动物细胞工程论文

今天小编为大家推荐《动物细胞工程论文(精选3篇)》，供大家阅读，更多内容可以运用本站顶部的搜索功能。摘要：细胞培养技术已经深入生命科学研究的各个领域，对于细胞培养技术的提高已经是迫在眉睫。如何提高动物细胞培养实验课的教学质量，如何让学生能够熟练掌握细胞培养技术，是如今形势下所面临的主要问题。本文通过对现阶段动物细胞培养实验课教学的问题进行分析，针对所出现的问题通过教材内容、教学方式以及考核体系三个主要方面进行浅显的探究。

第一篇：动物细胞工程论文

地方城市高校开设动物细胞原代培养实验教学改革初探

摘 要 为促进地方城市高校生命科学学院本科学生建立培养细胞、制备细胞、改造细胞以及基因/细胞治疗的现代生物知识体系和技术水平，锻炼实验思维和提升科学素养，广州大学生命科学学院开设细胞生物学理论与实验一体化教学，从教学的主导思想、实验内容、教学形式等方面进行一系列改革创新。具体以细胞原代培养实验为实验案例，探讨实验细胞生物课的课程改革情况。

关键词 细胞生物学实验;动物细胞原代培养;实验教学;素质教育;相差显微镜;实验室

1 前言

细胞培养技术是生物学、医学、药学研究以及细胞治疗过程中普遍应用的手段，已广泛应用于生命科学、基因工程、细胞工程、基因/细胞治疗等重要基础研究及临床领域，是加强学习细胞生物学理论课程知识的重要途径[1]。为了本科学生深入认识细胞，培养利用细胞、改造细胞的现代细胞知识框架和技术体系，广州大学生命科学学院开设细胞生物学实验课程，课时为36学时，细胞原代培养实验(12学时)贯穿理论和实验教学始终。广州大学原为广州市属高校，地处广东省会广州市，历史悠久。随着2015年晋升为一本院校，学院规模设备等充实扩大，研究实验经费充足，与广州中医药大学、广东药科大学同设大学城校区，校际交流紧密，也为进一步提升细胞生物学实验课程教学质量提供了坚实基础和丰富经验。

2 以素质教育为主，着重创新为主导思想

课程结合翟中和主编的《细胞生物学》(第四版，高等教育出版社)与杨汉民主编的《细胞生物学实验》(第二版，高等教育出版社)，教育学生以批判接受眼光学习前辈科研成果，启发学生科学探索的思路和方法，鼓励学生敢于创新思维，打破常规，做出合理实验假设。同时，宣讲生物伦理学和善待实验动物的态度与法规，引导学生合理运用科学技术，培养一批守法合规的科研工作者。

细胞培养技术的介绍能使学生对该技术领域有整体认识，了解仪器、方法、材料，熟悉细胞体外生长、代谢规律及影响因素[2]。细胞培养技术包括细胞原代培养和细胞传代培养。原代培养直接由体内取出组织或细胞进行培养，由于其离体时间短，性状与体内较相似，适用于研究。传代培养指把体外培养的原代细胞或细胞株，当细胞生长至高密度时，分殖至新的培养瓶中传代，以期获得大量同种细胞或稳定的细胞株，延续细胞种[3]。下面以原代细胞培养的学生实验为教学案例进行详述。

实验方法：细胞分离及原代培养

1)植块培养法。取1～3日龄的大鼠乳鼠[4]，浸入75%乙醇约15分钟处死，取出放在大平皿;在超净工作台内剪开皮肤，剖开腹腔取出需要的组织器官，置于冰冷小平皿;用PBS清洗血液，以锐剪刀修理，去除脂肪和筋膜，移到另一无菌烧杯中;剪成1 mm3小块后，再次清洗并移入青霉素瓶中;加入胰蛋白酶1 mL，37 ℃慢速振荡15分钟，弃去上清液;再把组织块接种到培养瓶中，共10～15块，间距0.2～0.5 cm;轻翻转培养瓶，添含胎牛血清的DMEM培养液10 mL[5];盖好瓶塞，用封口胶封住，放入CO2培养箱中培养;隔2～4小时后，待小块贴附后，将培养瓶缓慢转平放，继续培养;隔24小时更换培养液，再倒置培养瓶，不贴壁的组织块取出，贴壁组织继续培养;培养3～5天后可换液，补充营养，用倒置显微镜观察实验结果[6]。

