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第一篇：细胞工程重点总结
超全干细胞重点知识总结
第九章干细胞 第一节干细胞概述
一、干细胞( stem cells)与个体发育
正常生物个体发育的过程是按严格的时空程序进行的一系列细胞分裂、分化和细胞凋亡相互协调作用的结果。 从一个受精卵、全能胚胎干细胞或组织谱系干细胞最终分化为具有独特功能体细胞所组成的组织器官,这是一个彼此协调而又制约的复杂过程,这一过程通常被称为发育的遗传程序(genetic program) ,被记录在细胞基因组的结构中。不同物种有不同的遗传程序,这可能是物种在长期进化过程中逐渐形成的。
在哺乳动物个体发育的不同阶段,包括胚胎、幼年和成年个体的各个发育时期,都存在着发育潜能参差不同的干细胞。干细胞最终演变为独特结构和功能的体细胞或成熟生殖细胞,这过程即是所谓细胞分化。从分子水平而言,可以认为细胞分化是部分基因选择性地被激活或差异性表达,从而控制专一性蛋白质的合成和排布的结果。对正常细胞分化来说,最重要的是多个基因表达过程在数量和时空上的精确联系和密切配合,并受不同层次的基因调控网络系统精确无误地调节和控制。干细胞在胚胎和成体组织内部的活动,包括干细胞基本特性的分子机制和调节控制、胚胎细胞的迁移活动、时空程序与相邻胚胎细胞的相互作用,对细胞增殖和分化的关系等,虽已有所了解,但由于技术上的原因,直接证据还很少,因此,干细胞增殖和分化问题仍是今天发育生物学研究的主题内容之一.
二、干细胞的定义和分类
因干细胞是指一类具有自我更新和产生分化后代这两种基本特性的细胞。 一个充满生命力的雌雄两性机体都是由两类不同的组织和器官构成的。一类是全部由体细胞组成的,另一类是以生殖细胞为主的,也包括一些由体细胞组成的组织和器官构成的。前者是执行机体生命活动各种生理功能的;后者一切都为了保证生殖系统的卵巢和辜丸中的卵子和精子的发育和成熟并延续生命的。对人类来讲,从一个受精卵的单细胞要产生200多种不同类别的细胞来构成各种组织和器官,必然要靠全能性的早期胚胎干细胞通过自我更新和产生分化后代来实现的。
自我更新是指干细胞可进行均等分裂,产生两个遗传特性上完全一样的干细胞,均等分裂是大多数细胞的特性,而产生分化后代指的是干细胞还可进行不均等分裂,产生的两个子代细胞中一个仍是干细胞,而另一个是遗传特性有所不同的,要开始走上分化道路的定向祖细胞。 早期胚胎细胞是全能的,它既可产生体细胞,又能产生生殖细胞,这包括从早期的卵裂球和囊胚期的ICM细胞以及后来胚胎的3个胚层已分化后的生殖嵴区的原始生殖细胞;而分化的后代细胞可从包括全能细胞向多能细胞和细胞谱系的各级祖细胞发展,这些细胞仍旧可通过均等和不均等两种分裂方式进行繁殖,一直到最后的终未分化体细胞。
干细胞可分为两类:一类干细胞包括从早期囊胚ICM (inner cell mass)细胞分离并在体外培养和建系的胚胎干细胞(embryonic stem cells,简称ES细胞)和从胚胎生殖嵴原始生殖细胞(primordial germ cells, PGC)分离建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells,简称EG细胞) ;另一类是先在成年组织和器官,以后在胎儿组织被证明其存在,随后个别也在体外培养和建系成功的干细胞, 称为组织干细胞( tissue stem cells) ,又称成体干细胞(adult stem cells) 。
三、胚胎干细胞研究简史
哺乳动物早期胚胎体积小,又在母体子宫内发育,因此,要在体内对各类干细胞的分化及其机制进行实验研究几乎不可能。从20世纪50年代开始,人们一直在致力于寻找一个既能在体外增殖,又具有胚胎细胞全能性(totipotency)或多能性的(pluripotency)并通过适当条件能被诱导分化为各种类型分化细胞的实验模型。20世纪50年代末美国发育生物学家Stevens (1967)将着床前发育阶段的小鼠胚胎(包括受精卵) 或12天胚龄的胚胎生殖嵴异位移植到同系成年小鼠辜丸或肾脏被膜下,移植后7天,发现有80%接种灶出现并发展为畸胎瘤。从中分离、培养和建立了胚胎性癌细胞(embryonal carcinoma cell, EC)系,揭开了胚胎性干细胞早期研究的序幕。EC细胞既具有恶性生长又具有早期胚胎细胞发育多潜能性的双重性质。在20 世纪70年代, EC细胞常用作研究哺乳动物发育遗传以及细胞分化的实验模型,并取得了一些重要结果。后因EC细胞核型异常,分化细胞类型有限等缺点而不再被使用。
20世纪80年代初,英国Evans和Kaufman以及美国Martin 2家实验室独立地从小鼠囊胚成功地建立了能在体外不断增殖,并维持不分化状态的多潜能胚胎干(ES)细胞系,开创了ES细胞生物学研究的新时代。但此后ES细胞在其他动物上的分离和建系却颇受挫折,直到20世纪80年代后期才有所突破,见表 19.1。 20世纪90年代初,美国Matsui等从小鼠9天胚胎生殖嵴建立了多潜能的胚胎生殖细胞系,同一时期,少数其他动物也相继建立了ES或EG细胞系。1998年美国威斯康星大学Thomson等人利用36枚新鲜或冻存的人工体外受精胚胎,获得人ICM细胞,经体外培养后,首次成功地建立了5株人类ES细胞系,同年, John Hopkins医学院Shamblott等人从5 -9周人流胚胎的生殖嵴和肠系膜首次培养出人EG细胞系。 第二节胚胎干细胞
胚胎干细胞又称ES细胞主要是指从早期胚胎的卵裂球、囊胚ICM细胞分离培养和建系的细胞。而从胚胎生殖嵴中PGC分离培养建成的称胚胎生殖细胞简称EG细胞。这2类干细胞统称为胚胎性干细胞,其最基本的重要特性是具有稳定地在体外自我更新并保持不分化和发育的多能性,即可以在体外分化为属于3个胚层的各种细胞。
一、ES和EG细胞培养、建系技术
体外培养建系ES和EG细胞的技术以小鼠的最为成熟,成功率最高,其基本原则是有赖于获得全能性胚胎细胞或细胞团并建立体外适合其增殖和抑制分化的培养系统。由于早期胚胎细胞离体后极易发生分化,首先要解决阻止其分化、确保维持其全能性或多能性这一关键问题。目前常用的细胞分化抑制物主要有3种:饲养层细胞( feeder layer cells)、特殊细胞的条件培液(conditioned medium) ,如BRL (Buffalo rat liver)细胞条件培液,分化抑制因子(differentiation inhibitory factor, DIF) ,如白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF) 。此外,也有添加通过gp130信号转导途径的细胞因子,例如,白介素6 (lL一6)、Oncostatin M和睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)等同样可达到维持小鼠ES细胞的不分化状态。因此,体外培养ES和EG细胞可划分为两大类:饲养层培养法和无饲养层培养法。 (一)饲养层细胞培养法
