高糖刺激ICCs短时间抑制了ICCs的生理功能。随培养时间延长细胞功能恢复胞内超微结构如内质网扩张、线粒体肿胀、胞质内空泡形成等,致使ICCs细胞体积增大,长度增长,造成其生理功能异常改变。15mol/L组胞体明显缩短,并随培养时间延长胞体进一步变小,可能是过高浓度的糖对ICCs直接造成破坏,随培养时间延长过高浓度的糖环境持续破坏,线粒体发生肿胀、空泡样变甚至溶解,内质网扩张,粗面内质网发生脱颗粒,胞质广泛溶解等,导致ICCs细胞进一步缩小缩短致使其结构、功能异常。

本研究结果提示,高糖环境与DCP中ICCs功能改变有重要关系。高浓度长时间的影响,致使ICCs内部结构破坏,进而造成形态改变,导致其作为起搏功能及控制肌细胞运动的结构、功能异常,导致膀胱逼尿肌收缩能力异常,临床出现DCP症状。ICCs形态结构的变化可能是DCP发生的重要病理基础之一。

参考文献

[1]Jiang HH,SongB,Lu GS,et al.Loss of ryanodine receptor calcium release channel expression associated with overactive urinary blad-der smooth muscle contractions in adetrusor instability model[J].BJU Int,2005,96(3):428～433.

[2]McCloskey KD.Characterization of outward currents in intersti-tial cells from the guinea pig bladder[J].J Urol,2005,173(1):296～301.

[3]Andersson KE,Arner A.Urinary bladder contraction and relaxation:physiology and pathophysiology[J].Physiol Rev,2004,84:935～986.

高糖水果养成妊娠高糖 篇2

细细一想，不知不觉我已结婚整整八年。刚结婚那阵子因为积蓄不多，根本没往孩子方面想。直到去年，我们终于搬了新家，现在经济上早已没有了后顾之忧，可忙着生意的我们压根还是没往那方面想。

那晚和丈夫商量后，我们向婆婆立下保证：尽早让她抱上孙辈。

三个月后我如愿怀孕，作为准妈妈的我顿时身价倍增。三亲六故嘘寒问暖，父母公婆送吃送喝，丈夫更乐得成了个不知疲倦的店小二，对我小心呵护。

婆婆每天一睁开眼睛就叨念一日三餐给我吃什么好，而且注意高蛋白、高维生素和钙、铁、锌、硒、镁等微量元素的补充。她买回各种高营养的食材精心烹煮，各类水果也是琳琅满目。她的目的只有一个：让我从早到晚吃个不停。

这般山吃海喝，我的体重却没增加多少，倒是肚子上的风景日渐显露。才6个月就和临盆的孕妇有得一比了。我为自己怀孕却没增胖庆幸不已，也为将来产后依然拥有骄人的曲线而沾沾自喜。

没想到乐极生悲。再一次孕检时医生的话石破天惊：“高龄初孕，胎儿又如此巨大。你很可能患了妊娠糖尿病!”这下可把我吓坏了，一做血糖筛查，果然血糖过高。再做糖耐量试验，诊断更加确定。医生说得控制饮食，少食多餐，不能再吃含糖高的水果。回家一查资料，说这孕期糖尿病可引起胎儿高血糖、继发胎儿高胰岛素血症，导致胎儿过度增长。若母亲血糖控制不理想，会影响到新生儿的肺成熟程度，令他患呼吸窘迫综合征。另外，新生儿突然离开母亲高血糖环境，还容易发生低血糖。

这些可都是危险的信号呀!我、丈夫、婆婆无不为此面容失色，丈夫恍然大悟道：“我说你怎么吃也不见胖呢!”我也明显感觉到整天什么都不干还疲惫得要命，可我又开始对他蛮不讲理：“都怪你，整天让我吃、吃、吃，把肚子吃成个糖罐，这下害着了孩子，看你怎么办!”婆婆赶忙出来调解，一再说是自己的错。

为了“将功补过”，婆婆更忙了，一天给我做5顿饭，还要不时和我商量，既要胃口又要避开高糖，为此，我们制定了这样的计划：碳水化合物总量不超过300克，蛋白质要靠兔肉、鱼肉和鸡鸭肉提供，水果只敢买圣女果、猕猴桃、火龙果和西红柿，饮料只喝不加糖的牛奶、豆浆，盐改成低钠盐，炒菜用油换成橄榄油。

婆婆这场厨房革命在轰轰烈烈地进行着，丈夫一回家除了帮着她精确计算我每天食物的热量，落实好每餐的营养均衡，还要安抚再也不能随心所欲吃戒大开的我。

我们全家竭尽全力，只为了自己肚中的胎儿别成了“糖罐子”。第一次检测，居高不下，二次检测，略有降低……第四次血糖筛查时，医生总算告诉我：血糖正常值。婆婆看着我的肚子，明显消瘦的脸上满是笑容，似乎那消失掉的糖分，全都跑到了她心里，那个甜啊!

总算平平安安熬到了预产期，在医生的建议下我选择了剖腹产，婆婆抱着3.8公斤的大胖儿子给我看，她告诉我：“幸好降糖及时，医生说孩子健康值都在正常范围内。”面黄肌瘦的婆婆和白白胖胖的儿子成了鲜明对比，看着她，我想到她老人家这段日子的辛劳，禁不住热泪盈眶……

专家观点：

一些人误认为多吃、多喝是妊娠后正常的身体需要，却忽略了某些症状耽误病情的诊治。

妊娠糖尿病最明显的症状是“三多一少”：吃多、喝多、尿多，但体重减少，还伴有呕吐，常常会被混同为一般的妊娠反应。另外还有个不常见的症状是疲乏无力，这是因为病人的身体无法充分利用摄入的葡萄糖，而且葡萄糖的分解代谢异常加快，体力无法得到补充。孕妇虽然吃了很多营养丰富的食物，但是由于体内胰岛素缺乏，食物中葡萄糖不能充分利用，使得蛋白质转化为葡萄糖的速度大大加快，造成糖类、蛋白质及脂肪大量消耗，致使患者体质差、体重轻。也有部分患者肾排糖阈值高。即使血糖浓度已经很高，尿中也没有排出葡萄糖。这样的患者因为掩盖了症状而显得更危险。

轻度的糖尿病只要控制好饮食即可，而且妊娠糖尿病患者是禁止使用一切口服降糖药物的，因为药物能通过胎盘对胎儿有致畸作用。治疗和预防妊娠糖尿病需要注意这些方面：

1.首选人胰岛素治疗，这样可避免动物胰岛素结合抗体对胎儿的不良影响。为了确保母子安全，一般孕妇的空腹血糖要控制在5.6mmol/L以下，餐后血糖在6.7mmol/L以下。

2.在饮食方面要避免高糖食品，少食多餐，多食蔬菜、富含纤维素的食品，另外注意维生素、铁、钙补充。水果的补充要在两餐之间，并尽量挑选含糖低的水果，或以蔬菜代替。

高糖环境 篇3

1 资料与方法

1.1 一般资料

CML-BSA购于美国Cell-Biolabs公司(货号STA-314),该产品不能直接使用,需要用PBS将其降低稀释。美国公司Hy Clones出出品的的DMEM/F12;美国公司GIBCO出品的胎牛的血清(Fetal Calf Serum,FBS);由美国赛摩科技公司(Thermo Fisher Scientific)出品的型号HERACELL150i的CO2类细胞的繁殖箱;流式细胞仪:美国BD公司,型号FACSCaliber;酶标仪:美国Bio Tek公司,型号ELx800NB;倒置显微镜:日本OLYMPUS公司,型号IX71-A12FL/PH。