2)单细胞培养法(酶解法)取组织的方法同上，取出后把器官放入青霉素瓶中;用PBS缓冲液清洗，剪碎，加入适量的胰蛋白酶，以盖住细胞为宜;保持37 ℃摇匀1～2分钟，注入含胎牛血清的DMEM培养液终止消化;静置2分钟后，弃去上清液，注入2 mL培养液;用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液;吸出细胞悬液分装至2～3个培养瓶中，加入适量培养基后旋紧瓶盖;置于倒置显微镜下观察细胞数量，必要时可使用细胞计数法计数;用酒精棉球擦拭培养瓶后，适当旋松瓶盖，置于CO2培养箱中繼续培养[7]。细胞培养2小时后开始贴附在瓶壁上，当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积75%时记为+++，占50%时记为++，占25%时记为+。

3)机械解离法以之前相同方法处死小鼠，用解剖剪剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠的脾脏;在直径60 mm培养皿中注入EZ-Sep? Mouse 1X淋巴细胞分离液4～5 mL，不锈钢筛网盖在培养皿上;用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过不锈钢筛网进入淋巴细胞分离液中;把含有脾脏细胞的分离液转移到培养瓶中，加入RPMI 1640培养基1 mL[8]，放入CO2培养箱中培养[9]。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积75%时记为+++，占50%时记为++，占25%时记为+。

结果

1)植块培养法实验结果如图1A、图1B、图1C所示，观察到较多的细胞从组织块溢出，细胞数目较多。该法是一种操作简易、成功率高的细胞原代细胞培养法，大约30%的学生采用此法，成功率较高。

2)单细胞培养法的实验结果如图2A、图2B所示，能看到较清晰的贴壁细胞，细胞分布均匀。图2A细胞数目较多，记作+++;图2B细胞数目较少，记作++。该法也是比较常用的原代细胞培养法。

3)机械培养法的实验结果如图3A、图3B所示，能看到较清晰的悬浮的淋巴细胞，圆球形，细胞数目较多，占视野的75%，记作+++。该法常用作悬浮细胞的培养法。

讨论 综上，植块培养法、单细胞培养法、机械培养法都是学生实验常用的原代细胞培养法。其中植块培养法是成功率最高，可选材料部位多，操作最简单的培养方法，翻转培养瓶，以组织块贴壁不掉落为成功。单细胞培养法培养效果好，需掐准酶解时间，防止消化不足或取材不够，消化过度、细胞失活的情况发生。第三种机械培养法操作较前两种方法稍复杂，取材部位有局限，较常用作实质器官细胞培养。

在教学进程中，针对学生观察乳鼠中不同部位细胞的形态结构、组织粘连性的需要，组织学生分组实验。每组采用一种取样方法取同一部位，多组实验结果记录在案，由学生完成并记录对比数据，摸索最佳实验效果，共享实验成果。

3 教学管理双管齐下，重视技能训练

细胞培养实验是细胞生物学基础实验，准备时间长，实验耗材大，实验要求高，实验流程紧。实验流程包括前期灭菌消毒→实验材料乳鼠养殖→实验过程取材→细胞培养监控→形态学显微观察与记录→实验总结和汇报。建立周汇报制度：学生代表每周汇报并检查进程，加强师生互动交流，促进教学进程。建立实验室值班制度：每班一把钥匙，交由学生组长轮流值日检查。建立仪器使用登记制

度：学生使用大型贵重仪器(如相差显微镜)需登记使用日期、人员、使用情况。培养学生自主管理、独立完成、爱护仪器、清洁卫生的习惯，全面提高学生实验素养和技能。

4 创新教学形式，激发学生兴趣

开放式课堂[10] 该课程发展日新月异，为了使学生更充分地接触前沿知识，开阔领域思路，课堂组织形式以讲授教材为主，但不局限于教材和课堂教学，理论教学以章节为单位，集文字、动画、图像、教学视频于一体，有机组合教学资料[7];课后组织学生搜集细胞工程、试管婴儿、人造器官等话题材料，制作宣传海报等作业形式;课余邀请外院客座教授讲座，满足学生直观感悟和理性认识。

开放式讨论 生物领域充满未知和探索，开设每周一题、每周一例、每周一汇，引导学生针对前沿概念、诺贝尔生理学和医学奖案例、实验所遇问题等进行讨论分析，教师认真听取学生意见，给予参考思路或建议。