不论ES细胞或EG细胞,原代或初期培养阶段一般都需依赖于能分泌使它们在体外存活和增殖所必需生长因子的饲养层细胞。
不同类型的饲养层细胞分泌的生长因子略有不同。但都要求在ES或EG细胞培养过程中的饲养层细胞保持不分裂增殖,而仍然保持细胞的代谢活性。常用的饲养层细胞有下列两种:一种是取自各种品系小鼠交配后12 dpc (days post coitum)的胚胎成纤维细胞(embryonic fibroblast, MEF) 。经丝裂霉素C (mitomycin C)处理以终止细胞分裂后,用作ES细胞培养的饲养层。另一种是来自SIM小鼠 (S)胚胎的对硫代鸟嘌岭(thioguanine, T)和乌本苷(ouabain, O )有抗性的成纤维STO细胞系,主要分泌干细胞生长因子(stem cell factor, SCF)和白血病抑制因子(LIF)。此外,SLCM) 。一般以2 -3份上述细胞条件培养液加120%胎牛血清,共同组合成无饲养层的ES 细胞培养系统。但往往在胚胎干细胞原代和建系初期缺乏饲养层时,用这种条件培养液培养ES和EG细胞成功率不高,因此,正确使用饲养层细胞和条件培养液在ES/EG细胞建系初期仍是成功的一个关键因素。 (三) ES和EC细胞的体外培养 1. ES细胞
不同动物,甚至同种不同品系动物的胚胎发育速度和方式存在着较大差异,例如,猪ICM细胞生长与小鼠的不一样,其生长速率很慢,且有一个休眠(quiescent)时期。因此,ES细胞培养建系需根据各个物种而选择不同发育阶段的早期胚胎。例如,一般小鼠多选用3 -4 d的囊胚或210 d 的囊胚,绵羊取8 -9 d的囊胚,人和牛取7 -8 d的囊胚。同时,经体外受精的胚胎或由核移植获得的重构胚胎在体外培养至所需适当的发育阶段也是选取ES细胞培养的有效材料来源。
基本培养液为含15%4.5 dpc的小鼠囊胚主要由己分化的滋养外胚层(trophectoderm)和未分化的ICM细胞组成,前者细胞表面一般已表达主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC) ,能识别其相应抗体和形成免疫复合物,在补体存在时可导致细胞发生免疫溶解。囊胚去除透明带,直接暴露于稀释的兔抗JCR小鼠脾细胞抗血清(抗H10. 5 dpc小鼠胚胎,在解剖镜下用镊子剖取包含原始生殖细胞(PGC)的生殖嵴组织，以0.02% EDTA液孵育含PGC细胞的生殖嵴组织, 37 0C , 15 min。吸管轻吹打散,接种于铺有MEF或STO饲养层细胞的4孔培养板内。接种细胞首先出现贴壁生长,每天或隔天更换培养液。生殖嵴组织培养物在饲养层细胞上分裂增殖,480和GCTM -2抗体均可起反应。人与猴是近亲,因此,人与猴的ES细胞都表达 TRA分子,而啮齿动物小鼠却缺(见表19.2) ,推测TRA可能是灵长类多能胚胎干细胞特异性的分子标记。
Oct -4是生殖系专一性转录因子,在小鼠胚胎发育早期、生殖细胞谱系以及体外培养的多能胚胎干细胞中特异地表达,被认为是全能和多能性的一种标志基因。小鼠、猪和包括人类在内的灵长类动物的ES和 EG细胞都表达Oct3 d更换培养液,50 d后,这种拟胚体发育成软骨细胞,经Alcian blue液染色,显示出明确的软骨细胞特征,细胞间存在着11型胶原。 小鼠ES细胞经过拟胚体阶段,结合无血清和多种生长因子、有丝分裂原处理,可被诱导分化为分泌胰岛素的、类似胰岛的结构。近来利用人ES细胞经过悬浮培养获得胚体,再经如bFGF等生长因子诱导可分化为以产生胰岛素为特征的胰岛β样细胞,为临床糖尿病的细胞治疗提供了β细胞来源打下基础。
ES细胞定向诱导分化为肝细胞已有少数几篇报道。国内蒯小玲等成功地用RA、肝细胞生长因子 (HGF)、β-神经生长因子(β- NGF)共同添加至细胞培养液,被诱导分化细胞从形态学、生化和肝细胞功能性标记等指标都证明是具有功能性的肝细胞。但仅使用RA,虽能分化为上皮样细胞,可是并不表达各种肝功能的生化指标,例如,白蛋白、AFP、G-6-P、α1-AT、肝核因子-4和SAPK/ERK激酶-1 (SEK1)等,表明 HGF和β-NGF是诱导小鼠ES细胞分化为功能性肝细胞的重要因子。在现阶段,通过不同的诱导途径可将ES细胞诱导成肝细胞。但体外诱导,体内诱导以及体内外相结合的诱导分化,总的来看, ES细胞定向分化为肝细胞的分化率和在体内与正常肝的嵌合率都还不高,这是一个急需解决的问题。
由于ES细胞易进行遗传操作,近年日本科学家Toyooka将标记基因GFP或lacZ定点敲人(knock in) ES细胞Mvh基因(在生殖细胞分化中特异表达的基因)位点,用以ES细胞体外分化期间追踪生殖细胞的产生。体外ES细胞形成拟胚体时,出现Mvh阳性的生殖细胞,与分泌骨形态发生蛋白(BMP4 )的细胞共培养下,可促进这种Mvh阳性生殖细胞分化。将这种Mvh阳性生殖细胞接种人CD - 1 (ICR)裸鼠辜丸被膜下,可进一步分化成熟为精子。同年早些时候,美国Hubner等人也报道了小鼠ES细胞在体外可发育为进入减数分裂期的卵原细胞(oogonia) ,在体外观察了卵子发生( oogenesis)过程。 第三节成体干细胞
20世纪初, Pappenheim根据对骨髓中的造血细胞发生过程的形态学观察,提出了骨髓中存在着未分化干细胞的设想,认为未分化的干细胞通过各个中间阶段的前体细胞最终生成成熟的多种类型血细胞。第一次提出了成体干细胞(adult stem cell)的概念。 成体干细胞是指一群分布在成体组织中尚未分化的、具有自我更新潜能并负有构建和补充某种组织的各种类型细胞的干细胞,故又名组织干细胞。实际上,成体组织中存在干细胞是个体发育进化史的产物, 涉及组织器官的再生能力和创伤修复等基本特性。例如,骨髓组织的造血干细胞可分裂、分化为血液系统的各种细胞,定期补充细胞成分或失血。小肠和皮肤中的干细胞也分别能分化、补充和更新小肠和皮肤组织的一些细胞。传统的观点曾认为,干细胞一旦分化成熟,就不再分裂增殖了;人体除了血液、皮肤、消化管上皮和肝脏的组织干细胞有一定的再生能力外,其他组织器官例如神经组织基本上不再具有再生能力。同时也认为在成体中存在的、属于某组织器官的成体干细胞是专能或限能的,例如造血干细胞只能分化为血液系统的各种细胞等。但是,新近的研究表明,这些成体干细胞的发育潜能可跨越组织或胚层的界限。例如,从成年小鼠脑组织分离的神经干细胞移植入经X射线照射过的小鼠骨髓部位,则分化出血液细胞。此后,发现人和小鼠的神经干细胞具有分化为肌细胞和胚胎多种组织细胞的潜能。看来,神经干细胞随着微环境条件的改变,其分化潜能会有所变化。因此,神经干细胞同样具有可塑性,能分化为非神经类型的细胞。人们把成体干细胞具有跨越组织或胚层分化的这一特性称为干细胞的可塑性(plasticity)或跨越分化(transdifferentiation).这些新概念从根本上动摇了早先经典的关于组织干细胞分化的胚层限制理论。成体干细胞分化的多能性表明：当机体需要的时候,细胞的命运不是一成不变的。成体干细胞可以"多向分化"的多潜能性的发现,不仅从理论上改写了"组织特异性干细胞只能向特定方向分化"的传统概念,而且还为许多疾病的细胞治疗提供了新的思路和有希望的前景。