1.2 方法

首先需要对一个健康的成人核细胞进行分解,所用的方法为EPSs分解繁殖不同密度离心法。经过此方法后,将有促进血管内皮发育的因子以及碱性纤维发育因子和10%的幼牛血清放入M199培养基进行放置,3d之后除去没有贴壁的细胞,至于贴壁的细胞,将其继续添加生长银子,每3 d重新放置,等到第八天的时候贴壁细胞被消化吸收殆尽,这时使用激光式共聚焦显微镜额细胞仪进行分析。

1.3 分组

为对比、观察、实验(对比组20μg/m L、观察组60μg/m L、实验组80μg/m L),每组进行实验/d。

1.4 衡量检测和所用方式

首先在EPCs96孔式的能力检测板上添加100微毫升两千个没有血清的细胞培养基,在经过1 d的同步之后,对他们进行不同的处理,每个小孔添加10μL升LCCK-8液体继续繁殖2 h,酶标仪450 nm来检测对光感应程度,最后根据小孔和对比孔的对光感应程度分析出EPCs的增加数量。每一个小组必须做五次反复尝试。然后EPCs死亡能力相关测验将处理后的细胞加入195μLAnnexin V-FITC结合液(1X)重悬细胞。加入5μL Annexin V-FITC,轻轻混匀。室温避光孵育10 min,1000 g离心5 min,弃上清,加入190μLAn-nexin V-FITC组合水微微重新悬挂细胞。加入10μm L碘化丙啶染色液体,慢慢地把他们摇匀,在低温中清晰尽量躲开阳光。随即进行流式细胞仪的检查。每组反复重新做五次。接下来是EPCs发育成功的骨头基因探测,该探测采用SYBRGreen I嵌合荧光法在illumna公司的E-co TM-Real.Time PCR仪上进行Real.Time PCR实验,所使用的试剂盒为SYBRPremix Ex Ta q II(Tli RNase H-Plus,Ta Ka Racode:DRR820),反应条件为预见变化95度30 s、PCR对应40个循环95度5 s60度30 s、溶解曲线式的解析和总结。最后是用统计学软件进行解析,计量单位用%表示,均数和标准差相等,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度高糖干预液内皮祖细胞迁移、增殖及凋亡情况比较

与对照组比较,观察组及实验组可明显抑制内皮祖细胞的增殖、迁移,促进其凋亡,其中实验组最为显著,差异具有统计学意义(P<0.05),详见表1。

2.2 各组内皮祖细胞成骨分化基因表达情况比较

与对照组比较,观察组及实验组可明显增加内皮祖细胞成骨分化相关基因BMP2、ALP、RUNX2、OCN的表达,其中实验组最为显著,差异有统计学意义(P<0.05),详见表2。

3 讨论

血糖升高是糖尿病病理的重要标志,患者血糖控制良好与否直接关系到血管并发症的发病率;糖尿病患者一般情况下有血管并发症状,血管中最重要的内皮祖细胞大量减少,并且遭到毁灭性的损害,这意味着,糖尿病后期的血管病变症状与内阻皮细胞的总量联系密切,并且内皮祖细胞最大的敌人就是高血糖。除此之外,高血糖对细胞的破坏已经得到相关研究确定,很多种特殊情况都可以使得细胞被破坏。比如线粒体的激活,破坏相关基因的失衡,细胞的发育异变等等。从这次的实验可以看出,糖分过多可以回使得

EPCs大量死亡。因而,研究高糖环境对内皮祖细胞的迁移、增殖及凋亡等一些生物的特点的变化和相应的改变有很重要的作用。

综上所述,高糖环境能明显抑制内皮祖细胞的迁移及增殖能力,加速其凋亡,可明显促进内皮祖细胞成骨分化;对深入研究糖尿病血管钙化机制有积极作用,为临床干预治疗提供新相关依据。

参考文献

[1]高冬,焦雨欢,武一曼,等.血府逐瘀汤诱导内皮祖细胞参与缺血区血管新生的实验研究[J].中国中西医结合杂志,2012,32(2):224-228.

[2]钟钧琳,彭隆,罗艳婷,等.瑞舒伐他汀抑制C-反应蛋白诱导的晚期内皮祖细胞炎症因子的表达[J].中国病理生理杂志,2013,29(4):597-602.

[3]秦臻,黄水清.当归补血汤对动脉粥样硬化兔内皮祖细胞及血清VEGF、SDF-1的影响[J].中国病理生理杂志,2012,28(2):211-215.

[4]卓裕丰,许顶立,程颖,等.不同剂量阿托伐他汀对扩张型心肌病患者外周血内皮微粒及内皮祖细胞的影响比较[J].实用医学杂志,2013,29(11):1759-1761.

[5]王娟,周兵,王欣欣,等.Fe3 O4纳米粒子与慢病毒载体共同感染内皮祖细胞的促血管新生和MRI示踪的应用[J].高等学校化学学报,2016,37(6):1148-1153.

[6]林海泓,施海明,肖萍,等.普伐他汀对人骨髓间充质干细胞增殖分化及分泌功能的影响[J].中国组织工程研究与临床康复.2008(34)

[7]徐展望,张建新,谭国庆,等.中药骨碎补提取液对兔骨髓基质细胞体外成骨分化的影响[J].中医正骨,2006(6):69-70.

[8]刘大庆,杨印祥,高艳红,等.胎儿骨髓间充质干细胞中SSEA-4阳性表达细胞的分离和检测[J].科学通报.2006(11):59.

[9]马慧萍,贾正平,张汝学,等.淫羊藿总黄酮含药血清促进骨髓间充质干细胞增殖与成骨性分化[J].中国骨质疏松杂志.2004(4):102-104.

嗜高糖食物会“慢性中毒” 篇4

当然，在现实生活中，爱吃甜食的人有很多，而且也是人的一种本能，这一点从新生儿身上就可以得到验证，因为许多孩子从会吃东西开始就喜欢吃甜的东西。有研究证明，新生儿对甜味的接受要比对苦、酸和咸味快。只不过，对于喜欢甜食的人而言，在过去并没有多少甜蜜的东西可吃，只是近年来生活条件提高了，不仅有各种各样的糖果可以吃，而且其他食品和饮料中含的糖分也多了。由此，人们的味觉被娇惯得越来越刁，喜欢嗜食含糖食物的人们，对于不甜的食品不屑一顾，为迎合此类人的口味，食品中加入各种甜味添加剂的越来越多，甚至连本来酸涩的水果，也被改良的越来越甜了。这种状况，虽然满足了喜欢吃甜食的人们的需求，但可怕的是，贪食高糖食物的人却不知，甜蜜就像毒品，它不仅会让人上瘾，而且还会使人中毒，它是一种慢性毒药，慢慢地侵害着人们的身体健康。文前所举那位因患胃癌而去世的老人，就是一位长期嗜食高糖食物的受害者。

之所以说甜蜜的食物是一种慢性毒药，对此有关专家通过研究早有结论。世界卫生组织在调查了23个国家人口的各种死因后发现，在人类的日常生活习惯中，嗜糖比嗜烟更可怕，各国人口死亡率竟与该国糖的消耗量成正比。长期嗜高糖食物的人，平均寿命要比正常食糖者缩短20年左右。不仅如此，长期嗜食高糖食物还会腐蚀牙齿、影响视力，导致胃溃疡和尿路结石，使中老年人的骨质疏松更加严重。而其最大的危害则是，致使贪食吃甜食者诱发脉粥样硬化、冠心病及各种癌症，对此，嗜甜者更应格外注意，学会掌握生活中的医学知识。