开放式实验 在实验课堂中，师生角色发生改变，转变传统课堂教学以教师为中心、学生被动接受知识的局面，实验以学生为主，教师角色从主体变为主导，从旁指导。在同学协助下，学生动手完成实验[11]。鼓励学生利用课余时间，充分利用校内外资源，参加创新大赛和“挑战杯”，组队完成开放型实验课题，如探索有趣实验现象，简化原有实验工作步骤等。

5 结语

细胞生物学是广州大学生命科学学院本科生的基础必修课程，其课程改革有利于培养创新型、实用型本科人才。本文以动物细胞原代培养实验为例，介绍学院如何从以素质教学为主、着重创新培养的主导思想入手，辅以教学管理，注重技能培训的教学内容革新，创新教学形式，激发学生兴趣，全面改革细胞生物学课程。实践证明，改革有助于提升学生的科学素养和实验技能，出色地完成生物医药本科人才培养计划。

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作者：陈鲲 欧瑾仪 周伯春

第二篇：提高动物细胞培养实验教学质量的探讨

摘要：细胞培养技术已经深入生命科学研究的各个领域，对于细胞培养技术的提高已经是迫在眉睫。如何提高动物细胞培养实验课的教学质量，如何让学生能够熟练掌握细胞培养技术，是如今形势下所面临的主要问题。本文通过对现阶段动物细胞培养实验课教学的问题进行分析，针对所出现的问题通过教材内容、教学方式以及考核体系三个主要方面进行浅显的探究。

关键词：细胞培养技术;实验教学;教学改革

随着科技的发展，细胞生物学领域的研究不断地在拓展，作为生命基础的细胞成为近年来人们研究的主要对象，使得来自不同专业的科学家不断地在这一领域对细胞功能以及结构进行探索性研究，使得细胞培养技术变得尤为重要[1]。通过运用细胞培养技术，科研工作者已经在生命现象的研究中获得了越来越多的重要成果。因此细胞培养技术已经成为了生命科学研究领域中必备的经典技术。

动物细胞培养是将包括人类细胞在内的动物细胞在机体外进行培养的重要实验技术，即是在机体外模拟机体内的细胞生活环境，在无菌且有一定营养物质支撑等严格条件下，动物细胞在培养皿中存活、生长、繁殖以及维持其本身结构和功能的重要实验技术。细胞培养技术简化了细胞在机体内复杂的生存环境，通过在机体外培养可以方便地对细胞在不同条件下的结构以及功能进行研究。

作为医学生以及生物学科学生，熟练掌握这门技术是必不可少的[2]。为了能够让学生更加系统完整的掌握这一门技术，本文针对如何提高动物细胞培养实验的教学质量进行了简单探讨。

一、教学内容的优化

(一)讲义教材的编排

随着科技的不断进步，生物学领域的发展突飞猛进，特别在细胞生物学方面不断涌现新的技术。然而我们现在教学中所使用的内容相对陈旧，滞后于当今科技的发展，使得学生不能在教学过程中对新型高效的技术和方法有充分的了解。为了全面提高学生综合素质，针对教学教材以及讲义我们也在实验教学过程中不断地进行探讨和研究，特别是教材讲义内容的创新，从而使学生能够跟得上科学技术的发展。

经过在教学过程中的总结体会，我们发现一本结合当今科技发展的讲义可以让学生在实际的学习中受益匪浅，也可以为我们以后的教学带来很大程度的便利。目前使用的教材由于编著作者的专业背景、所处院校及研究方向的不同，作者的侧重点也有很大的不同。因此，为了使教材内容能够更加切合我校医学教育目前的實际情况，我们本着理论联系实际且跟随科技发展新动向的目的，在编排教材的过程中，吸收国内外相关教材的精华部分以及授课教师在教学过程中的实际经验和研究成果，通过不断推敲编写出适合本院系学生使用的实验课讲义。

(二)实验内容的精选

动物细胞培养实验课应以提升学生的实验技能、启发学生的创新意识、增强学生的实践能力为目的。同时，学生通过实验课的学习，能够增强团队协作能力并能培养观察分析的科研精神。

细胞培养实验，需要非常苛刻的实验条件以及极其熟练的实验技术，同时还需要将细胞生物学的理论知识与实验技能进行高度的结合。但是实验课的课程时间有限且实验器材缺乏，这就对我们动物细胞培养实验的进行造成了一定程度的挑战。因此，细胞培养实验课的内容务必需要一定的侧重点。

