犊牛大肠杆菌药敏试验

2024-05-03

犊牛大肠杆菌药敏试验（精选十篇）

犊牛大肠杆菌药敏试验篇1

(1) 供试菌株的分离鉴定与培养。从丰宁县乐拓牧业公司羊场因腹泻死亡的羔羊中取1只进行试验研究, 取肝脏做细菌分离, 接种于普通营养琼脂平板, 37℃培养24小时, 挑取表面光滑、边缘整齐、灰白色、半透明的小菌落, 接种于麦康凯琼脂平板, 37℃培养24小时, 再从麦康凯琼脂平板上挑取孤立的红色菌落。将分离的单个菌落涂片革兰氏染色、镜检, 观察到两端钝圆的小杆菌, 单个或成对排列, 革兰氏染色阴性。将分离的菌株进行生化试验。结果见表1。

由表1可知, 所分离的5个菌株均为羊的大肠杆菌。将分离鉴定后确定为大肠杆菌的菌落无菌接种在营养肉汤中37℃培养24小时, 用灭菌生理盐水稀释10倍, 备用。

(2) 药敏纸片。用6mm打孔器打出滤纸小圆片, 160℃干热灭菌1小时后按常规方法分别制备青霉素、链霉素、庆大霉素、环丙沙星和氟本尼考等药敏纸片, 备用。

(3) 中药。从本地医药公司采购白头翁、苍术、白术、黄芪、茯苓、泽泻、大青叶、苦参、青皮和陈皮。

2 试验方法

(1) 制备药液。将上述中药加适量水煎煮30分钟后过滤, 水煎2次, 将2次过滤的药液合并浓缩成含生药1g/m L的药液备用。

(2) 中药药敏试验。采用平皿打洞法将供试药液均匀涂布在琼脂培养基表面, 用直径6mm打孔器在琼脂平板上打孔 (适当封闭孔底) , 将制备好的中药供试液分别加入各孔内 (满而不溢) , 贴上标记, 置37℃温箱培养24小时。

(3) 抗菌药敏试验。将供试菌液均匀涂布于琼脂培养基表面贴上标记, 以无菌方法贴上各种药敏实验纸, 置37℃恒温箱培养24小时。

(4) 抑菌结果的判定。抑菌圈大于15mm以上为高度敏感, 10~15mm为中度敏感, 小于10mm为低度敏感, 没有抑菌圈为无效。

3 试验结果

犊牛大肠杆菌药敏试验篇2

山东省胶东地区鸡场疑似大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

试验对20春季山东省胶东地区疑似大肠杆菌病例进行病原分离鉴定及耐药性检测,共分离到大肠杆菌40株,鉴定出血清型35株,以O78、O5 、O24、O111四个血清型为主,约占定型菌株的80%.其中O78血清型占定型菌株的`43% ,为优势血清型.细菌的耐药性检测结果显示,分离菌株呈现出不同程度的耐药性,对阿米卡星的高敏株为78%,头孢噻肟钠为70%,大观霉素、庆大霉素、硫酸安普霉素、硫酸粘菌素敏感菌株为60%～64%,乳酸环丙沙星、氟苯尼考,敏感菌株比例为50%～55%;硫酸新霉素、诺氟沙星、达氟沙星、盐酸沙拉沙星、恩诺沙星、盐酸多西环素的高敏菌株比例低于43%;林可霉素、金霉素、泰妙菌素、泰乐菌素、氨苄西林、阿莫西林对所分离的菌株几乎无抑制作用.结果表明,山东省胶东地区鸡致病性大肠杆菌血清型复杂,耐药性广泛.

作者：邹玲 Zou Ling 作者单位：青岛农业大学动物科技学院,山东青岛,266109刊名：浙江畜牧兽医英文刊名：ZHEJIANG JOURNAL ANIMAL SCIENCE AND VETERINARY MEDICINE年，卷(期)：200934(2)分类号：S858.31关键词：大肠杆菌血清型药敏试验鸡

禽源大肠杆菌的分离及药敏试验篇3

【关键词】禽源大肠杆菌；细菌分离；药敏试验；抗菌药物

禽源大肠杆菌病是指部分或全部由致病性大肠杆菌感染引起的家禽局部或全身性感染的传染病，临床表现为多种病型：胚胎死亡、脐炎、败血症、肉芽肿、卵黄性腹膜炎、全眼球炎、气囊病、禽蜂窝组织炎、肿头综合症、腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎等。家禽的大肠杆菌病一年四季均可发生，各种年龄和性别都易感。在规模养殖的条件下，该病是影响养禽业发展的重要疾病之一，造成的损失不可低估。大肠杆菌血清型复杂多样，为该病的防治带来了一定的困难。

1材料与方法

1.1 材料

高压灭菌器、显微镜、冰箱、电泳箱、微量糖发酵管、大肠杆菌O型抗血清（O1、O2、O78、O119）、麦康凯琼脂培养基、营养琼脂培养基、营养肉汤，试验动物：5日龄健康雏鸡。药敏试验纸片：氨苄青霉素（AMP）、阿莫西林（AMX）、头孢吡肟（CPI）、头孢曲松（CRO）、头孢克洛（CEC）、链霉素（STR）、四环素（TET）、利福平（RIF）、红霉素（ERY）、诺氟沙星（NOR）、复方新诺明（SXT）、头孢噻肟（CTX）、新霉素（NEO）

1.2 样品采集

从常州、南京及附近雞场采集临诊上具有典型大肠杆菌病病变的病死鸡作为病料，采集十二指肠、肺以及肝脏作为分离细菌的材料。

1.3 方法

1.3.1 细菌分离培养

用无菌操作的方法将样品分别接种于普通营养琼脂、麦康凯琼脂及营养肉汤培养基上，置于37℃环境中培养24h后观察结果。挑取疑似大肠杆菌的菌落连续纯培养，获得单个菌落细菌。

1.3.2 显微镜检查

置于37℃环境中培养24h后，挑取表面光滑、边缘整齐、微隆起的红色单个菌落，经革兰氏染色，在光学显微镜下观察细菌的形态和染色特征。

1.3.3 生化鉴定

按常规方法对所有分离取得的分离菌培养物进行葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖的发酵试验，同时进行吲哚、MR、V-P、枸橼酸盐利用试验和硫化氢试验。糖发酵试验在24h时观察结果，其他生化试验在48～72h内观察结果。

1.3.4 血清型鉴定

用大肠杆菌单因子血清对大肠杆菌分离株进行O血清型鉴定。将被检菌株培养物水浴1h，破环其K抗原，在载玻片上经凝集试验检测分离菌株的血清型。

1.3.5 PCR检测

针对fyu A保守序列设计引物P1：5’-GCGACGGGAAGC GATGACTTA-3’，引物P2：5’-CGCAGTAGGCACGATGTTGTA-3’（引物由上海生工生物工程公司合成）。PCR反应体系：PCR Mix 12.5?L，P1、P2各1?L，模板（ RT反应液） 2?L，加蒸馏水至总25?L。反应条件为95℃预变性3min；95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸10min。取PCR反应产物5?L，用1.2%琼脂糖凝胶电泳（1%Goldview）20min，置于紫外灯下观察并拍照。

1.3.6 动物接种实验

将分离菌接种于营养肉汤，置于37℃恒温培养箱中培养24h。取健康雏鸡10只，随机分为A、B两组，每组5只，A组腹腔接种营养肉汤菌液，每只0.2ml；B组腹腔接种等量的灭菌生理盐水作对照，隔离饲养观察。

