高中化学实验常用仪器

第一篇：高中化学实验常用仪器

实验室常用仪器简介

点击次数：412 发布时间：2010-8-4

显微镜用于放大微小物体成为人的肉眼所能看到的仪器

电子称电子称是用来对货物进行称重的自动化称重设备，通过传感器的力电转换，经称重仪表处理来完成对货物的计量，适用于各种散货的计量。

电子秤电子秤是用来对货物进行称重的自动化称重设备，通过传感器的力电转换，经称重仪表处理来完成对货物的计量，适用于各种散货的计量。

离心机该机适用于生物，化学，遗传学，医药学，医院，实验室对学业，生物体，叶绿素，蛋白核酸等液体混合物的分离。

测厚仪测厚仪用来测量不同单一材料或者覆盖层的厚度，分无损和有损两种，其中大部分是无损的。 切割机电阻切割机用于切割电阻.电容.晶体管等,可连续工作.效率高.切口整齐平滑等特点. 硬度计硬度计是测量各种材料硬度的仪器，分为洛氏、维氏、布氏、邵氏、里氏、消氏等不同类别。 抛光机在金相试样制备过程中，试样的抛光是一道主要工序，经过磨光的试样，在抛光机上抛光后，可获得光亮如镜的表面，它具有传动平稳、噪音小、操作、维修方便等优点。该机的抛光盘直径和传递功率均大于国内同类产品，能适合更多种材料的抛光要求。

电子天平是实验室分析或质量控制所必须的仪器，具有称量大，精度高，在较差使用环境下亦可达到精密称量的要求。

测温仪是温度计的一种，用红外线的原理来感应物体表面温度，操作比较方便，特别是高温物体的测量。应用广泛，如钢铸造、炉温、机器零件、玻璃及室温、体温等各种物体表面温度的测量。

干燥箱干燥箱是一种常用的仪器设备,主要用来干燥样品,也可以提供实验所需的温度环境.干燥箱应用与化工,电子,铸造,汽车,食品,机械等各个行业.

放大镜是用来对细小物体的放大以观察、识别、鉴定等最普通而方便、有效的仪器，有台式、便携式、带光源、带刻度等多种选择，可以应用于各行各业。

分光光度计常用分析仪器之一，常用于样品的定性与定量的分析，或透射、反射等光谱分析。广泛应用于医药，食品，石油，建材等各个领域

电导率仪电导率仪是适用于精密测量各种液体介质的仪器设备,主要用来精密测量液体介质的电导率值,当配以相应常数的电极可以精确测量高纯水电导率，广泛应用各领域的科研和生产.

粘度计一种用于测量液体的粘性阻力与液体的动力粘度的仪器，广泛应用于油脂、油漆。

千分尺外径千分尺：广泛用于长度厚度的测量。 外径千分尺现在分为数显和机械两大类，数显的精度一般都是0.001mm,机械的分为两种，有0.01mm也有0.001mm

内径千分尺广泛应用于孔径直径，沟槽宽度的测量。其也分为两个大类：两点接杆式的内经千分尺，和三点式的三爪内径千分尺。两点式一般测量比较大的孔径，最长可以到6米。三爪主要测量小孔径，最小可以到达3.5mm的孔径。需要注意的是，三爪分为通孔和盲孔。

电流表电流表是测定电流强弱和方向的电学仪器。分直流电流表和交流电流表。供实验室和工业现场测试用。

温湿度计用来测定环境的温度及湿度，以确定产品生产或仓储的环境条件。也应用于人们日常生活。应

用较为广泛。

水分测定仪快速测定物质含水量，可提供实时温度、样品质量、脱水率、样品含水百分比等数。

金相显微镜是主要用来观察金相组织的专业仪器，同时可以观察不透明物体表面的状态。具有稳定性好、成像清晰、分辨率高、视场大而平坦的特点。

示波器就是具有图形显示的电压表，它是具有屏幕，能在屏幕上以图形的方式显示信号电压随时间变化。

酸度计酸度计是一种常用的仪器设备,主要用来精密测量液体介质的酸碱度值,配上相应的离子选择电极也可以测量离子电极电位MV值，广泛应用于工业,农业,科研,环保等领域.

万用表万用表主要由磁电系电表的测量机构与整流器构成的多功能、多量程的机械式指示电表。可用以测量交、直流电压、电流及电阻，又称繁用表或万用表。有些多用表还具有测量电容、电感等功能。随着电子技术的不断进步，多用表正逐步向数字式方向发展。

PH计PH计是一种常用的仪器设备,主要用来精密测量液体介质的酸碱度值,配上相应的离子选择电极也可以测量离子电极电位MV值，广泛应用于工业，农业,科研,环保等领域。

超声波探伤仪运用超声波反射原理对于材料中的缺陷进行无损侦测。金属在锻造过程中有缺陷或者裂缝在今后的使用中会影响使用，所以金属探伤现在是这些钢铁行业，汽车行业等工业生产过程中必不可少的一个环节。

涂层测厚仪涂层测厚仪是测量各种金属材料上的油漆层、氧化层、镀层等。

生物显微镜是用来观察生物切片、生物细胞、细菌以及活体组织培养、流质沉淀等的观察和研究，同时可以观察其他透明或者半透明物体以及粉末、细小颗粒等物体。

转速表是机械行业必备的仪器之一，用来测定电机的转速、线速度或频率。常用于电机、电扇、造纸、塑料、化纤、洗衣机、汽车、飞机、轮船等制造业。

超声波清洗器超声波清洗可以达到物件全面洁净的清洗效果，特别对深孔，盲孔，凹凸槽俄清洗是最理想的设备，不影响任何物件的材质及精度。同时在生化，物理，化学，医学，科研及大专院校的实验中可作提取，脱气，混匀，细胞粉碎之用。

水份测定仪快速测定物质含水量，可提供实时温度、样品质量、脱水率、样品含水百分比等数。

振荡器主要适用于各大中院校、医疗、石油化工、卫生防疫、环境监测等科研部门作生物、生化、细胞、菌种等各种液态、固态化合物的振荡培养。

蒸馏水器通过加热蒸馏水产生蒸汽，冷凝成蒸馏水，可适用于制药，制剂，实验室，化验室等部门使用。 超净工作台广泛适用于医疗卫生、制药、化学实验、电子、国防、精密仪器、仪表等行业作操作区空气净化作用的设备。

露点仪是机械设备和环保行业常用的测量设备之一，用来测定管道、野外等环境的露点值。

电压表电压表是用来测量电路两段的电压。单位是伏特，所以也称为伏特表。电压表分为直流电压表和交流电压表。它广泛适用于学校、工业、科研、国防等各种领域。

培养箱培养箱是科研实验的必需设备，主要适用于医疗卫生、医药、生物、农业、科研单位等部门作储藏菌种、生物培养之用。

湿度计用来测定环境的湿度，以确定产品生产或仓储的环境条件。也应用于人们日常生活。应用较为广泛。

照度计广泛应用于电光源、科教、冶金行业、工业监察、农业研究以及照明行业的品控。

测量投影仪投影仪用途：本仪器能高效地检测各种形状复杂工件的轮廓和表面形状.例如:样板、冲压件、凸轮、螺纹、齿轮、成形锉刀、丝攻等各种刀具、工具和零件等，该仪器广泛地应用于机械制造业，仪器仪表和钟表行业有关厂矿的计量室和车间。

全站仪集合了经纬仪水准仪测距仪的所有功能，并将这些仪器的所有长处进行组合从而达到更高的精度和更多的拓展功能。广泛用于道路测量建筑行业农林等行业。

经纬仪简单来说就是测量水平角，竖直角。广泛运用于船舶的制造，重型设备的安装，等行业。 水准仪利用一条水平视线，并借助水准尺，来测定地面两点间的高差，可以推算出未知点的高程。

测距仪就是利用激光或超声波在一定时间内所走的路程。广泛运用于室内装潢道路量测设备安装等行业。 酶标仪可广泛用于医院临床诊断，锡疫病理检测，微生物抗原及搞体检测，寄生虫病诊断，血液病诊断，内分泌障碍测定，植物病虫研究学等领域。

浊度仪浊度，即水的混浊程度。浊度仪就是用来测量水的浊度的专门仪器。可供水厂，电厂，食品加工业，制药工业实验室对水样混浊度的测定，还可以用于监测天然水等。

搅拌器是工厂，科研机构，大专院校和医学单位等的科学研究，产品开发，品质控制和生产过程应用的理想设备。

测振仪用于测量电动机的震动速度以及频率。如果电机正常，那么它的振动速度应该保持在一个区间内，为此，每个产品里面都附有这样的一个电机正常运作与振动速度之间关系

电泳仪可作各种聚丙烯酰胺凝胶电泳、纸电泳还可作淀粉凝胶、琼脂凝胶电泳，还可作醋酸薄膜、点洗脱以及各种分析制备先用等。

洛氏硬度计洛氏硬度计适用于黑色金属、有色金属以及可锻铸铁的洛氏硬度测定。

电子分析天平是集精确，稳定，多功能与自动化于一体的电子天平，可以满足所有实验室质量分析要求,还可以直接连接打印机，计算机等设备来扩展天平的使用。

恒温水浴供大专院校、工矿企业和科研单位等作精密恒温和辅助加热之用。

原子吸收分光光度计其特点是采用了原子吸收分光光度法对样品进行分析，其分析对象是呈原子状态的金属与部分非金属元素。通常用来分析样品中微量及痕量的元素含量，主要应用于生化，冶金，环保等领域。

体视显微镜用于教学示范，生物解剖，观察分析，电子和精密机械工业零件的装配和检验等

旋光仪用来测试样品的旋光度、比旋度、浓度、糖度等。是医药行业、食品、饮料、轻工制造业、精细化工等行业必备的实验仪器。

超声波测厚仪超声波测厚仪采用超声波的原理测量一切超声波良导体材料的厚度。

接地电阻测试仪主要是测试设备的各处外露可导电部分与设备的总接地端子之间的电阻。由于接地电阻非常小，一般在几十毫欧姆，因此必须采用四端测量才能消除接触电阻。

电桥电桥主要用于测量其范围内的电阻。有测温电桥、直流单双臂两用电桥、直流电阻电桥、单臂电桥、双臂电桥、变压比电桥、交流电桥、高压电桥等等。

声级计是声学(噪声)测量的基本仪器，它按照一定的频率记权和时间记权来测量声音的声压级或声级的仪器。它用于环境、机器、车辆仪器其他各种噪声的测量，也可用于电声学及建筑声学的测量。

紫外可见分光光度计其特点是提供紫外-可见波段的波长范围200-1000nm，主要应用于样品的紫外-可见光区域之间的定性与定量等分析。

电缆故障测试仪主要是通过直流高压闪络法，冲击高压电感取样法，冲击高压电流取样法等对通信电缆，

电话线电缆，电力电缆等故障测试，故障点探寻的测试仪器。它包括电缆探伤仪，，路径探伤仪和故障点测试仪。

千分表原理使用范围和百分表相同，精度能达到0.001mm 配合比较仪座使用，可以测量超薄工件的高度。 定氮仪由电加热消化器、蒸馏器两大部分组成，是对蛋白质含量测定的一种仪器。

测斜仪是测量钻孔弯曲的小型仪器，适用于钻孔内作连贯多点的测量其方位角和顶角。

菌落计数器适用于对微生物的菌落计数和计算，抗生素的抗菌性测试和菌种筛选等。用于食品卫生检验、水质分析检测、医院临床检验、化装品检验和药品质量检测等。

第二篇：化学实验常用仪器的使用方法及注意事项

(一)

1、可直接加热的仪器

(1)试管(玻璃仪器)

主要用途：①常温或加热条件下，用作少量试剂的反应容器。

②收集少量气体和气体的验纯。③盛放少量药品。

使用方法及注意事项：

①可直接加热，用试管夹夹住距试管口1/3处。用试管夹夹持试管或取出试管时都要从试管底部取出(防止杂质落入试管)。

②试管的规格有大有小。不加热时，试管内盛放的液体不超过容积的1/2，盛液体加热时不超过容积的1/3(防止液体受热溢出)，。

③加热前外壁应无水滴;加热后不能骤冷，以防止试管破裂。

④加热时，试管口不应对着自己和他人(防止液体喷出伤人)。

盛固体加热时，试管要横放，管口略向下倾斜，且未冷前试管不能直立(防止管口的水流回管底而使试管破裂)。

盛液体加热时，管口要高于管底，管体与桌面成45度角。(增大受热面积和防止液体的爆沸)

加热时，先预热，后集中加热(防止试管受热不均匀而使试管破裂)。 ⑤不能用试管加热熔融NaOH等强碱性物质。

(2)蒸发皿(瓷质 仪器)

主要用途：①溶液的蒸发、浓缩、结晶。

②干燥固体物质。

使用方法及注意事项：

①盛液量不超过容积的2/3(便于搅拌和防止液体的益出) 。外部要擦干(防止破裂)。

②可直接加热，受热后不能骤冷(马上用水冲洗)。(防止破裂)

③应使用坩埚钳取放蒸发皿，不用手拿。热的蒸发皿不要直接放实验桌上(防止烫坏桌子)，要让它在三脚架或石棉网上冷却。蒸发出现固体较多时，要停止加热利用余热将剩下的水分蒸干。

(3)坩埚

主要用途：用于固体物质的高温灼烧。

使用方法及注意事项：

①把坩埚放在三脚架上的泥三角上直接加热。

②取放坩埚时应用坩埚钳。

③加热后可放在干燥器中或石棉网上冷却。

④应根据加热物质的性质不同，选用不同材料的坩埚。

习题：

1、加热试管中的液体时正确操作是( )

A竖立试管B不超过容积的1/3C 管口略向下倾斜 D 手握住试管

2、下课铃响了，小民同学忙回家，他立即停止了在做的试管加热实验，并用冷水冲洗试管，他这样操作正确吗?为什么?