根据具体情况我们将教学内容大致分为四部分：①原代细胞培养，如贴壁培养法和消化培养法。这一部分的实验主要是以了解为主，因此对于这一部分的学习可以让学生通过查阅文献以及在线视频资料进行学习;②传代细胞培养，如细胞的复苏、传代以及冻存等，这一部分是主要的实验内容，因此授课教师要侧重对这一部分的讲解，以保证学生都能够领会并掌握;③细胞活性的测定，这一技术是为了验证所培养的细胞是否能顺利成活，也是非常重要的，授课老师也应该要求学生们掌握;④对培养的细胞进行不同药物处理并对细胞结构及性能进行研究，这些技术是将细胞培养技术运用到实际的科研探究中。对于这一部分，教师可以对学生进行启发性的讲解并鼓励学生设计并实施一些简单探究性的实验，以培养学生的科研创新能力。通过以上四部分的学习，学生能够在有限的时间较为立体的对细胞培养技术有一个较为详细的了解。

(三)科研能力的培养

对于学生，应该注重对学生科研素质能力的培养。针对这一方面，授课教师应当从学生的基本实验操作能力、科研思维能力以及科研素养进行重点培养。

实验基本操作能力的培养：对于细胞培养中的基本操作，如实验器具的灭菌及准备、无菌操作、细胞计数及观察等，需要授课教师一边操作一边讲述，尤其是实验操作过程中的一些具体的注意事项，以让学生对细胞培养有一个正确的认识。另外，在学生进行实验的过程中，授课教师应当及时进行指导，让学生能够通过对错误操作导致的结果进行总结，明白严格规范操作的重要意义。学生们通过对实验基本操作能力的训练培养，能够增强自己的能力和意识，并为以后的职业发展夯实基础[3]。

科研思维能力以及科研素质的培养：对于这一部分的培养要结合实验教学进行培养训练。授课教师可以在实验过程中与学生进行交流，并对实验过程中出现的问题进行探究，听取学生对实验中出现的问题的意见和解决方案，并针对学生对问题分析的逻辑思维能力以及观察能力进行评价。如：使用不同实验方法对细胞类型进行判定，在不同实验条件下对细胞形态以及功能影响进行探究等。只有这样将理论知识与实验技术紧密结合，才能真正培养学生的科研能力和科研素质。

二、教学方式的改进

(一)无菌操作理念的树立

在细胞培养的过程中，最关键的是细胞能否存活。而确保细胞存活的关键就是无菌操作。

细胞培养实验比较复杂，涉及的步骤繁多，且步骤之间具有较强的关联性。所以，学生必须对实验过程中的所有步骤都非常清楚了解才能保证实验效果，尤其是无菌操作[4]。

大多数学生在上细胞生物学的实验课之前都没有接触过严格的无菌操作，对无菌操作的了解仅限于书本上的理论知识，并没有进行过实际的操作。所以，授课教师应当在实验课堂上对无菌操作的理论知识及技术要点进行详细的讲解，让学生更为直观的接触无菌操作，以使学生们都明白无菌操作的重要性，树立无菌操作的理念。

教师在讲授的过程中一定要结合具体的实验步骤，从实验开始前的实验器具的消毒灭菌到实验进行中的具体操作，再到实验结束后的清理打扫等所有步骤，均需要现场示范并进行演示讲解。同时教师也应该鼓励学生在讲授的过程中积极提问，并针对学生们的疑惑给予详细且准确的解答。另外，授课教师在学生进行实际操作时要严格要求，及时进行指导并解释原因。实验结束后，教师需要将同学们的疑问汇总并集中进行答疑解惑，同时还要让学生对所使用的实验器材进行清洁整理，并对无菌操作台擦拭消毒，以养成良好的实验习惯[5]。

(二)对实验所需设备的熟悉

动物细胞培养实验中涉及到的实验器械较多，且大部分实验器材都是学生第一次接触。所以学生对一些实验器材的使用不够熟悉，对实验过程中的注意事项不够了解，在实验过程中容易因为操作不当而出现这样或那样的问题，使实验无法顺利完成。

正是由于这些不熟悉，而如果授课教师在讲课时也没有进行详细的讲解，那么学生们在实验过程中便会产生很多的疑问，比如，有的学生会问：无菌操作台内部本身就是无菌的环境，那么为什么在实验过程中还需要在台子里点燃一盏酒精灯呢?还有的学生也会问：为什么细胞需要放在一定浓度的二氧化碳培养箱中进行培养呢?为什么不能用普通的光学显微镜，而是必须用倒置相差显微镜来观察培养的细胞呢?