1.3.7 药敏试验

采用K-B纸片法对13种药物进行耐药性检测：用灭菌接种方法环取大肠杆菌纯培养物，置于5ml灭菌生理盐水中，用灭菌玻璃棒充分混匀，将此液滴于普通琼脂培养基表面，用灭菌玻璃棒涂布使其覆盖整个培养基表面，置于37℃环境中培养8～10min后取出。用灭菌尖头镊子取13种抗菌药纸片分别对称贴到上述的营养琼脂培养基上，每个平皿贴4种纸片，为使抗菌药纸片与培养基表面密贴，可用镊子轻轻按一下纸片，在药敏纸片上做上标记或在平板底上用笔写上其药名或贴上标签，将贴纸片的平板底部朝下，置于37℃温箱中培养18～24h。

2 结果

2.1 细菌的分离和培养

通过以上实验共分离到细菌40株，所有细菌在麦康凯平板上均生长为表面光滑、边缘整齐、圆形、隆起的红色菌落；普通琼脂平板上形成表面光滑、湿润、半透明、灰白色、圆形微凸起、中等大小的菌落。

2.2 显微镜检查

被检菌为两端钝圆、散布或成对、偶尔有2～3个连在一起的革兰氏阴性短杆菌。大多数菌株以周生鞭毛运动，除少数菌株外，通常无可见荚膜。革兰氏染色镜检均为形态均一、中等大小、散在排列的红色杆菌，菌体两端较深染，初步确定为大肠杆菌。

2.3 生化实验结果（见表1）

注：+代表阳性（产酸），代表阴性（不产酸）。

2.4 血清型鉴定结果

经平板凝集试验，确定了40株大肠杆菌的血清型：优势血清型为078，占62.5%；其他血清型以0119居多，这两种血清型共占92.5%。（见表2）

2.5 PCR结果

以细菌DNA为模板进行PCR扩增试验，结果扩增出与目的片段大小一致的DNA片段（见图1）。

1：Marker DL2000；

2～12：随机从40株大肠杆菌中抽取11株；

13：阳性对照。

2.6 动物实验结果

雏鸡实验结果：接种1周后，A组雏鸡全部死亡，剖检死亡雏鸡，大部分表现为败血症，少数表现为纤维素性心包炎、心包积液、肝表面被一层薄膜状纤维素性渗出物覆盖、气囊炎。用死鸡的心血、肝、脾接种于普通营养琼脂培养基上，置于37℃环境中培养24h后，有菌落生长，革兰氏染色及生化化鉴定表明此菌与接种菌为同种细菌；B组雏鸡则正常。动物试验结果表明：此次分离出的细菌对雏鸡均有较强的致病性。

2.7 药敏试验结果

40株致病性大肠杆菌的13种抗生素药敏试验结果表明：所有细菌对RIF的耐药率为100%。40株大肠杆菌全部对1种或多种抗生素有耐药性，均敏感，其中只有1株对1种药物耐受。（见表3）

3 讨论

本试验通过对被检病料进行病原分离与纯化、病菌形态学检查、培养特性、生化试验以及血清学试验，鉴定为大肠杆菌。

用标准O抗原单因子血清进行玻片凝集试验，结果表明分离出的致病性大肠杆菌的血清型为O78。致病性大肠杆菌血清型多，有研究报道称在禽类大肠杆菌病中，常见的病原性血清型包括O1、O35、O8 ，但在本次实验中除出现了1株（占4. 2% ）O1外，并未见其他血清型，与国内已有的报道存在差异，这说明我国禽类大肠杆菌血清型分布存在着地区性和多样性，这给本病的预防带来很多困难。

药敏试验结果表明：不论是同一地区的同一血清型或不同血清型，还是不同地区的同一血清型或不同血清型，它们对同一种药物的敏感性可能相同，也可能不同，其原因可能与用药历史不同或细菌在传代过程中质粒丢失或增加使其耐药性降低或提高有关。

大肠杆菌很容易产生耐药性，由染色体或质粒介导，它可以通过菌毛将耐药质粒传递给其他大肠杆菌。近几年来，由于各种抗菌药物的广泛应用，耐药菌株迅速增加。尤其是在一些养鸡场内，为了控制大肠杆菌和某些细菌感染，养殖者在饲料中添加或在治疗中盲目使用抗菌药物，致使大肠杆菌耐药菌株越来越多、耐药性也越来越严重。由于不同菌株对药物的敏感性存在差异，建议在使用药物治疗病原菌时要加强对病原菌的耐药性检测，篩选出对病原菌敏感的药物，按临床指导合理用药，以减缓细菌耐药性的产生。

4 结语

致病性大肠杆菌是重要的人畜共患病病原，盲目地使用抗生素类药物，会使抗生素所带来的负面影响越来越重。抗生素残留问题的加剧，会直接影响禽类产品的质量，威胁人类健康。动物的大肠杆菌病常常通过食物链的途径对人类健康造成严重危害，因此，加强对病原菌耐药性的检测，定期总结经验，观察耐药趋势，对指导临床合理用药和减缓细菌耐药性产生具有重要意义。为此，我们应做到以下几点：

（1）以全价优质饲料喂养，经常喂给多种维生素和电解质，增强机体抵抗力；

（2）定期清扫粪便，对地面、工具、水槽、料槽进行清洗和消毒，保持饲料和饮水的清洁卫生；

鸭大肠杆菌药敏试验研究篇4

1 材料与方法

1.1 试验材料

细菌分离培养基为LM营养肉汤、LM营养琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基,均由新疆畜牧科学院兽医研究所传染病实验室制备提供。病鸭取自新疆米泉某鸭场,该鸭场自2008年12月从四川引进多批肉雏鸭,每批2 000羽左右,每批鸭群饲养到10日龄时开始发病,发病率高达35%,死亡率3%~10%,病情持续10~30 d。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌的分离培养。

无菌采集病死鸭的脑、肝脏、肺脏等病料,首先接种于LM营养肉汤,置于37℃恒温培养24h,再转接到LM营养琼脂培养基上培养。

1.2.2 涂片镜检。

从LM营养肉汤培养物或LM营养琼脂培养基上挑取的单个菌落,涂片,自然干燥,并通过火焰固定后进行革兰氏染色镜检。

1.2.3 分离菌株鉴别。

将分离的细菌在无菌条件下接种于麦康凯琼脂培养基上,37℃培养24 h,观察细菌的形态、颜色。

1.2.4 药敏试验。

将分离细菌在无菌条件下涂布在普通肝汤营养琼脂平板上,然后用无菌眼科镊子将已制备好的抗菌药物药敏纸片按编号放置其上,置37℃培养24 h,观察各药物的敏感性,测量抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 细菌分离及培养特性

LM营养肉汤接种病料37℃培养24h后,LM营养肉汤由清亮变为均匀浑浊,管底有少量沉淀。将液体培养物转接到LM营养琼脂培养基上培养24 h后形成边缘整齐、光滑、湿润、半透明、圆形凸起、灰白色菌落,直径1~3 mm。

2.2 涂片镜检结果

将细菌培养物涂片,经革兰氏染色后,油镜观察可见粉红色、无芽孢、两端钝圆的长、短杆菌,单个或成双,不形成长链,为革兰氏阴性杆菌。

2.3 鉴别培养

分离菌接种在麦康凯琼脂上形成粉红色菌落,表明分离细菌为埃希氏大肠杆菌,而非沙门氏菌。

2.4 药敏结果

对分离细菌用18种常用抗菌药物进行药敏试验,结果乳酸诺氟沙星、头孢唑啉、链霉素、恩诺沙星、硫酸新霉素的抑菌圈直径分别为21、20、12、11、8 mm,其他抗菌药物无抑菌圈,包括阿莫西林、氧氟沙星、环丙沙星、庆大霉素、阿米卡星、多粘菌素、土霉素、卡那霉素、林可霉素、头孢氨苄、头孢哌酮钠、头孢拉定及氟苯尼考等。