3、做完用蒸发皿做的蒸发实验后，小王同学戴上手套后将蒸发皿拿下放在了 实验桌上，她的操作中有哪些错误?

第三篇：实验一 分子生物学实验室常用仪器设备简介

一、实验目的

熟悉分子生物学实验室常用仪器并熟练使用

二、实验原理

1、恒温气浴摇床：用于对温度和振荡频率有较高要求的细菌培养，发酵，杂交，生化反应及酶和组织研究等。

2、超净工作台：用于分子生物学无菌操作。

3、低温台式高速离心机：用于分离纯化DNA和蛋白质等，如基因片段的分离，蛋白酶的沉淀和回收等。

4、微量移液管：是连续可调的，计量和转移液体的专用仪器，其装有直接读数容量计。有多种规格：①0.5-10μL②10-100μL③20-200μL④100-1000μL。

5、电泳仪：用于确定大分子物质的分子量以及鉴定物种亲缘关系的仪器。

6、PCR仪：用于目的基因的扩增，是一对寡糖核苷酸引物结合到正负DNA链上的靶序列两侧，从而酶促合成拷贝数为百万倍的靶序列DNA片段。主要用于基础研究和应用研究等领域。

7、灭菌锅：用于细菌和细胞培养及核酸等有关实验使用的试剂，器皿及实验用具的严格灭菌。

三、实验仪器

恒温气浴摇床、超净工作台、低温台式高速离心机、微量移液管、灭菌锅、PCR仪、电泳仪。

四、实验步骤

(一)、恒温气浴要穿的使用：

1、样品瓶牢固放入弹簧夹中

2、接通电源开关，仪器进入准备状态

3、参数设定，(设定温度、时间、转速等参数 )

4、按启动键仪器开始工作，按暂停键可暂停托盘的旋转;

5、按电源键，显示屏显示消失，关闭电源总开关

(二)、超净工作台的使用

1、使用工作台时，先经过清洁液浸泡的纱布擦拭台面，然后用消毒剂擦拭消毒。

2、接通电源，提前30分钟打开紫外灯照射消毒，处理净化工作区内工作台表面积累的微生物，15分钟后，关闭紫外灯，开启送风机。

3、工作台面上，不要存放不必要的物品，以保持工作区内的洁净气流不受干扰。

4、操作结束后，清理工作台面，收集各废弃物，关闭风机及照明开关，用清洁剂及消毒剂擦拭消毒。

5、最后开启工作台紫外灯，照射消毒30分钟后，关闭紫外灯，切断电源。

(三)、低温台式高速离心机的使用

1、把离心机放置于平面桌或平面台上，目测使之平衡，用手轻摇一下离心机，检查离心机是否放置平衡。

2、打开门盖，将离心管放入转子内，离心管必须成偶数对称放入，且要事先平衡，完毕用手轻轻旋转一下转子体，使离心管架运转灵活。

3、关上门盖，注意一定要使门盖锁紧，完毕用手检查门盖是否关紧。

4、插上电源插座，按下电源开关(电源开关在离心机背面，电源座上方)。

5、设置转子号、转速、时间：

在停止状态下时，用户可以设置转子号、转速、时间，此时离心机处于设置状态，停止灯亮、运行灯闪烁;按下启动离心开始

(常用，最高转速为13000r/min，时间最长为20分钟);

注意：对应的转子一定要设置在相应的转速范围内，不可超速使用，否则对试管或转子有损坏。

6、离心机时间倒计时到“0”时，离心机将自动停止，当转子停转后，打开门盖取出离心管，关断电源开关。

(四)、微量移液管的使用

1. 将微量移液器装上吸头(不同规格的移液器用不同的吸头) 2. 将微量移液器按钮轻轻压至第一停点;

3. 垂直握持微量移液器，使吸嘴浸入液样面下几毫米，千万不要将吸嘴直接插到液体底部;

4. 缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样液。否则液体进入吸嘴太快，导致液体倒吸入移液器内部，或吸入体积减少; 5. 等一秒钟后将吸嘴提离液面

6. 平稳地把按钮压到第一停点，再把按钮压至第二停点以排出剩余液体; 7. 提起微量移液器，然后按吸嘴弹射器除去吸嘴。

(五)、PCR的使用

1、开机：打开开关，视窗上显示“SELF TEST”。

2、放入样品管，关紧盖子。

3、如果要运行已经编好的程序，则直接按《Proceed》， 用箭头键选择已储存的程序，按《Proceed》，则开始执行程序。

4、如果要输入新的程序，则在RUN-ENTER菜单上用箭头键选择ENTER PROGRAM,按《Proceed》，

1)命名新的程序，最多8个字母，输入后按《Proceed》确认(如何输入字母、数字)。 2)输入程序步骤：名字输入后，确认，然后输入相关程序

5、输入完成的程序后，到RUN-ENTER菜单，选择新程序，开始运行。

6、其它：用《pause》可以暂停一个运行的程序，再按一次继续程序。用《stop》或《Cancel》可停止运行的程序。

(六)、 电泳仪的使用

1. 首先用导线将电泳槽的两个电极与电泳仪的直流输出端联接，注意极性不要接反。 2.按电源开关，显示屏出现“欢迎使用DYY-12型电脑三恒多用电泳仪…”等字样后，同时系统初始化，蜂鸣4声，设置常设置。屏幕转成参数设置状态，根据工作需要选择稳压稳流方式及电压电流范围。 3.确认各参数无误后，按“启动”键，启动电泳仪输出程序。在显示屏状态栏中显示Start! 并蜂鸣4声，提醒操作者电泳仪将输出高电压，注意安全。之后逐渐将输出电压加至设置值。同时在状态栏中显示“Run”，并有两个不断闪烁的高压符号，表示端口已有电压输出。在状态栏最下方，显示实际的工作时间(精确到秒)

4.电泳结束，仪器显示：“END”，并连续蜂鸣提醒。此时按任一键可止鸣

(七)、高压灭菌锅

1、开盖：转动手轮，使锅盖离开密封圈，添加蒸馏水刚没至板上

2、通电：将控制面板上电源开关按至ON处，若水位低(LOW)红灯亮

3、堆放物品：需包扎的灭菌物品，体积不超过200mm×100mm×100mm为宜，各包装之间留有间隙，堆放在金属框内，这样有利 于蒸汽的穿透，提高灭菌效果 ，灭菌时间： 121℃， 20min，;如为液体，液体必须装在可耐高温的玻璃器皿中，且不可装满，2/3即可， 121℃， 18-20min

4、密封高压锅：推横梁入立柱内，旋转手轮，使锅盖下压，充分压紧

5、设定时间和温度，开始灭菌

6、灭菌结束，所有东西放入干燥箱干燥，排尽水气

五、思考题

1、列出分子生物学常用仪器的名称，用途及操作时的注意事项。

答：①恒温气浴摇床：常用于液体摇匀以培养微生物、细菌和细胞等。注意要依据不同的用途设置不同的参数。②超净工作台：常用于为微生物学实验提供无菌操作环境。注意操作时关掉紫外灯，避免给人类带来伤害。③低温台式高速离心机：常用于分离纯化蛋白、病毒、细胞等。使用时不能随便移动离心机或打开盖子;离心机运行时要处于锁定状态;离心管的放置要处于平衡状态。④微量移液管：用于计量和转移微量液体的专用仪器。操作时注意避免枪头的污染;调节刻度时不宜超过最大量程;使用完后将刻度调到最大收藏。⑤电泳仪：可对不同物质进行定性或定量分析，或将一定混合物进行组分分析或单个组分的提取制备。操作时不可把导线极性接反;当电泳仪进入工作状态后，避免人体与其各部分的接触，不同介质支持物的电泳不要同时在同一电泳仪上进行;若使用时出现异常，要立刻切断电源。⑥PCR仪：用于扩增DNA片断。操作时应注意盖子要盖紧，按正确步骤进行。⑦高压高温灭菌锅：用于杀菌消毒。使用时应严格按照规程操作，避免发生安全事故。

实验二 琼脂糖凝胶电泳的制备及核酸检测

一. 实验目的

1、掌握琼脂糖凝胶电泳的原理;

2、学习琼脂糖凝胶电泳的操作。 二. 实验原理

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。

DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。 溴化乙锭(EB)未扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA含量成正比。

三、仪器和试剂

仪器： 微量移液器，电泳仪，电泳槽，微波炉

试剂： 琼脂糖：1.0%;电泳缓冲液(50 × TAE 电泳缓冲液取Tris24.2g ，冰醋酸5.7ml ， 0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml ，加蒸馏水至100ml ) EB：5 µl / 100 ml TBE 电泳材料：标准分子量核酸(DL2000) 四. 操作步骤

(1)制胶(以20 mL为例)

a. 称取0.2 g 琼脂糖，加入20 ml 的1XTAE缓冲液(pH 8.0)，摇匀; b. 微波炉加热，至琼脂糖完全溶解(要防止过热溢出三角瓶);

c.将制胶板放入制胶槽中，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖(约50℃)加入2ul EB后，混均匀，倒入其中，直至厚度为4～6 mm(如有气泡要把气泡赶出)，在室温下冷却凝固(约30~ 45 min);

d.小心垂直向上拔出梳子,以保证点样孔完好,将胶板置于电泳槽中。 (2)点样

用微量移液器将5 µl含蓝色染液的 DL2000 加入点样孔下部。 (3)电泳

打开电源开关，调节电压至3~5 V/cm(约100 V)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约30-40分钟后即可观察结果。 (4)观察

将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度。如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳，则可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。

五、实验结果

点样时效果较好的照片点出的白色荧光线比较亮，条带粗细均匀;条带没有出现两端粗中间细的情况

六、思考题

1、做琼脂糖凝胶电泳应注意哪些问题。

答：①EB为强致癌剂，使用时一定要戴手套，避免造成伤害。EB废液要进行正确的处理。②制胶过程中要注意细节，用微波炉加热时要分三步，每步只加热十秒，且要用不戴手套的那只手开微波炉，以免污染。③拔梳子时要垂直向上拔出，以防破坏点样孔。④点样时要小心，既要将样品点到样孔里，又不至于将点样孔戳破。⑤接电源时不可把正负极接反。

第四篇：分子生物学实验室常用仪器及使用方法

实验一

分子生物学实验室常用仪器及使用

事实证明，在科学飞速发展的今天，无论从事哪个领域的研究，要想突破，除了有良好的理论基础外，更重要的是依赖于先进的技术和优良的仪器设备以及良好的研究环境。一个标准的分子生物学实验室除了具有一般生物学实验室的常规仪器设备外，还具有一些特殊用途的仪器，这些仪器一般较精密，价格昂贵。下面介绍这些仪器的使用方法和注意事项。

一、冷冻离心机

低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实验中都离不开低温离心技术，心机成为分子生物学研究中必备的重要仪器。室的高速冷冻离心机为GL-20G-Ⅱ型(上海安亭)×10ml和12×1.5ml。极限转速20000rpm。

1. 安装与调试

离心机应放置在水平坚固的地面上，应至少距离中，周围空气应呈中性，且无导电性灰尘、易燃气体和腐蚀性气体，环境温度应在之间，相对湿度小于80%。试转前应先打开盖门，用手盘动转轴，轻巧灵活，无异常现象方可上所用的转头。转子准确到位后打开电源开关，然后用手按住门开关，动后立即停止，并观察转轴的转向，若逆时针旋转即为正确，机器可投入使用。2. 操作程序

(1)插上电源，待机指示灯亮;打开电源开关，调速与定时系统的数码管显示的闪烁数字为机器工作转速的出厂设定，温控系统的数码管显示此时离心腔的温度。

(2)设定机器的工作参数，如工作温度，运转时间，工作转速等。

(3)将预先平衡好的样品放置于转头样品架上，关闭机盖。

(4)按控制面板的运转键，离心机开始运转。预先设定的值。

(5)在预先设定的运转时间内(不包括减速时间)定的减速时间内降至零。

(6)按控制面板上的停止键，数码管显示机器已准备好下一次工作。

3. 注意事项

(1)离心机应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹配，并要求有良好的接地线，机器不使用，要拔掉电源插头。

(2)开机前应检查转头安装是否牢固，机腔中有无异物掉入。

(3)样品应预先平衡，使用离心筒离心时离心筒与样品应同时平衡。

(4)挥发性或腐蚀性液体离心时，应使用带盖的离心管，并确保液体不外漏以免腐蚀机腔或造成事故。

在国内，有多个厂家生产冷冻离心机，，落地式。配有角式转头：10cm在预先设定的加速时间内，其运速升，离心机开始减速，其转速在预先设dedT，数秒钟后即显示闪烁的转速值，这时1

本实验6×50ml、120～30℃

至 因此低温冷冻离 以上且具有良好的通风环境再按运转键，转

(5)除工作温度、运转速度和运转时间外，不要随意更改机器的工作参数，以免影响机器性能。转速设定不得超过最高转速，以确保机器安全运转。

(6)使用中如出现0.00或其它数字，机器不运转，应关机断电，10秒钟后重新开机，待所设转速显示后，再按运转键，机器将照常运转。

(7)不得在机器运转过程中或转子未停稳的情况下打开盖门，以免发生事故。

(8)每次操作完毕应做好使用情况记录，并定期对机器各项性能进行检修。

二、电泳仪

电泳技术是分子生物学研究不可缺少的重要手段。带电泳大类，自由界面电泳不需支持物，泳目前已很少使用。区带电泳需用各种类型的物质作为支持物，纤维薄膜、非凝胶性支持物、是琼脂糖凝胶电泳。应用电泳法可以对不同物质进行定性或定量分析，组份分析或单个组份提取制备。下面以为例介绍其使用方法。