所以，这就需要授课教师在教学的过程中针对所使用的所有器械进行详细的讲解，包括：器械的作用及原理、器材设备的消毒灭菌方法、所有仪器的使用方法及注意事项等。例如：无菌操作台中酒精灯的使用目的、移液器的使用方法及注意事项、二氧化碳培养箱的工作原理、倒置相差显微镜的操作规程及注意事项等。通过这些学习，学生可以对动物细胞培养实验中所需要使用的所有设备、仪器及试剂等有充分的了解，并为今后的工作打下坚实的基础。

(三)观察细胞能力的培养

对培养细胞进行观察，通过观察确定细胞的生长情况，因此对细胞的观察能力的培养也是必不可少的。例如，运用组织块培养法培养细胞时，细胞生长情况的判断标准即是贴壁组织块的生长状况。如果观察发现贴壁组织块周围存在生长晕，则说明细胞生长情况较好，如果没有生长晕则说明细胞培养得不成功。另外，在观察细胞的时候，同学们也会发现，在同样的环境下，同样的组织，有的生长情况很好，而有的则生长不良。针对这个问题，授课教师就需要向学生们将组织生长的条件以及细胞贴壁的程度与组织的生长状态之间的关系讲解清楚。

授课教师在讲解这一部分内容时，可以提前准备好不同生长状态的细胞来让学生们观察并进行总结。同时，教师也可以预先准备一些出现了污染的细胞让学生观察并进行讲解。通过对不同类型细胞污染的观察，学生们可以学会对细胞培养中的污染现象进行识别[6]。

另外，由于课上时间有限，授课教师可以提前搜集一些不同类型细胞的照片及视频资料，在课堂讲解时播放这些照片及视频。同时教师也可以提前实际操作一遍，并将全过程拍摄下来，同样在课上播放及讲授。通过这种方式，学生们既可以提高自己的观察力，也能提升自己发现及分析问题的能力。

三、考核体系的完善

(一)实验报告的撰写

实验报告是学生对实验过程掌握程度以及该学生科研素养的综合体现[7]。通过实验报告的撰写，学生们的观察能力、发现及分析问题的能力、总结及解决问题的能力等都能获得较大的提高。另外，学生们通过撰写实验报告，也能够较大地提升自己的逻辑思维能力，同时能够大大激发探索研究的兴趣。授课教师也可以通过对学生实验报告的批改，掌握学生的学习情况，对学生的实验成绩给予准确的评价。

传统的实验报告包括实验意义、实验目的、实验步骤、实验结果及分析与讨论等。学生在完成实验之后，通过撰写实验报告，可以对实验结果以及实验过程中出現的问题进行分析，巩固该次实验课的学习。

通过对实验报告撰写这一环节的完善及改革，将传统的实验报告改为论述文，可以达到考查学生综合能力的目的。授课教师可以要求学生通过查阅有关资料，严格按照论文的格式，对实验过程中出现的问题进行分析总结并撰写出一份论述文。这样最终提交给教师的是一份以科研论文格式呈现的论文式实验报告。因为在该论文式实验报告中，讨论是主要部分，所以学生们通过这样的训练，可以极大地提升发现问题及分析问题的能力。

(二)现场操作的考察

动物细胞培养是一项对理论知识与实践技能相结合有着较高要求的实验技术。对于这门实验课的考查，实验报告非常重要。但是作为一项以实际操作为主要内容的实验课程的考核，对学生实验课上实际现场操作的考查也尤为重要。

因此，动物细胞培养这门实验课，对学生的实验课评价不能单一地只考查学生的实验报告，还应该侧重于对学生的现场操作能力的考查，以衡量学生对相关理论知识及实验操作技能的掌握程度[8]。

学生现场操作的规范程度以及熟练程度，可以反映出该学生对该门实验课的理论知识与实验技能的掌握情况。所以，授课教师对所带班级学生的实验操作技能的考查就不应该仅仅只看学生是否能把实验完成，是否能把实验结果做出来，而是应该更加注重对学生的科研态度、实验操作的规范程度及熟练程度的综合考查，以对每一位学生做出科学的实验课评价。