高糖环境 篇5

1 材料和方法

1.1 材料

人RPE细胞购于北京协和医院细胞库,经过形态学及细胞染色法鉴定。DMEM、0.25%胰蛋白酶、D-葡萄糖、青霉素链霉素(Sigma公司),胎牛血清(杭州四季青)、人重组脂联素(PEPRO TECH公司)、SOD、MDA试剂盒(南京建成生物公司)、Trizol试剂(Initrogen life technologies 公司)、SYRB Green Mastar(Roche 公司)、AnnexinV-FITC/PI(南京凯基公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验模型制作

RPE细胞在37℃、5%CO2条件下以10%胎牛血清低糖(5.5 mmol/L)DMEM培养基培养于25 cm2培养瓶中。实验时,以无血清低糖DMEM饥饿培养细胞12 h,待细胞生长至85%融合状态时,按以下方法分组:①正常对照组(N组):D-葡萄糖浓度5.5 mmol/L;②高糖组(H组):D-葡萄糖浓度30 mmol/L;③高糖+脂联素组(A组):D-葡萄糖浓度30 mmol/L+脂联素浓度2.5 mg/L。分别干预24、48、72 h。

1.2.2 上清液中丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)检测

分别用硫代巴比妥酸法检测MDA的含量,用黄嘌呤氧化酶法检测SOD的含量和活性。将细胞分为上述3组,每组设置24 h、48 h、72 h三个时间点,取每组每个时间点培养瓶中的上清液,密封后于-20℃保存。按MDA、SOD试剂盒说明检测各管吸光度,根据MDA、SOD含量公式计算其含量。

1.2.3 实时荧光定量PCR法

应用引物设计软件Primer5.0设计引物,并由康成生物有限公司合成。内参β-actin:上游:agagctacgagctgcctgac 下游:agcactgtgttggcgtacag Ho-1:上游:tccgatgggtccttacactc 下游:taaggaagccagccaagaga, P66Shc:上游:cagctcttggcattttcctc下游:cagtctcgcggtaagagacc。在上述各组各时间点弃上清的培养瓶中加入Trizol试剂裂解细胞后,按照说明书操作提取总RNA,反转录为cDNA,采用荧光定量PCR仪并使用SYBR Green法实时荧光定量PCR检测。反应条件:荧光定量PCR反应体系为20 μl,在PCR扩增仪上按照94℃预变性10 min,活化Tag酶;94℃ 15s,60℃ 60s,45个循环结束。荧光定量PCR读取CT值,采用2-ΔΔCt的方法计算Ho-1、p66Shc mRNA表达情况的相对定量结果,表示实验组测定基因X的表达相对与正常对照组样本X表达的变化倍数。

1.2.4 流式细胞仪检测RPE细胞凋亡率

采用AnnexinV-FITC/PI双标记染色法检测RPE细胞凋亡率。按上述分组将细胞培养于6孔板中,待测细胞浓度为0.5×108～1×109。PBS洗2次。用0.25%胰蛋白酶消化,收集细胞,加入500 μl Binding Buffer于细胞悬浮液中,加入5ulAnnexinV-FITC混匀后,加入5 μl PI,混匀,室温避光孵育15 min,用流式细胞仪检测各组RPE细胞的凋亡率。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件,各实验组数据均以$\overline{x}\pm s$表示,组间比较采用方差分析,P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞上清液中MDA、SOD含量,反应RPE细胞氧化应激水平

与正常对照组相比高糖组MDA含量显著上升,SOD含量显著下降(P<0.05),与高糖组相比,脂联素组MDA含量显著下降,SOD含量显著上升(P<0.05),并且呈时间依赖性(表1、表2)。

2.2 Ho-1和衔接蛋白p66Shc mRNA表达

与正常对照组相比,高糖组Ho-1 mRNA表达增高;脂联素组较高糖组表达亦增高(P<0.05)。与正常对照组相比,高糖组p66Shc mRNA表达增高;脂联素组较高糖组表达降低(P<0.05)(表3、表4),呈时间依赖性。

注:*与正常对照组相比,P<0.05;#与高糖组相比,P<0.05

注:*与正常对照组相比,P<0.05;#与高糖组相比,P<0.05

注:*与正常对照组相比,P<0.05;#与高糖组相比,P<0.05

注:*与正常对照组相比,P<0.05;#与高糖组相比,P<0.05

注: *与正常对照组相比,P<0.05;#与高糖组相比,P<0.05

2.3 流式细胞术RPE细胞凋亡

高糖组细胞凋亡率较正常对照组明显增加,而脂联素组细胞凋亡率较高糖组显著下降(P<0.05)(表5)。

3 讨论

糖尿病是一种以血糖代谢紊乱为特点的常见慢性疾病,DR是其最常见的慢性并发症之一,临床表现为视力下降、眼底出血、出现新生血管,最终引起继发性视网膜脱落而失明。目前认为高血糖介导的氧化应激是糖尿病并发症发生发展的关键因素。氧化应激目前认为是指细胞ROS生成和防止ROS损伤的抗氧化能力之间失衡的状态。Brownlee[1]提出,线粒体ROS生成过多是糖尿病并发症的共同机制,并认为多元醇通路激活、蛋白非酶糖化产物晚期糖基化产物的形成、蛋白激酶C激活、己糖胺途径激活都是由这一共同机制所激发。

p66Shc是调控氧化应激和生命周期的关键蛋白,是近年来研究细胞氧化应激的主要蛋白之一。其通过在线粒体内氧化细胞色素C产生大量ROS导致细胞氧化损伤[2]。P66Shc表达的调控主要取决于转录水平的调控,即它的启动子发生了表观遗传学的修饰,导致基因转录的起始位点发生改变[3]。Nemoto等[4,5]认为p66Shc还可以通过抑制叉头蛋白转录因子,从而抑制抗氧化酶的表达,加重氧化应激导致的细胞凋亡。越来越多的研究证实它与糖尿病产生的氧化应激及其造成的血管损伤密切相关。Wu等[6]研究发现,抑制p66Shc的表达可以减轻H2O2造成的视网膜细胞的氧化损伤,眼球内注射p66Shc siRNA可以延缓氧化应激导致的视网膜功能下降,因此推测p66Shc在糖尿病视网膜细胞氧化损伤过程中起重要作用。本实验检测p66Shc的mRNA水平反应RPE细胞氧化应激水平。

Ho-1产生当量摩尔的一氧化碳、铁、胆绿素,是一种重要的抗氧化剂。关美萍[7]研究发现:初诊T2DM合并慢性并发症患者的血糖水平、血清MDA、外周血单核细胞ROS产量及Ho-1表达均显著高于无并发症的患者,Ho-1表达与氧化应激指标呈显著正相关,但机体自身抗氧化防御功能的代偿增高尚不足以对抗高糖所致氧化应激。Cukiernik[8]研究报道:STZ诱发的DM大鼠发病6周后,对照组视网膜上有Ho-1和Ho-2表达,DM组视网膜上Ho-1表达显著增高,Ho-2也有不同程度的提高,通过定位分析发现,Ho-1在小鼠视网膜神经节细胞层、内丛状层、毛细血管内皮细胞层等处均有表达,Ho-2也有类似的分布特征。Ho-1在DR初期表达的增加被认为是高血糖时机体对氧化损伤的一种保护性反应。本实验检测Ho-1 mRNA水平反应RPE细胞抗氧化应激水平。