1.使用方法

(1)按电源开关，显示屏出现“欢迎使用同时系统初始化，蜂鸣

U:

0V

U=

I:

0mA

I =

P:

0W

P=

T:

00:00

T=

其中:左侧大写Mode(模式)：STD(标准

(2)设置工作程序。用键盘输入新的工作程序。例如，要求工作电压I限制在200mA以内，功率动关掉输出。则操作步骤如下：

①按“模式”键，将工作模式由标准(

凝胶性支持物及硅胶―4声，设置常设置。屏幕转成参数设置状态，见图一：

100V

50mA

|

50W

| 01:00

|U: I: P: T: );TIME(定时W限制在 电泳一般分为自由界面电泳和区如等速电泳、密度梯度电泳及显微电泳等，这类电G薄层等，分子生物学实验中最常用的DYY-12型电脑三恒多用电泳仪(北京六一仪器厂)DYY-12型电脑三恒多用电泳仪„”等字样后，

Mode：

STD

中间部分显示程序的常设值);VH(伏时);STEP(分步)100W以内，时间T为3STD)转为定时(TIME)2

醋酸或将一定混合物进行 (预置值)。U=1000V，电流20分，并且到时间自常用的支持物有滤纸、

|

为电泳时实际值; 小时 模式。每按一下模式键，其工作方式按下列顺序改变：

STD®TIME®VH®STEP®STD。

②先设置电压U，按“选择”键，先将其反显，然后输入数字键即可设置该参数的数值。按数字1000,则电压即设置完成。

③设置电流I，按“选择”键，先使I反显，然后输入数字200。

④设置功率P，按“选择”键，先使P反显，然后输入数字100。

⑤设置时间以按“清除”键，再重新输入。

⑥确认各参数无误后，按“启动”键，启动电泳仪输出程序。在显示屏状态栏中显示Start! 并蜂鸣至设置值。同时在状态栏中显示“压输出。在状态栏最下方，显示实际的工作时间(精确到秒)

⑦每次启动输出时，仪器自动将此时的设置数值存入“要调用时可以按“读取”键，再按“出执行。

⑧电泳结束，仪器显示：

2.注意事项

(1)U、I、P三个参数的有效输入范围是：

(2)一般情况下，当的地方，可以用万用表的欧姆档逐段测量。

(3)如果输出端接多个电泳槽，则仪器显示的电流数值为各槽电流之和，此时应选择稳压输出，以减小各槽的相互影响。

(4)注意保持仪器的清洁，不要遮挡仪器后方进风通道。严禁将电泳槽放在仪器顶部，避免缓冲液洒进仪器内部。

(5)本仪器输出电压较高，使用中应不避免接触输出回路及电泳槽内部，以免发生危险。

(6)长期不用仪器，应放置在干燥通风的清洁环境中保存。

三、分析天平

分析天平是定量分析工作中不可缺少的重要仪器，充分了解仪器性能及熟练掌握其使用方 T，按“选择”键，先使 4声，提醒操作者电泳仪将输出高电压，“No Load!时，首先应关机检查电极导线与电泳槽之间是否有接触不良

T反显，然后输入数字Run”，并有两个不断闪烁的高压符号，表示端口已有电0”键，按“确定”键，即可将上次设置的工作程序取END”，并连续蜂鸣提醒。此时按任一键可止鸣。U：5 3

注意安全。3000V;I：320。如果输入错误，可之后逐渐将输出电压加 MO”号存储单元。以后需4～400mA P：4～400W. 。～ ; 法，是获得可靠分析结果的保证。分析天平的种类很多，有普通分析天平、半自动/全自动电光分析天平及电子分析天平等。目前实验室常规备用的是自动化程度较高的电子分析天平。下面介绍电子分析天平 PL203/01型和AL104/01型 (METTLER-TOLEDO)的性能及使用方法。PL203/01型精密电子天平：最大称量210g;实际分度值0.001g;AL104/01型高分辨率电子分析天平：最大称量110g;实际分度值0.0001g

1. 使用方法

(1)检查并调整天平至水平位置。检查电源电压是否匹配(使用配置的稳压器)，按天平仪器要求通电预热至所需时间

(2)打开天平开关“短时点亮，天平回零时，可进行正式称量。

(3)称量时将洁净称量瓶或称量纸置于称盘上，关上侧门，天平将显示该重量，点击“®O/T¬”键自动校对零，然后逐渐加入待称物质，直至所需重量为止。

(4)称量结束应及时除去称量瓶(纸)

2. 注意事项

(1)天平应放置在牢固平稳水泥台或木台上，室内要求清洁、干燥，同时应避免光线直接照射到天平上。

(2)称量时应从侧门取放物质，读数时应关闭箱门以免空气流动引起天平摆动。

(3)挥发性、腐蚀性、强酸强碱类物质应盛于带盖称量瓶内称量，防止腐蚀天平。

(4)电子分析天平若长时间不使用，则应定时通电预热，每周一次，每次预热确保仪器始终处于良好使用状态。

四、分光光度计

不同物质对不同波长入射的吸收程度各不相同，从而形成各具特征的吸收光谱原理，应用比色法可以对某些有色物质进行定性或定量分析。而且精度低，已远远不能满足高精度微量分析的要求。不断地更新换代，人们引进了分光光度法的概念，单色器、吸收池、接受器、显示屏幕所组成，它不仅适应于可见光区，同时还扩展至紫外光区及红外光区。光密度(而测定某一溶液对该单色光的吸收值。液定量和纯度的初步判断。下面介绍紫外可见光分光光度计的使用方法。该仪器除了能检测核酸样品浓度外，的测定，能检测低至几微升样品(

30min 。 on”，天平则自动进行灵敏度及零点调节。待显示屏上所有字段 ，关上侧门，切断电源，并做好使用情况登记。

随着科学技术不断发展，分光光度计随之应用。OD)是许多溶液中的溶质定量的指标之一，通过所产生的单色光分子生物学实验中常使用紫外分光光度计进行核酸溶还可进行蛋白质浓度以及细胞培养液浓度70µl和5～7µl)，样品无需稀释，测量后还可全部回收。4

分光光度计由光源、GeneQantTM Pro

2h，以。根据这一分析仪器也Amersham)

但由于比色法仅限于可见光区，(使用方法

(1)打开电源开关(ON)，等待数秒钟，显示屏上显示一系列数据，如本机型号、当前日期等，这些数据可以重新设置，当出现“instrument Ready”即可进入下一程序。

(2)在仪器面板上有许多功能键，其中包括检测base sep 、Tm、DNA、RNA、oligo、Protein595assay、Protein280 meas、cell culture等。例如，欲检测DNA， 按DNA键，即进入DNA检测程序。在显示屏上：

以上为仪器预设置的参考数据，若按“新设定。

(3)取石英样品杯后放入仪器上的样品槽中，放入时注意样品杯的光学面朝前方。

(4)按“set ref”键，进行空白测试。显示屏上出现一系列数据均““Insert sample 中进行测定。

(5)一个样品测定完毕，按“

(6)取出样品杯，吸出样品，然后用高纯水洗几次，自然晾干。由于样品杯十分昂贵，使用时要小心操作。以至铬酸洗液(浓酸中浸泡不要超过

五、数字式酸度计

酸度计是实验室配置溶液必备的仪器。本实验室的酸度计为台式微电脑酸碱度计和温度计(Hanna

1. 使用方法

(1)将pH

70µl或5。将样品杯取出，吸干水分，稍干燥后，同样吸入待测样品，放入样品槽 ,测量pH范围为

Pathlengh

10mm

Units

µg/µl

Use 320nm

NO

Dilution Faotor 1

Insert reference,

enter”键，和“select”键可以将以上的参数进行重7µl ，容量大小根据需要。先用吸管吸高纯水入样品杯中，然 0.000”并提示插入样品stop”键，返回“Instrument Ready”。 可用温水或稀盐酸，乙醇15分钟)，表面只能用柔软的绒布或拭镜头纸擦净。 0.00～14.00pH;温度为0.0～100.0℃;

～”不能用手指拿样品杯的光学面，用后要及时洗涤，)电极和温度探头与主机连接，主机与电源连接。

(2)取出电极保护套，如果有结晶盐出现，这是电极常见现象，浸入水后就会消逝。如果薄膜玻璃或透析膜发干，可在HI170300电极保存液中浸泡1小时。

(3)pH校准。将pH电极和温度探棒浸泡在所选的标准缓冲液内4cm(建议用pH6.8

6、7.01)，缓冲液值可通过“D℃”或“Ñ℃”键来调节。按“CAL”键，仪器将显示“CAL”和“BUF”符号及“7.01”数据。当读数不稳定时，屏幕会显示“NOTREADY”;当读数稳定时，屏幕会显示“READY”和“CFM”，按“CFM”键确认校准值。确认第一校准点后，将pH电极与温度探棒浸泡在标准缓冲液内4cm(建议用pH4.0

1、9.

18、10.01);再按“CAL”键，仪器将显示“CAL”和“BUF”符号及“4.01”数据。按“CFM”键确认校正值。

(4)pH测量。校准完毕后，仪器自动进入溶液约4cm，停几分钟让电极读数稳定。

2. 注意事项

(1)由于pH211酸度计内装有可充电电池，在刚购买或长时间放置后，再使用时，通电校正测量完毕后，可将电源继续还插入电源插座，只需关闭开关，这样可以保证电池充电，是校正值得以储存，下次测量时无须校正即可进入精确测量。

(2)不可用蒸馏水、去离子水和纯水浸泡电极。如果读数偏差太大(±没有校正或电极变干。为避免电极受损，在关机前要将状态时，在电极浸入电极保存液前，电极要与机器分开。

(3)如仪器已测过几种不同的样品溶液，请用自来水清洗，样品清洗电极。

(4)温度会影响pH的读数，为测量准确的补偿，用HI7669/2W温度探棒浸入样品中，紧靠电极并停几分钟，如果被测溶液的温度已知或测量是在相同温度下进行，只需动手补偿，示温度读数伴有℃信号闪烁。温度可通过“

六、PCR仪

PCR仪，也称DNA热循环仪、基因扩增仪，它是使一对寡核苷酸引物结合到正负上的靶序列两侧，从而酶促合成拷贝数为百万倍的靶序列三种不同温度进行DNA变性、引物复性、

PCR仪主要应用于基础研究和应用研究等许多领域，如基因分析、序列分析、进化分析、临床诊断、法医学等等。随着分子生物学的不断发展，因此了解PCR仪的性能，熟练掌握仪器的正确使用方法及使用过程中的注意事项，将是十分必要的。

现介绍PCR 扩增仪(Tl Thermocycler)的使用方法和注意事项。

pH测量状态，将电极与温度探棒浸泡在待测

pH电极从溶液中拿出。当处于关机 或在插入样品溶液前，用待测pH值，温度要在适合的范围内进行自动温度那么此时温度探棒是不用连接，Ñ℃”或“D℃”来调节。 DNA片段，它的每一循环包括在DNA聚合酶催化的延伸反应的三个过程。PCR扩增技术也得到普及推广应用， 6

1pH)，则是由于屏幕上会显DNA链 1. 使用方法

(1)接通电源开关，仪器进入准备状态;在显示屏上记录了当前仪器的温度和盖子(Lid)的温度。若仪器正在运行时，须按“

B ”键(start/stop)，才能退出运行并返回准备状态。

(2)编写程序段。在准备状态下按“

C ”键(programs)进入编程状态，选定一程序号，然后按“enter”键，进入下一程序;按 “A”(list)键后，选一文件号(empty program);再按“enter”键，进入下一程序;按“ABC”键，进入下一程序，用上下左右键号选择一个字母(A、B、C、D、„)，然后按“enter”键，进入下一程序;按“name ok”键，完成文件命名。

(3)设定盖子的温度。性温度是95℃，那么盖子的温度就要设定为程序。

(4)设定变性温度、变性时间、延伸温度、延伸时间、退火温度、退火时间及循环总数等参数。从第一步依次按“间，全部参数设置完后，按“

(5)运行程序。检查设定是否正确，屏上可观察到系统运行的情况，按“

七、凝胶成像系统

本系统属全自动电脑控制影像分析系统，主要拍摄核酸的acrylamide电泳胶片。在与确定量，是分子生物学及生化蛋白试验的重要检测工具。像头，变焦镜，电脑以及专业凝胶图象采集及分析斑点测量、PCR密度的定量分析等。此外，还提供图像采集、标注、打印、数据和图像发送到Word、Excel、图像处理等功能。

1.使用方法

(1) 打开电脑，启动凝胶分析软件，进入用户界面。

(2)打开采集凝胶图像的暗箱装置电源开关，放入凝胶，打开紫外光源或白光光源，将采集装置与电脑上采集卡相连，然后选择“文件”菜单中的“图像采集”或工具栏的“图像采集”按钮，出现图像窗口：晰，可以调节暗箱上的变焦镜，使之清晰。可直接将图像保存起来，也可通过“图像处理”对图像进行旋转、裁剪、滤波、调节对比度„„方面的处理。

(3)对读入的电泳凝胶图像，可以启动电泳凝胶分析系统。在“功能选择”菜单中选择“电泳凝胶”或在工具栏上的“电泳凝胶”工具，将出现泳道分析工具栏，并在“图像显示”子窗口中出现一个红色的矩形框。还可进入“条带分析”系统，对条带 lid temp：

℃”enter”键进入，用四个移位键移动设定位置。先设定温度，后设定时pgm ok”键，所设定的程序自动被保存。

按“Stop”可停止运行。markers比较后，可精确计算样本的分子量，对核酸电泳也可准 “开始采集”105℃。待盖子预热后按“start”键，选择设定好的程序，开始运行。显示 agarose本系统包括暗箱，.软件(3.3版)。该软件提供对电泳凝胶、 、“停止采集”、“采集图像”等。如果图像不清 7