(三)综述论文的评价

综述论文能够反应出某一领域在一定时期内的研究工作进展情况。通过阅读综述论文，研究者可以对某一领域的新技术、新进展等有较全面的了解，更有利于自己研究工作的开展。

教师通过对学生撰写的综述论文的评价，能够从以下几个方面评判学生的综合能力：所搜集的原始文献资料的数量和水平、对所搜集的文献资料的提炼加工程度、论文的组织写作水平等。学生通过将自己的综述论文交由授课教师评改，可以提高自己的学术水准及写作能力。

关于动物细胞培养实验课，授课教师可以让学生撰写关于细胞培养方面的综述论文，比如，不同类型动物细胞培养方法的比较，哺乳动物细胞培养技术研究进展，哺乳动物细胞培养中的注意事项等。学生们通过查找大量相关资料撰写这些综述性文章，可以学习到细胞培养方面的很多知识，为今后的学习和工作打下坚实的基础。

四、结语

细胞培养技术是对生命科学进行探究的一项关键的技能[9]。随着科技的日益发展，生命科学研究的不断深入，细胞培养技术作为生物研究的一项基本操作技术，逐渐地深入到众多与生命探索有关的领域当中。

对于细胞培养技术的教学也是在科技发展的大形势下所必需的。同时为了提高教学质量，赶上科技发展的步伐，我们应该对细胞培养实验教学进行改革。具体来讲，授课教师应当打破传统教学理念，利用当今信息发展技术，结合现在生物发展的形势，将理论与实践相结合，以学生为主体，调动学生的积极性，激发学生的创新意识，提高他们独立分析问题解决问题的能力。这样，通过提高细胞培养实验课的教学质量，我们可以为培养“高精尖”的创新型人才贡献出一份力量。

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[9]陈萍，郭威，刘丹，等.细胞原代培养实验教学的实践与思考[J].医学研究杂志，2009，38(6)：119-120.

作者：郑皓 景嘉楠 李江峰 陈昱妍 郭燕洁 程晓丽

第三篇：骨髓间充质干细胞复合组织工程化脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤

[摘要]目的：体外培养扩增sD大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，复合组织工程化脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤，为进一步-临床应用奠定基础。方法：将SD大鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增后，以生长状态良好的骨髓间充质干细胞接种于制备好的组织工程化脱细胞真皮支架上，进行体外联合培养，构建组织工程皮肤。观察细胞生长情况及组织工程皮肤结构。结果：体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞生长良好，传代扩增容易，组织工程化脱细胞真皮基质去细胞完全，骨髓间充质干细胞在脱细胞真皮基质中生长良好，可体外构建组织工程皮肤。结论：利用体外扩增培养的骨髓间充质干细胞及制备的组织工程化脱细胞真皮基质可以体外联合构建组织工程皮肤。

[关键词]骨髓间充质干细胞;脱细胞真皮;组织工程皮肤

对于大面积皮肤缺损患者，尽早在功能和外观上修复创面对降低病人的死亡率、提高病人的生存质量极为重要。但由于自体皮源不足和取皮本身又造成新的皮肤缺损等原因，限制了自体皮移植的应用。组织工程皮肤的研制和应用为大面积皮肤缺损患者带来了福音，但也存在着种子细胞来源不足和理想的支架材料没找到等问题。骨髓问充质干细胞是具有多项分化能力的成体干细胞，在皮肤创面微环境下，它可以分化为表皮细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞，另外，它还可分泌多种生长因子，促进创面愈合，有望成为皮肤组织工程理想的种子细胞。组织工程化脱细胞真皮基质是一种新开发的组织工程支架材料，具有组织相容性好，适于组织再生等优点。本研究以骨髓间充质干细胞为种子细胞，以组织工程化脱细胞真皮为支架载体，体外联合培养，以期构建组织工程皮肤。

1　材料和方法

1.1　材料：SD大鼠(第四军医大学实验动物中心提供)，Percoll淋巴细胞分离液(1.073g/ml，购自美国Pharmacia公司)，DMEM-F12培养基(购自美国Sigma公司)，胰酶(购自美国Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青犊牛应用研究所)，超净工作台(Nuair)，CO2孵箱(Nuair)，倒置显微镜(Olympus)