目前,比较一致的看法是：成体干细胞是一种处于尚未终末分化的、处于干/祖或前体细胞状态的成体细胞,它来源于成年和未成年个体的组织干细胞。在正常生理条件下,倾向于分化成并更新所在组织的各种细胞。但在特定的外界条件诱导下,一种组织的成体干细胞能超越该特定组织、胚层分化成其他组织的功能性细胞,补充参与其他组织损伤的修复等。
一、成体干细胞具分化可塑性
在成体干细胞的研究中,近年来最重要的发现是干细胞具有可塑性( plasticity)。证据大多数来自小鼠的实验,人们确信机体中成体干细胞的可塑性现象具有普遍性。 (一)骨髓干细胞
骨髓是由不同类型多种细胞成分组成的组织,除了分化的血细胞和间质细胞外,其中主要有二类成体干细胞：一类是造血干细胞(hematopoietic stem cell, HSC),能生成各种血细胞;另一类是间质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC) ,能生成内皮细胞、脂肪细胞和成纤维细胞等。一些实验室通过全骨髓移植实验证明,骨髓中的细胞在不同微环境的位点,除了形成各种血细胞和衍生于间质干细胞的各类细胞外,还可以被诱导分化为神经细胞、肌细胞、骨和肝细胞等外、中、内3个胚层的不同类型的分化细胞(表19.4)。证明骨髓组织中含有的干细胞具有多潜能性,在特定的条件下可跨越组织或胚层分化的能力,能够分化为内皮、神经元、胶质细胞和肝细胞等。
目前已知道骨髓中存在着造血干细胞(HSC)和间质干细胞(MSC)两类干细胞,为区别这两类干细胞在分化潜能上的不同,便把骨髓干细胞分离和纯化。体外培养的骨髓细胞,HSC细胞呈悬浮集落生长;而MSC细胞则贴壁生长,通过换液很容易把两者分开。发现两者也都具有多潜能性。
1.间质干细胞
从骨髓组织分离的MSC细胞在体外单独培养时,经证明具有分化为包括骨细胞、软骨细胞、腱、脂肪细胞和肌细胞等潜能,也能分化成内皮细胞和内胚层的肝细胞。MSC细胞移植至脑中,可分化为非间质细胞性质的神经细胞,特别是神经元、神经胶质细胞。当MSC细胞注射入早期囊胚,然后移植入假孕母鼠,分析嵌合体动物,发现MSC细胞可参与大多数(但不是所有)体细胞类型的分化;当MSC细胞移植入正常宿主时,则除了肝、肺和肠的上皮外,主要分化为造血细胞的谱系世代。当MSC细胞移植入小量射线照射的宿主,则造血系统和胃肠道组织有所增加。
2.造血干细胞
在成体干细胞中,HSC细胞是研究得最早和最多的一种异质性很强的干细胞。由于已知HSC细胞表面存在着一些标志,可用流式细胞仪或免疫磁性分选技术从骨髓细胞中分离和纯化出HSC细胞。经移植至不同的体内微环境,可分化为三胚层的各种类型细胞,包括心肌、骨骼肌、血管内皮系统,肝细胞、肺泡、食管、肠道、胃、胆管以及皮肤和神经细胞等。因此,骨髓中的HSC与MSC一样,分化潜能具有很大的可塑性,可分化为跨越胚层的各种类型细胞。HSC细胞在体外培养时,发现血细胞系之间,即淋巴细胞系与髓性细胞系之间和系内也存在分化方向的转变。
(二)神经干细胞
受经典的造血发生和无脊椎动物神经发育研究的启示,发现了神经干细胞。起初,把神经发育过程中未成熟的、增殖中的各类细胞称为神经前体细胞(progenitor cell)。因此,神经干细胞是神经系统中一类能自我更新并产生神经元和神经胶质细胞的前体细胞。早期研究是从哺乳动物胚胎的中枢神经系统和周围神经系统开始的,确证了胚胎的神经系统中普遍存在着这类神经干细胞。其后,进行成体神经干细胞分离,发现成体神经干细胞主要存在中枢神经系统的2个神经发生区域：即脑的海马区(hippocampus)和次脑窒区(subventricular zone, SVZ )以及包括脊髓等其他一些非神经性的区域。
总而言之,神经干细胞或神经前体细胞在个体发育过程中,经受发育上的时空变化,成体神经干细胞的可塑性受到限制。通过个体不同发育阶段的神经干细胞移植至宿主不同部位,可以发现,神经干细胞移植物分化为神经细胞的潜能具有发育阶段的依赖性,成体中的神经干细胞分化潜能随发育遂受到限制。用成体中枢神经系统的干细胞经体外培养扩增的移植实验表明,其在成体微环境中尚有一定的可塑性。例如,成体脊髓衍生的干细胞通常不产生神经元,若注人成体脑的海马区,则能产生神经元;成年海马衍生的干细胞移植入SVZ,则能产生嗅球神经元。然而,至今却没有直接证据表明成体神经干细胞分化为如在胚胎中正常产生的有突触的神经元。当然,移植的神经干细胞或神经前体细胞在宿主不同部位也会受到所在微环境各种因素的相互影响;神经干细胞经体外不同方式处理后移植至宿主体内,也可能会改变其分化行为和表型。
倘若神经干细胞分化潜能被限制,这些限制能否撤消?即成体干细胞能否重新获得如在胚胎正常所产生各类细胞的能力?现有的研究资料表明,把体外培养的SVZ干细胞生长成神经球通过注射入鸡胚神经嵴 (neural crest)途径,其分化潜能有所扩大,可产生周围神经系统。另外,神经干细胞的子代也有可能恢复发育多潜能性。例如,通常唯一产生神经胶质细胞的视神经O2A中枢前体细胞在体外可恢复其多能的、产生中枢神经系统的干细胞。表明环境因子能改变神经干细胞的命运或增加其可塑性。 (三)肝干细胞
由于肝干细胞本身缺乏特异性标志,给肝干细胞分离和鉴定带来了困难。人们对肝干细胞存在与否一直有争论,直到最近才得以确认。早在1958年, Wilson JW等人认为"肝组织中存在着干细胞",其依据是肝组织因营养损伤或部分切除时仍能再生,但已存在的肝细胞不能分裂和再生,因而,新生的肝细胞只能来源于肝干细胞。肝癌发生的研究也支持了肝干细胞存在的假设。化学致癌实验时,位于门管周围的小细胞发生增殖,这种具有卵圆形细胞核、少细胞质的细胞称为卵圆形细胞(oval cell)。在人的肝组织中,同样发现这种卵圆形细胞。对发育中的肝具有自我更新能力的细胞进行单克隆培养和分析,证明这种卵圆形细胞在体外能大量增殖,细胞移植后在形态和功能上可分别分化为肝细胞和胆管上皮细胞,表明肝卵圆形细胞是肝干细胞,具有分化为肝细胞和胆管上皮细胞的双潜能性。近来发现,骨髓和血液中的细胞能分化为肝细胞,因此,肝干细胞来源可能有两条途径：一是肝组织外的来源,近年越来越多的资料证明,骨髓和血液是卵圆形细胞的来源,人的骨髓细胞也能分化为肝细胞和胆管上皮细胞;二是肝组织内处于休眠期的肝干细胞。双潜能的肝干细胞同时表达肝细胞和胆上皮细胞的标志物,细胞角蛋白CK7 和CK19为胆上皮细胞的特异性标志;白蛋白和肝代谢酶细胞色素P450可作为肝细胞的特异性标志物;而细胞角蛋白CK8和CK18在肝实质细胞和胆上皮细胞都有表达。角蛋白CK14可区分单层和复层上皮细胞。OV-6抗体是啮齿类卵圆形细胞的特异性标志物,但不是人肝干细胞的标志,原因不清楚。肝干细胞一般除了其特有的形态学外,常结合上述特有标志通过免疫组织化学、流式细胞检测和原位杂交等方法予以鉴定。