10℃，例如变enter”键，进入下一 紫外透射仪，摄 进行编号，对“，盖子的温度一般比变性温度要高 电泳胶片，及蛋白质的二条以上的条带进行比较。

(4)采集图像结束后，关闭暗箱电源开关，从暗箱中取出凝胶，并将玻璃板清洗干净，晾干。

八、空气恒温摇床

摇床(振荡器)为实验室的常规设备。SHK-99-Ⅱ型台式空气恒温摇床，采用微电脑控制系统，温度范围：室温+5℃～60℃，精度±0.5℃;时间范围：1分钟～99小时59分钟;转速范围：60RPM～250RPM。

1.使用方法

(1)LED屏幕上各段数据：

000

00.0

屏幕上“1”表示第一段，如果是第二段则为“转速，“Time”表示时间，不设定时可自动累计时间一直运行。的值随时可以修改，随时按新值运行。

(2)工作程序设置。按“F1”键，进入设置状态。可在速度，温度，时间，运行等四部分之间切换。在每一部分按“F2”键输入数据，输入完十位数据，再输入个位数据，按“键，再按“F2”键，到小数位，再按“

(3)再按“F1”键，转回运行状态，按“

(4)按“End”键，结束系统运行。

2. 注意事项

(1)打开电源，系统开始自检，等待完毕，可以进行第2步参数设置。若屏幕出现：错误;b.“MOTOR ERROR”，表示电机部分有错误。

(2)运行过程可以打开箱盖，这样电机不运行，时间也停止，盖上盖接着运行。

(3)工作完毕，关闭电源。关机后，要等一段时间再开机。

九、水的净化装置

分子生物学实验对水的纯度要求越来越高， RPM

Temp

Time

00:00 2”，“Temp”表示温度，“RPM”表示每分钟“Temp”、“RPM”、 F2”键，又到十位，以此循环。 Start”键，电机开始运行，时间开始计时。LCD屏幕出现“WELCOME”字样，系统自检a.“TEMP ERROR”，表示温度检测线路有

一般蒸馏水常常难以满足实验要求，大多要求要

Time”F2”

“ 进行第二次蒸馏(双蒸水)，它可以去除水中的大部分有机杂质，但制作时间较长，而且无机杂质还是很多。许多实验还需要去离子水，这就需要阴阳离子交换树脂进行处理。目前，分子生物学实验室都使用高质量的超纯水。如美国微孔滤膜公司的Milli-Q超纯水制造系统所制造的超纯水适用于许多学科领域，如分子克隆、各种色谱分析、氨基酸分析、DNA测序、酶反应、组织和细胞培养等实验。下面介绍RO-MB壁挂式反渗透高纯水机性能及使用方法。RO-MB反渗透高纯水机(杭州永洁达)产水量(25℃)10L/H;产水水质：RO纯水：<10μs/cm，高纯水：>15MΩ.cm;可用自来水制成普通实验用水和高纯水，同时满足不同水质要求。在线电导率仪对产水水质连续检测，可保证产水质量。

1. 使用方法

(1)准备：先检测与纯水机相连的原水管路、废水管路连接是否正常，打开原水阀门。供电电源是否正常，检查按钮是否在关闭状态(按钮弹出状态)220V电源插座上。

(2)开机：依次按下电源开关，泵开关，纯水机启动产水，同时废水排出，指示灯亮起，并处于自动运行状态。

(3)取纯水：若打开阀门打开时，检测仪表显示高纯水电导率或电阻值。一杯水后再取新鲜水。

(4)关机：不用时可关闭个按钮停机，自来水进水阀门不必关闭，这时机子内部的进水电磁阀已自动切断水路。只要管路阀门不漏，也可使机子保持自动待机状态。

2.注意事项

(1)纯水机的正常使用环境温度为度不低于5℃。

(2)预处理滤芯一般三至六个月更换一次，实际使用寿命与自来水水质、总过滤量等有关。

(3)混床滤芯产高纯水约水中含盐量、总用水量等有关。天开机30分钟冲洗一次，冬季每隔

(4)使用过程若发现停机后泵仍频繁地每隔数分钟有规则地启动数秒钟又停机，此为管路漏水引起，需及时打开机箱加以解决。象，有利于冲洗和保护反渗透膜元件，

十、消毒设备

细菌和细胞培养以及核酸等有关实验所用的试剂、

RO纯水或高纯水出口阀门，则可获得相应水质的纯水。当高纯水出口 115～3吨，约二至四个月更换一次，2～3避免遭到微生物繁殖和减少污物沉积，。将电源插头插入带有接地线的为了获得高质量的高纯水，可以先放掉 35℃，产水量会随温度降低而下降，冬季保养温实际使用寿命与自来水水质、2天。必须注意定期冲洗维护。夏季宜每 乃属正常现尤其高温季节。 器皿及实验用具，应严格灭菌，有的实验

～设备停运时间超过天开机冲洗一次。若每隔半小时以上启动数秒钟又停机，还要求没有核酸酶的污染，故应将实验器械，试剂等进行高压消毒。对于经过导入DNA重组分子的菌株，操作后必须进行严格的高压消毒灭活处理。

大批实验物品、试剂、培养基等可以使用大型消毒器进行消毒。一些不能经受高压、高温消毒的试剂可用滤器滤膜除菌，器皿可用紫外线照射、75%乙醇或0.1%的十二烷基硫酸钠(SDS)浸泡消毒。所有的细胞培养、细菌培养的操作，都应在紫外线消毒后的超净工作台中进行。

下面介绍立式自动压力蒸汽灭菌器(LDZX-40BI)的使用方法。

1.使用方法

(1)开盖：转动手轮，使锅盖离开密封圈。

(2)通电：连接自动进水装置。接通电源，将控制面板上电源开关按至低(LOW)红灯亮，蒸发锅内属断水状态;缺水(

(3)加水：打开水源，水位达到低水位，控制面板上低水位红灯和缺水黄灯相继灭，加热(1-绿灯)亮，继续加水至高水位(

(4)堆放物品：需包扎的灭菌物品，体积不超过包装之间留有间隙，堆放在金属框内，这样有利于蒸汽的穿透，提高灭菌效果。

(5)密封高压锅：推横梁入立柱内，旋转手轮，使锅盖下压，充分压紧。

(6)设定温度：通电后数显窗灯亮，上层为红色，显示温度，下层为绿色，设定温度和时间。先按控制面板上确认键，绿色数显闪烁，进入温度设定状态。按一次移位键指相应位置闪烁，根据所需数据位置进行(单项循环)移位。按△增加键或所需温度设定。设定完毕，按二次确认键，进行温度确认。

(7)设定时间：按一次确认键，将温度设定切换成时间设定;再按一次移位键，所指相应位置闪烁，完毕，按二次确认键，定时器开始倒计时。

(8)灭菌：在加热初，将下排汽阀打开至垂直位置;下排汽阀待蒸汽冒出时，压力表显示指示为的15%为宜。安全阀设定数，超出压力部分，安全阀将自动泄压，并开始计数灭菌所需时间。灭菌完成，电控装置将自动关闭加热系统，伴有蜂鸣提醒;并将保温时间切换成控制面板上电源开关按至

(9)干燥：物品灭菌后需要迅速干燥，须打开放汽阀和下排汽阀，将灭菌器内的蒸汽迅速排出，使物品上残留水蒸汽快速挥发。 根据所需数据位置进行移位;进行时间设定确认。 ℃时，将下排汽阀推向水平关闭位置;留有微量蒸汽逸出，以控制总汽流量使用最高灭菌温度为OFF HIGH)绿灯亮，自动停止加水。按增加键或减少键，时间采用倒计时，124℃～126℃，

ON处，若水位LACK)黄灯亮，电源已正常输入。

200mm×100mm×100mm为宜，各

所??减少键，进行 进行所需时间设定。设定当灭菌锅内温度达到设定温度，0.145Mpa～0.165Mpa范围内属于END显示;此时，将

100压力在处;关闭电源，停止加热待其冷却。

(10)将盖开启，取出已灭菌物品。关闭水源，打开下排水阀，排尽灭菌室的水与水垢，以备下次使用。

2.注意事项

(1)堆放灭菌物品时，严禁堵塞安全阀的出汽孔，必须留出空位保证其空气畅通，否则安全阀因出汽孔堵塞不能工作，造成事故。

(2)灭菌液体时，应将液体灌装在硬制的耐热玻璃瓶中，以不超过选用棉花纱塞，切勿使用未打孔的橡胶或软木塞，放蒸汽，必须待压力表指针回零位方可排放余汽。

(3)对不同类型，不同灭菌物要求的物品，切勿放在一起灭菌，以免顾此失彼，造成损失。

实验二

质粒DNA

一、实验原理

细菌质粒是一类双链、闭环的在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，于染色体外的游离状态，制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

DNA，大小范围从

在灭菌液体结束时不准立即释 至200kb3/4体积为好，瓶口随着染色体的复特别注意，的提取-碱裂解法1kb以上不等。各种质粒都是存通常情况下可持续稳定地处但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，

一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA大量扩增;②收集和裂解细菌;③分离和纯化质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验介绍碱裂解法提取质粒DNA。

碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠绕形成不溶性网状结构，而复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA。

二、仪器及试剂

1.仪器及耗材：37℃恒温摇床、冷冻离心机、台式离心机、微量移液器、50 ml离心管、1.5 ml离心管管、枪头、各种规格的量筒、接种环、试剂瓶、100 l或者250 ml三角瓶、玻棒等。

2.试剂及配制：

LB培养液的配制：

酵母浸提物

5.0 g;

胰蛋白胨

10.0 g;

NaCl

10.0 g;

依次称量后加入800 ml去离子水后搅拌至完全溶解，用5 mol/L NaOH(约0.2 ml)调节培养液的pH值至7.0。再加去离子水将溶液定容至总体积为1000 ml，10磅高压灭菌20 min，冷却后4℃保存。

溶液 Ⅰ(GET缓冲液)： 25 mmol/LTris-HCl(pH8.0), 10 mmol/L EDTA, 50 mmol/L 葡萄糖

配制：1000 ml

1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)

25 ml

0.5 mol/L EDTA(pH8.0)

20 ml

20% Glucose(1.11mol/L)

45 ml

dH2O

910ml

将以上溶液混合装瓶， 10磅高压灭菌20 min，冷却后4℃保存。

溶液II(变性液)：200 mmol/L NaOH ， 1% SDS

配制： 500 ml

10% SDS

50 ml

2N NaOH

50 ml

取以上溶液，用灭菌去离子水定容至500 ml，充分混匀。室温保存，此溶液保存时间最好不超过一个月，最好现用现配。

注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。

溶液 III (醋酸钾液)：3 mol/L 醋酸钾(KAc)缓冲液，pH 5.6。 5 mol/L 冰醋酸

配制：500 ml

醋酸钾

147 g

冰醋酸

57.5 ml

加入300 ml去离子水后搅拌溶解。待醋酸钾溶解后，再加去离子水将溶液定容至高温高压灭菌后，4℃保存。

10×TE缓冲液(pH 8.0)：100 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA

配制：1000ml

1 mol/LTris-HCl 缓冲液(pH 8.0)

100ml

500 mmol/L EDTA (pH8.0)

20 ml

加入约800 ml的去离子水，均匀混合。溶液定容至1 L。高温高压灭菌后，

苯酚/氯仿/异戊醇(25 : 24 : 1)：将量取25 ml Tris-HCl(pH8.0)平衡苯酚，加入 13

500 ml。4℃保存。 24 ml 氯仿和 1 ml 异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。

其它试剂：TE(pH8.0)、异丙醇、氯仿/异戊醇(24:1)、无水乙醇、70%乙醇、氨卞青霉素贮存液(50 mg/ml)

三、操作步骤

1.菌体的培养和收获

(1)将5～10 ml含有氨卞青霉素(后接入一单菌落，并保持通气良好，于接一次，于37℃ 220 rpm振摇培养 (2)吸取培养的菌液1.5 ml，转入弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。

2.质粒DNA提取(碱裂解法)

(1)加100 ul 溶液Ⅰ 重悬细菌沉淀，用枪吹打直至混和均匀。

(2)加200 ul溶液 Ⅱ，盖紧管口，液变透明，粘稠)。

(3)加150 ul溶液 Ⅲ，轻微振荡混和

(4)12000 rpm离心6 min，取上清液至另一离心管(弃沉淀)

(5)加等量的酚/氯仿/异戊醇，旋涡混匀离心管。

(6)加1倍异丙醇，振荡混匀，静置倒置于吸水纸，将附于管壁的残余液滴除净。

(7)加200 ul 70%乙醇洗涤沉淀物，台式离心机在室温下晾干(或在50℃-60℃的烘箱中也可)

(8)沉淀加20μl TE, 反复吹打使质粒

四、常见问题及可能原因

1.提取的质粒DNA不纯：变性不充分;关键步骤反应时间过短;离心时间或速度不够。

2.提取的质粒DNA呈涂布状：操作过程中用力过猛，动作过大;操作系统内有污染。

AP)的LB培养基加入到容量为100ml的三角瓶中，然37℃ 220 rpm振摇过夜培养(约16h)后可以再转3～4 h。 的离心管中，用台式离心机以12000 rpm

轻缓上下颠倒离心管以混合内容物。室温静置10 sec，置冰上10 min (溶液出现白色沉淀。 1 min，12000 r/min离心6min，取上清液至另一10 min，12000 rpm离心6 min。弃上清液，将离心管 12000 rpm离心2 min，弃上清液，将沉淀。 DNA充分溶解，-20℃保存。 14

3 min。5 min(溶)。

1.5 ml离心 3.与染色体DNA分离不全：变性过程不完全;试剂配制有问题(成分，浓度或pH)。

实验三

琼脂糖凝胶电泳

一、实验原理

琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中，并置于静电场上。由于架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，分子的迁移速度取决于分子筛效应。因而可依据DNA可以分离相对分子质量相同，而构型不同的相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。以提供一个用于确定EB)，其分子可插入下，呈桔红色荧光，因此也可对分离的