3 结论与讨论

该试验对多批发病鸭群进行临床症状观察和病理剖检,发现病鸭具有比较明显的大肠杆菌病特征,即心包、肝表面和气囊壁附有黄白色纤维素性渗出物,肝脏肿大,腹膜有渗出性炎症,腹水为淡黄色胶冻样。细菌分离、涂片镜检和鉴别培养证实,导致鸭群发病和死亡的病原为埃希氏大肠杆菌。该病原的血清型还需开展进一步研究鉴定工作[3]。

鸭大肠杆菌病是一种常见多发病,随着规模化养鸭的发展和区域集约化养殖的扩大,且环境污染加重,该病危害日益严重,往往一个场发病,可导致集养区成片流行[4,5]。鸭大肠杆菌为条件致病菌,当环境条件改变或机体抵抗力下降时,易暴发本病。因此,预防该病的关键是改善饲养管理条件,提高雏鸭机体抵抗力。此外,为降低大肠杆菌病的发病率及防治成本,开展相关应急灭活菌苗的制备规程的研究及其科研成果的推广应用意义重大。

试验表明,目前鸭大肠杆菌药敏率很低,该菌耐药性很强,几乎对兽药市场上常见抗菌药物全部耐药,主因是抗生药物滥用及不合理应用所致,所以选择敏感药物是治疗本病的关键[6,7],而要杜绝此种现象的进一步发展之关键则是加强政府职能部门对兽用抗菌药物临床应用的监管和引导。

试验表明,头孢唑林、诺氟沙星对分离菌株效果最好,链霉素、恩诺沙星次之,新霉素再次之,其余药物无效。根据药敏试验结果,使用头孢唑啉注射,诺氟沙星口服,既可取得抗菌药物的协同作用,提高疗效,又可降低细菌产生耐药性的几率。硫酸新霉素喷雾治疗肠道菌引起的呼吸道感染临床效果评价较好,主要是因为新霉素化学性质稳定,进入呼吸道后难以吸收,可在局部形成较高浓度并保持较长时间。

参考文献

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犊牛大肠杆菌药敏试验篇5

关键词：鸡；致病性大肠杆菌；耐药性

中图分类号： S852.61+2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0226-03

收稿日期：2013-10-10

基金项目：湖南省“十二五”重点建设学科（动物学）项目（编号：湘教发[2011]76 号）；湖南省高校科技创新团队项目（编号：2008244）；湖南省动物学重点实验室项目（编号：200824632）；湖南文理学院青年专项基金（编号：QNYX0811）。

作者简介：李娜（1977—），女，吉林长春人，硕士，讲师，研究方向为预防兽医学。E-mail：vetlina@163.com。大肠杆菌为临床上常见的病原菌，在腹泻畜禽的粪便中及各种原因引起的败血症畜禽中都能分离到致病性大肠杆菌。该病的主要特征包括心包炎、肝周炎、脐炎、气囊炎、败血症、眼炎、滑膜炎、卵黄性腹膜炎等，多继发新城疫、传染性喉气管炎等疾病，导致鸡群高死亡率，对养鸡生产的危害极大[1]。国内已有很多关于鸡大肠杆菌病流行病学的研究报道，主要针对我国的主要省（市），而对较小的市、县的研究报道并不多。由于大肠杆菌血清型多、抗原复杂，在小区域间也存在较大差异；同时随着抗生素的广泛应用，大肠杆菌的耐药性越来越强。为了能准确防治鸡大肠杆菌病，应在尽可能小的区域内对其进行病原血清型调查，并合理用药。目前，国内尚无对湖南省常德地区鸡场大肠杆菌耐药性监测的调查研究报道。为此，笔者从2006年10月至2012年12月对湖南省常德地区范围内的鸡大肠杆菌病流行情况和耐药情况进行了调查和监测，以了解湖南省常德地区的主要流行菌株的耐药规律，为兽医临床用药提供指导性参考意见。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1病料采集在2006年10月至2012年12月期间，选取105份湖南省常德地区饲养的疑似大肠杆菌病鸡的脏器。

1.1.2培养基及试剂普通琼脂平板培养基、三糖铁（TSI）琼脂培养基、伊红美兰（EMB）琼脂培养基、麦康凯（MAC）琼脂培养基，购自北京奥博星生物技术责任有限公司；生化试验微量发酵管，购自杭州微生物试剂有限公司；普通营养肉汤，自制。

1.1.3试验动物18～25 g/只的小白鼠，购自湖南农业大学小动物室。

1.1.4药敏纸片试验用药敏纸片共30种，包括阿莫西林、哌拉西林、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氨苄青霉素、苯唑青霉素、妥布霉素、庆大霉素、丁胺卡那霉素、链霉素、头孢哌酮、头孢他啶、头孢唑啉、头孢噻肟、头孢曲松、头孢氨苄、四环素、氯霉素、红霉素、新霉素、壮观霉素、强力霉素、林可霉素、乙酰螺旋霉素、氯洁霉素、呋喃妥因、氨曲南、复方新诺明、利福平等，购于杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2试验方法

1.2.1细菌形态与分离培养将采集的新鲜病料分别划线接种于普通培养基、MAC、EMB培养基上，同时分别穿刺TSI琼脂管，置于37 ℃恒温箱培养18～24 h后观察；挑取疑似的单个菌落进行革兰氏染色镜检，将培养特性及形态、染色反应、排列均符合大肠杆菌特征的菌株划线接种于普通营养琼脂平板上进行细菌的数次纯化，然后将纯化的细菌接种于普通斜面培养基上，4 ℃保存备用。

1.2.2生化特性鉴定将分离的60个致病菌株接种于普通肉汤中，37 ℃恒温箱培养24～48 h后适量接种于葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、棉子糖、尿素、H2S、靛基质、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、MR、VP微量发酵管中，置于37 ℃恒温箱培养24 h后觀察生化反应结果。靛基质发酵管中滴加1滴靛基质试剂、MR发酵管中滴加1滴MR试剂即可观察结果；VP发酵管中滴加2滴VP甲液、1滴VP乙液，置于37 ℃培养2 h即可观察结果。

1.2.3大肠杆菌致病性试验取已鉴定的、生化反应符合大肠杆菌的各个菌株于37 ℃恒温箱培养18 h的普通肉汤培养物（菌液浓度为3.0×109 CFU/mL），经纯粹检验合格后分别腹腔接种18～25 g小白鼠，按0.2 mL/只的剂量接种，每个菌株接种6只；对照组按相同的途径接种0.2 mL普通肉汤培养液，共接种6只。接种后饲养观察120 h小白鼠的存活情况，记录小白鼠的死亡时间并对死亡小白鼠进行剖检取肝脏、心脏，用EMB平板进行接种菌回收试验以分离致病菌。

1.2.4分离菌药物敏感性试验采用WHO推荐的 Kriby-Bauer （K-B）法[2]对分离鉴定的75株大肠杆菌进行耐药性监测，判断标准参照美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）颁布的M100-S15药敏试验纸片扩散法法规[2]和相关文献[3-4]，以高敏、中敏、低敏或耐药3种形式对抑菌圈大小作出判定。先将菌株接种到普通营养琼脂斜面培养基上，37 ℃ 恒温箱培养18 h，用生理盐水洗下菌苔；将菌悬液稀释到麦氏比浊管中，相当于终浓度5×107～1×108 CFU/mL；将普通营养琼脂倾注于直径为10 cm的平皿上，制成厚4 mm的营养琼脂平板，15 min内用灭菌棉拭子蘸取上述浓度的菌悬液，在管内壁挤去多余菌液后在琼脂平板表面涂布接种3次，每次旋转70°，最后沿平板内缘涂抹1周；室温干燥3～5 min后，用无菌镊子将药敏纸片紧贴于营养琼脂平板表面，各纸片中心的距离应大于24 mm，纸片距平板内缘的距离应大于 15 mm；37 ℃恒温箱培养16～18 h后观察结果，记录各纸片的抑菌圈直径。