双潜能卵圆形细胞不仅能分化为肝细胞和胆管上皮细胞,当分别移植到胰腺和十二指肠时,还能跨越组织各自分化为胰腺细胞和肠上皮细胞。表明肝干细胞在适当的微环境能被诱导分化为仍是内胚层其他组织的细胞。但还未见有跨胚层分化的直接例证。但是,利用胚胎的肝组织在体外培养则大量生成血细胞,但很难说明这些血细胞就是来自肝干细胞,很可能这些血细胞是来自胚胎肝组织中混杂的造血干细胞。卵圆形细胞异常分化或分化突然停止有可能发生肝细胞癌。国内外曾有报道,在培养液添加适当的分化诱导剂,如丁酸钠或二甲基亚砜,可诱导和促进肝干细胞分化为肝细胞。在培养液中添加转化生长因子β(TGFβ)或肝细胞生长因子(HGF) ,可诱导肝干细胞分化为胆管上皮细胞。因此,结合细胞分化诱导物等培养条件,有可能使肝干细胞定向分化为肝细胞或胆管上皮细胞。 (四)骨骼肌干细胞 肌肉的生长、更新和修复是与肌纤维周围的卫星细胞(satellite cells)有关,故一般认为这就是骨骼肌干细胞。近年证明,从肌肉分离的干细胞不仅能分化出肌肉,还能产生血液细胞成分。Jiang等人从3天龄的新生小鼠前后肢近端分离和体外培养骨骼肌细胞,得到一类被称为多能成年前体细胞(multipotent adult progenitor cells, MAPC)的细胞。这种细胞具有类似于小鼠骨髓MAPC的表型和特征,能在体外增殖。肌肉来源的MAPC在体外特定的细胞因子条件下可被诱导分化成内皮、肝细胞样细胞和包括进一步分化为神经元及神经胶质样细胞的神经外胚层细胞。表明骨骼肌组织中确实存在着干细胞,并具有分化的可塑性。
二、成体干细胞研究中的问题 (一)异质性
实际上,成体干细胞在组织中的所含数量极少,又缺乏特异性检测标志,很难从组织中将其分离纯化出来。因此,在一些成体干细胞"可塑性"的实验中,人们质疑所谓"可塑性"可能是组织中混杂着几种或一群不同类型的干细胞而分化的结果,这在骨髓组织的干细胞实验中更为明显。在肝细胞谱系分化的各类祖细胞中,就发现存在着异质性(heterogeneity)和可塑性。干细胞的异质性在遗传学中是指由于不同遗传机制而产生相同或类似的表型。异质性在某种程度上是干细胞固有的特性。造血干细胞异质性早已被证明。从骨髓肌干细胞的研究中发现,这类所谓的肌干细胞在特定环境下分别分化出肌肉和血细胞,其实这是由含有两类分化方向完全不同的干细胞所致。这一实验结果使得成体干细胞"可塑性"理论受到质疑和动摇。
人们也曾设想成体组织中存在着类似胚胎干细胞那样的多能性干细胞。Zuk等人(2001)发现,从人体脂肪组织来源的干细胞可分化为肌肉、骨和软骨。但该作者指出不排除该组织中混入了诸如随血流循环进人脂肪组织的造血干细胞(HSC)或其他类型干细胞的可能性。因此,无法确证这类分化为肌肉、骨和软骨的就是"脂肪干细胞"。也有人相信"来源于肌肉组织的多能干细胞"其实就是随血液循环迁移或过客(itinerate)而停留在肌肉的造血干细胞。因为当这些细胞被移植入动物体内,在内皮细胞生长因子等细胞因子的剌激下,会被重新激活而分化为血细胞。甚至估计小鼠体内有100 -400个HSC细胞处于这种状态。目前还不能确定成体干细胞的可塑性是否因干细胞异质性直接所致,因此,要明确一种干细胞与其组织来源及归宿之间的确切关系,还得进行大量的研究。 (二)干细胞所处的环境
小鼠造血干细胞和胰腺干细胞都能分化出肝细胞并能修复小鼠受损的肝组织。但是,移植造血干细胞和胰腺干细胞对修复小鼠受损肝组织的效果远远不如移植成熟肝细胞本身。看来干细胞所处环境的信号对于细胞分化有重要影响。特殊稳定的微环境可以控制造血干细胞生长和分化,这种微环境在早期被称为壁鑫(niche)。现在微环境定义为能容纳一个或多个干细胞并能控制其自我更新和分化的组织细胞和胞外基质的组合。它是由各种调控活性成分组成的空间,细胞间保持的距离以及局部的近距离调控正适合于细胞间相互作用。从视网膜再生研究中发现一个很有趣的现象。将视网膜祖细胞分离出来在体外培养一些时间后,分化为视网膜感受器细胞。如果从小鼠眼中分离的干细胞移植入正常小鼠视网膜,它们将不能分化和被整合入正常视网膜;而当移植入损伤的视网膜中,则分化为感受器细胞,并整合入该受损组织,尽管尚未确证这类整合入的细胞是否具有正常细胞的功能,但组织环境确实对干/祖细胞的命运有决定性的作用;同时,也不可忽视干/祖细胞本身对所处环境信号的反应能力。众所周知,脊髓产生的运动神经元具有对来自各组织的信号具有反应的能力;从鼠脑中获取的神经干细胞在体外因中断了来自大脑的信号刺激,故在体外培养条件下,只能一过性地分化为多巴胶能神经元,不能维持长久的多巴胶能神经元的功能。因此,干细胞与所处的细胞环境之间精巧而默契的协调作用可能是干细胞"可塑性"的重要原因之一。 (三)成体干细胞可塑性的调控
目前认为,人们对成体干细胞"可塑性"现象的解说有4种：①机体中存在着多种来源和不同分化方向的成体干细胞群体,分别能定向地向各自的组织来源的细胞分化。②机体中存在着一种多潜能的成体干细胞,在不同的微环境信号的刺激下,可向不同组织的细胞方向分化。③某特定组织来源的成体干细胞,除了向该组织的细胞成分分化外,在特殊信号的剌激下,可重新编程(reprogramming),继续分化为其他类型的细胞。④某种成体干细胞与特定组织来源的干细胞发生融合,成为具有来自2种细胞的遗传物质,染色体数量也是正常2倍的"杂交细胞"。但使前者具有了后者的分化潜能,因此,成熟的干细胞也许无法变成不同类型的细胞,但它们可自动与现有的干细胞融合,形成其他组织类型的细胞。例如神经干细胞与造血干细胞融合,从而"变性"为血液干细胞,分化为各类血细胞。
正如上所述,干细胞的"可塑性"一方面与其所处微环境密切相关,即受到外源性因素调控;另一方面也受到成体干细胞本身对这类外来信号做出反应的固有特性即内源性因子调控。外源性因素通常指各种体液因子、邻近同种或异种细胞的直接接触、细胞外基质等的作用。至今大多数干细胞的可塑性研究是基于组织损伤而造成的微环境,因而人们正把注意力集中在组织损伤后的微环境对干细胞的调控作用。