一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在

二、仪器及试剂

1.仪器及耗材：

水平电泳槽、电泳仪、100 ml或250 ml锥形瓶、量筒、吸头等。

2.试剂及配制：

50×TAE缓冲液的配制：

配制1000 ml

DNA 片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质DNA分子的双螺旋骨因此在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，DNA， 也DNA分子。在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物相对可DNA片段大小的标准。在凝胶中加入少量溴化乙锭(ethidium bromide, DNA的碱基之间，形成一种络合物，在254～365nm波长紫外光照射DNA进行检测。 0.2kb～50kb范围内的DNA片段。本实验介绍琼脂糖凝

DNA片段分离中的应用方法。

凝胶成像分析系统、微波炉、微量移液器、透明胶带、点样板或parafilm、 2 mol/L Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA(pH 8.0) 15 分子的大小来使其分离。凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的

Tris

242 g

冰乙酸

57.1 ml

0.5 mol/L EDTA

100 ml

加入600 ml去离子水后搅拌溶解，将溶液定容至1 L后。高温高压灭菌，室温保存。

1×TAE缓冲液的配制：

称量20 ml的50×TAE缓冲液，再加入980 ml的去离子水。

溴化乙啶贮存液：10 mg/ml 溴化乙啶

配制：100 ml

称取1 g溴化乙啶，置于100 ml烧杯中，加入80 ml去离子水后搅拌溶解。将溶液定容至100 ml后，转移到棕色瓶中。室温保存。

6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。

配制：10 ml

溴酚蓝

25 mg

二甲苯青FF

25 mg

甘油

3 ml

用6×TAE缓冲液定溶至10 ml，分装成1 ml/管。-20℃保存。

其它试剂：DNA样品、DNA Ladder 、琼脂糖、

三、操作步骤

1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml，小胶用50ml)：称取0.7 g中，加入70 ml(50ml)1×TAE，瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。

2. 胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净、晾干，放入制胶玻璃板。取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。将内槽置于水平位置，好梳子。将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取 16

0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶3次至琼脂糖全部融化，并在固定位置放 (下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止。

3. 加样：在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。(注意：加样前要先记下加样的顺序)。

4. 电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60-100V，样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。

(5)电泳完毕后，取出凝胶，用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE用清水漂洗10 min。

(6)观察照相：在紫外灯下观察，DNA存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。

四、常见问题及注意事项

1.配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶。

2.琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。

3.电泳时应注意电源线路，预防触电。

4.溴化乙淀具有致癌作用，配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套。并在专门的实验室内使用。

5.紫外线对人体有损伤作用，开灯时间不宜太长，注意防护。

6.DNA带形状模糊：DNA加样过多;电压太高;凝胶中有气泡。

7.质粒DNA的存在形式有3种，①共价闭环DNA(cccDNA)，常以超螺旋形式存在;②开环DNA(ocDNA)，此种质粒DNA的两条链中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张力，形成松弛的环状分子;③线状DNA，因质粒处断裂而造成。因此质粒DNA电泳的结果中有可能出现三条泳带，它们的泳动速度为：cccDNA > 线状DNA > ocDNA。

20 min，再DNA的两条链在同一溶液染色约 DNA18

DNA

实验四

限制性内切核酸酶的酶切与鉴定

一、实验原理

限制性内切酶是一类能识别双链分子中特异核苷酸序列的水解酶，主要存在于原核生物中。根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。其中Ⅱ类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶。

限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。一般情况下，识别序列越长，在同一DNA分子中识别位点出现的频率就越小。许多限制性内切酶的酶切位点已被确定。例如EcoRl 酶的识别与切割序列为以下6个碱基对。

5′„„GAATTC„„3′

EcoR I以独特的方式识别并裂解这个顺序，形成两个 和

……G

这些末端为互补的，即粘性末端，并可在连接酶的催化下与由相连接。

限制性内切酶主要用于基因组基因片段的分离与回收以及单酶切、双酶切或部分酶切等不同方式。大量的酶切反应。小量酶切反应主要应用于质粒的酶切鉴定，DNA，大量酶切反应用于制备目的基因片段，体积为

本实验为EcoR I对质粒性内切核酸酶酶切位点。琼脂糖凝胶电泳进行鉴定酶切效果。

二、仪器与试剂

1.仪器：

水浴锅、离心管、移液器、吸头、

2.试剂：

质粒pUC

18、EcoR I限制性内切核酸酶、内切酶反应缓冲液、琼脂糖、电泳缓冲液、样缓冲液、溴化乙啶染液、无菌水等。

三、操作步骤

3′„„

……CTT AA DNA的片段化、重组DNA分子物理图谱的构建等。根据酶切目的和要求不同，可有pUC18的小量酶切。在用特定的限制性内切核酸酶对质粒进行酶切反应后，

CTT AAG„„ 5′

5′突出末端：

AATTC……

EcoR I产生的其它分子末端DNA分子的构建与鉴定、载体中目的可分为小量酶切反应和体积为20 μ50～100 μl，DNA

在质粒的双链环状DNA电泳设备等。

l, 含0.210通常可采用1 μg 30ug。 6×上

G……根据酶切反应的体积不同，～用量在～分子上有多个限制

19

1.限制性内切酶反应一般在灭菌的0.2或0.5ml PCR薄壁离心管中进行。

2. 酶切反应体系(10ul)：

酶解缓冲液(10×buffer)

1 ul

限制性内切酶

0.5 ul EcoR I(7.5U)

底物DNA(质粒)

灭菌ddH2O

限制性内切酶最后加入，手弹混匀或用吸头轻轻上下吹吸，混匀后离心15s。37℃水浴消化

3.酶切完毕，分子量标准物同时进行电泳以确定应，或加入适量酶后继续反应。

5. 经电泳观察酶切反应完全后，将上述反应液置将剩余酶切产物保存于

四、注意事项

1.限制性内切酶需保存于

2. 限制性内切酶溶液通常含有溶液底部，所以要充分摇匀。

3. 加样时吸头垂直进入试剂管，避免碰到管壁，每加完一样要换一个吸头，同时在已加的样品前做个记号以防止错加或漏加，避免污染。

4. 酶(置于冰盒上)应最后加入，尽量减少室温接触机会。加酶时吸头深入不可过深。

5. 酶解消化反应温度及时间根据该酶使用说明书而定。

6. 注意酶的用量，加入的酶量按的10%，以避免酶液中甘油干扰反应活性的可能，即在识别序列以外的位点进行切割。此外，反应体系中甘油的质量分数大于12%，以及缺少

五、相关问题

2h。 取5ul酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳， ?C20℃备用。 -20℃，操作时应将酶保持在冰浴中，避免长时间置于高温中。 NACL和存在M

x ul(依质粒浓度而定)

加至10 ul 鉴定酶切反应效果，DNA片段的大小。如果酶切不完全，可继续65℃水浴中10～15min，中止酶切反应， 50%甘油，加入反应管后，因密度较大，往往沉淀至

1-3U/ug DNA计算，酶的体积应低于反应总体积

。酶量过大(≥25U/ug DNA)时，有产生所谓星号 20

6000 r/min，DNA.酶解消化反

必须用 等情况下，都有可能出现星号活性。

1.酶的保存

不同的限制酶往往保存在大致相似的缓冲液中，这种特定配方的缓冲液能使酶活性维持较长时间。常用的保存缓冲液各组分作用如下：

Tris-HCl (7.4―7.8)：

维持稳定的pH范围。

50-100mmol/L

NaCl或KCl：提供一定的离子强度。

0.1mmol/L EDTA：

1mmol/L

DTT：

200-500ug/ml BSA：

度，防止蛋白质分子浓度过低而导致酶分子变性。

50%的甘油：

1-5 g/L的Triton-100：

白质分子的表面变性作用。

2. 酶单位的定义

限制酶的单位通常定义为：1U的酶能在约完成酶切1ug的λDNA。确定限制酶单位的具体操作方法是分别向列的酶(1U左右)，当电泳观察到酶切片段的条带不再发生变化时说明已作用完全，割的最少酶量定为1U的酶量。

3. 限制酶的作用条件

限制酶切割DNA的反应中，酶切条件是实验成功的重要因素，其中包括反应的温度、时间与反应的缓冲体系，除了这些条件外，只有在正确选择酶反应条件时才能达到最佳酶切效果。

(1)作用温度

早期的酶切反应都在37℃进行，这种方法虽然简单、统一，但却不能达到每个酶的最适反应温度。为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度。

(2)缓冲体系

限制酶反应的缓冲体系大致相同，都含有以下组分：约作用是将酶反应体系的pH维持在7.5-8.5;约

络合掉能激活限制酶的镁离子。

保护酶分子上的还原性基团。

牛血清白蛋白提高溶液中蛋白质的浓

使酶液保存于-20℃不至冻结。

这是一种非离子型表面活性剂，能防止蛋50ul合适的反应缓冲体系中，在1ug的底物中加入一系DNA的纯度与浓度也会影响酶切效果， 100mmol/L10mmol/L的MgCl2，作用是为限制酶提供激

21

1h内完全切Tris-HCl，

的活因子;1mmol/L的DTT，作用是保护还原性基团;约150mmol/L的NaCl，作用是提供合适的离子强度。由于认识的局限性，早期的限制酶反应体系仅根据其中NaCl含量的不同分为高盐、中盐与低盐三种，这同样不能使每种酶获得最适反应条件。现在提供酶的很多厂商能提供4-10种缓冲体系，其中各必需成分之间只有很小的差别，目的是使每种酶都发挥最大的作用。

缓冲液一般配成10倍的浓度，使用时以1/10的比例加入，当然为了减小吸量误差也可自行配制5倍的缓冲液。

(3) 反应体积与时间

酶反应体积一般不宜小于20ul。因为过小的反应体积在加入各种成分时易产生误差，甘油含量易超过10%。在37℃保温可因水分蒸发而明显改变反应体系中各成分的浓度，从而影响酶活力。同时还要考虑反应完毕进行电泳时，所加样品中DNA的量能够在电泳中显出清晰的泳带。

常规的酶切反应一般控制在60min内进行，但也可以根据切割对象与所用的酶将保温时间延长至十几个小时。

(4) DNA的纯度与浓度

除了上述酶反应条件外，影响酶切效果的最主要因素是DNA的纯度。例如，样品中含有大量RNA杂质时会因减少了酶的有效浓度而影响酶切效果;某些杂蛋白未除净而结合在DNA时也会影响酶切效果。。至于抽提过程中未除净的各种影响因素就更多了，可能是微量的氯仿、SDS、EDTA、酚、EB、乙醇或是琼脂糖凝胶中的硫酸根离子等。

DNA纯度的另一个指标是不可含有微量的DNA酶。如果酶切后电泳结果显示出不清晰条带或成为一片红色(术语称Smear)时，可肯定系统中已经污染了DNA酶。

DNA样品中含有大量RNA时可用RNA酶处理;含有结合在DNA上的杂蛋白与DNA酶时都可用氯仿/异戊醇抽提;当样品中含有氯仿、SDS、硫酸根等抑制酶切的小分子物质时可以通过沉淀更换一个新的缓冲体系。当然，酶切失败时也不能排除除DNA外的一切因素，如无菌水，EP管，吸咀等的干净程度以及内切酶自身的酶活性情况。

除纯度外，DNA的浓度也会影响酶切效果，一般DNA质量浓度在1ug/20ul才能得到较好的酶切效果，质量浓度高达1.5ug/20ul时就可能发生酶切困难。

(5)终止酶切反应的方法

如果需对酶切片段进行连接或标记等操作时，首先要将限制酶灭活。灭活的方法可分为三种：第一种是向反应缓冲体系中加入终浓度为10-12.5mmol/L的EDTA，原理是络合掉酶反应中所需的镁离子。但这种方法会影响需镁离子的后续反应。所以一般加入EDTA后，要用乙醇沉淀法来更换缓冲体系，以除去EDTA，但这样就会造成DNA的损失。第二种方法是热失活：一般的酶如EcoRⅠ等在65℃保温60min即可;另一些酶如Hind Ⅲ等需在85℃保温 22 30min方能达到目的;极端的例子是Ttb Ⅲ甚至不能用加热的方法使之失活。热失活方法的特点是简单并且未向体系中引入任何物质，特别适用于连续进行几个酶切反应;热失活法的另一个特点是不用更换体系，所以不会造成DNA的损失。第三种方法是用酚和氯仿抽提使之失活，之后以乙醇沉淀DNA片段。这种方法的特点是处理条件剧烈，能使酶彻底失活(不像第一种方法中酶蛋白并未变性而只是没有激活因子而已)。

实验五

大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

23

一、实验原理

体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。研究发现，用含Ca2+ 的溶液处理大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA。大肠杆菌吸收外源DNA的过程被称为转化。细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。用理化方法可以诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaCL2法。

CaCL2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0°C 、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42°C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。宿主细胞一般是限制―修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，而质粒载体携带有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因(AP+)。若将转化的细胞涂布与于含氨卞青霉素的平板上，则只有那些含有被转化质粒的细胞才能生存并生长增殖。从而可以筛选出哪个克隆含有质粒。

本实验以E.coli JM109菌株为受体细胞，受体菌使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温实现转化。将经过转化后的全部受体细胞进行适当稀释，在含有氨卞青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，化的受体细胞则因无抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。转化子经过扩增后，可将转入的质粒DNA分离提取出来，用于电泳分析、限制性内切酶图谱的制作以及

二、仪器及试剂

1. 仪器：

恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、超净工作台、分光光度计、高速冷冻离心机、台式离心机。