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2结果与分析

2.1细菌形态及生长情况

由细菌培养结果可知，在普通营养琼脂平板上的菌落生长良好、湿润，呈现半透明状态与灰白色，边缘光滑；在EMB琼脂培养基平板上的细菌形成中等大小、边缘整齐、表面光滑、黑紫色带金属光泽的菌落；在MAC琼脂培养基平板上的细菌长出圆形粉红色、表面光滑圆形中等大小的菌落；TSI管底及斜面培养的细菌均变黄色，产气而不产硫化氢；经过革兰氏染色镜检后，镜下均可见大量散在的红色、中等大小、两端钝圆的无芽孢G-短小直杆菌。

2.2分离菌的生化特性

分别对分离出的60株致病细菌进行生化试验，结果均符合大肠杆菌的生化特性，详见表1。

2.3大肠杆菌致病性试验

小白鼠在接种分离菌12 h后，均表现出精神不振，18 h后开始出现死亡，48 h后全部死亡；而对照组小白鼠健康活泼。剖检死亡的小白鼠可见肝脏肿大瘀血，表面散在针尖大小的出血点，心包膜、腹膜、肺、肾、脾脏均有不同程度的出血。从死亡小白鼠的肝脏、心脏中均可分离到分离菌。综合试验结果可知，分离菌株的培养特性、形态、染色反应均符合大肠杆菌特性，确定为致病性大肠杆菌。

2.4分离菌药物敏感性试验结果

以抑菌圈直径大小作为判定药物敏感性高低的标准，抑菌圈直径越大表明细菌对该药的敏感性越高。抑菌圈直径≥21 mm为高度敏感；在15.1～20.0 mm范围内为中度敏感；≤14 mm 为低敏或耐药。抑菌圈直径的测定结果见表2。研究表明，虽然常德地区3个不同养鸡场的大肠杆菌菌株对30种藥物的敏感性存在一定差异，但是同一养鸡场的大肠杆菌菌株对抗生素的敏感性几乎一致。

养殖户把药物防治作为控制大肠杆菌的主要手段，但药敏试验普及率很低，用药盲目性非常大，且在实际生产中有时用药不合理，如低剂量长时间使用，随意加大剂量或根据个人经验感觉盲目添加等，均会造成大肠杆菌严重耐药，从而导致药效下降甚至无效，药物控制难度增大，耐药菌株增多。75 株受试大肠杆菌均对除头孢曲松外的29种抗菌药物有多重耐药性，表现为对4种或4种以上药物耐药，8耐菌株所占比例最大，为14.67%；其次是5耐、9耐，分别占10.67%、9.33%。因此在临床用药方面或作为饲料添加药物时，有条件的应该进行药敏试验，尽量选择高效敏感的药物，尽量避免长期大量使用同一种药物，也可以几种药物交替使用，要足量、按疗程给药，以免产生耐药性。

参考文献：

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仔猪大肠杆菌的分离及药敏试验篇6

1 材料

1.1 试剂及培养基

伊红美兰琼脂 (EMB) 、麦康凯琼脂 (Macconkey) ;药敏试验用MuellerHinton (MH) 培养基;普通肉汤、普通营养琼脂、生化反应培养基及试剂按《现代微生物培养基和试剂手册》 (谢正旸, 1994) 配制。

1.2 药敏纸片

药敏纸片共10种。

1.3 实验动物

18~24g小白鼠。

2 方法

2.1 菌株的分离、鉴定

无菌方法采取60日龄内腹泻仔猪的新鲜粪便或直肠棉拭子, 接种麦康凯琼脂平板, 37℃18~24h后将可疑红色菌落接种于伊红美兰琼脂平板, 37℃18~24h后再挑取紫黑色带或不带金属光泽的可疑菌落进行革兰氏染色, 镜检。将培养特性及形态、染色反应、排列均符合大肠杆菌的菌株在普通营养琼脂斜面上纯增, 进行生化鉴定 (房海, 1997) , 生化符合的确定为大肠杆菌。

2.2 致病性试验

生化反应符合大肠杆菌的菌株接种普通肉汤, 37℃18h, 培养物分别腹腔接种小白鼠0.2ml/只, 观察存活情况。死亡的小白鼠经剖检后用伊红美兰琼脂平板进行接种菌回收试验, 其培养特性、形态、染色反应符合大肠杆菌的菌株确定为致病性大肠杆菌。

2.3 药敏试验

将致病性大肠杆菌采用KribyBauer (K-B) 法进行耐药性监测, 判断标准按美国Nation CommitteeforClinical Laboratory Standards (NCCLS) 药敏试验纸片扩散法法规进行 (王辉等, 1995) 。

3 结果与讨论

本次共调查了8个养猪场621头60日龄内仔猪, 其中腹泻仔猪161头 (采样数) , 后经分离、鉴定, 动物试验, 确定为由致病性大肠杆菌引起的147头, 说明致病性大肠杆菌仍是引起仔猪腹泻的主要病原 (147/161) , 发病率为23.67% (147/621) 。同时确认不同猪场发病率相差很大, 个别猪场高达61.34%。这与猪场的环境卫生、免疫状态、饲养密度关系密切。

此次试验共从161份检样中分离到189株大肠杆菌。其培养特性、染色反应、生化反应为:麦康凯琼脂平板上形成红色菌落, 伊红美兰琼脂平板上为黑色、圆形、湿润、表面光滑、边缘整齐, 且有金属光泽的菌落, 均为革兰氏阴性两端钝圆小杆菌, 单个或成对;均可发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇, 产酸产气, 少数菌株缓慢发酵蔗糖, 只产酸或产酸产气;MR试验阳性, V-P试验阴性, 硫化氢试验阴性, 硝酸盐还原试验阳性, 尿素酶阴性, 吲哚试验阳性, 枸橼酸盐利用试验阴性;三糖铁斜面、底层产酸变黄, 有气体无变黑现象。

189株大肠杆菌经动物试验, 其中156株可致死小白鼠, 确定为致病性大肠杆菌。

156株致病性大肠杆菌对10种抗生素敏感性试验结果见表1。

分离到的156株致病性菌株对四环素 (TET) 、青霉素 (P—G) 、庆大霉素 (GEN) 、磺胺 (SU) 等猪场常用的药物有较高的耐药水平, 同时表现为许多菌株同时对多种药物具有耐药性;而对环丙沙星 (CIP) 、头孢唑啉 (CFZ) 等较敏感, 可用这些敏感药物进行仔猪大肠杆菌病的治疗。因此兽医临床工作者应重视用药前的药物敏感性监测, 选出几种有针对性的药物交替使用, 效果好, 经济实惠。

摘要：从互助县8个养猪场60日龄内腹泻仔猪中分离鉴定出156株致病性大肠杆菌。通过药敏试验, 选出了环丙沙星、头孢唑啉等高敏感药物。

鸡场大肠杆菌的分离与药敏试验篇7

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源

2014年2月采自某规模化鸡场20份病死鸡的肝脏。

1.1.2 仪器与试剂

阿莫西林、丁胺卡那霉素、氟苯尼考、头孢噻呋、庆大霉素、青霉素、红霉素、恩诺沙星和链霉素药敏纸片均由杭州微生物制品有限公司生产。麦康凯培养基、革兰氏染色液、高压灭菌锅、恒温培养箱、超净工作台、显微镜、冰箱和常用玻璃仪器等均由和县畜牧兽医局实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 染色镜检