脂联素是脂肪细胞分泌的一种脂肪因子,具有调节葡萄糖运转、改善胰岛素敏感性,抗炎,抗氧化应激、抗动脉粥样硬化等作用。近期研究表明脂联素的降低在DM的发病机制中起重要作用,脂联素可能参与了DR的发生和发展[9,10]。Prior等[11]的研究发现GG型患者血浆脂联素水平高,对应的总抗氧化水平高,血浆OX-LDL水平低;CC/CG型患者血浆脂联素水平低,对应的总抗氧化水平低,血浆OX-LDL水平高,说明脂联素通过抗氧化应激发挥保护作用。糖尿病患者血清脂联素水平明显低于健康对照组,糖尿病合并视网膜病变组患者血清脂联素浓度低于单纯糖尿病患者,血清脂联素的浓度与DR病变程度呈负相关[12]。糖尿病视网膜病变患者血清脂联素水平降低,存在氧化应激,氧化应激与血清脂联素水平降低有关[13]。王文峰等[14]研究发现脂联素在早期T2DM大鼠视网膜中的含量较正常组显著减少。提高脂联素在视网膜局部的含量可减轻视网膜炎症反应,延缓DR发生。以上研究分析了脂联素在氧化应激及凋亡方面的作用机制,诠释了脂联素在DR发生过程中扮演的重要角色,并可能对 DR 有治疗作用。

本实验通过检测脂联素对高糖环境下RPE细胞不同时间段氧化应激水平和凋亡,来探讨脂联素对高糖环境下RPE细胞氧化应激和凋亡的影响。本实验选用正常生理浓度(2.5 μg/ml)的球形脂联素,与Rengasamy Palanivel等[15]研究一致。实验发现高糖环境下的RPE细胞随着时间梯度p66Shc表达较正常组增加,加入脂联素组较高糖组降低。MDA是氧自由基和脂质反应的终产物,可间接反应氧自由基的多少。MDA的变化与p66Shc RNA变化正相关。提示高糖环境下RPE细胞氧化应激状态较正常组高,脂联素组较高糖组低。由此可以推测脂联素可能通过降低p66Shc mRNA表达,进而影响蛋白表达,使磷酸化的p66Shc表达减少,影响ROS含量,降低氧化应激水平。但是本实验局限性未能做全各个水平。本实验发现高糖环境下RPE细胞随时间梯度Ho-1 mRNA较正常组表达升高,是因为Ho-1是应激性蛋白,但是结合MDA水平说明机体自身抗氧化防御功能的代偿增高尚不足以对抗高糖所致氧化应激,加入脂联素后Ho-1 mRNA较高糖组表达升高,结合MDA水平氧化应激水平降低。说明脂联素通过增加Ho-1 mRNA的含量使RPE细胞抗氧化应激水平升高,减少细胞凋亡。

综上所述,脂联素通过影响p66Shc、Ho-1表达影响减少氧化应激反应,减少RPE细胞凋亡,提高存活率。因此在积极控制血糖的同时,脂联素可能成为治疗糖尿病并发症的新途径。

摘要：目的 通过高糖环境下培养人RPE细胞建立RPE细胞的氧化应激模型,观察脂联素对RPE细胞各氧化应激指标及凋亡的影响,从而揭示脂联素对RPE细胞可能的保护机制。方法 将体外培养的人RPE细胞分为3组:正常对照组、高糖组、高糖+脂联素组,分别干预24、48、72h。在倒置显微镜下观察RPE细胞形态变化,采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量,用黄嘌呤氧化酶法检测SOD含量和活性,用荧光定量RT-PCR法测定p66Shc、Ho-1在各个时间点上的表达,通过流式细胞术检测RPE细胞的凋亡率。结果 与正常对照组相比,高糖组MDA含量显著上升,SOD含量显著下降(P<0.05),与高糖组相比,脂联素组MDA含量显著下降,SOD含量显著上升(P<0.05),并且呈时间依赖性。与正常对照组相比,高糖组Ho-1mRNA表达增高;脂联素组较高糖组表达亦增高(P<0.05)。与正常对照组相比,高糖组p66ShcmRNA表达增高;脂联素组较高糖组表达降低(P<0.05),呈时间依赖性。流式细胞术RPE细胞凋亡高糖组细胞凋亡率较正常对照组明显增加,而脂联素组细胞凋亡率较高糖组显著下降。结论 脂联素可通过减少p66Shc表达,从而减少线粒体ROS产生、增加Ho-1表达,增加抗氧化能力,减少氧化应激反应,减少细胞凋亡,对糖尿病RPE细胞起保护作用。

高糖环境 篇6

1 材料与方法

1.1 材料 人视网膜色素上皮(hRPE)细胞株购于中南大学湘雅细胞中心;DMEM培养基,胰蛋白酶(美国Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青);D-葡萄糖,D-甘露醇、MTT(美国sigma公司);脂联素Human gAcrp30(Peprotech);VEGF ELISA试剂盒(RapidBio Lab,California,USA),PEDF ELISA试剂盒(chemicon公司)。

1.2 hRPE细胞的培养与处理 hRPE细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中,置于含5%CO2、37℃恒温培养箱中孵育,每3~4 d用0.25%胰酶消化传代,取生长良好的第3代hRPE细胞,以2×104个/ml接种于96孔培养板中,每孔体积为200 μl, 待细胞贴壁后,改用无血清DMEM培养液继续培养24 h,弃上清液,用于下一步实验。

1.3 实验分组 分为三组 ①对照组:5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养液;②高糖组:33 mmol/L葡萄糖的DMEM培养液;③高糖+不同浓度脂联素组:33 mmol/L葡萄糖+脂联素终浓度分别为2.5,5,10和20 μg/ml。每组包括6复孔,48 h后收集培养上清液,-20℃保存。

1.4 VEGF和PEDF 的检测 采用VEGF、PEDF酶联免疫试剂盒,按说明书操作,将48 h收集到的上清液在常温下溶解后,各取100 μl分别加入已包被好VEGF、PEDF抗体的ELISA 96孔板中, ELISA间接夹心法检测反应终止后,用酶联免疫检测仪测定450nm处的A值,根据VEGF、PEDF标准品A值曲线,换算所测上清液中VEGF、PEDF的含量。

1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件,数据以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示,不同组间总体均数的比较用单因素方差分析,组内两两比较采用SNK-q检验,P<0.05有统计学意义。

2 结果

与正常对照组相比,高糖组VEGF水平明显升高,PEDF水平明显下降,差异具有统计学意义(P<0.01)。随着脂联素浓度的升高,VEGF含量逐渐减少(F=64.67,P<0.01)同时PEDF含量逐渐增多(F=52.22,P<0.01)。两两比较发现,2.5 μg/ml脂联素组与高糖组相比,对VEGF及PEDF水平影响不大,无统计学意义(P>0.05)。脂联素浓度达到5~20 μg/ml时与高糖组相比,结果相反,VEGF水平显著降低、PEDF水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.01),且呈浓度依赖性见表1。

注:与正常对照组相比,*P<0.01;与高糖组相比,#P<0.01

3 讨论

DR是糖尿病最常见的慢性并发症之一,它严重损害视力。目前DR的发病机制尚不十分明确,DR后期出现新生血管进入增殖性糖尿病视网膜病变(PDR),新生血管的发生和发展是临床面临的难题,后期可引起视网膜脱离。病理研究表明RPE细胞使DR的晚期发生病理变化,促进了眼内的新生血管形成。RPE细胞位于视网膜感觉层和脉络膜之间,构成视网膜外屏障,在视网膜的代谢中起到重要的作用。RPE转运大量葡萄糖为视网膜神经感觉层提供能量,更易受血糖波动的影响发生病理生理的改变。