2. 材料

E.coli JM109受体菌、质粒pUC18。

3. 试剂：

LB培养液(1L)：

胰蛋白胨

10g

酵母粉

5g

NaCl

10g(高盐)或

氨苄青霉素(Ampicillin)

100mg/ml

24

用CaCl2处理而未有转DNA测序等实验。 5g(低盐) 在三角瓶中将胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高压灭菌。待冷却至55℃，向溶液中加入1.5ml 100mg/ml 的氨苄青霉素。然后贮存于4℃备用。

LB平板培养基：

胰蛋白胨

10g

酵母粉

5g

NaCl

10g

琼脂

13g

在三角瓶中依次将上述配方加入1L的重蒸水中并高压灭菌。待培养基降温至养基并轻轻旋转以使溶解的琼脂均匀分布于整个培养基溶液中，根据需要加入氨苄青霉素，然后可直接从三角瓶中倒出培养基铺制平板。90mm直径的培养皿约需培养基完全凝结后，倒置平皿并贮存于4℃备用。

其它试剂：

0.1M CaCl2溶液、灭菌蒸馏水

三、操作步骤

1. 感受态细菌的制备：

(1)用接种环从E.coli JM109菌平板上挑取一单克隆菌落，培养基的试管中中，37℃ 220 rpm振荡培养过夜(12～16h)。

(2)取0.5 ml过夜菌液接种到装有50ml LB液体培养基三角瓶中中，振荡培养2-3h，隔20-30min测量OD600值，至OD600值为转至1.5ml 离心管中，每管1ml菌液，按需要决定管数。

(3) 4℃，12000 rpm，离心2 min，以回收细菌。

(4)倒净上清液，倒置离心管于滤纸上1min，使残留的痕量培养液流尽。冰预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细胞，冰浴30 min 。

(5)4℃，12000 rpm，2 min。

(6)倒净上清液，倒置离心管1min，使残留液流尽。每管加CaCl2重新悬浮细胞(重悬时操作要轻)，即成感受态细胞悬浮液。

2.细菌转化：

(1)取3只灭菌的Ep管，分别编号

1、

2、

3、分别加入以下各组分：加入

25

5g ， 30接种于装有0.3-0.4。无菌条件下将细菌100 ul冰预冷的 50℃，取出培50ml培养基。5ml LB液体37℃，220 rpm每管加1ml0.1 mol/L 10～20ng

或 ～ 质粒DNA(体积小于10ul)，同时做两个对照组：

1号：受体菌对照组：

100ul感受态细胞悬浮液+2ul无菌ddH2O

2号：质粒DNA对照组：100ul 0.1mol/L CaCl2+2ul pUC19

3号：正常转化组：100ul感受态细胞悬浮液+2ul pUC19

(2)轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴30min，促进DNA分子在感受态细胞表面的吸附。

(3)转入便于DNA分子的吸附进入，提高转化率。

(4)迅速转入冰上冷却

(5)使受体菌恢复正常生长状态，并且表达

(6)取200ul37℃恒温培养箱倒置培养可将之置于37℃恒温培养箱继续培养，100ul左右，用移液器吹打重悬，再全部涂于含

(7)观察并记录转化子出现的数目，计算转化率。

四、注意事项：

1. 实验中所用的器皿均要灭菌，以防止杂菌和外源

2. 实验过程中要注意无菌操作，溶液移取、分装等均应在无菌超净工作台上进行。

3. 必须设对照组，以检验实验过程中是否有污染。

4. 整个实验过程均需置于冰上。

5. 选用对数生长期细胞，

42℃水浴2min，通过热刺激增强CaCL2的作用， 2min，修复细胞膜。 600u无抗生素lLB液体培养基，摇匀后于37℃，Ampicillin抗性基因。 Ampicillin的LB平板，将平板置于无菌台直至液体被吸收，12-16h后观察结果，其余保存于4℃。如果平板上没有长出菌落，同时将剩下的500ul菌液离心，Ampicillin的LB平板上，置 DNA

OD600不应高于0.6。 26

使细胞膜产生通道，220 rpm，振荡倒掉大部分上清，37℃培养。 60min。留 加菌液涂在含 的污染。

实验六

动物组织细胞基因组

一、实验原理

真核生物的一切有核细胞(包括培养细胞)都能用来制备基因组的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，质、脂类和糖类等分离，又要保持组织细胞在含仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的

蛋白酶K在匀浆后提取EDTA则抑制细胞中分子完整地分离出来。

二、仪器及试剂

1.

恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计(离心管(灭菌)

SDS(十二烷基硫酸钠)和蛋白酶DNA的反应体系中，Dnase

、吸头(灭菌) DNA提取 因此，制备DNA分子的完整。提取KDNA溶液经乙醇沉淀使SDS和EDTA(乙二胺四乙酸二钠)存在下保持很高的活性。SDS可破坏细胞膜、 活性;而蛋白酶K可将 27

DNA的原则是既要将DNADNA核膜，并使组织蛋白与蛋白质降解成小肽或氨基酸，GeneQuant)DNA。真核生物DNA与蛋白 DNA分离，使DNA 的一般过程是将分散好的的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯从溶液中析出。的重要特性是能在的 仪器：、移液器、玻璃匀浆器、

2. 试剂：

(1)细胞裂解缓冲液：

Tris (pH8.0)

100 mmol/L

EDTA (pH 8.0)

500 mmol/L

NaCL

20 mmol/L

SDS

10%

胰RNA酶

20ug/ml

(2) 蛋白酶K：

称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，?C20℃备用。

(3)TE缓冲液(pH 8.0)：高压灭菌，室温贮存。

(4)酚?氯仿?异戊醇(25:24:1)、

(5)异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。

三、操作步骤

1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g(0.5cm3)，尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K (500ug/ml)20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。

2.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul TE 重新溶解。(可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行)

3.加等量的酚?氯仿?异戊醇振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

4.取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿?异戊醇，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

5. 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ,10min。

6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。

7.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ， 5min。

8.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。

28

9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存备用。

10.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。

四、常见问题

1.选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。

2.在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少

3. 提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多;加溶解液太少使浓度过大。沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。

4. 电泳检测时DNA成涂布状：操作不慎;污染核酸酶等。

5.分光光度分析DNA应加入SDS至终浓度为

6.酚/氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含高浓度的的量或减少所取组织的量。

A280/A2600.5%，并重复步骤 DNA团块形成。 1.8;不纯，含有蛋白质等杂质。在这种情况下，2～8。 DNA，可加大抽提前缓冲液29

的小于

实验七

DNA的定量

一、

实验原理

核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌吟环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。

1 OD260相当于dsDNA 50 ug/ml，ssDNA 33 ug/ml和ssRNA 40 ug/ml。可以此来计算核酸样品的浓度。

紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度，纯的DNA制品的比值为1.8，RNA的比值为DNA高于1.8,则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。

对于很稀的核酸溶液，可用荧光光度法进行测定。DNA 本身并不产生荧光，但在荧光染料溴化乙锭(EB)插入DNA 的碱基对平面之间并与之结合后，DNA样品能在紫外光的激发下产生桔红色荧光。荧光强度与被结合的EB的量成正比，而被结合的EB的量又与核酸分子长度和含量成正比，使用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液的浓度。灵敏度可达1～5ng。由于是基于目测，所以是估计水平。简便，但准确性较低。

二、仪器及试剂

1. 仪器：Amersham

GeneQantTM Pro 紫外可见分光光度仪，琼脂糖凝胶电泳设备。

2. 试剂及配制：

5×上样缓冲液：

配制10 ml

30

2.0, 波长处有特异若 该方法经济

0.5 mol/L EDTA(pH8.0)

2 ml

10% SDS

50 ul

50% 甘油

2.5 ml

0.2% 溴酚蓝

10 mg

0.2% 二甲苯青FF

10 mg

加去离子水至10 ml

其它试剂：0.1×TE 、DNA标准液，EB储存液(10 mg/ml)，

三、实验步骤

1.紫外分光光度法

(1)用0.1×TE对待测DNA样品按1:20或合适的倍数稀释。

(2)开机，仪器会自动对光路及分析软件进行检测，待显示屏上出现“instrument Ready”时，进入核酸测定窗口

(3)调零。先用0.1×TE缓冲液注入样品杯，放入样品槽，关闭盖板。点击“set ref”键，仪器自动校正零点。将样品槽内的样品杯取出，换上待测样品。

(4)吸70 ul已稀释的DNA样品转入石英样品杯，放入样品槽，关闭盖板。如果样品很少，可以用5～7ul的石英样品杯。点击“enter” 键，仪器即进入分析状态。窗口同时显示260和280nm处的光密度(OD值)及260/280nm和280/260nm的比率以及DNA样品的浓度等。

(5)打开盖板，取出石英样品杯，吸出样液，用高纯水清洁石英样品杯，风干后，再加入下一个待测样品。

(6)DNA纯度：以OD260/ OD280比值来反映。当OD60 /OD80比值 <1.8时，说明样品存在蛋白质或酚等杂质，可采用平衡酚/氯仿―异戊醇再抽提除去蛋白质或用乙醚抽提去除残留酚，再用无水乙醇沉淀，TE悬浮后再测定。当OD60/OD280比值>2.0，说明样品存在RNA污染，可以用RNA酶处理样品去处RNA。

2. EB荧光分析法

(1)琼脂糖凝胶的制备。

31

(2)样品的准备。把待测DNA样品进行1:2连续稀释，并准备一份DNA标准液作对照。

(3)上样。稀释样品与上样缓冲液按1:5混合均匀后上样。

(4)电泳。用100V稳压电泳至溴酚蓝指示剂迁移到凝胶的3/4处停止电泳。

(5)取出凝胶，入EB荧光染液中作用20min，取出后清水漂洗干净，然后紫外检测。肉眼可见到的最高稀释度约含DNA 80ng。此法也可用于了解核酸样品中的严重污染干扰核酸紫外线吸收物质的情况。

四、常见问题

1. 紫外分光光度法不能区分三种构型，也不能区分染色体染色体DNA、以及偏高。

2.OD320值是背景，若溶液盐浓度越高，

3.的光面以避免干扰测定。

DNADNA和DNA解链的增色效应等因素的影响，因此测得的数据往往比实际浓度 RNA等。由于测定吸收光度OD320也越高。要小心不要摔破，32

DNA分子的超螺旋、开环、线状A260时，难以排除 持杯时也不要接触透明RNA、 分子的构型，如质粒测样品时使用的石英样品杯比较贵，

实验八

PCR基因扩增

一、实验原理

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种体外核酸扩增系统，其原理类似DNA分子的天然复制过程，是将在待扩增的DNA片段和与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，生物学中一种有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。

PCR的工作程序实际上是一个在模板种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。整个扩增过程分三步：①变性，加热使模板裂而形成两条单链;②退火，突然降低温度后模板存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度、物与模板之间;③延伸，在DNA聚合酶及镁离子等的存在条件下，从引物的结合单核苷酸，形成与模板链互补的新的循环，样本中的DNA量就增加一倍，新形成的40个循环后，DNA 可扩增106～109倍。

二、仪器及试剂

1.仪器：PCR仪、台式离心机、移液器及吸头、

2.试剂：

10X PCR 缓冲液配制(部分随Taq

250～500 mmol/L

100～500 mmol/L

15～20 mmol/L

0.5%

1mg/L

其它试剂：模板DNA、dNTP 混合液、凝胶、等

DNA扩增 DNA、一对已知序列的寡核苷酸引物和四DNA引物按碱基配对原则互补结合，也结构简单等特点，DNA链。完成以上三步为一个循环，每经过一个DNA链又成为下一轮循环的模板。 现用图示说明PCRPCR薄壁管、电泳仪等： KCl Tris-Cl(pH8.4)

MgCl2

Tween-20

BSA Taq聚合酶、上游和下游寡核苷酸引物、琼脂糖33

2n 倍。该技术已成为分子DNA主要的结合发生在引: 3 ′端开始，经过25～ 双链间的氢键断 原理酶提供)

三、操作步骤

1. PCR 体系(40ul)：

4ul

10XPCR 缓冲液

4ul

25mM MgCl2(根据不同公司PCR 缓冲液的不同而定)

Xul

模板DNA ≥50ng

1ul

上游引物(50-100ng)

1ul

下游引物(50-100ng)

1ul

dNTP Mixture(终浓度

0.4 ul

Taq聚合酶

加ddH2O至40ul

视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。

2. 将上述试剂依次加入PCR薄壁管。加样后用手轻弹混匀，使反应成分集于管底。

3. PCR反应热循环程序设置：

(1) 95℃

300s

变性

(2) 94℃

45s

变性

(3) 55℃

45s

退火(根据不同引物可能有不同退火温度)

(4) 72℃

45s

延伸(每分钟可延伸

重复步骤2-4共 30 循环

(5) 72℃

600s

延伸

反应结束后短暂离心，吸取少量(10ul)进行分析，其余置

4℃保存备用。

4. 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

34

20-200uM) 1kp) 6000 rpm 15 sec

离心

四、 注意事项：

1. PCR 体系所加成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的贮备液浓度进行核算。

2.加样时要认真,吸头垂直进入试剂管，每加完一样要换一个吸头，同时在已加的样品前做个记号以防止错加或漏加，避免污染。

3.Taq聚合酶(置于冰盒上)应最后加入，尽量减少室温接触机会。加酶时吸头深入不可过深，酶量不能过多。

五 、影响PCR的主要因素

1.模板DNA

单链、双链DNA白水解酶等的污染。模板用量依具体实验而定，PCR反应时模板变性要充分。

2. PCR引物

PCR引物设计是否成功是能否获得高质量应用时，需注意以下重要环节：

(1)PCR引物的长度约为以使它们在相近的温度下与其互补序列结合。随机的，应避免连续出现4个以上的单一碱基，否则会使引物在G+C富集序列区错误引发。引物免选用T ,尤其应避免连续出现

