细胞技术论文提纲

论文题目：利用基因编辑和干细胞技术进行人胰腺分化及糖尿病预防和治疗研究

摘要：糖尿病是一种世界范围内高发的代谢性疾病,患者体内的胰岛β细胞缺失或功能障碍导致胰岛素分泌不足,进而诱发慢性高血糖症。因此,在体外产生大量有功能的胰岛β细胞对于胰腺发育学研究和糖尿病治疗至关重要。近期的研究报道了很多具有前景的研究方案,其中包括由人多能干细胞向胰岛β细胞的定向分化法。通过对定向分化体系的优化,我们获得了大量有功能的胰岛β细胞。这些细胞高表达胰岛β细胞的标志基因、具有胰岛素分泌囊泡的亚显微结构且可以感应葡萄糖浓度的变化来分泌胰岛素,并且具有一定的体内功能,因而在疾病建模、药物开发和细胞治疗等方面有广阔的应用前景。精准的基因编辑有助于高效地构建疾病模型。然而,在人多能干细胞中进行精准的基因编辑仍然非常耗时耗力。CRISPR-Cpf1是新开发的一种基因编辑工具酶,具有很多独特的优势,包括具有较短的crRNA和低脱靶率等。因此,在人多能干细胞中开发基于CRISPR-Cpf1的精准基因编辑系统具有十分广阔的应用前景。而化学小分子具有使用简便、高效以及非整合等特点,可以用于提高基因编辑效率。在这里,我们在人多能干细胞中构建了 CRISPR-Cpf1基因编辑体系,并且开发了一种无偏好的药物筛选平台。利用该系统,我们在人多能干细胞中进行了高通量药物筛选,并且最终发现了两个小分子VE-822和AZD-7762,可以显著提高CRISPR-Cpf1介导的基因编辑效率。CRISPR-Cpf1体系与化学小分子相结合,为精准高效的基因编辑提供了简单有效的方法。本研究中,我们将人多能干细胞向胰岛β细胞定向分化体系与CRISPR-Cpf1基因编辑体系相结合,构建了 CLEC16A敲除的糖尿病疾病模型,发现CLEC16A参与了人胰腺分化的过程,并且对胰岛β细胞的功能具有一定的影响。这些结果为深入研究CLEC16A对人胰岛β细胞分化调控及分子机制奠定了基础。综上所述,干细胞技术、基因编辑、生物医学工程、高通量遗传和化学筛选以及生物信息学的快速发展,将极大促进疾病建模、药物开发和细胞治疗的进展,帮助解决基本生物学问题并推进临床应用的发展。

关键词：人多能干细胞;胰岛β细胞;定向分化;CRISPR-Cpf1;小分子;CLEC16A

学科专业：细胞生物学

致谢

中文摘要

Abstract

缩略词表

1 引言

1.1 CRISPR基因编辑系统的发展与应用

1.1.1 基因编辑技术的早期发展

1.1.2 CRISPR-Cas9基因编辑系统

1.1.3 CRISPR-Cpf1基因编辑系统

1.1.4 CRISPR基因编辑系统的近期发展

1.1.5 CRISPR基因编辑系统的应用

1.2 人胰腺的基本介绍

1.3 糖尿病的相关介绍

1.4 体外获得胰岛β细胞的方法

1.4.1 人多能干细胞研究的发展

1.4.2 人多能干细胞定向分化为胰岛β细胞

1.4.3 胰岛β细胞的体细胞重编程法

1.4.4 促进胰岛β细胞增殖的方法

1.5 人胰岛β细胞的应用

1.5.1 分化的人胰岛β细胞在疾病模型中的应用

1.5.2 体外获得的胰岛β细胞在药物筛选中的应用

1.6 CLEC16A的研究背景与现状

1.7 本课题的研究方向及内容

2 实验材料和方法

2.1 主要仪器及设备

2.2 主要试剂及耗材

2.3 细胞系及菌株

2.4 质粒

2.5 小鼠品系及饲养

2.6 实验常用细胞培养基及试剂溶液

2.6.1 MEF培养基

2.6.2 人多能干细胞培养基

2.6.3 干细胞定向分化的培养基

2.6.4 胰岛前体细胞培养基

2.6.5 胰岛β细胞分化培养基

2.6.6 50× TAE溶液

2.6.7 10×磷酸缓冲液(PBS)