无菌操作采集病死鸡的肝脏组织, 涂片进行革兰氏染色, 镜检。

1.2.2 细菌分离培养和形态学观察

无菌操作取病死鸡的肝脏组织分别接种于普通琼脂和麦糠凯琼脂培养基上, 37℃培养24h, 挑取培养基上的独立单在的菌落接种于LB液体培养基, 37℃培养24h后, 分别取上述菌落涂片, 革兰氏染色镜检, 在油镜下观察细菌的形态及染色特性。观察是否存在杂菌。对于已经纯化的细菌进行冷冻保存, 未纯化的重复划平板, 镜检, 直至纯化为止。

1.2.3 生化试验

自制各种糖发酵管, 取纯培养物分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖和甘露醇等生化管中, 置于37℃恒温培养箱中, 培养18~24h, 观察发酵管的反应情况。按文献要求自制各种生化试剂, 取纯培养物分别做M.R.试验、V-P试验、硫化氢试验和靛基质试验。

1.2.4 动物实验

190只健康30日龄雏鸡随机分为19组, 每组10只, 第1组至第18组为实验组, 分别腹腔接种分离的18株大肠杆菌肉汤培养物, 每只0.2m L, 第19组为对照组, 常规饲养。观察发病情况, 于雏鸡死后, 剖检观察病理变化, 并且无菌操作采心血涂片, 革兰氏染色, 镜检。

1.2.5 药敏试验

对分离到的18株菌株进行了药敏试验, 共检测9种药物, 包括阿莫西林、丁胺卡那霉素、氟苯尼考、头孢噻呋、庆大霉素、青霉素、红霉素、恩诺沙星和链霉素。根据NCCLS标准判定结果。

2 结果

2.1 剖检变化

经剖检可见:病死鸡剖检均发现以肝周炎、心包炎变化为主, 即俗称“包心包肝”。特异性恶臭味, 腹腔有积液, 呈浅黄色。

2.2 染色镜检

肝脏涂片革兰氏染色镜检, 均为阴性小杆菌, 单个散在, 两端钝圆, 表面光滑湿润, 两极着色较深, 边缘整齐的小菌群。符合大肠杆菌的形态特征, 结合临床症状和病理变化, 初步判断为大肠杆菌感染。

2.3 细菌分离结果

分离菌经37℃培养24h, 在麦糠凯琼脂上形成红色、圆形、隆起、光滑湿润及边缘整齐的中等大菌落, 在普通琼脂斜面上为灰白色菌落, 培养物涂片, 革兰氏染色, 镜检, 可见到革兰氏阴性、两端钝圆的小杆菌。

2.4 生化试验结果

各分离菌株均能发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖和甘露醇, 产酸产气;能产生靛基质, 不产生H2S;M.R.试验为阳性, V-P试验为阴性。试验结果符合大肠杆菌的生化特征。

2.5 动物试验结果

对照组10只仔鸡存活, 无临床症状。攻毒组接种后12h开始发病, 24h后全部发病, 于72h陆续死亡。死前症状为精神沉郁, 食欲不振, 腹泻, 排黄白稀粪, 离群呆立, 昏睡, 符合鸡大肠杆菌病的临床症状。死后剖检可见大肠杆菌典型病变, 无菌操作取发病鸡的肝脏涂片、染色和镜检, 镜下观察可见两端钝圆的短小杆菌, 单个或成对存在, 两极着色较深, 革兰氏染色阴性。生化试验结果同2.4, 从而证明, 动物实验的仔鸡被大肠杆菌感染。

2.6 药敏试验结果

所分离大肠杆菌对阿莫西林、丁胺卡那霉素、氟苯尼考和头孢噻呋高度敏感, 对庆大霉素中度敏感, 对青霉素、红霉素、恩诺沙星和链霉素等产生耐药性。

3 讨论

本次试验分离的18株细菌的革兰氏染色涂片细菌的形态皆与鸡大肠杆菌的形态特征一致, 18株细菌的生化试验结果一致, 且与鸡大肠杆菌的生化特征一致, 可断定这些菌株属于大肠杆菌。从本次的药敏试验结果可以看出, 该批大肠杆菌分离株对阿莫西林、丁胺卡那霉素、氟苯尼考和头孢噻呋高度敏感, 对庆大霉素中度敏感, 对青霉素、红霉素、恩诺沙星和链霉素等产生耐药性。建议各养殖场治疗鸡大肠杆菌病时, 临床上应严格掌握抗菌药物的适当使用, 防止错用、滥用抗菌药, 最好先做药敏试验, 选出敏感药物进行有效治疗。

4 结合

药敏试验结果考虑联合用药和交替用药。大肠杆菌是一种条件致病菌, 常在一定条件下转变为致病病原。所以, 对于鸡场大肠杆菌病的防治不能仅仅依靠药物, 应采取综合防制措施, 建立规模化鸡场生物安全体系, 最大可能地减少鸡场内的病原微生物, 降低鸡场病原感染几率, 从而促进养鸡业的健康发展。

参考文献

[1]姚火春.兽医微生物实验指导[M].中国农业出版社, 2002, 36-42.

[2]王辉, 等.简要介绍美国NCCLS药敏试验纸片扩散法法规 (续) [J].中华医学检验杂志, 1995, 18 (2) :118-124.

[3]陆承平主编.兽医微生物学[M (]第三版) .北京:中国农业出版社, 2001, 217.

鸡大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验篇8

本试验通过对细菌的分离培养、生化试验、动物试验、药敏试验等一系列细菌生物学试验, 来分析研究本地区养鸡场内常发生的大肠杆菌病, 并深入了解其发病机理、病原特性以及预防机制, 以便获得更好的临床应用效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源

所有病料均来自于县畜牧局动物门诊日常诊断病例, 初步确诊为大肠杆菌病的病鸡68只, 其中肉仔鸡、蛋雏鸡41只, 育成鸡27只。

1.1.2 培养基与试剂

麦康凯琼脂 (NA) 、伊红美兰琼脂、普通肉汤、营养琼脂 (NA) (均购自上海伯奥生物科技有限公) ;硝酸盐还原剂、氧化酶试剂、微量生化试验管、药敏纸片购自 (均购自杭州天和微生物试剂有限公司) 。

1.1.3 试验动物

各日龄健康鸡 (购自山东济南SPF种鸡场) 。

1.1.4 仪器及设备

光学显微镜、恒温箱、高压灭菌器、无菌实验台、微量移液器等。

1.2 方法

1.2.1 大肠杆菌的分离培养

以无菌操作的方法, 采取病死鸡的肝、脾、心包液、气囊膜等处病料, 划线于麦康凯琼脂上, 37℃培养24~48h挑取红色单个菌落划线接种于伊红美蓝琼脂平板, 37℃培养18~24h, 挑取紫黑色带金属光泽的单个菌落接种于普通肉汤和普通琼脂斜面, 37℃培养18~24h, 用石蜡胶塞密封, 置4℃冰箱中保存备用。

1.2.2 形态学观察

取伊红美蓝琼脂平板上紫黑色带金属光泽的单个菌落涂片, 革兰氏染色镜检, 观察记录菌体形态和染色特征。

1.2.3 生化培养

取微量生化管及各种生化培养基, 将分离菌纯培养物的菌种接入后封口, 置于37℃培养箱中培养18~24h, 观察结果。

1.2.4 致病性试验

将分离到的大肠杆菌接种普通肉汤培养物, 37℃培养24h。经测定每毫升肉汤培养物约含1×109CFU。按每株菌3只 (5日龄健康非免疫雏鸡) , 颈部皮下注射0.2ml/只。对照组6只颈部皮下注射灭菌肉汤。及时剖检死亡鸡, 分离细菌。判定标准:能使试验鸡在24h内全部死亡或在48h内死亡2/3以上的菌株作为致病菌株。