(2)一般来说，PCR引物长度选择24bp左右为宜。

(3)要避免引物分子自身序列互补，否则会形成发夹样二级结构。两个互之间的3，末端序列不能有明显的互补性，以免形成引物二聚体。

(4)引物的熔点温度(引物的GC/AT应与要扩增的模板

(5)引物的3，末端必须与模板严格互补，而

(6)目前在引物选择中已广泛应用计算机软件，从基因序列，并对设计的引物在引物二聚体形成、自身互补性及特异性等方面进行分析评价。 PCR

18～30个核苷酸，并且成对引物间的2个以上T500bp时，引物长度选择 Tm值)要适当。DNA相当或略高些。一般熔点温度以大于DNA样品尽量纯净，不能有核酸酶、蛋一般为100ul反应液有105-106个目标分子。PCR产物最关键的因素之一。在设计和G+C含量应相似。G+C含量应为45%～55%之间。碱基分布是尤其是不应在其3，端出现3个连续G或C，3，端碱基最好选用A、G、C,尽可能地避16-18bp;PCR产物≥5kb时，PCR引物相 Tm值与引物的碱基组成和长度有关;PCR55℃为宜。 5，末端的要求可灵活些。 EMBL或Genebank中查找有关

35

均可作为的模板，。 产物≤

(7)用于亚克隆的引物，常在引物的5，端加上限制性内切酶位点。为了保证内切酶有效酶切扩增产物，一般在酶切位点的5，端再加上几个额外的碱基。

(8)引物的浓度，在终浓度为0.2～1.0 umol/L的范围内产量基本相同，低于0.2 umol/L时会影响产量。但过高时一乃不经济，二则会出现非特异扩增及增加引物二聚体的产生。

3. 热稳定DNA聚合酶(如Taq DNA聚合酶)

一般用量为2.5 U/100uL 反应体积。酶量过多易导致非特异性产物的产生。适温度为75℃，在低温下仍保留相当高的活性，易引起不完全配对的引物伸及引物二聚体的扩增延伸，所以应注意防止非特异性产物的出现。

4. dNTPs

PCR常用的dNTP浓度在50-200umol/L。四种

低则反应速度下降，过高则特异性下降，可根据具体实验来确定最适的

5. PCR缓冲液

因PCR反应中的dNTP能与Mg2+结合，影响反应液中游离应按不同条件，确定合适的Mg2+浓度。一般在标准的Mg2+浓度约为1.5mmol/L。Mg2+离子浓度可显著影响出现非特异扩增，过低则酶活性显著下降。应用无核酸酶的及5mmol的二硫苏糖醇(DTT)对酶有一定的保护作用。

6. PCR循环的温度

预变性：起始变性的时间应该长些，以使变性充分。一般为不完全时，DNA双链会很快复性，影响PCR反应，但若变性温度太高(不宜超过会影响Taq酶的活性。

变性：一般为94℃ 30s或95℃ 20s。

引物退火：应根据具体反应中引物与模板的碱基配对情况及实验的目的确定。一般为50-72℃。退火温度增高会增强对不正确退火引物的识别，还能降低引物酸的错误延伸。

延伸：一般为72℃ 60-90s。最后一个循环后应在物合成的完整性。

7. 平台效应和PCR循环的次数

36

dNTPsPCR反应中(PCR的产量及产物特异性。BSA 72℃保留该类酶的最-模板的非特异延

dNTP浓度。 Mg2+的浓度，所以dNTP浓度200umol/L)，浓度高则Tween-20(0.05%～0.1%)94℃ 3-5min。变性95℃)，3，端不正确核苷5min，以保证PCR产应等当量。浓度、

在PCR基因扩增的后期，由于产物的堆积，将使原来产物以指数增加的速度变为平坦曲线，即所谓平台效应。它的出现是由于PCR原料的不断消耗、酶的稳定性的降低、终产物的阻滞效应及非特异性产物等多种因素造成的，所以选择合理的循环次数，既能得到足够量的PCR产物，又不要无意义地增加循环次数。

8. 操作环境

避免环境污染和交叉污染，如核酸酶的污染、非目标DNA的污染等。

37

实验九 琼脂糖凝电泳分离与纯化目的

一、实验原理

不同大小的片段分离位于不同的位置，的片段。有许多型号的低熔点琼脂糖可在双链DNA的解链温度高于收DNA片段。该法的优点是可直接在熔化的凝胶中进行各种酶反应，如合成同位素探针、进行限制酶切割和连接反应等。

二、仪器及试剂：

1.仪器

电泳仪、凝胶成像系统、移液器、离心管、吸头等。

2.试剂：

低熔点琼脂糖、待纯化的

三、操作步骤：

1.配制1%的琼脂糖凝胶，在适当的位置切一条与加样槽平行的槽，换低熔点琼脂糖凝胶。

2.加样，100V

DNA DNA酶切片段是基因工程中常用的手段。在电泳过程中切下目的片段并采用低熔点琼脂糖回收法即可获得目65℃时熔化成液体，在65℃，所以可以熔化凝胶而 DNA、凝胶回收试剂盒、去离子水或38

30℃时凝固成凝胶。由于DNA并不变性，在凝胶成液态时回TE(pH7.6)

分离和纯化

。

电泳，观察所需片段是否移至低熔点胶内。3.在紫外灯下切含有DNA的低熔点胶，置1.5 ml离心管中，于70℃热水中熔化。

4.按凝胶回收试剂盒说明书操作。

12.取适量纯化好的目的DNA在 GeneQuant 中检测，确定纯度和浓度，其余样品于-20℃保存。

四、 注意事项：

1. 配凝胶的三角瓶、电泳槽和配胶板要先冲洗干净

实验十

DNA重组

一、实验原理

外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这种重新组合的DNA在体外的连接重组是基因工程操作的核心技术之一，其本质是一个酶促反应过程。即在一定的条件下，DNA连接酶催化两个双链DNA用，形成磷酸二酯键的过程。常用的DNA连接酶有两种：菌DNA连接酶。其中T4噬菌体DNA连接酶对底物的要求低，能更有效地连接末端，应用更广泛。

T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分连接酶通过ATP的磷酸与连接酶的赖氨酸的氨基形成酶―随后从赖氨酸残基转移到DNA一条链的5¹端的磷酸基团上，形成磷酸―磷酸键。③链3¹端的羟基被活化，取代ATP后与DNA5¹端的磷酸根形成磷酸二酯键，完成DNA之间的连接。T4噬菌体DNA连接酶需要镁离子和温度和pH条件下进行连接反应。

二、仪器及试剂：

1. 仪器：

台式离心机、移液器、吸头、恒温水浴锅等。

2. 试剂：

T4 DNA连接酶、10×T4 DNA连接酶缓冲液、 载体

三、操作步骤

1. 外源DNA片段和载体DNA的连接

39

DNA5¹端磷酸和3¹端羟基之间相互作T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆3步：①首先，ATP与T4ATP复合物。②被激活的并释放出ATP作为辅助因子， DNA、外源DNA。 DNA的平DNAAMPDNAAMP，在一定的 叫做重组子。片段的噬菌体

取1只无菌Ep管、用微量进样器按下列顺序加入各成分。

10×T4 DNA Ligase Buffer

2.5 ul

酶切后的DNA片段

*1

约0.3 pmol

酶切后的载体DNA *2

约0.03pmol

T4 DNA Ligase

ddH2O

*1 DNA片段的摩尔数应控制在载体

*2 相同末端的载体与DNA自身环化。

2.盖好盖子，用手指轻弹Ep

3.将反应管放入16℃过夜反应(

4.取出约25ng的DNA连接液进行琼脂糖凝胶电泳，片段和酶切DNA片段作电泳。

5.用0.1×TE将连接混合物稀释至

四、注意事项

1. 连接产物经鉴定后应迅速做转化实验。

2. 根据具体情况调节酶的用量。平端连接或接头连接都比黏端连接慢得多，而且酶的用量也增大。

3. 单价阳离子或低浓度的聚乙二醇可提高平端连接的效率。

4. 防止载体DNA自身环化，常用碱性磷酸酶处理线性载体，去掉载体的DNA片段的自身环化。

5. 正确调整载体DNA和外源

五、相关问题

1. 连接反应的影响因素

1ul

加至 25ul DNA摩尔数的3-12～16h)。 鉴定连接结果， 50ul，使用10～20ul DNA之间的比例有助于获得高产量的重组产物。40

10倍。 2s 以集中溶液。 以未经连接的质粒 5¹?CDNA

片段进行连接时，应首先将载体进行去磷酸化处理，以防止其管数次，并于台式离心机离心转化大肠杆菌感受态细胞。 磷酸以抑制

除了载体、供体的浓度及其比例等因素外，影响连接反应的因素还有很多，如缓冲液组分、连接温度与时间、酶浓度、DNA浓度及片段末端的碱基序列等。

(1)连接缓冲液的影响

不同的公司提供的连接缓冲液可能有所不同，但大体上都含有以下组分：20-100mmol/L的Tris-HCl，较多用50mmol/L，pH的范围在7.4-7.8，较多用7.8，目的是提供合适酸碱度的连接体系;10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反应;1-20mmol/L的DTT，较多用10mmol/L，作用是维持还原性环境，稳定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。与限制酶缓冲液不同的是连接酶缓冲液还含有0.5-4mmol/L的ATP，现多用1mmol/L，是酶反应所必需的。

(2)pH的影响

一般将缓冲液的pH调节到7.4-7.8，较多用7.8。有实验表明，若把pH为7.5-8.0时的酶活力定为100%，那么体系偏碱(pH为8.3)时仅为全部活力的65%;当体系偏酸(PH为6.9)时仅为全部活力的40%。

(3)ATP浓度的影响

连接缓冲液中ATP的浓度在0.5-4mmol/L之间，较多用1mmol/L。研究发现，ATP的最适浓度为0.5-1mmol/L，过浓会抑制反应。例如，5mmol/L的ATP会完全抑制平末端连接，黏端的连接也有10%被抑制;还有报道，当ATP的浓度为0.1mmol/L时，去磷酸载体的自环比例最大。由于ATP极易分解，所以当连接反应失败时，除了DNA与酶的问题外，还应考虑ATP的因素。含有ATP的缓冲液应于-20℃保存，溶化取用后立即放回。连接缓冲液体积较大时最好分小管贮存，防止反复冻融引起ATP分解。与限制酶缓冲液不同的是，含ATP的连接缓冲液长期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的缓冲液(可长期保存)，临用时加入新配制的ATP母液。

(4)连接温度与时间的影响

因为黏性末端的DNA双链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，但连接酶的最适温度又恰为37℃。为了解决这一矛盾，在经过综合考虑后，传统上将连接温度定为16℃，时间为4-16h。现经实验发现，对于一般的黏性末端来说，20℃ 30min就足以取得相当好的连接效果，当然如果时间充裕的话，20℃ 60min能使连接反应进行得更完全一些。对于平末端是不用考虑氢键问题的，可使用较高的温度，使酶活力得到更好的发挥。

(5)酶浓度的影响

根据New England Biolabs公司对T4 DNA连接酶的定义，1U的酶可在16℃ 30min内连接20ul体系中Hind Ⅲ酶切片段(黏性末端为0.12umol/L 5,末端，此时DNA质量浓度约为300ng/ul)的50%。日常使用的DNA浓度比酶单位定义状态低10-20倍，连接平末端时酶用量要比连接黏端大10-100倍，厂商为了满足这一要求，又往往提供高浓度的酶(几百个 41 单位/ul)，所以进行黏末端连接时需先行稀释。除了立即用于反应的部分可用酶反应缓冲液稀释外，其余都应使用厂商提供的稀释液。稀释液的成分与酶保存缓冲液相同或类似，稀释液中的酶能在长时间保持活力，也便于随时取用。

(6)DNA浓度的影响

尽管有的实验手册上推荐使用0.1-1nmol/L的DNA浓度，但考虑到用质粒作为载体克隆时，最后要求得到环化的有效连接产物，所以DNA浓度不可过高，一般不会超过20nmol/L。相比较而言，以噬菌体、cosmid质粒为载体的克隆过程最后要求线性化的连接产物，所以，DNA的浓度可以高些，至少是接近推荐的浓度。此外，在用大质粒载体进行大片段克隆时，以及在双酶切片段的连接反应中，DNA浓度还应降低，甚至是DNA的总浓度低至几个nmol/L。另据研究，T4 DNA连接酶对DNA末端的表观Km值为1.5nmol/L，所以，连接时DNA浓度不应低于1nmol/L。即应具有2nmol/L的末端浓度。

2. 三种连接酶单位定义

(1)Weiss单位

连接酶单位最早是1968年由Weiss提出的Weiss单位，现也称PPi单位。他的单位定义为：37℃ 20min内将1nmol的32P从焦磷酸根上置换到ATP分子上所需的酶量。现在大多数厂商仍使用这种单位。

(2)d(A-T)环化单位

由于Weiss单位定义中测试的是T4 DNA连接酶中除连接功能外的另一种磷交换功能，并且测试温度高达30℃，与实际连接反应相比无论在哪一方面都有一定的差距，于是，1970年Modrich与Lehman提出了真正度量连接功能的d(A-T)环化单位，又称外切酶抗性检测。d(A-T)环化单位的定义为：30℃ 30min 内将100nmol/L的d(A-T)(约2kb长)转化成抗外切酶的形式。

(3)黏性末端单位

与Weiss单位相比，d(A-T)环化单位更接近实际，但仍有一定的问题，例如，环化单位测试中用的是纯AT片段，与实际连接中4种碱基随机排列不符;再说，如果连接酶将片段连接成多聚体而末环化时，仍可能被外切酶组所切;除此之外，与实际上大多数连接反应使用的温度16℃相比，30℃仍显得偏高。为了衡量实际连接条件下的酶活力，New England Biolabs公司提出了最实用的黏性末端单位，它的单位定义为：16℃ 30min内将5,末端浓度为0.12umol/Lλ-HindⅢ 酶切片段的50%连接上。