2.6.8 PBST溶液

2.6.9 免疫荧光染色封闭液

2.6.10 4%多聚甲醛溶液

2.6.11 液体LB培养基

2.6.12 固体LB培养基

2.6.13 琼脂糖电泳胶

2.6.14 5×KRB溶液

2.6.15 1 M HEPES溶液

2.6.16 KRBH溶液

2.7 实验方法及操作

2.7.1 细胞基因组提取

2.7.2 PCR实验

2.7.3 PCR产物割胶回收

2.7.4 crRNA的设计与构建

2.7.5 基因组片段和质粒的酶切

2.7.6 目的片段与载体连接实验

2.7.7 大肠杆菌转化实验

2.7.8 质粒扩增及抽提实验

2.7.9 T7EI实验

2.7.10 RFLP实验

2.7.11 RNA提取与反转录实验

2.7.12 RT-qPCR实验

2.7.13 免疫荧光染色实验

2.7.14 FACS流式细胞分析实验

2.7.15 细胞复苏与培养

2.7.16 细胞传代与冻存

2.7.17 人多能干细胞定向分化实验

2.7.18 细胞电转染实验

2.7.19 普通细胞转染实验

2.7.20 细胞凋亡实验

2.7.21 NHEJ报告实验

2.7.22 透射电镜观察细胞内胰岛素分泌囊泡

2.7.23 GSIS葡萄糖应激实验

2.7.24 小鼠体内移植实验

2.7.25 组织包埋和冰冻切片染色实验

2.7.26 统计学分析

2.7.27 基因编辑脱靶率分析

2.7.28 RNA-seq分析

2.7.29 全基因组测序分析

2.8 课题中使用的各种核苷酸序列

2.8.1 构建crRNA表达载体的核苷酸序列

2.8.2 构建质粒载体相关的引物

2.8.3 基因型鉴定相关引物

2.8.4 T7EI实验相关引物

2.8.5 RFLP实验相关引物

2.8.6 脱靶位点分析相关引物

2.8.7 潜在脱靶位点信息

2.8.8 qPCR实验相关引物

3 实验结果

3.1 CRISPR-Cpf1系统在人多能干细胞中的应用

3.1.1 CRISPR-Cpf1基因编辑体系的建立

3.1.2 CRISPR-Cpf1在人多能干细胞中的作用

3.1.3 构建基因敲除的人多能干细胞系

3.1.4 基因编辑的脱靶率分析

3.1.5 基因敲入的人多能干细胞系的构建

3.1.6 促进CRISPR-Cpf1基因编辑的化学小分子筛选

3.1.7 VE-822和AZD-7762的功能鉴定

3.1.8 VE-822和AZD-7762在构建报告细胞系中的作用

3.1.9 VE-822和AZD-7762在构建点突变细胞系中的作用

3.1.10 VE-822和AZD-7762在构建双基因敲入细胞系中的作用

3.1.11 VE-822和AZD-7762的分子作用机制

3.1.12 VE-822和AZD-7762的细胞毒性分析

3.2 人多能干细胞向胰岛β细胞高效分化体系的建立

3.2.1 人多能干细胞向胰岛前体细胞定向分化体系的建立

3.2.2 胰岛前体细胞向胰岛β细胞分化体系的建立

3.2.3 PBE1的功能鉴定

3.2.4 人胰岛β细胞定向分化过程的RNA-seq分析

3.2.5 分化的胰岛β细胞的体外功能鉴定

3.2.6 分化的胰岛β细胞的体内功能鉴定

3.3 CLEC16A在胰腺分化过程中的功能

3.3.1 CLEC16A敲除的人多能干细胞系的构建

3.3.2 CLEC16A在人胰岛β细胞分化中的作用

4 结论

5 讨论

参考文献

作者简历