DR新生血管形成过程中各种促血管新生因子及抑制血管新生因子起了重要作用, 其中RPE细胞分泌的VEGF和PEDF分别作为主要的促血管新生因子及抑制血管新生因子成为研究的热点。实验证明,VEGF和PEDF之间的平衡对调节新生血管的形成起关键作用[2] 。VEGF和PEDF作为两种具有拮抗作用的生长因子,互相作用,维持一定的平衡,从而介导了视网膜某些正常生理功能。DR时两者平衡性被打破,VEGF表达增多,PEDF表达减少,二者呈负相关,促进了病理性新生血管的形成。

脂联素亦称为Acrp30,是脂肪细胞分泌的一种血浆激素蛋白,生理浓度为2~30 μg/ml,具有多种重要的生理功能:调节葡萄糖代谢,影响胰岛素敏感性、抗炎、抗动脉粥样硬化、通过抑制细胞生长因子作用抑制病理性新生血管形成。目前国内外对VEGF与PEDF的平衡在DR中作用的研究较多, 而脂联素对高糖环境下hRPE细胞的干预作用研究很少。本实验模拟高糖环境,应用含33 mmol/L 葡萄糖的DMEM培养基处理hRPE细胞48 h。高糖组中VEGF的含量较正常对照组明显升高,而PEDF的含量较正常对照组明显降低,VEGF与PEDF的平衡被破坏,与文献报道一致[3] 。

在高糖环境中加入不同浓度脂联素后,通过对RPE细胞分泌VEGF及PEDF的作用,研究脂联素对DR的病理性新生血管形成的作用。发现在高糖作用48 h,VEDF增多同时PEDF减少,而加入5~20 μg/ml脂联素后VEDF明显减少同时PEDF明显增多。生理浓度脂联素呈剂量依赖性使VEDF增多同时使PEDF减少,脂联素通过调整高糖环境下VEGF与PEDF的浓度使VEGF与PEDF的平衡性恢复正常,从而可能延缓DR病理性新生血管形成。有研究结果显示,脂联素对小血管的生成具有显著作用, 通过抑制细胞生长因子作用抑制视网膜病理性新生血管形成[4] 。重组脂联素注射后可降低脉络膜组织VEGF等血管生成因子的表达,从而抑制新生血管的形成[5] ;重组脂联素通过CAMP或PKA信号途径能够有效的抑制VEGF诱导的血管内皮细胞的迁徙,但不增加内皮细胞凋亡,在糖尿病血管生成过程中起调节作用[6] 。研究表明末端糖基化产物(AGE)可促进培养的微血管内皮细胞AGE受体RAGE的表达,增加NF-KB及AP-1的转录活性,并可上调VEGFmRNA及angiopioetin-2的水平。脂联素可能通过抑制AGE-RAGE信号途径,降低VEGF的表达。PEDF主要由RPE细胞分泌,与VEGF者呈负相关;同时PEDF是一种细胞外神经营养因子,对RPE细胞的生长、分化及成熟发挥作用,所以与高糖组相比,脂联素干预下RPE细胞分泌的PEDF明显增加。其具体机制有待于进一步研究。

总之,高糖可以导致RPE细胞损伤分泌VEGF增多,分泌PEDF减少,参与DR的发生发展,生理浓度(5~20)μg/ml的脂联素对高糖导致的RPE细胞损伤具有保护作用。表明脂联素可以纠正高糖诱导的hRPE细胞功能紊乱,通过调节VEGF与PEDF的平衡来抑制DR病理性新生血管的形成,为临床应用脂联素治疗DR提供理论依据。

摘要：目的研究脂联素对高糖环境下人视网膜色素上皮(hRPE)细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)和色素上皮衍生因子(PEDF)的影响。方法hRPE细胞分为3组:①正常对照组;②高糖组;③高糖+不同浓度的脂联素组(2.5,5,10,20μg/ml),分别在48h后,用ELISA法测定上清液中VEGF及PEDF的含量。结果与正常对照组相比,高糖组VEGF水平明显升高,PEDF水平明显下降,加入2.5μg/ml脂联素对VEGF及PEDF水平影响不大,脂联素浓度达到5～20μg/ml时和高糖组相比,结果相反,VEGF水平显著降低、PEDF水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论5～20μg/ml脂联素可以使hRPE细胞VEGF分泌减少和PEDF分泌增多。提示脂联素可以纠正高糖诱导的hRPE细胞功能紊乱,通过调节VEGF与PEDF的平衡来抑制糖尿病视网膜病变(DR)中病理性新生血管的形成。

关键词：高糖,视网膜色素上皮细胞,脂联素,血管内皮生长因子,色素上皮衍生因子

参考文献

[1]张合珍,李兴.肿瘤坏死因子α、脂联素与糖尿病视网膜病变的关系.中华眼底病杂志,2007,23(4),293-294.

[2]ZhangSX,WangJJ,Gao G,etal.Pigmentepithelium-derived factor downregulates vascular endothelial growth factor(VEGF)expres-sion and inhibition VEGF-VEGF recaptor-2binding in diabetic retinopathy.ol Endocrinol,2006,37(1):1-12.

[3]姚毅,关明,赵秀琴,等.低氧和高浓度葡萄糖对体外培养人视网膜色素上皮衍生因子表达的影响中华医学杂志,2003,83(22):1989-1992.

[4]Ebba B,Niina V,Renhai C,et al.Adiponectin-induced antiagio-genesis and antitumor activity involve caspase-mediated endothelial cell apoptosis.PNAS,2004,101(8):2476-2481.

[5]Bora PS,Kaliappan S,LyzogubovVV,etal.Expression ofadiponec-tin in choroidal tissue and inhibition oflaserinduced choroidal neo-vascularization by adiponectin.FEBS Lett,2007,581(10):1977-1982.

高糖环境 篇7

1 材料与方法

1.1 细胞及仪器

1.1.1 细胞选择

选取美国某公司的人体心肌细胞株为本次研究材料,选用心肌细胞株均经过相关形态学鉴定,鉴定结果均符合相关纳入标准[3,4]。

1.1.2 试剂选择

选取从美国某公司购置人脂联素,以及上海哈灵生物科技有限公司销售酶联免疫吸附试剂为本次研究的应用试剂。

1.1.3 仪器

选择实时荧光定量仪(上海杰一生物技术有限公司)、离心机(江苏赛德力制药机械制造有限公司)、超净工作台(苏州麦克仕德净化设备有限公司)为本次研究的仪器。

1.2 方法

1.2.1 培养细胞

将心肌细胞株放置在10%牛血清溶液中,并在其中加入葡萄糖5.5 mmol/L,青霉素100U/mL。并将其放置在温度为37℃的5%二氧化碳孵箱中进行孵育,待细胞生长到85%,并完成融合,则使用0.25%的胰蛋白酶进行消化。

1.2.2 分组

将生长完好的心肌细胞分为3组;对照组、观察A组及观察B组。对照组给予D-葡萄糖5.5mmol/L进行培养,观察A组给予3 0.0mmol/L的D-葡萄糖进行培养,观察B组在观察A组的基础上增加2.5μg/mL脂联素进行培养。对3组细胞进行20h、40h及70h的培养。