42

实验十一 动物组织细胞总RNA的提取

一、实验原理

RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。对中占有重要地位。获得高纯度和完整的RNA 是很多分子生物学实验所必需的，如杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总抑制内源和外源的RNase活性，保护RNA分子不被降解。中进行。可使用RNase抑制剂，如DEPC是RNase的强抑制剂，常用来抑制外源性。提取缓冲液中一般含SDS、酚、氯仿、胍盐等蛋白质变性剂，也能抑制并有助于除去非核酸成分。

本实验介绍异硫氰酸胍法和TRIzol法提取动物组织总

二、仪器和试剂

1.仪器：

超净工作台、高速冷冻离心机、电泳仪、紫外分光光度计、吸头、Ep管、玻璃匀浆器、试管、

玻璃器皿洗净后置180℃烘烤8h;不耐高温的器皿(如塑料制品)应用2h,70～80℃烘烤干燥，120℃高压20min，再70～80

2.试剂：

(1)细胞裂解液：

异硫氰酸胍

4mol/L

柠檬酸钠(pH7.0)

25mmol/L

十二烷基肌氨酸钠

0.5%

43

RNA进行操作在分子生物学NorthernRNA的质量。由于细胞RNA时要利用高浓度的蛋白RNA。再通过酚、氯仿等有RNA。在提取的过程中要RNase的环境RNase活RNase活性。RNA并通过电泳 进行鉴定。 振荡器、移液器、0.1% DEPC浸泡 因此提取必须在无凝胶成像系统、℃烘烤干燥方可使用。

β-巯基乙醇

0.1mol/L

称取柠檬酸钠0.64g，十二烷基肌氨酸钠0.415g，吸取β-巯基乙醇0.7ml，用无Rnase的蒸馏水溶解，定容至50ml。然后取以上配制的溶液(CBS液)33ml，异硫氰酸胍 25g,混合，完全溶解后4℃保存备用。

(2)10×凝胶缓冲液：

吗啉代丙璜酸(MOPS)(pH7.0)

200mmol/L

NaAc

EDTA(pH 8.0)

过滤除菌后避光保存。

(3)5×变性上样缓冲液：

水饱和的溴酚蓝

500mmol/LEDTA(pH 8.0)

甲醛(37%)

甘油

甲酰胺

10×凝胶缓冲液

加无RNase水至10ml，4℃可保存

(4)TRIzol RNA抽提试剂

(5)2mol醋酸钠

(6)0.1% DEPC

(7)平衡酚：氯仿：异戊醇(

(8)平衡酚、氯仿

(9)无水乙醇、70%乙醇、异丙醇

100mmol/L

10mmol/L

16μl

80μl

720μl

2ml

3084μl

4ml 3个月。 25：24：1)

44

(10)无RNase水

三、操作步骤

(一)异硫氰酸胍法(PLT)

1.取新鲜动物组织0.1～0.2g置于组织匀浆器中，加入预冷的细胞裂解液1ml,在冰浴中迅速匀浆15～30s，以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一试管中。

2.加入2mol醋酸钠(pH4.0)120μl，充分混匀。

3.加入1.2ml酚：氯仿：异戊醇，充分混匀摇振10s，冰浴15min。

4.将混合物转移至1.5ml Ep管中，4℃，离心10 000r/min,20min.

5.移取上层水相至另一Ep管中，加入等体积的异丙醇，静置?C20℃，30min沉淀RNA.

6. 4℃，离心12 000r/min，15min.

7. 弃上清液，加入70%乙醇400μl,洗涤RNA沉淀物;如果RNA沉淀物被悬浮，则4℃离心10 000r/min，10min。

8. 弃上清液，自然干燥，但应避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。

9.加入100μl无RNase水重悬RNA，或加1ml无水乙醇和1/10体积3mol醋酸钠(pH4.0)，?C70℃保存。

(二)TRIzol试剂提取RNA

1.取新鲜动物组织0.1～0.2g置于组织匀浆器中，加入预冷的Trizol液 1ml 于玻璃匀浆器中，在冰浴中迅速匀浆15～30s，以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一1.5ml Ep管中，于室温下静置5min。

2.加入200μl氯仿，剧烈振摇15s混匀后，室温静置3min。

3. 4℃，10 000r/min离心15min，RNA分布于水相中。

4.将上层无色水相转移到另一Ep管中，加入500μl 异丙醇，室温静置10min。

5.4℃，10 000r/min离心10min。

6.弃上清液，用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀物，4℃，7500r/min离心5min。

7.弃上清液，室温干燥15min.

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8.向干燥过的沉淀物中加入200μl DEPC处理水(无核水)溶解沉淀物，于-20℃保存备用。

(三)RNA检测

1.在紫外分光光度计上检测RNA浓度及纯度。

方法同实验四，用DEPC处理水校正零点;用DEPC处理水稀释RNA样品;读取OD260、OD280值及OD260/OD280的比值。

2. 琼脂糖凝胶甲醛变性电泳检测

(1)制备凝胶(1.2%)。称1.2g琼脂糖，加72ml DEPC处理水，加热熔化。冷却至60℃，在通风橱内加入10×凝胶缓冲液10ml，甲醛(37%)18ml，混匀后，倒胶。

(2)制备样品。在离心管中，将RNA样品与5×变性上样缓冲液以4：1温育5～10min，迅速在冰上冷却5min，离心数秒。

(3)上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品卷入上样孔。以5V/cm的电压电泳2h.。

(4)待溴酚蓝迁移至凝胶长度的2/3～4/5处结束电泳。将凝胶置于溴化乙啶溶液μg/ml，用0.1mol/L乙酸胺配制)中染色约30min。

(5)在凝胶成像系统观察并分析。

四、注意事项

1.RNA是极易降解的核酸分子。因此提取总RNA必须在无RNase 环境中，戴口罩、手套、使用无RNase污染的试剂、材料、容器。

2.所有溶液应加DEPC至0.05%～0.1%，室温处理过夜，然后高压处理或加热至小时或60℃过夜，以除去石油残留的DEPC。

3.所用的化学试剂应为新包装，称量时使用干烤处理的称量勺，所有操作均应在冰浴中进行，低温条件可减低RNA酶活性。

4.根据RNA样品的紫外吸收OD值，可计算出RNAd 浓度。

单链RNA [ssRNA]=40×(OD260-OD310)×稀释倍数

纯RNA OD260 / OD280比值通常在1.7～2.0。若比值低于1.7,说明有蛋白质等污染，/氯仿在抽提。若比值低于2.0,表明有盐、胍、糖可用LiCL选择沉淀RNA以除去杂质。

46

65℃1.5～(0.570℃ 1 应用酚 混匀。

5.RNA样品电泳后，可见28S、18S及5S小分子RNA条带，则说明完整性好。若有降解可能是操作不当或污染了RNase.。28S和18S RNA比值约为2：1,表明RNA无降解。如比值逆转，则表明RNA降解。电泳中如果在28S 后方还有条带，表明有DNA污染，应用DNase处理后再进行纯化。

主要参考书：

1..金冬雁等译.分子克隆实验指南. 第二版.北京：科学出版社，1995

2.子颖等译.精编分子生物学实验指南

3.周俊宜编.分子生物学基本技能和策略

4.姜泊等编.分子生物学常用实验方法

5.刘进元等编.分子生物学实验指导

. 科学出版， .

科学出版社 .北京：人民军医出版社，.北京：清华大学出版社，47

1996. 2002.

第五篇：高中化学实验常用试剂性质总结

1.甲烷

(1)甲烷通入KMnO4酸性溶液中

实验：把甲烷通入盛有KMnO4酸性溶液的试管里，观察紫色溶液是否有变化?

现象与解释：溶液颜色没有变化。说明甲烷与KMnO4酸性溶液不反应，进一步说明甲烷的性质比较稳定。

(2)甲烷的取代反应

实验：取一个100mL的大量筒，用排饱和食盐水的方法先后收集20mLCH4和80mLCl2，放在光亮的地方(注意：不要放在阳光直射的地方，以免引起爆炸)，等待片刻，观察发生的现象。

现象与解释：大约3min后，可观察到量筒壁上出现油状液滴，量筒内饱和食盐水液面上升。说明量筒内的混合气体在光照下发生了化学反应;量筒上出现油状液滴，说明生成了新的油状物质;量筒内液面上升，说明随着反应的进行，量筒内的气压在减小，即气体总体积在减小。

2.乙烯

(1)乙烯的燃烧

实验：点燃纯净的乙烯。观察乙烯燃烧时的现象。

现象与解释：乙烯在空气中燃烧，火焰明亮，并伴有黑烟。乙烯中碳的质量分数较高，燃烧时有黑烟产生。

(2)乙烯使KMnO4酸性溶液褪色

实验：把乙烯通入盛有KMnO4酸性溶液的试管里，观察试管里溶液颜色的变化。

现象与解释：KMnO4酸性溶液的紫色褪去，说明乙烯能被氧化剂KMnO4氧化，它的化学性质比烷烃活泼。

(3)乙烯使溴的四氯化碳溶液褪色 实验：把乙烯通入盛有溴的四氯化碳溶液的试管里，观察试管里溶液颜色的变化。

现象与解释：溴的红棕色褪去，说明乙烯与溴发生了反应。

3.乙炔

(1)点燃纯净的乙炔

实验：点燃纯净的乙炔。观察乙炔燃烧时的现象。

现象与解释：乙炔燃烧时，火焰明亮，并伴有浓烈的黑烟。这是乙炔中碳的质量分数比乙烯还高，碳没有完全燃烧的缘故。

(2)乙炔使KMnO4酸性溶液褪色

实验：把纯净的乙炔通入盛有KMnO4酸性溶液的试管里，观察试管里溶液颜色的变化。

现象与解释：KMnO4酸性溶液的紫色褪去，说明乙炔能与KMnO4酸性溶液反应。

(3)乙炔使溴的四氯化碳溶液褪色

实验：把纯净的乙炔通入盛有盛有溴的四氯化碳溶液的试管里，观察试管里溶液颜色的变化。

现象与解释：溴的红棕色褪去，说明乙炔也能与溴发生加成反应。

4.苯和苯的同系物

实验：苯、甲苯、二甲苯各2mL分别注入3支试管，各加入3滴KMnO4酸性溶液，用力振荡，观察溶液的颜色变化。

现象与解释：苯不能使KMnO4酸性溶液褪去，说明苯分子中不存在碳碳双键或碳碳三键。甲苯、二甲苯能使KMnO4酸性溶液褪去，苯说明甲苯、二甲苯能被KMnO4氧化。

5.卤代烃

(1)溴乙烷的水解反应 实验：取一支试管，滴入10滴～15滴溴乙烷，再加入1mL5%的NaOH溶液，充分振荡、静置，待液体分层后，用滴管小心吸入10滴上层水溶液，移入另一盛有10mL稀硝酸溶液的试管中，然后加入2滴～3滴2%的AgNO3溶液，观察反应现象。

现象与解释：看到反应中有浅黄色沉淀生成，这种沉淀是AgBr，说明溴乙烷水解生成了Br—。

(2)1，2-二氯乙烷的消去反应

实验：在试管里加入2mL1，2-二氯乙烷和5mL10%NaOH的乙醇溶液。再向试管中加入几块碎瓷片。在另一支试管中加入少量溴水。用水浴加热试管里的混合物(注意不要使水沸腾)，持续加热一段时间后，把生成的气体通入溴水中，观察有什么现象发生。

现象与解释：生成的气体能使溴水褪色，说明反应生成了不饱和的有机物。

6.乙醇 (1)乙醇与金属钠的反应

实验：在大试管里注入2mL左右无水乙醇，再放入2小块新切开的滤纸擦干的金属钠，迅速用一配有导管的单孔塞塞住试管口，用一小试管倒扣在导管上，收集反应中放出的气体并验纯。

现象与解释：乙醇与金属钠反应的速率比水与金属钠反应的速率

慢，说明乙醇比水更难电离出H+。

(2)乙醇的消去反应

实验：在烧瓶中注入20mL酒精与浓硫酸(体积比约为1:3)的混合液，放入几片碎瓷片。加热混合液，使液体的温度迅速升高到170℃。

现象与解释：生成的气体能使溴的四氯化碳溶液褪色，也能使高锰酸钾酸性溶液褪色。

7.苯酚

(1)苯酚与NaOH反应

实验：向一个盛有少量苯酚晶体的试管中加入2mL蒸馏水，振荡试管，有什么现象发生?再逐滴滴入5%的NaOH溶液并振荡试管，观察试管中溶液的变化。

现象与解释：苯酚与水混合，液体呈混浊，说明常温下苯酚的溶解度不大。当加入NaOH溶液后，试管中的液体由混浊变为澄清，这是由于苯酚与NaOH发生了反应生成了易溶于水的苯酚钠。

(2)苯酚钠溶液与CO2的作用

实验：向苯酚与NaOH反应所得的澄清中通入CO2气体，观察溶液的变化。

现象与解释：可以看到，二氧化碳使澄清溶液又变混浊。这是由于苯酚的酸性比碳酸弱，易溶于水的苯酚钠在碳酸的作用下，重新又生成了苯酚。

(3)苯酚与Br2的反应

实验：向盛有少量苯酚稀溶液的试管里滴入过量的浓溴水，观察现象。

现象与解释：可以看到，立即有白色沉淀产生。苯酚与溴在苯环上的取代反应，既不需加热，也不需用催化剂，比溴与苯及其同系物苯环上的取代反应容易得多。这说明受羟基的影响，苯酚中苯环上的H变得更活泼了。