1.2　方法与步骤

1.2.1　组织工程化脱细胞真皮基质的制备：在无菌条件下，将BAM用醋酸溶液溶解后，加入1/10体积的胎牛血清和10X的DMEM培养基，调节pH值为7.2，加入培养的成纤维细胞，使终浓度为106个细胞/ml，再将BAM—细胞悬液加至培养皿中，在37℃、5%CO2条件下固化30min，再加入器官培养液;每天换液，37℃条件下连续培养10天。取出培养好的组织工程化细胞外基质，PBS清洗后置于-80℃条件下反复冻融3次，每次30min，使细胞完全破裂崩解;最后将其置于冷冻干燥机内冻干。60Co消毒，无菌封装。取部分材料做组织学和扫描电镜观察，观察组织工程化脱细胞真皮基质的颜色、结构、空隙分布、细胞残留情况。

1.2.2 骨髓问充质干细胞的分离培养及扩增：取120-150g雄性SD大鼠(4周)，将大鼠断颈处死，70%乙醇消毒，无菌条件下取股骨、胫骨，剔出周围肌肉组织，剪去两端骨骺，抽取5ml无血清DMEM—F12培养基(含青霉素、链霉素各100U/ml)冲洗骨髓腔，吹打制成单细胞悬液，注入含有5mlPercoll的分离液于离心管中，离心半径8cm，2000r/min离心20min，收集离心液界面上乳白色云雾状的细胞层，先后以PBS和DMEM-F12漂洗，用含有10%胎牛血清的DMEM—F12培养基重悬细胞，计数5×106个/ml后即接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2、95%湿度的培养箱中进行原代培养，分别于1、3天半量换液，以后每3天全量换液1次。倒置相差显微镜观察细胞培养全过程。待细胞长满瓶底80%时进行传代培养，以1×104个/ml传代。

1.2.3 复合骨髓问充质干细胞的组织工程皮肤的构建：取冻干、灭菌过的组织工程化脱细胞真皮基质，用DMEM—F12培养基浸润12h，后把培养基吸干，置37℃孵箱中4h。取生长状态良好的第3代的骨髓间充质干细胞，用胰酶消化成细胞悬液，800r/min离心5min，DMEM-F12重悬，以105/cm2的密度接种在自制的组织工程化脱细胞真皮基质上，培养体系为DMEM—F12培养基，补充10ml/L的胎牛血清，置37℃、5%CO2、95%湿度的培养箱中培养，每2天换液一次，连续培养12天左右，倒置显微镜下连续观察有无污染及细胞生长情况。

1.2.4 组织工程皮肤的检测方法：构建的组织工程皮肤在体外培养12天后，取材，并行大体观察，组织学观察和扫描电镜观察，主要观察组织工程皮肤的颜色、柔韧性、组织工程皮肤的结构、骨髓间充质干细胞与组织工程化脱细胞真皮的结合以及骨髓问充质干细胞在组织工程化脱细胞真皮基质中的生长、伸展状况。

2　结果

2.1　组织工程化脱细胞真皮基质：大体观察组织工程化脱细胞真皮基质呈乳白色，微泛红色，柔韧，厚度为2500μm左右。HE染色显示胶原呈无规则排列，存在大小不等的不规则腔隙，未见任何细胞碎片。扫描电镜观察在其表面和内部均有大量的宏观孔隙，形态不一，分布较均匀，且孔与孔之间成三维连通结构，孔隙率较高。

2.2　骨髓间充质干细胞体外培养：原代培养的BMSCs于1天开始贴壁，细胞伸展成梭形、椭圆形或多角形;2天有细胞集落形成，贴壁细胞增多;4天呈典型的成纤维细胞形态;10天细胞集落逐渐扩大融合成单层。传代细胞生长较原代快，6天即铺满培养瓶底，传代细胞保持原代细胞的形态特征，随着代数增加细胞得到纯化，梭形细胞占95%以上。

2.3 组织工程皮肤的结构：骨髓问充质干细胞与组织工程化脱细胞基质共培养12天后，大体观察组织工程皮肤柔软，乳白色，随形性好。在倒置显微镜下选择透光性好的部位进行观察，发现细胞在支架上呈梭形排列，生长良好。HE染色可见骨髓问充质干细胞在表面形成了有3-5层细胞的类表皮结构，在下层，骨髓问充质干细胞较均匀的生长在组织工程化脱细胞真皮基质中，形成类真皮结构。扫描电镜观察可见在表面的孔隙中有大量的细胞附着生长，细胞突起伸入四周孔隙。