1.2.3 实时荧光定量测定方法

Smad-3引物:上游:5’-TGCTGGTGGTACTGGATAGCAG-3’,下游:5’-GCTGCAAGGTGAAGATGTCA-3’;Smad-7引物:上游:5’-CCAACTGCAGACTGTCCAGA-3’;下游:5’-CAGGCTCCAGAAGAAGTTGG-3’。

1.2.4 酶联免疫吸附试剂测定方法

取细胞培养上清液组织,严格按照酶联免疫吸附试剂测定使用,根据测定结果绘制标准品曲线,并根据曲线反应计算检测样本的TGF-β1、骨形成蛋白(BMP-7)值。

1.3 统计学处理

采用SPSS13.0统计软件,计量资料用均数±标准差(±s)表示,采用方差检验,计数资料采用χ2检验。P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 3组实时荧光定量法测定结果

观察A组在培养20h、40h及70h的Smad-3含量均高于对照组,且Smad-7含量低于对照组,经统计学分析,组间差异具有统计学意义(P<0.05);观察B组的Smad-7的含量高于观察A组,Smad-3含量低于观察A组经统计学分析,组间差异具有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

2.2 3组实施酶联免疫吸附法测定结果

观察A组的TGF-β1含量均高于对照组,且40h、70h观测点时BMP-7的含量低于对照组(P<0.05);观察B组BMP-7含量高于观察A组,且TGF-β1含量低于观察A组(P<0.05)。详见表2。

3 讨论

脂联素是指脂肪细胞分泌出的蛋白质,也可称为内源性生物活性多肽物质。从某种意义上来说,脂联素是胰岛素增敏激素的一种,可改善机体的胰岛素抗药性和动脉硬化症状。有研究显示[5,6],脂联素在人体细胞培养和检测中得到应用,通过对脂联素水平进行检测,可对2型糖尿病和冠心病的疾病发展趋势进行反映和预测,相关研究中对此观点也有所提及[7],并证实了T-钙黏蛋白对表达1型糖尿病病灶周围心肌组织具有极其重要的作用,且其表达量与血清脂联素的水平成正比关系。在临床试验中主要用于抗糖尿病和动脉粥样硬化等疾病中,且取得了较好的应用价值。通过对相关医学文献和医学报道的查阅和研究[8],发现TGF-β1作为二聚体性多肽生长因子中重要的一员,具有调节生长因子的作用,其三种异构体即:TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3在哺乳类动物中应用较为广泛,其中,应用最为广泛的就是TGF-β1。TGF-β1是机体内促纤维化最强的生长因子,可预测细胞的生长趋势和分化方式,并对细胞外基质沉淀具有潜在促进作用。

已有研究结果对糖尿病心肌病的病理特征进行证实[9],并明确提出心肌间物质纤维化是糖尿病心肌病的主要病理特征。TGF-β1/Smads传导通路具有一定的活化性,这种活化性也是导致心肌细胞出现纤维化的重要影响因素。相关医学文献研究结果表明[10],Smad-7的表达水平降低将会促进TGF-β通路的活化,并通过此种作用机制对TGF-β1受体的抑制性进行激活,逆转受体的激活性能。借助此种研究方式,最终得出的结论为Smad-7与TGF-β1通路的作用点均位于TGF-β1受体上,但造成此种现象的根本原因并不是TGF-β1的含量。还有学者对Smad-7的高表达情况进行研究,并以研究结果为依据,解释Smad-7高表达对抑制TGF-β1纤维化的内在联系。Smad-7的作用点在于其本身的复合物,因此,不会因Smad-7高表达导致TGF-β1的含量受到一定影响。

BMP-7是近年来医学实验中逐渐引用并发展起来的纤维化负性调节因子,作为TGF-β中的重要分支,BMP-7可借助对Smad-2和Smad-3的抑制作用,发挥其对TGF-β1通路的活化作用,同时,Smad-7对TGF-β1通路具有一定的抑制性,因此,可同时起到促纤维化作用。总而言之,Smad-3可对TGF-β1通路起到促活化作用,同时,Smad-7还可同时起到抑制通路活化、促纤维化的作用,可最大限度地实现通路活化抑制和抗纤维化增强。但从一方面来看,Smad-7并不是通过对TGF-β1通路的抑制以起到影响TGF-β1含量的作用,并且,TGF-β1含量与TGF-β1通路的抑制作用亦不是完全由BMP-7的抑制作用而实现的。TGF-β1/Smads通路的激活作用与细胞外基质的关系较大,可有效抑制细胞基质的缓解性,促进心肌间的纤维化作用。而高糖对TGF-β1/Smads通路的激活具有一定的促进性作用,可缓解促纤维化过程。

本研究结果显示,观察A组Smad-3、TGF-β1含量均高于对照组,且Smad-7及BMP-7含量低于对照组(P<0.05);观察B组Smad-7及BMP-7的含量高于观察A组,Smad-3、TGF-β1含量低于观察A组(P<0.05)。本结果与相关研究结果具有一致性[11,12],可以看出,脂联素和高糖干预的检测效果更具有临床研究价值,可为临床医疗工作的进一步发展奠定基础。

脂联素对高糖环境下心肌细胞中TGF-β1/Smads传导通路具有一定的影响作用,且可对心肌细胞形成一定的保护作用,TGF-β1/Smads的活化可能是导致此种现象的主要机制。通过脂联素对抗纤维因子的抑制性作用,可控制心肌细胞的纤维化作用,提高糖尿病心肌病病人的生存质量。

摘要：目的 探析脂联素对高糖环境下心肌细胞中转化生长因子β1(TGF-β1)/Smads传导通路的影响及作用机制。方法 将培养的心肌细胞分为对照组、观察A组(高糖培养)、观察B组(脂联素干预),对3组心肌细胞的Smad-3、Smad-7表达情况、细胞上清液转化生长因子β1以及骨形成蛋白(BMP-7)的含量进行回顾性评价。结果 观察A组Smad-3、TGF-β1含量均高于对照组,且Smad-7及BMP-7的含量低于观察A组(P<0.05);观察B组的Smad-7及BMP-7的含量高于观察A组,Smad-3、TGF-β1含量低于观察A组(P<0.05)。结论 脂联素对高糖环境下心肌细胞中TGF-β1/Smads传导通路具有一定的影响作用,TGF-β1/Smads活化可能是导致此种现象的主要机制。

高糖环境 篇8

1 材料与方法

1.1 细胞培养和分组

人骨髓间充质干细胞 (MSC) 购自广州赛业生物有限公司 (广州, 中国) , 用含10%胎牛血清 (FBS, Gbico, USA) , 1μmo L青霉素 (Sigma, USA) , 100 u/m L链霉素 (Sigma) 的α-MEM基本培养基培养。细胞没有衰老和分化现象, 第3~4代进行实验。含300mo L葡萄糖 (Sigma) 的α-MEM基本培养基为高糖MSC培养基, 含25 mo L葡萄糖的α-MEM基本培养基为低糖MSC培养基, 分别在低糖或高糖MSC培养基中培养MSC[A组 (转染pc DNA3.1-Mn SOD) 、B组 (转染pc DNA3.1空质粒) 、C组 (空白组) ]。

1.2 Mn SOD基因转染MSC

大肠杆菌E.coli pc DNA3.1由本实验室提供;Mn SOD基因引物由大连宝生物有限公司设计 (大连, 中国) ;pc DNA3.1-Mn SOD由本实验室构建保存并提取质粒DNA。按4×104个/m L MSC添加500μL1%DNA-LipofectamineTM2000比例, 37℃、5%二氧化碳 (CO2) 孵育48 h, 0.1 mo L PBS清洗, 提取蛋白质, Western blotting检测Mn SOD基因的表达。