在内源性调控机制中,一般认为转录因子在其中起着重要的作用。细胞分化中,一个已明确定向分化程序的谱系特异性转录因子过表达会致使该谱系特异性转录因子功能发生颉顽作用,并使原有的基因程序活性保持沉默。这样,这类细胞对微环境中特定细胞因子的反应是分化成另一类新细胞。例如,在成肌细胞分化中,转录因子MyoD和Myf5起着调控成肌细胞调控因子(myogenic regulatory factor, MRF)网络中的颉顽作用。在成纤维细胞中, MyoD的过表达可致使这类细胞转变为成肌细胞,同时, Myf 5又抑制成肌细胞的分化活性。然而,在某些情况下,这一过程却是可逆的。在转基因C2C12细胞的肌管形成中,同源异形框基因的异位表达降低了成肌细胞调控因子MRF和MyoD表达水平,致使多核的肌管去分化而转变成单核的细胞, 进一步再分化为软骨细胞、脂肪细胞等中胚层类型的细胞。 (四)分化细胞的功能
目前成体干细胞包括"可塑性"的研究的结果大多数是基于检测新生组织中终末分化细胞的特定蛋白或标记的表达,很少直接论及到终未分化细胞的生理功能。然而,有的不同类型的细胞却具有相同的标记, 例如,内皮细胞与成熟血细胞亚群表面标志都有CD31,甚至HSC表面也有CD31,因此,选用CD31作为进行分析HSC能否分化为内皮细胞时,显然是不合适的。不少人对仅仅检测到某种标志就证明该细胞或组织具有正常细胞功能的做法常持有质疑;特别是干细胞的异质性和类型以及环境的复杂性使得人们对体外培养的干细胞移植入体内能否发挥预期功能表示怀疑。确实,目前在技术学上还无法适当地证明成体干细胞在所移植的组织或器官中产生出来的细胞具有功能性,例如,在研究帕金森氏病的动物实验中,体外培养的多巴胶能神经元移植入脑内,可观察到被整合入动物脑组织,但不能证明这些新的神经元是否具有完整的功能。因此,欲要确定供体干细胞的终末分化状态应该包括细胞表面标志鉴别和细胞功能确定这2方面因素。例如,神经干细胞移植后，"可塑"为血细胞,既要鉴定出分化细胞具有血细胞的表面标志,又要肯定使已接受致死辐射剂量照射过的受体小鼠存活并使造血功能恢复。只有这样,才能完整地确定干细胞的分化细胞特性和功能。 (五)体外增殖
成体干细胞从某一组织分离、纯化后,目前,尚未有现成的能较长期在体外维持其未分化状态并大量增殖的方法。因大多数成体干细胞研究是用于再生医学作细胞治疗的目的,常设计使用两种手段:其一是将分离的成体干细胞直接移植入动物或患者的损害组织器官,以期在受损组织原位分化出该组织中成熟的功能性的细胞;其二是在体外将干细胞诱导分化为所需要的成熟细胞,而后将细胞移植入损害组织或器官。鉴于成体干细胞很难分离、纯化和体外培养,因而,目前这两种手段都不能奏效。一个典型的例子是将烫伤患者的、含有皮肤干细胞的健康皮肤切取下来,进行短暂体外培养,再重新植回患者的皮肤损害部位,发现尽管皮肤可愈合,但不能产生汗腺和毛孔,无法行使正常功能。由于在体内观察组织行为极为困难,而且得到的结果不确定因素较多,因而,继续探索成体干细胞体外培养和增殖的条件和方法,将是一项极为重要的课题。
第四节干细胞在再生医学中的应用
干细胞(包括胚胎干细胞)生物学研究的最新进展,使人们对干细胞独特的生物学特性有新的了解。成体干细胞的"可塑性"或"跨越分化"潜能的发现具有重要的理论意义和应用价值。不仅向传统的细胞分化和细胞周期理论提出了挑战,而且成体干细胞在细胞生物学行为上与癌细胞很相似,成了研究癌症发生机制新的生长点。在再生医学中可望利用成体干细胞修复创伤、疾病的细胞治疗并介入整形外科学和组织工程学等方面,其中除了神经干细胞作为脑损害的细胞治疗研究有较多的报道外,大部分工作集中在组织工程学领域,干细胞在生物和再生医学中的应用主要有下列4方面。
一、哺乳类发育的体外模型
如前所述,体内研究哺乳动物胚胎发育和各类细胞分化极为困难。干细胞,特别是ES细胞因其富具独特的发育全能或多能性质,在嵌合体动物中,ES细胞又能参与个体发育,并产生包括生殖系在内的各种类型细胞,表明ES细胞类似胚胎的ICM细胞,不仅具有完整的发育潜能性,而且也持有对调节正常发育所有信号的应答能力。在特定的体外培养条件和诱导剂共同作用下,ES细胞在体外可被诱导分化属于3个胚层谱系的各种高度分化的体细胞,例如神经细胞、肌肉、血细胞、上皮细胞和成纤维细胞等。同时,在这些细胞分化过程中,必然先经过一定的前体细胞阶段。因此,ES细胞不仅是研究特定类型细胞分化的模型,而且也是研究某些前体细胞起源和细胞谱系演变较理想的实验体系。可能ES细胞体外分化途径和机制与在体胚胎的不完全相同,但在分子水平包括发育的遗传程序仍有共同或相似之处。小鼠的卵受精后的卵裂期较长,约 3天才到达16细胞期,进一步分裂,约在4.5 dpc时形成囊胚。这时胚胎出现第一次分化,产生以后参与胚外结构的滋养外胚层和原始内胚层。胚泡内约由20个左右细胞组成内细胞团(ICM)。胚胎进一步增殖和空腔化(cavitation) ,约在5.0 dpc时逐形成原始外胚层或上胚层(epiblast) ,后者在原肠期除了主要发育成胎儿本体的3个胚层组织外,还有部分细胞将来参与胚外中胚层的发育。悬浮生长的体外细胞拟胚体在结构排列上与在体胚体的有些不同,但一些类型的细胞分化秩序和方式却非常类似于在体的胚体。因此小鼠ES 细胞已被公认为是研究哺乳类发育较理想的模型。人ES细胞建系后,一些国家的法律和道德伦理禁止用于人体胚胎研究。但近来认识到,ES细胞本身缺乏胚外组织,不可能产生完整的胚胎。因此,许多国家在法律上禁止以克隆或复制人为目的的前提下,已允许将人ES细胞类似于小鼠ES细胞的体外实验那样,用于研究人类胚胎在体内所不能分析的发育、分化和调节信号等事件。这无疑将丰富、充实和完善人们对人类早期发育或畸胎发生等认识。
二、介导改造动物的基因
ES细胞介导的转基因优点明显超过常规如逆转录病毒载体整合至早期胚胎或显微注射DNA至受精卵原核等一般转基因方法,主要是因为在后一途径中,导人的多拷贝DNA存在着随意整合的问题,产生的转基因动物效果一般不太理想。利用ES细胞技术学的优点是在于产生一种新的经生殖系传递的转基因动物以前,可以通过在体外ES细胞系统中,研究和筛选外源DNA表达质粒的构建、整合和表达。从而可提高产生转基因动物的效率;同时,ES细胞在体外增殖迅速,可作为重组ES细胞取之不尽的来源;ES细胞的基因改造技术,如剔除(knock out)、敲入(knock in)能够精确地改造细胞内存在的基因,克服位置效应、插入失活和特殊内源性基因失活等弊病。重组ES细胞的基因组经生殖系传递途径,可不断地提供和产生同样基因型的、丰富的转基因动物的种子细胞来源。近年来,在制备转基因动物出现了一个新的策略利用体外培养的体细胞经外源基因转染后,取其细胞核显微注射至去核卵细胞,从而获得转基因动物,这一技术路线显然比直接显微注射DNA至去核卵细胞效果更好,特别是对那些至今还未建立ES细胞系但核移植已获成功的那些动物。
三、人体的基因和细胞治疗