1.2.5 药敏试验

将获得的致病菌株的菌液, 均匀涂抹于营养琼脂平板, 每菌株两板, 然后将药敏纸片平均分布, 37℃培养24h。

2 结果

2.1 大肠杆菌

麦康凯琼脂上形成红色、圆形隆起、光滑湿润、边缘整齐、直径为1.5~2.5mm的小菌落;在伊红美蓝琼脂上形成紫黑色、具有金属光泽的小菌落;在普通琼脂斜面上的菌落为灰白色;在普通肉汤中呈均匀浑浊, 管底有灰白色沉淀, 并有粪臭味。

2.2 形态

经镜检可见到革兰氏阴性, 两端钝圆, 长约1.5~3.0µm的短小杆菌, 多单在, 偶有2~3个菌体相连, 无芽孢。

2.3 生化鉴定

将分离到的68个菌株, 经生化试验鉴定, 符合大肠杆菌特征见表1。

2.4 致病性

大部分雏鸡6h以后开始出现症状, 表现精神沉郁, 食欲下降, 多数出现腹泻, 有的出现神经症状。接种12h后开始出现死亡。剖检死亡鸡, 表现为典型大肠杆菌病病变, 并从死亡鸡病变组织均回收到相应接种致病菌株。在分离的68株菌中确认56株为致病性菌株, 占分离菌株的82.35%。

2.5 药敏效果

其中阿米卡星、头孢哌哃、氟苯尼考敏、磷霉素钠敏感率达到85%以上, 而四环素、链霉素、阿莫西林等药物的敏感性较低。统计情况见表2。

抑菌圈直径15.1~20mm者为高度敏感;直径10.1~15mm者为中度敏感;直径在l0mm以下者为耐药。

3 讨论

3.1 关于致病菌

从局动物门诊日常疑似病例抽取的68只病鸡中分离出68株菌株, 涂片镜检、生化试验等方法分离鉴定, 均符合大肠杆菌特征, 确定全部为大肠杆菌。经致病性动物试验, 共56株菌为致病性大肠杆菌。说明本地区鸡大肠杆菌的致病率与致死率都很高, 需要本地区的养殖户必须提高警惕与做好防范措施。

3.2 药物防治

药敏实验发现, 本地区鸡致病菌对阿米卡星、头孢哌酮、氟苯尼考、磷霉素钠有较高的敏感性, 可考虑使用;而四环素、链霉素、阿莫西林等药物的敏感性较低, 该区养殖户应慎用或不用。该区养殖户还应注意正确的用药措施, 长时间使用一种药物易产生耐药性, 细菌耐药性的发生和发展正是抗菌药物广泛应用, 特别是滥用药物的结果。因此广大养殖户在治疗大肠杆菌病时必须注意用药问题, 加强抗菌药物的质量监督, 合理选用药物, 在有限的条件下尽量避免耐药菌株的产生。选择药物时必须先进行药敏试验, 采取“交替”的用药方案, 可在发病日龄前1~2d进行预防性投药。近些年来, 利用中草药防治鸡大肠杆菌病取得了明显的效果。目前业内已有报道, 用清瘟败毒散、复方黄连口服液、禽菌灵、大肠杆菌净等药物对大肠杆菌性腹泻治愈率达80%以上。

3.3 疫苗免疫

由于大肠杆菌血清型多, 不同血清型抗原性不同, 市场上的疫苗具有一定的局限性。在常发病的养禽场, 有条件的可从本场病禽中分离出致病性的大肠杆菌, 制成自家多价灭活疫苗, 在雏鸡7~15日龄、25~35日龄、120~140日龄各免疫1次。

摘要：本试验通过收集动物门诊临床诊断为大肠杆菌病的鸡群作为病料, 进行分离培养、生化鉴定、动物试验。通过药敏试验, 发现该菌对阿米卡星、氟苯尼考、头孢哌哃、磷霉素钠等药物有较高的敏感性, 而对链霉素、四环素、阿莫西林等药物的敏感性较低。

关键词：鸡,大肠杆菌,分离鉴定,药敏试验

参考文献

[1]李永清, 甘孟侯.禽大肠杆菌病防制研究进展[J].中国兽医学报, 2000, 4.

[2]徐海花, 牛钟相, 秦爱建等.鸡源致病性大肠杆菌地方株的分离与鉴定[J].山东家禽, 2004, 10.

[3]刘吉山, 沈志强等.我国部分地区禽致病性大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验[J].中国家禽, 2005, 7.

[4]刁有祥, 李久芹等.山东省鸡大肠杆菌的分离鉴定[J].中国预防兽医学报, 2002, 1.

鸭大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验篇9

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源

2013年5月新沂市马陵山镇某养殖户送检的病死鸭。

1.1.2 培养基的制备

麦康凯琼脂购自青岛海博生物技术有限公司, 批号20110524。各种糖及MR、VP、吲哚试验、枸橼酸盐利用试验和硫化氢试验微量发酵管, 购自青岛海博生物技术有限公司, 批号20090816。营养肉汤、VP试剂等参考文献配置[1]。

1.1.3 试验动物

9日龄雏鸭10只, 购自城区某养鸭专业户, 饲养3d后用于作动物致病性试验。

1.1.4 药敏纸片

药敏纸片购自青岛海博生物技术有限公司, 批号200100125。

1.2 方法

1.2.1 流行病学调查

5家养殖户均在新沂市马陵山镇一条小河边养殖, 水质污染严重, 5个鸭场养殖量均在10000左右, 饲养方式原始、简单, 卫生状况不好, 每天都有8-12只蛋鸭死亡, 产蛋率低, 用多种抗生素治疗均不理想, 鸭群整体精神状态差。

1.2.2 病理剖检

病理剖检可见纤维素性心包炎, 心包膜明显增厚, 其上沉着白色或黄色纤维素性附着物。肝脏肿大, 表面膜附着纤维素性样物。

1.2.3 细菌的分离培养和镜检

无菌取病送检病鸭肝脏、心血接种于营养肉汤培养基, 37℃增菌培养24h。然后将培养物在麦康凯琼脂平板上划线接种, 37℃培养24h, 观察细菌的培养特性, 革兰氏染色结果。再钩取典型菌落接种鲜血琼脂斜面37℃培养24h, 4℃保存。

1.2.4 细菌的生化试验

参考文献[1]进行细菌生化试验。

1.2.5致病性试验

取分离菌接种营养肉汤, 37℃培养18h。将10只雏鸭分为两组, 每组5只, 第一组为于皮下接种注射纯培养物0.2ml/只 (约含细菌0.6亿/只) , 第二组注射灭菌肉汤0.2ml/只。接种24h后观察试验动物的发病及死亡情况。

1.2.6 细菌的药敏试验

取细菌纯培养物密集划线接种于整个普通琼脂平板上, 将药敏片依次均匀贴放到平板上。每个平板放5片, 各纸片中心相距约24mm, 纸片距平板边缘约15mm, 各纸片间距离相等。将平板倒置于37℃温箱培养24h, 然后观察药物的抑菌情况, 并测定各种药物抑菌圈的大小。

2 试验结果

2.1 细菌特性及镜检结果

细菌在普通肉汤中均生长良好, 均匀混浊, 管底有灰白色沉淀, 轻摇呈云雾状;在麦康凯琼脂培养基上生长出周围粉红色, 中心深红色的菌落。该菌经革兰氏染色可见红色中等大小, 两端钝圆的球杆菌, 多单个散在排列。

2.2 生化试验结果

该细菌能够发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖和甘露醇, 产酸产气;发酵蔗糖, 不产气;吲哚试验和MR试验阳性;VP试验、柠檬酸盐利用试验、硫化氢试验和尿素分解试验为阴性 (表1) 结合培养特性及镜检结果, 鉴定为大肠杆菌。

