海州常山腋芽诱导培养初探

海州常山 (Clerodendrum trichotomum Thuhb) 别名斑鸠菜、泡花树, 因叶大有特殊臭气, 又叫臭梧桐, 为马鞭草科 (Verbenaceae) 大青属 (Clerodendrum) 落叶灌木或小乔木[1]。海州常山是一种风味独特的木本野生蔬菜, 又是应用很广的药用植物, 在中药材市场上的用量很大。此外, 海州常山一株树上花果共存, 而且花果期长, 色泽亮丽, 为良好的观花、观果园林植物;具有一定抗旱、耐淹、耐涝和抗污染的能力, 对重金属砷的耐受性和富集能力都较强, 是砷污染地的理想修复树种[2,3]。

海州常山市场需求量大, 具有广泛的开发利用前景, 但种苗繁殖难是规模化种植的一个制约因素。由于扦插和分株的繁殖系数低, 而种子发芽较困难, 因此, 组培快繁体系的建立, 对海州常山种质资源保护及规模化人工种植都具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 植物材料

试验材料为海州常山1年生带腋芽茎段, 取材于云南省楚雄市彝人古镇。

1.2 方法

1.2.1 外植体消毒

将海州常山枝条去掉叶片, 留叶柄0.2 cm左后, 以保护腋芽免受机械损伤, 先用洗衣粉液进行清洗, 然后流水冲洗5 h左后。冲净后置于超净工作台上紫外灯照射10 min, 后用75%酒精浸泡30 s, 无菌水冲洗2次, 再根据设计的消毒试验方案 (表1) 进行消毒, 在消毒液中加入2滴吐温20。倒去消毒液, 用无菌水漂洗5~7次, 吸干水分, 将消毒后的茎段置于无菌滤纸, 切去基部受损组织, 接种于培养基上。通过对比不同消毒剂以及不同消毒时间的消毒效果, 筛选合适的消毒剂及最佳消毒时间。

1.2.2 初代培养

筛选最佳消毒剂及最佳消毒时间, 参考刘慧春等人的方法[4], 采用MS+BA0.2+IAA0.1培养基。诱导海州常山腋芽抽生, 以MS为基本培养基, 添加不同浓度的6-BA、IAA作为外源生长调节剂, 共设计8种浓度配比 (见表2) 。附加3%蔗糖、0.7%琼脂, p H=6.0。将配制好的培养基置于121℃、0.12 MPa压力下高温灭菌30 min, 培养温度为23~25℃, 光照度1500~2000 lx, 光照12 h/d。

1.2.3 数据处理

对外植体消毒后的污染率、存活率及腋芽萌动率进行统计[5,6], 每处理重复3次, 统计公式如下。

污染率= (污染的外植体数/接种外植体数) ×100%

存活率= (消毒后存活的外植体数/接种外植体数) ×100%

腋芽萌动率= (腋芽已萌动的外植体数/接种存活的总外植体数) ×100%

2 结果与分析

2.1 最适消毒剂及消毒时间的筛选

本试验采用7 5%酒精处理3 0 s后, 分别用0.1%Hg Cl2、5%Na Cl O对外植体进行不同时间的消毒处理。结果表明, 不同消毒剂、不同消毒时间对海州常山茎段消毒效果表现不一, 其污染率和存活率有所不同, 试验结果见表3。

茎段用75%酒精30 s+0.1%Hg Cl2消毒5 min时, 污染率为48.6%, 消毒后茎段褐化轻, 后期长势好, 芽萌动快, 抽生叶片为深绿色 (图1a) ;消毒7 min时, 茎段稍有褐化现象, 但后期恢复快, 整体长势好, 存活率高达62%, 消毒效果最好 (图1b、图2) ;消毒10min时, 外植体汞中毒较深, 部分外植体褐化死亡, 腋芽后期抽生缓慢 (图1c) ;当消毒15 min时, 汞中毒很深, 60%以上的外植体褐化死亡, 存活率仅有30%, 腋芽抽生极为缓慢。

茎段用75%酒精30 s+5%Na Cl O消毒3 min时, 无褐化现象, 接种160个茎段, 仅有4个茎段存活, 污染率为97.5%, 存活率为2.5%;当消毒7 min时, 茎段褐化非常严重, 70%的外植体因褐化死亡, 存活率仅有15%, 且后期腋芽抽生困难;而消毒时间为5 min时, 效果最好, 存活率最高达30%, 后期腋芽抽生相对缓慢。

综合上述试验结果, 海州常山外植体 (茎段) 进行消毒最适方案为75%酒精30 s+0.1%Hg Cl2消毒7 min, 污染率低, 存活率最高。

2.2 诱导海州常山腋芽抽生培养基的筛选

以筛选出的适宜消毒方法, 75%酒精30 s+0.1%Hg Cl2消毒7 min, 设计8个不同浓度配比的培养基 (见表2) , 试验结果表明, 生长调节剂的不同浓度配比对诱导海州常山腋芽抽生效果表现不一, 其7 d液芽萌动率跟15 d腋芽萌动率均有所不同 (见表4) 。