1.3 GSHPX、SOD检测

正常或高糖环境下, 收集5×104的各组MSC, 0.01 mol/L PBS清洗2遍;冰浴, 用3 m L 50 mmo L Tris缓冲液 (p H=7.5, 含1 mmo L EDTA, 10 mmo L DTT, 0.2%Triton X-100) 裂解细胞;4℃, 12 000×g, 上清液使用英国Randox公司生产的超氧化物歧化酶 (SOD) 和谷胱甘肽还原氧化酶 (GSHPX) 试剂盒测定SOD和GSHPX活性。

1.4 MTT细胞增殖

2×104MSC接种在96孔板, 按MSC分组情况, 培养48h, 每孔加入20μL 5 mg/m L MTT (Sigma) , 孵育4 h, 更换150μL DMSO (Sigma) , 使用Emax酶标仪 (Molecular Devices) , 490 nm波长测定每个样品吸光度[7]。

1.5 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行实验数据分析, 结果用均数±标准差 (±s) 表示, 每组实验至少重复3次, 并进行t检验和方差分析, 检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 各组MSC表达Mn SOD的差异

转染48 h后, 收集Mn SOD-MSC实验组、空白质粒组及MSC对照组的细胞总蛋白, Western blotting检测各组蛋白表达, 结果表明Mn SOD-MSC实验组有外源性Mn SOD表达, 而空白质粒组、MSC对照组均无表达, 见图1。

2.2 各组MSC增殖情况

MTT细胞增殖实验表明, 与正常培养条件相比, 高糖条件下, MSC增殖能力明显降低, 差异具有统计学意义 (P<0.01) ;而在高糖条件下, 与空白质粒组相比, Mn SOD-MSC实验组MSC增殖的OD值明显增高, 差异具有统计学意义 (P<0.01) , 见图2。

2.3 各组MSC氧化应激酶类的变化

与正常培养条件相比, 高糖条件下, MSC的SOD含量较低, 差异有统计学意义 (P<0.01) ;而在高糖条件下, 与空白质粒组相比, Mn SOD-MSC实验组GSHPX含量明显增高, 差异有统计学意义 (P<0.01) , 同时也发现, Mn SOD-MSC实验组SOD含量比空白质粒组增高, 差异有统计学意义 (P<0.01) , 见图3。

1) 高糖条件下MSC组与正常条件下MSC组OD值比较, P<0.01;2) 高糖条件下Mn SOD-MSC组与空白质粒-MSC组OD值比较, P<0.01

3 讨论

高血糖通过线粒体氧化磷酸化比较、NADPH氧化酶、脂质过氧化物酶和糖的自身氧化等多种途径产生自由基[8]。糖尿病并发症的多元醇途径、糖基化终末产物途径、蛋白激酶C途径和氨基己糖途径, 均是高糖条件下线粒体呼吸链中氧自由基生成过多导致的结果。在正常机体内, 氧化-抗氧化体系处于平衡, 正常体内生成的活性氧基团 (ROS) 很快就被抗氧化防御体系清除, 不至于在体内蓄积。而糖尿病患者机体内抗氧化酶活性降低, 浓度下降, 体内抗氧化系统遭到破坏, 机体清除ROS的能力受损[9]。与机体其他组织细胞相比[10], 胰岛细胞内抗氧化物水平较低, 因此, 也更容易受到ROS的损害, 产生氧化应激, 从而使葡萄糖刺激的胰岛素分泌减少, 加重糖尿病。

众所周知, ROS的产生是高血糖介导的内皮细胞损伤的重要介质。有研究表明[11], STZ诱导的1型糖尿病小鼠的糖尿病足皮肤Mn SOD蛋白和抗氧化酶的活性均显著降低, 局部注射Mn SOD基因显著促进糖尿病伤口愈合。MSC具有正常的抗氧化酶, 如Mn SOD, 说明MSC具有抗氧化应激的作用[12]。目前研究表明, 糖尿病MSC细胞活性降低, 其分泌的Mn SOD也逐渐降低, 严重影响MSC的生物作用, 导致归巢到糖尿病足区域的MSC日益减少, 从皮肤再生角度来看, 皮肤再生过程类似胚胎时皮肤的生长, 需要干细胞或祖细胞的参与, 但是糖尿病足皮肤抗氧化性降低, 大量自由基堆积, 导致皮肤毛囊细胞再生、血管新生或成纤维细胞存活均受到影响。体外实验也证实, 高血糖抑制血管内皮细胞在体外的血管生成, 并显示可能是由于线粒体ROS过度积累造成的。糖尿病患者的Mn SOD的表达和酶活性均显著降低。最近研究表明[13], Mn SOD基因转染自身骨髓干细胞可以显著重建辐射性食管炎内膜, 也提示该基因修饰MSC可以归巢到糖尿病伤口, 有加速伤口愈合的可能性[14]。

本研究分析结果表明, 高糖条件下, MSC的MnSOD表达降低, 与其他学者的研究一致, 但是转染Mn SOD后的MSC高表达Mn SOD, 同时MSC细胞增殖能力明显增强, 抗高糖效果非常明显, 说明Mn SOD的增高, 明显对抗高糖引起的ROS高表达, 而自由基含量的降低, 又促使GSHPX、SOD总量升高, 逆转糖尿病自由基增多的局面, 改善血管内皮细胞活性, 促进血管通畅或再生, 进而呈级联放大性对抗自由基效果越发明显, 本结果提示, Mn SOD转染MSC明显促进了MSC功能的恢复, 如果应用到糖尿病足皮肤, 可以对抗自由基, 发挥MSC多分化特性, 将加速伤口愈合[15], 后续研究将会用Mn SOD转染的MSC应用于体内糖尿病动物足实验模型, 观察Mn SOD-MSC对糖尿病足愈合的作用和机制, 为MSC临床应用提供基础研究的根据。

摘要：目的 研究锰超氧化物歧化酶 (MnSOD) 转染间充质干细胞 (MSC) 发挥抗自由基的细胞保护作用, 并分析其机制。方法 利用pcDNA3.1-MnSOD质粒转染MSC作为MnSOD-MSC实验组, 仅转染pcDNA3.1为空白质粒组, 未转染者为MSC对照组, 在正常或高糖 (含250 mmoL葡萄糖) 培养条件下, MTT法观察MSC增殖情况, 使用试剂盒检测各组MSC中谷胱甘肽氧化还原酶 (GSHPX) 、超氧化物歧化酶 (SOD) 表达情况。结果高糖环境下, 与MSC对照组相比, MnSOD-MSC实验组MSC增殖OD值增高 (P<0.01) ;与空白质粒组GSHPX相比, MnSOD-MSC实验组GSHPX含量明显增高 (P<0.01) , MnSOD-MSC实验组SOD含量在高糖条件下比空白质粒组增高 (P<0.01) 。结论 MnSOD转染MSC可以促进抗氧化酶类表达增高, 对抗自由基, 对MSC具有保护作用。

75亩甜菜高糖栽培示范田总结 篇9

关键词：甜菜；栽培

1 选用新的品种

有农科院国家甜菜试验提供的JZ98-1（新甜14号），种植面积75亩。

2 示范田地点与时间

（1）按示范田要求，选择土壤肥力中上等地块，五年以内未种植甜菜，前茬为棉花、玉米、番茄。（2）地点：园户村十三户村五组，执行农户为陈建清、杨延贵。（3）执行时间：2009年4月—10月底。