干细胞生物学技术和理论的发展,促使医学产生了一门新的学科分支,即再生医学(regenerative medicine)。它是一门探索人体组织和器官自身所具有的构建、更新和修复的能力,并使用多种修复术手段使人体的组织器官功能得以改善或恢复新兴学科。干细胞的基因和细胞治疗则是再生医学的重要组成部分之一。这里基因治疗是指用遗传改造过的人体细胞直接移植或输入患者体内,达到控制和治愈疾病为目的的治疗手段,又称细胞治疗。人ES细胞经遗传操作后一般能稳定地在体外增殖传代,克服了目前基因治疗中需大量靶细胞来源的主要问题。
四、组织工程的种子细胞来源
第二篇：细胞工程总结
★绪论：
细胞工程：是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的实验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特征，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体有关理论和技术方法的学科。 ★第一章：
细胞全能性：一个生活细胞所具有得产生完整生物个体的潜在能力。(作为植物组织或器官的基本单位细胞，在离题培养条件下，实现分裂和分化并能发育成胚胎和完整植株的能力)
细胞分化：导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。
脱分化：培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程。
再分化：当细胞脱分化以后，无序生长的细胞及其愈伤组织要重新进入有序生长才能再生为个体的过程。
按细胞分裂能力植物细胞可分为3类：第一类始终保持分裂能力：茎尖、根尖及形成层细胞。第二类分化终端细胞，永远失去分裂能力：筛管、导管、气孔保卫细胞等特化细胞。第三类暂不分裂细胞(G0细胞)在受到外界刺激后可重新启动分裂：表皮细胞及各种薄壁细胞。 离体培养中器官发生的方式：先芽后根、先根后芽、愈伤组织的不同部位形成芽和根，在通过维管组织的联系形成完整植株。
器官分化过程：第一阶段外植体经过诱导形成愈伤组织。第二阶段是“生长中心”(即分生组织，愈伤组织中形成器官的部位)形成。第三阶段器官原基及器官形成(生长中心部位形成不同的器官原基，进而分化出相应的组织和器官)。
体细胞胚：离题培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物。
体细胞胚形成的途径：1直接途径就是从外植体某些部位直接诱导分化出体细胞胚，如：直接从子叶基部的表皮细胞或切口处产生体细胞胚。
2、间接途径是在固体培养中外植体先形成愈伤组织，再分化发育产生体细胞胚;悬浮培养中先产生胚性细胞团再形成体细胞胚。 与器官发生形成个体的途径相比，体细胞胚发育再生植株的特点：一是体细胞胚具有双极性，二是体细胞胚形成后与母体的维管束系统联系较少，即出现生殖隔离现象。
体细胞胚的特点：
1、起源于非合子细胞
2、双极性细胞能同时允许根芽发生
3、存在生殖隔离
4、经历类似合子胚发育的各种胚共四个发育阶段
5、遗传稳定变异相对较小
6、由性细胞发育而来 ★第二章;
离体培养条件下遗传变异的特点：普遍性、局限性、嵌合性、生理适应性。
影响体细胞遗传与变异的因素：1供体植物(原有的倍性水平在培养细胞多倍化过程中起着重要作用)2培养基及培养方式(培养方式、激素以及其他附加成分均会诱导体细胞变异的发生)3继代培养的次数(继代时间越长继代次数愈多细胞变异的概率就越高)。 ★第三章：
实验室的组成：基本实验室，辅助实验室，实验室布局。其中基本实验室分为准备室(进行一切与实验有关的准备工作)接种室(进行材料的离体无菌操作)培养室(对离体材料进行控制条件下的培养)。辅助实验室又分细胞学实验室和生化分析实验室。
基本设备配置：常规设备(天平、冰箱、酸度计、离心机、加热器、纯水器、分装设备)、灭菌设备(高压蒸汽灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒装置、紫外灯)、无菌操作设备(净化工作台、接种箱)、培养设备(培养架、培养箱、摇床、生物反应器)、其他设备。 灭菌技术：培养基灭菌(高压蒸汽灭菌或过滤灭菌)玻璃器皿灭菌(湿热和干热灭菌)金属用具灭菌(使用前干热灭菌使用中浸泡在70%的酒精中，再以火焰将酒精烧去，冷却)操作环境灭菌(气体熏蒸或紫外线照射)
培养基成分：无机盐类、有机化合物、生长调节物质、水、其他附加成分。
外植体：指用于离体培养的活的植物组织，器官等材料。
外植体的来源有三种：生长在自然环境下的植物、有目的地培养在温室控制条件下的生长的植物、无菌环境下已经经过离体培养的植物。 培养基组成：
1、无机盐类：大量元素、微量元素;
2、有机化合物：糖类、维生素、肌醇、腺嘌呤、氨基酸、其他复合成分;
3、生长调节物质：生长素类、细胞分裂素类、赤霉素类;
4、水;
5、其他附加成分：琼脂、活性炭。
外植体灭菌选择：
1、种子灭菌;
2、芽，叶片，茎等组织材料灭菌;
3、未成熟胚，子房，及花药灭菌。注意：灭菌后的材料应立即接种培养，否则会造成二次污染。 ★第四章：
快速繁殖：利用细胞的再生特性，在组织培养条件下加速繁殖材料的个体生产提高繁殖系数
植物脱毒和快繁的意义：1能够有效保持优良品种特性2生产无病毒种苗，防止品种退化3快速繁殖新品种，加速优良品种推广4节约耕地，提高农产品商品产出率5便于运输
离体繁殖：在人工控制的无菌条件下，使植物在人工培养基上繁殖的技术。
立体繁殖的一般技术环节：1无菌培养物的建立2培养物的增殖3器官分化4植株的形成和移栽
培养基的增殖方式：芽增殖，不定芽增殖，胚状体的增殖，愈伤组织增殖。
增值方式的选择：首先选择茎芽增殖，其次是不定芽，除非万不得已不宜选择愈伤组织增值方式。
花药培养：把发育到一定阶段的花药接种到人工培养基上，使其发育和分化成为植株的过程。
花粉培养：从花粉中分离出花粉粒使之成为分散的或游离的状态，通过培养使花粉粒脱分化进而发育成完整植株的过程。 共同点：利用花粉染色体、单倍体性培养发育
不同点：1.花粉培养可以避免花药壁花丝和药隔等体细胞组织的干扰能更好地调节控制雄核发育的各种因子;2.花粉数量大具有单细胞单倍性和较高同步性等特点，可以从较少的花药获得大量的花粉植物，3.花粉培养还能为研究细胞分化条件胚胎发生和形态发生机理提供较为理想的实验系统，4花药培养的成功为深入展开原生质体的培养遗传操作和发育分子生物学的研究提供了有用的材料和良好的技术基础。
单培体培养的特点;1体细胞染色体数目减半;生长发育弱，体型小，各种器官明显减小;2各种器官明显减少;3雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代。
单培应用潜力:1迅速获得纯和性材料，缩短育种年限2获得育种中间材料3与诱变育种结合可提高诱变率4作为遗传工程受体更有效5与体细胞融合6用作基础研究的各个领域。
胚培养的意义:1克服杂交育种中杂种胚的早期夭折2克服珠心胚的干扰，提高育种效率3理论研究的意义，胚培养可用于探讨植物器官发生过程的许多问题，研究胚发育中胚乳的作用和进行胚胎切割实验等。 胚培养类型:成熟胚培养和幼胚培养。