分析7 d和15 d的腋芽抽生情况, 其中5号、6号、7号、8号培养基腋芽抽生相对缓慢, 1号、2号、3号、4号培养基腋芽抽生相对较快, 故6-BA浓度为0.2mg/L最佳;1号、2号、3号、4号培养基腋芽萌动率以1号、2号较高, 1号最高, 故低浓度的IAA更有助于腋芽的抽生。所以1号培养基“MS+BA0.2+IAA0.1”为诱导海州常山腋芽抽生的最佳培养基。

3 讨论

3.1 防止褐变的方法

褐变在海州常山组培过程中普遍存在, 能否有效控制褐变是决定组培成功的关键。可以采取以下防止方法。

(1) 通常取幼龄部位进行组织培养不易褐变, 但随着组织的老龄化, 植物组织内醌类物质增多而褐变严重[7], 选择外植体时应尽量选择腋芽饱满、无病虫害的1年生枝条。

(2) 春夏季特别是春季取材的褐变情况较轻, 外植体生长旺盛, 分生能力强且不易褐变, 而以已经木栓化或木质化的枝条和处于休眠状态的芽作为外植体进行组织培养时则褐变严重, 因此组培尽量在春季进行并选择半木质化枝条。

(3) 外植体受伤程度较小时褐变更易控制[8], 所以平常取材时应尽量减少伤口面, 保持材料的完整性。

(4) 适当添加抗氧化剂及吸附剂, 前者抑制多酚氧化, 后者吸附氧化物, 从而减轻对组织培养物的毒害。

3.2 选择合适的消毒方案

对大多数外植体只需要进行表面消毒即可, 外植体表面消毒的关键在于选择合适的消毒剂和消毒时间。不同植物或同一植物不同外植体消毒的方法不同, 本试验中所采取的7种不同消毒方式, 其消毒结果存在明显差异, 所以为达到满意的消毒效果, 需根据外植体情况, 选择多种类消毒方式进行试验, 摸索出适宜的消毒剂及最佳消毒时间。

3.3 诱导海州常山腋芽抽生的最佳生长调节剂配比

试验结果表明, 低浓度的6-BA与低浓度的IAA更有助于腋芽的抽生。最适培养基为1号“MS+BA0.2+IAA0.1”, 此试验结果与刘慧春[4]等人在豆腐柴组培试验中的结果一致, 低浓度的生长调节剂配比更有利于腋芽抽生。

4 小结

综合上述试验结果, 初步确立海州常山外植体 (茎段) 消毒处理的最适方案为75%酒精30 s+0.1%Hg Cl2消毒7 min, 污染率低, 存活率最高。诱导腋芽抽生1号培养基速度最快, 15 d腋芽萌动率最高, 高达90.9%, 所以“MS+BA0.2+IAA0.1”为诱导海州常山腋芽抽生的最佳培养基。

摘要：以海州常山的1年生茎段为外植体, 比较不同消毒剂、消毒时间的消毒效果。消毒后的茎段接种到附加了不同浓度的6-BA和IAA的MS培养基中, 筛选腋芽抽生的适宜生长调节剂浓度组合。结果表明:外植体消毒的最佳方案是75%酒精30 s+0.1%Hg Cl2消毒7 min, 有效材料获得率高达62.0%。在诱导腋芽抽生培养中, 以培养基“MS+6-BA 0.2 mg/L+IAA 0.1 mg/L”的配方效果最佳, 腋芽萌动率高达90.9%。

关键词：海州常山,组织培养,茎段,外植体消毒,腋芽抽生

参考文献

[1] 曾现艳.海州常山种质资源遗传多样性的初步研究[D].济南:山东农业大学, 2011.

[2] 谢福春.海州常山的生长特性与抗逆性研究[D].济南:山东农业大学, 2009.

[3] Mahmud R, Inoue N, Kasajima SY, et al.Assessment of potentia1 indigenous plant species for the Phytorem ediation of Arsenic-contaminated areas of Bangladesh[J].International Journal of Phytoremediation, 2008, 10 (2) :117-130.

[4] 刘慧春, 朱开元, 金关荣, 等.豆腐柴的组织培养与快速繁殖[J].浙江农业科学, 2008, (1) :30-31.

[5] 于婷乔.蓝果忍冬组培快繁技术的研究[D].哈尔滨:东北农业大学, 2014.

[6] 王树芝, 刘德华, 刘黎, 等.冬青苦丁茶树组织培养的研究[J].湖南农业科学, 2009, (2) :131-133.

[7] 李佳, 赵文龙, 周长艳, 等.莲藕愈伤组织诱导及组织学观察[J].湖北农业科学, 2014, 53 (3) :701-703, 717.

[8] Bonga J M, Durzan D J著.阙国宁译.树木组织培养[M].北京:中国林业出版社, 1988:25-26.