注:“⊕”表示产酸产气, “+”表示产酸不产气;其余试验中“+”表示阳性结果, “-”表示阴性结果。

2.3 致病性试验结果

雏鸭在细菌接种后24h内死亡4只, 而剩下的在48h后也死亡。剖检发现雏鸭有肝周炎, 心包积液, 心包膜有轻微的纤维素性渗出等病变。从死亡雏鸭的肝脏和心血中, 分离到了大肠杆菌。而对照组无异常表现。

2.4 药物敏感试验结果

所分离菌株对呋喃妥因、阿米卡星和痢特灵3种药物高度敏感, 对先锋噻肟、菌必治和庆大霉素中度敏感, 而对四环素、环丙沙星等药物表现为耐药性 (见表2) 。

(mm)

注:抑菌圈直径大于15mm者为高敏药物;直径为10~15mm者为中敏药物;直径为10mm以下者为耐药。

3 讨论

根据分离培养菌的特性、染色特点及生化试验结果, 该细菌鉴定为大肠杆菌。经动物试验表明该分离菌株有较强的致病性。大肠杆菌病是一种常发病, 但是却难于控制, 这不仅因为其血清型多, 各血清型间无交叉保护性, 而且不同血清型对药物的敏感性不一致[2,3]。不同地区的大肠杆菌对药物敏感性也各不一致[4,5]。本次药敏试验结果表明分离菌对呋喃妥因、阿米卡星和痢特灵3种药物高度敏感, 对先锋噻肟、菌必治和庆大霉素中度敏感, 而对四环素、环丙沙星等药物表现为耐药性, 表明当地鸭大肠杆菌分离株对常见的药物均有较强的耐药性。由于大肠杆菌极易产生耐药性, 且介导其产生耐药的质粒具有遗传性, 所以一般不建议采用抗生素低剂量长期预防用药, 临床最好使用经实验筛选的敏感性药物治疗剂量作治疗性用药, 病愈后应及时停止使用以防耐药性的产生[6,7]。此外, 使用高敏药物时, 应按说明给药, 避免超量和滥用, 每个疗程应在4d以上较好。当畜主按照药敏试验结果使用了高敏药物呋喃妥因5d后, 病情得到了很好的控制。

4 结论

大肠杆菌为一种条件性致病菌, 鸭发大肠杆菌病除了环境卫生条件差外, 还与饲养密度、混群饲养、种蛋污染的因素有关[5]。为减少此病发生, 主要措施是改善饲养管理, 做好鸭舍的环境卫生工作, 保持合理放养密度, 鸭棚保持良好的通风条件, 采用全进全出饲养方式。塘水清洁, 定期换水, 饮水、饲料要卫生消毒, 特别是当天气骤变时要防止寒风侵袭, 导致鸭体质下降而引发本病。种蛋要及时收集并清洁表面的污物, 入孵前进行熏蒸或浸泡消毒。接种大肠杆菌灭活疫苗可以有效地预防本病的发生。由于大肠杆菌的血清型多且比较复杂, 在生产中应考虑使用当地分离株制备灭活的自家苗或多价疫苗免疫预防。

大肠杆菌耐药谱很广, 而且易产生或获得耐药性, 因此在生产中使用药物进行预防和治疗时, 要定期更换药物或几种药物交替应用。最有效的方法是根据分离细菌的药敏试验结果来选用有效的药物进行治疗。

参考文献

[1]姚火春.兽医微生物学实验指导[M].北京:中国农业出版社, 2002.

[2]刘柱江, 赵来兵.鸭大肠杆菌油佐剂灭活苗的研制[J].中国家禽, 2002, 24 (8) :25-26.

[3]高松, 刘秀梵, 张如宽等.我国部分地区禽病原性大肠杆菌的分离与鉴定[J].畜牧兽医学报, 1999, 30 (2) :l64-l71.

[4]黄瑜, 李文杨.番鸭大肠杆菌病的诊治[J].中国兽医杂志, 2000, 26 (12) :34-35.

[5]程方俊, 周廷宣, 田晋红等.重庆养鸭场雏鸭大肠杆菌分离鉴定及药敏试验[J].西南农业大学学报, 2006, 28 (6) :1107-1110.

[6]刘永松, 韦兵, 汤社护等.产蛋鸭大肠杆菌疾病的诊治及结果分析[J].中国动物检疫, 2007, 24 (l2) :33.

犊牛大肠杆菌药敏试验篇10

犊牛大肠杆菌性腹泻有着较高的发病率和死亡率, 而且还能同时激发其他疾病, 对养牛业危害很大。大肠杆菌极易产生耐药性, 并且耐药质粒能够遗传[2,3]。目前, 在养牛生产中普遍存在抗生素滥用现象, 导致药物治疗效果不理想, 因此研制大肠杆菌疫苗具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种:选取分离菌中3种强毒力的优势血清型O2、O86、O101。动物:体重为1.5～3 kg的健康家兔, 购自第四军医大学实验动物中心。佐剂:氢氧化铝胶、油佐剂, 由杨凌职业技术学院微生物实验室制备。培养基:普通琼脂培养基、麦康凯培养基、普通肉汤、硫乙醇酸盐试管斜面、葡萄糖蛋白胨培养基、酪胨斜面, 常规方法配制, 高压湿热灭菌后4 ℃保存, 备用。

1.2 方法

1.2.1 灭活菌液的制备

无菌条件下将3株分离菌株分别接种于pH值为 7.3～7.5的普通肉汤培养基中, (37±1) ℃摇床培养18 h;染色、镜检进行细菌纯度检查, 平板计数后将细菌浓度调整为×1010 cfu/mL以达到配苗标准;加入10 %甲醛, 使其终浓度为0.3%, 边加边摇, 混合均匀;37 ℃灭活48 h, 其间每隔4～6 h振摇1次, 即为抗原液;经灭活检验合格后4 ℃保存, 备用。

1.2.2 三价油乳剂灭活疫苗的制备

将注射用白油、司盘-80及硬脂酸铝按一定比例混合均匀, 高压灭菌, 冷却即为油相, 4 ℃保存, 备用;将灭活检验合格的3种菌液按1∶1∶1的比例混合均匀, 加入一定量无菌吐温-80混匀后即得水相;将油相与水相按一定比例混合, 然后高速搅拌3～5 min, 乳化制成三价油乳剂灭活疫苗 (以下简称油苗) , 定量分装, 备检。

1.2.3 三价氢氧化铝胶灭活疫苗的制备

用无离子水将三氯化铝配成一定浓度溶液, 加热至50 ℃, 向其中加入含量为40 g/L氢氧化钠溶液, 调pH值为5.6～6.8, 高压灭菌, 备用;将灭活检验合格的3种菌液按1∶1∶1的比例混合均匀, 即为抗原液;取灭活的菌液3份加1份氢氧化铝胶混匀即为三价氢氧化铝胶灭活疫苗 (以下简称铝胶苗) , 定量分装, 备检。

1.3 疫苗检验

1.3.1 疫苗物理性状检查

分别观察和检验各疫苗的物理性状, 包括外观、剂型、稳定性、黏度。

1.3.2 疫苗无菌检验

按参考文献[4]的方法进行无菌检验, 分别将各疫苗接种于普通琼脂培养基、麦康凯培养基、硫乙醇酸盐试管斜面、酪胨斜面及葡萄糖蛋白胨培养基, 分别置于37 ℃及25 ℃培养7 d, 观察并记录结果。