幼胚培养的生长发育方式：1胚胎发育2早熟萌发3愈伤组织 胚乳发育类型：核型 细胞型 沼生目型 ★第五章
植物细胞培养：在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养使其增殖的技术。
细胞悬浮培养：将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。
用于建立细胞悬浮培养的愈伤组织要求：有较好的松散型，使之在悬浮培养的起始阶段易打散;还必须必备较强的增殖和再生能力。 满足细胞悬浮培养体系的三条件：1悬浮培养物分散性良好，细胞团较小一般在30到50个细胞以下;2均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色;3细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2到3天甚至更短时间可增加一倍。
悬浮细胞培养的同步化:同一悬浮培养体系中的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。
同步化方法：分选法，饥额法，抑制剂法，低温处理法。
单细胞培养方式:微室培养，看护培养，平板培养，其他单细胞培养技术。
生物反应器类型：搅拌式，气动式，固定化细胞。 悬浮细胞的生长动态(S曲线)：延迟期、指数生长期、直线生长期、减缓期、静止期。当细胞生长进入减缓期时，就要及时继代。 ★第六章
原生质体：除去细胞壁后的裸露的球形细胞。
原生质体的特点：虽然没有了细胞壁，但仍能进行植物细胞的各种基本生命活动，如蛋白质和核酸的合成、光合作用、呼吸作用以及通过质膜的物质交换等。
原生质体纯化方法：
1、沉降法;优点是搜集方法方便，操作简单，原生质体丢失少。但这种方法在漂洗过程中易造成原生质的损害且纯度不够好，常存在少量脱壁不完全的细胞和破碎的原生质体。
2、飘浮法;优点是可收集较纯净的原生质，还可避免在离心纯化过程中因震荡撞击或挤压引起的原生质损伤或破裂，所用试剂简单，成本低，从而造成原生质体的获得率较低。缺点是原生质在数量上损失较多。
3、梯度离心法：优点：获得原生质体更为纯净。 原生质活力测定原理：
方法:荧光素双醋酸酯染色法(FDA)，酚藏花红染色法，荧光增白剂染色法(CFW)，伊凡蓝染色法。
原生质的应用：1原生质由于脱去了细胞壁并且在离体培养条件下能够实现细胞的全能性而且再生植株，可以作为一个良好的试验系统而用于细胞壁的形成与功能，质膜的结构与功能，细胞骨架细胞分化与脱分化等基础理论问题的研究。2原生质体容易摄取外缘DNA、染色体、细菌、细胞器和质粒等，从而为高等植物细胞水平和分子水平的遗传操作提供理想的实验体系。3原生质体还可应用于体细胞杂交，无性系变异及突变体的筛选，细胞器的分离等研究。4原生质体可以作为植物生理学，分子生物学，遗传学，病毒学，育种学，体细胞遗传学和实验生物学等学科的理论和应用研究提供重要的实验体系。5作为遗传转化的受体。 ★第七章
植物体细胞杂交:又称原生质体融合将植物不同属种甚至科间的原生质体通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。
融合方法：
1、PGE诱导融合方法，优点是融合成本低，不需特殊设备;融合子产生的异核率较高，融合过程不受物种限制。缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害作用。
2、电融合法：优点是不存在对细胞的毒害问题，融合效率高，融合技术操作简便。缺点是仪器昂贵，给融合技术的实际应用带来一定的限制。 ★第八章
人工种子的概念：任何一种人工种皮包被或裸露的具有形成完整植株能力的繁殖体。 人工种子的分类：(根据包被的需要程度分)
1、裸露或休眠的繁殖体。
2、被人工种皮包被的繁殖体。
3、水凝胶包埋在包被的人工种皮的繁殖体。(根据繁殖体的类型分)1体细胞人工种子2非体细胞人工种子 人工种子的特点：一 重要的经济作物、粮食作物以及多年生经济林木的人工种子报道日益增多。二 是以微器官为繁殖体的报道呈增加趋势，其中包括微芽、微枝、原球茎、小鳞茎和小块茎等。 人工种子组成的三个部分：繁殖体、人工胚乳和人工种皮。 ★第九章
玻璃化:是指液体转化为非晶体的固化过程。
玻璃化法：是将生物材料经极高密度的玻璃化溶液快速脱水后直接投入液氮，使生物材料连同玻璃化溶液发生玻璃化转变，进入玻璃态。 玻璃化的途径：1 大幅度提高冷却速率 2 增加溶液浓度 影响超低温保存效果的因素：植物的基因型 抗冻性及器官、组织和细胞的年龄及生理状态。
冰冻保护剂的特点：易溶于水，对细胞无毒，容易从组织细胞中清除。 冰冻保护剂的类型：渗透型冰冻保护剂、非渗透型冰冻保护剂。 第十章
植物基因转化受体系统：用于转化的外植体通过组织培养途径及其它非组织培养途径，能高效、稳定的再生无性系，并能接受外源基因的整合，对用于转化选择的抗生素敏感的再生系统。 植物基因转化受体系统的类型：1 经过愈伤组织的受体系统 2 不经过愈伤组织的受体系统 3 原生质体在生系统 4 细胞系及其体细胞胚受体系统 5 生殖细胞受体系统。 ★论述题：
植物细胞工程的应用：
1、在植物育种上的应用：将常规植物育种技术与植物组织培养技术相结合，可以获得常规技术难以获得或无法获得的种质材料。(快速获得特殊倍性材料、克服远源杂交不亲和、克服杂种胚早期夭折、导入外援基因、突变体筛选、种质资源保存)
2、种苗脱病毒与快速繁殖：利用茎尖培养脱毒，在组织培养条件下或在具有良好的病毒传播隔离条件下进行无病毒种苗的快速繁殖;利用组织培养技术，亦使许多传统上繁殖系数很低的有性繁殖植物得以快速繁殖，大大提高了经济效益。
3、细胞培养生产有用次生产物：植物几乎能生产人类所需要的一切天然有机化合物，如：蛋白质、脂肪、糖类、天然药物、香料、生物碱及其它活性物质。4在植物生物学和发育生物学研究中的应用：植物不同组织、细胞培养获得再生个体，及其在此过程中所形成的调控技术本身，进一步揭示里植物细胞全能性学说的本质和内涵，是对细胞生物学领域的重要贡献。
5、在植物遗传、生理生化以及植物病理等基础研究中心的应用：利用细胞途径进行染色体操作，可以有目的地创造植物附加系，代换系，易位系为染色体工程的研究开辟新途径;细胞培养和组织培养为研究植物生理活动提供了理想技术体系;在人工培养条件下对植物抗病性进行研究，免除了环境条件的干扰，使得结果更加真实可靠。 人工种子的应用前景：
1、微器官人工种子可能最先用于无性繁殖植物：微器官如微芽、试管块茎和试管鳞茎等作为繁殖体时，成苗率高且出苗整齐，具有田间应用的可行性，同时，在立体培养中，可采用脱毒技术首先出去病毒后再进行人工种子生产，可大大提高无性繁殖植物种子的质量，避免天然种苗引起的病害传播。