3 种子处理、土壤处理及做好播种前的准备工作

（1）采用精选药剂处理后的包衣种子。（2） 开春3月25日前后，土壤和墒时进行耙麼保墒，同时每亩施磷酸二铵20公斤作底肥，耙麼两遍。使土壤达到“齐、平、松、碎、净、墒”六字标准，使其处于待播状态。（3）土壤药剂处理：用72%都尔乳油，每亩160g加水30公斤均匀喷洒并与耙麼同时进行。

4 适时早播，合理密植

4.1 播种时间 2009年3月30日—4月8日。

4.2 播种方式 小四轮铺膜点播，行距55+45×25cm，每亩保苗5000株左右，实收3750株/亩。

5 加强田间管理，是获得高产的重要措施

5.1 早间苗、定苗 4月24日出苗，5月5日定苗，间苗、定苗一次完成，可节省成本开支。

5.2 勤中耕、早中耕 中耕三遍，第一遍在4月19日；第二遍5月10日；第三遍5月14日。

5.3 早防虫 出苗后于4月23日用2.5%功夫，每亩50克，加水15公斤对全田进行喷施。

5.4 合理灌溉 全生育期浇水5次，第一次6月18日；第二次7月1日；第三次7月23日；第四次8月20日；第五次9月20日。采挖前15天浇一次起挖水，于10月25日采挖。

5.5 极早预防病害 特别是白粉病的为害，严重影响块根生长和糖分的积累，于7月20日白粉病初发期，用20%三唑酮乳油50g/亩+25%多菌灵50g/亩+水15公斤/亩进行叶面喷施，可有效防治白粉病、褐斑病等多种病害。

6 合理追施肥料，提高含糖量

采挖前10月10日浇采挖水，于10月25日采挖，经测定含糖量为17.2度，未有控制浇水的甜菜地块含糖贝塔213含糖为15度，相差2.2度。

产量对比：示范田75亩实收345000公斤，每亩平均4600公斤，其它田块为4200公斤/亩，相差400公斤/亩左右，经济收益每亩可多收108元（每公斤甜菜0.27元）。

甜菜高产高糖综合栽培技术探讨 篇10

关键词：甜菜,高产高糖,栽培技术

随着我国社会生产力水平的提高, 经济得到快速发展, 人们的生活水准有了翻天覆地的转变, 对于物质生活的要求也越来越高, 甜菜作为重要的产糖作物, 其单位生产资料下的产量、单位数量的含糖量, 都直接影响着我国糖类生产企业的实际效益, 关系着广大人民群众的实际生活。探讨甜菜高产高糖综合栽培技术, 提高我国甜菜种植水平, 是提高我国糖业发展的重要途径。

1 优化播前准备

甜菜种植对土地有一定的要求, 不论是轮作还是种植用地规划, 都需要在播种之前做好充分准备, 为高产高糖的甜菜种植做好准备。

甜菜种植讲究合理轮作, 且需要深松改土, 这是甜菜种植高产高糖的重要基础。合理论作是提高甜菜成果品质的重要措施[1]。在土地轮作上, 尽量采用不同品种分区轮换, 例如甜菜和小麦、番茄等多区轮作, 为种植高产高糖甜菜创造有利条件。

依据种植地区的气候气象和土体条件, 依据所选种植品种, 在种植株行距和穴距上要科学规划, 力争建立甜菜高产高糖的群体。

2 优化播种过程

我国甜菜种植多选用外来品种, 但在播种之前就要了解到, 品种适应地的气候条件与本地的自然差异, 不论是甜菜的生长期还是积糖期, 都会有较大差距, 因此, 在栽培过程中, 应当尽量调整甜菜的生长期和积糖期, 以提高不同品种与种植地区的适应性, 尤其是对于品质较高的品种, 积极调整, 为甜菜的高产高糖创造良好条件。以KWS0143品种为例。该品种每667m2的播种量需在300g左右, 要在条田点完种的3d之后, 进行人工扫膜, 提升种子盖土均匀性的同时, 增加作物的采光面, 提高种子的出苗质量。此外, 在反浆前后, 要对缺墒地段进行及时有效的镇压接墒。

3 加强甜菜种植的田间管理

对于甜菜种植来讲, 要做到早中耕、勤中耕和深中耕。一般来说, 整个甜菜生育期的中耕次数要保持在3~4次左右。中耕应当选在种子反浆之后, 此时, 耕作机车能够顺利进入田间, 是首次中耕的前提。第2次中耕应当选在首次中耕的10~12d之后, 中耕深度为30cm。第3次与第2次的间隔时间为15~18d, 中耕的深度也是30cm。第4次中耕需要结合土地揭膜来进行。

中耕不仅要时间科学, 过程也要精细。中耕过程中, 尽量避免掀起地膜, 避免埋没种苗, 避免铲倒种苗。中耕要从头到尾面面俱到, 中耕后要达到地垄够宽、低头平整、中耕深度够深、体质松散的标准。

及时除草是种苗健康生长的前提。当种苗生长出一对真叶的时候, 就要开始定苗;长出2对真叶的时候结束定苗, 并及时祛除病苗和弱苗, 要避免留下双株苗。在定苗的同时, 要及时做好田间的杂草清除工作, 确保出生种苗能在更加清新的自然环境中生长。此外, 在定苗的过程中, 也要对所留苗进行及时的培土操作, 改善所留苗的生长土壤环境。

在中耕过程中, 要及时追施苗肥, 为种苗的生长补充养分。具体来说, 在进行第2次中耕的时候, 每667m2土地要追施尿素8~10kg和三料磷肥5~8kg, 另外要增施硫酸钾肥2~3kg。

揭膜要在预定期限之内结束, 在揭膜操作之后, 要进行中耕和锄草操作, 此时的中耕深度要保持在20~25cm之间, 实际操作以不损伤甜菜种苗的主根为准。

开沟工作要适时进行, 一般在中耕、揭膜和锄草工作结束后就可开始, 在规定时间之内结束, 要做到深开沟、高培土, 具体要求大沟口宽为40cm左右, 沟深为25cm左右, 同样以不伤害到甜菜为准, 尽可能的开出大深沟并兼向甜菜培土。

以KWS0143品种为例, 因为其块根较为粗大, 吸水性较强, 施肥性也不弱, 因此, 适当晚一些开始浇灌, 更有利于其根系的生长下扎, 是高产高糖甜菜形成的重要保障。而在施肥方面, 一定要科学合理, 氮肥、磷肥和钾肥等依据土地实情和甜菜的生长状况来定夺。

病虫害的防治以化学方法为主。在播种之前进行种子消毒, 使用药剂搅拌种子。通常情况下, 使用种子用量的1%的多菌灵、敌克松来搅拌种子;在甜菜生长期, 结合防虫计划提前进行病虫害的预防, 使用甲托和多菌灵、以1:800的剂量来进行喷药防护。

虫害的主要对象为象甲、地老虎和红蜘蛛等, 要依据案件调查实况选择科学剂量的乐果、敌杀死乳油以及杀灭菊酯进行药剂喷杀;对于红蜘蛛的病害, 也要使用手抹、药剂喷杀或补灌水等方式进行有效防治。

4 结语

甜菜是重要的经济作物, 是我国尤其是北方地区农村农民增收的重要来源, 探讨高产高糖的甜菜综合栽培技术, 从选地、播种和田间维护等各个方面入手, 用科学的农业生产方式来进行甜菜种植生产, 是提高甜菜产量和含糖率的重要手段。

参考文献