3 讨论

近年来，皮肤组织工程发展日新月异，国内外已有多项产品应用于临床，并取得了一定疗效，组

织工程皮肤研制的根本问题就是三维支架材料和种子细胞问题，寻找合适的支架材料和理想的种子细胞是研制组织工程皮肤的关键。

自1995年，Livesey等首先报道制成脱细胞真皮基质(A1lograft dermal matrix，ADM)，Wain-wright行异体移植用于烧伤患者Ⅲ度创面的覆盖取得成功以来，作为皮肤替代物的脱细胞真皮以其合理的结构，相对坚韧的机械性及良好的组织相容性受到越来越多学者的重视。1995年美国Life-cell公司生产的异体脱细胞真皮基质(Alloderm)在临床已广泛应用，成为较理想的真皮替代物。Takami等将大鼠的ADM异体移植，发现术后1-2周完全血管化并伴随成纤维细胞的浸润。脱细胞真皮依其材料和加工途径可分为天然皮肤中获取的脱细胞真皮和组织工程化的脱细胞真皮。脱细胞真皮去除了细胞成分，而保留了胶原成分，具有抗原性弱，生物相容性好，血管化速度快，可诱导自体组织细胞再生及减少瘢痕形成等优点。而组织工程化脱细胞真皮较天然的脱细胞真皮的最大优势就是其ECM结构与天然结构接近，而组织相容性较天然的脱细胞真皮好，由于我们在制备组织工程化脱细胞真皮基质过程中，使用了人的成纤维细胞，在此过程中，牛皮来源的基质蛋白逐渐得到降解，而同时成纤维细胞自身又分泌了胶原基质，如果应用于临床，这就在很大程度上降低了原来因不同种属所引起的免疫排斥反应，且人的成纤维细胞体外培养扩增容易，利用本方法可以得到大量的组织工程化脱细胞真皮，将解决临床上大量需要的问题。因此，它可作为一种良好的构建永久性皮肤替代物的真皮支架。种子细胞的研究是皮肤组织工程的基础和前提。骨髓间充质干细胞是存在于骨髓基质内的非造血细胞来源的细胞亚群，属成体干细胞，它们可以在体外经诱导后最终分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、肌管、神经细胞。最近研究表明，骨髓问充质干细胞可定向分化为皮肤的表皮细胞、皮脂腺、滤泡上皮细胞、树突状细胞;付小兵等研究证实自体移植的骨髓问充质干细胞可提高皮肤创面的修复质量。Yongbo Liu等用RT—PCR和ELISA等方法检测了在创伤微环境作用下生长因子在BMSCs中的表达，显示在创伤微环境作用下BMSCs可分泌TGF-β1、EGF、VEGF、PDGF、KGF、FGF、HGF等，而这些生长因子在创伤修复过程中起到关键的促进作用。另外，由于间充质干细胞取材相对简单，体外培养扩增较容易，不存在伦理学的问题，如果采用自体移植的方法，还可以避免异种异体细胞的免疫排斥问题，因此，骨髓问充质干细胞可作为良好的皮肤组织工程的潜能种子细胞。

本实验利用在组织工程化脱细胞真皮基质上接种骨髓问充质干细胞，探讨构建组织工程皮肤的可能性。结果表明，骨髓间充质干细胞在脱细胞真皮中生长良好，组织工程化脱细胞真皮基质对培养的骨髓间充质干细胞无明显的毒性作用。构建的组织工程皮肤HE染色可见表面形成了有3～5层细胞类表皮结构，下层细胞较均匀的分布在组织工程化脱细胞基质的孔隙中，形成类真皮结构。进一步，我们可以尝试利用人自体的骨髓间充质干细胞和组织工程化脱细胞真皮基质复合构建组织工程皮肤，用于临床皮肤大面积缺损的治疗，期望提高创面愈合的速度和质量。但有报道表明，脱细胞真皮在应用中还是存在着不同程度的免疫排斥等问题，虽然我们用的组织工程化脱细胞真皮的抗原性比天然的脱细胞真皮小，但还是应该尽量降低它的抗原性，以更好地应用于临床。另外，它的机械性能略差。因此，在脱细胞真皮研究中，要解决的主要问题是尽量降低其抗原性，并增加其机械性能。另一方面，骨髓问充质干细胞尚无或未找到其完全的特异性标志，所以目前对骨髓问充质干细胞的分离及特征性描述都是以一个细胞群体的形式进行，因此，进一步确定骨髓间充质干细胞特异的表面标志和研究更有效地分离纯化骨髓问充质干细胞的方法是十分必要的。

作者：耿献辉　余春艳　邓志宏　张勇杰　陆　伟　温　宁　薛　洁　张锐红　康晓军　金　岩