1.3.3 疫苗安全性检验

将6只健康家兔随机分为3组, 每组2只;将不同佐剂的2种多价苗和灭菌肉汤分别以3 mL/只的剂量颈背部皮下注射, 连续观察14 d。

1.3.4 疫苗免疫效力检查

将45只品系相同、体重基本一致的家兔随机分成3组, 即油苗组、铝胶苗组、对照组, 每组15只, 3组同条件饲养。油苗组每只家兔颈背部皮下接种油苗1 mL;铝胶苗组的每只家兔以同样方式接种铝胶苗0.45 mL;对照组注射灭菌生理盐水1 mL。3组分别于免疫前和接种后7, 14, 21, 28 天测定抗体效价。将3组再细分, 分别依次编组为油苗1～3组、铝胶苗1～3组、对照1～3组。这9组同时于28天分别使用3种菌的致死剂量攻毒, 连续观察20 d, 计算疫苗保护率。疫苗保护率 =[ (攻毒数-死亡数) / 攻毒数] × 100%。

1.3.5 疫苗抗体效价的测定

按照微量凝集试验方法进行。将灭活菌液稀释至50 cfu/mL并作为全菌抗原, 试验兔采血后分离血清, 将血清倍比稀释, 然后每孔加入抗原, 同时设立对照, 置37 ℃作用4 h, 取出观察结果。以50%凝集 (孔底有小的沉淀点, 边缘有伞状凝集片) 时血清稀释的最高倍数为该血清的凝集效价。

2 结果

2.1 自制疫苗的物理性状

2.1.1 油苗物理性状的检查结果

油苗为匀质的乳白色乳剂;将油苗滴于纯化水表面, 无分散现象;取油苗置离心管中, 以3 000 r/min 离心30 min, 无分层或破乳现象;用1 mL吸管吸取25 ℃左右疫苗1 mL, 垂直放出0.5 mL, 重复3次平均值都在7 s以下, 在规定的疫苗黏度范围内。

2.1.2 铝胶苗物理性状的检查结果

铝胶苗呈浅灰白色、无臭、无异物、无凝集、无酶团、细腻的胶体, 静置能析出少量的水分, 上层为淡黄色的澄明液体, 下层为灰白色的沉淀物, 振摇后为均匀混浊液体。

2.2 疫苗无菌检验结果 (见表1)

注:-代表无细菌生长。

由表1可知, 不同温度下各种培养基上均无细菌生长。

2.3 安全性检验结果

连续观察14 d发现各组家兔均未见任何不良反应, 全部健活, 证明疫苗安全性良好, 只是油苗吸收较慢。

2.4 疫苗免疫效力检查结果 (见表2)

注:-代表没有攻毒。

由表2可知, 对照组死亡率为100%, 免疫组保护率为100%, 说明2种疫苗免疫效力检验全部合格。

免疫接种后28天2种佐剂疫苗的保护率均为100%, 个别家兔于攻毒当天稍有反应, 次日即好转, 而对照组于攻毒后18～48 h全部死亡, 剖检症状与大肠杆菌引起的病变基本相同。分离培养可回收到相同的细菌, 说明2种佐剂的灭活疫苗均能有效预防由此3种血清型大肠杆菌引起的疾病。

2.5 抗体效价的检测结果 (见表3)

注:-代表无抗体效价。

由表3可知, 2种疫苗均于免疫后7天产生抗体, 铝胶苗产生抗体稍快, 但随着时间的推移, 油苗的效价逐渐增高, 在第28天时其效价已经高于铝胶苗。

3 分析与讨论

3.1 大肠杆菌分离菌株灭活苗的研制

由于大肠杆菌血清型复杂、变异大、抗原复杂, 而且不同地区流行的血清型菌株又存在很大差异[3]。因此, 根据不同地区致病性大肠杆菌的优势血清型研制切实有效的灭活疫苗具有现实的生产意义。本试验利用从陕西省部分市区腹泻犊牛的病料中分离、筛选出的3株致病性大肠杆菌菌株, 研制出大肠杆菌多价油乳剂灭活苗, 病料采集面广, 涵盖陕西地区各主要规模化养牛场, 分离的菌株具有一定的代表性和普遍性, 这些都为疫苗的研制打下了良好基础, 经动物试验证明研制出的地方株大肠杆菌灭活苗具有较好的保护效果。

3.2 细菌培养方式

研究表明, 普通肉汤培养的抗原比普通琼脂培养的抗原所制备的免疫血清效价高, 其维持高抗体水平的时间也长于后者[5]。产生此现象的原因是在液体培养条件下, 菌株的各种生物学性状能得到充分的表达, 可大量分泌免疫原性强的超抗原, 即渗透因子 (PF) , 大大增强了全菌抗原的免疫效果。因此, 本试验也采用了液体培养法。需要说明的是, 用液体培养的细菌浓度难以达到配苗标准时可采用半量细菌浓缩法或固体培养菌补充液体法, 即将液体培养基中细菌进行半量浓缩, 取其菌泥补充入剩余液体培养基中或用固体培养基培养同种菌株, 将菌苔补充入液体培养基中, 以达到配苗浓度。

3.3 细菌内毒素的灭活方式

由于细菌内毒素是存在于革兰阴性菌细胞壁的一种大分子结构物质, 进入动物体内可引起体温升高、白细胞增多、弥漫性血管内凝血、代谢紊乱等现象, 严重者还可引起死亡[6]。大肠杆菌属革兰阴性菌, 其内毒素若灭活不彻底, 注射制备的疫苗后可引起局部肿胀, 严重者出现溃烂, 甚至死亡[4]。因此, 内毒素是否被灭活, 是检验大肠杆菌灭活疫苗质量的重要指标。本试验参照于金铃[7]的试验方法选用0.3%甲醛于37 ℃灭活48 h即可彻底灭活内毒素, 保证疫苗质量。

3.4 抗体效价的检测

3.4.1 抗体效价的检测方法

参照参考文献[8]的方法。本试验在进行免疫效力检查时选择了以检查全菌抗原为目的的微量凝集法, 而没有选择以外膜蛋白、渗透因子等分泌性抗原为主要检查对象的琼脂扩散法。本试验的凝集效价反映出了3株强致病性大肠杆菌的主要抗体水平。

3.4.2 抗体效价的检测时间

陈明勇等[9]在初步研制牦牛致病性大肠杆菌多价油佐剂灭活苗时发现, 用油佐剂疫苗接种试验兔, 免疫后第7天即可检测到抗体, 28天抗体效价达到高峰, 90天仍维持较高的抗体效价。参照此内容, 本试验仅检测达到高峰期的抗体效价, 并未继续检测抗体维持时间, 此内容有待在以后研究中予以完善。

3.5 关于大肠杆菌病与其他疾病混合发生的问题

大肠杆菌病很容易激发其他疾病, 而使牛的死亡率升高。因此, 有效控制牛大肠杆菌病的发生对控制其他疾病的发生起着重要作用。要全面有效地控制大肠杆菌病, 在采用疫苗免疫的同时还须采取综合性防制措施, 加强饲养管理, 提高牛体抗体水平和预防应激等。

参考文献

[1]赵杰, 李有志, 李强, 等.提高农村养牛经济效益的几项措施[J].黄牛杂志, 2005, 31 (4) :1.

[2]高睿, 张彦明, 张耀相, 等.犊牛产肠毒素型大肠杆菌病的诊治[J].畜牧与兽医, 2009, 41 (7) :110-112.

[3]高睿, 张彦明, 张振仓, 等.陕西省犊牛细菌性腹泻病原分离鉴定及敏感中药的筛选和初步应用[J].西北农业学报, 2007, 16 (4) :195-197.

[4]许兰菊, 蒋大伟, 方丽云, 等.鸡大肠杆菌多价灭活油乳疫苗的研制和应用[J].安徽农业科学, 2007, 35 (34) :11105-11156.