二、人工种子可用于天然种子繁殖后代群体变异大的植物：不定芽试管苗繁殖体技术已在生产上显示了树体整齐的优越性，以微芽为繁殖体的人工种子技术已经建立，可大大降低生产成本，减少运输损耗。
三、以体细胞胚为繁殖体的应用的可能性体细胞胚胎发生在多种作物中已经进行过深入研究，然而迄今仍未达到实际应用的程度。总之，目前体细胞人工种子技术还不完全成熟，但它在生物学和社会经济发展中的潜在利用价值不容否认。
第三篇：植物细胞工程总结
绪论
1, 细胞工程：是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的实验方法或技术，在细胞水
平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术。狭义的细胞工程是指细胞融合和细胞培养技术。
根据研究对象的不同，高等生物的细胞工程分为动物细胞工程和植物细胞工程。动物细胞工程包括细胞培养技术(包括组织培养、器官培养)，细胞融合技术，胚胎工程技术(核移植、胚胎分割等)，克隆技术(单细胞系克隆、器官克隆和个体克隆)。植物细胞工程包括植物组织、器官培养技术，细胞培养技术，原生质体融合与培养技术，亚细胞水平的操作技术等。
2, 植物细胞工程：以植物组织细胞为基本单位，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操 作，使细胞得某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种或创造新物种，或加速繁殖植物个体，或获得有用物质的过程称… 植物细胞工程的应用：
1， 利用细胞融合技术，克服远缘杂交不亲和性。 2， 利用培养变异，筛选优良的突变体。 3， 倍性育种，缩短育种年限。
4, 离体种质保存。 5,
细胞培养生产有用的物质。 第二章
一， 实验室设置及内部设备
实验室建设应考虑的问题：
1、实验的性质
2、实验室的规模
细胞工程实验室: 基本实验室:准备室、无菌操作室、培养室 贮藏室 辅助实验室：细胞学实验室、生化分析实验室 温室
1、准备室
完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、 配制、培养基分装及高压灭菌;器皿、材料的洗涤等工作。
主要设备
纯水器 工作台 药品厨 天平 电磁炉 冰箱 玻璃器皿 酸度计 高压灭菌锅 干燥箱等
2、无菌操作室 (接种室)
用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序。
接种室应用推拉门，设有缓冲间，面积2m2为宜。进入接种室前更衣换鞋，减少带入接种室杂菌。
接种室主要设备
超净工作台 ：每次实验前要用紫外灯灭菌20min，关掉紫外灯开始工作，工作过程中注意一直开着吹风机。
无菌操作用具： 离心机 细胞融合仪
3、培养室
用于接种材料的培养。培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。 控制：温度、光照、湿度。
培养室主要设备：培养架 空调 时控器 自动开灯、关灯温度自动记录仪 摇床 二 ，培养基
1，培养基的种类
1 培养基根据其态相不同分为固体培养基与液体培养基。根据培养物的培养过程，培养基分为初代培养基和继代培养基。根据作用不同，培养基为诱导培养基、增殖培养基和生根培养基。 根据营养水平不同，培养基分为许多种,常用如下： (1) MS培养基：富盐平衡培养基(还有LS、BL、ER)
特点: ①无机盐浓度较高，元素比例合适，是较稳定的平衡溶液;②微量元素种类齐全; ③营养丰富 。
(2)B5培养基 ：高硝态氮培养基(还有N6和SH培养基)
特点: ①硝酸钾含量高; ②氨态氮含量低; ③ VB1含量较高。 (3)N6培养基：高硝态氮培养基
特点：硝态氮含量高，氨态氮含量较低。
(4)White培养基：低盐培养基(还有WS、HE、改良Nitsch等 特点：无机盐含量低，有机成分也很低，适于生根培养。 (5)KM-8P培养基：
特点:有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。 培养基成分：水 无机盐 有机成分 植物激素 培养物支持材料 辅助性物质 2，植物激素的应用规律
①先Aux后CKs处理,有利于细胞分裂但不利于细胞分化。容易产生多倍体细胞(核分裂和胞壁形成不同步所至)， cks有利于胞壁形成。
②先CKs 后Aux处理，细胞分裂也分化(可能是内源生长素起作用) ③ Aux 和CKs 同时处理，分化率提高。 Aux与CKs的比值改变形态建成的方向。
高 有利根分化，抑制芽形成; Aux / CKs 适中 促进愈伤组织生长;
低 有利芽分化，抑制根形成;
在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异, 培养基配制：
1、确定配方
2、移母液
3、定容
4、称蔗糖
5、调PH值(用0.1MNaOH或HCl调PH值为5.8)
6、培养基熬制(加琼脂)
7、分装(100ml的三角瓶约装入30-40ml, 30瓶/L)
8、扎口
9、灭菌
10、接种 三，植物材料灭菌
灭菌方法 ①.培养基灭菌：高压湿热灭菌，某些激素采用过滤灭菌
②.玻璃器皿灭菌：干热灭菌：150℃ 40min;120℃ 2h，湿热灭菌：121℃, 30min 接种前用酒精棉球擦试，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌。
③.接种工具灭菌：用前干热灭菌，用前湿热灭菌，接种前用酒精棉球擦试，浸入95%酒精液中，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌。 电热石英砂灭菌器 ④.实验服、口罩灭菌：湿热灭菌
⑤.接种室灭菌 ：紫外灯照射(接种室、超净台)：波长260nm，距离小于1.2m，15-20min。臭氧灭菌机：1-2h,熏蒸灭菌：(5-8ml甲醛+5g高锰酸钾)/ m3 ,接种台喷雾消毒：75%酒精。 ⑥.培养室灭菌 : 新建培养室用前要彻底熏蒸1次。
隔1周用洗衣粉水或来苏水拖地1次，用高锰酸钾擦架1次。
⑦.物体表面灭菌: 灭菌方式：喷雾、涂抹杀菌 ,范围：超净台的台面和四壁、双手 消毒剂：70%酒精;1-2%来苏水;1%新洁尔灭等。
⑧.接种材料消毒: A, 取材 营养器官：根、茎尖、茎段、叶片等
生殖器官：胚胎(胚、胚珠、胚乳等)和花药 等
外植体〔explant〕：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料 外植体灭菌
用化学灭菌剂灭菌
2 消毒步骤：①流水冲洗或洗衣粉漂洗②用化学灭菌剂浸润消毒通常：70%酒精30S，0.1%升汞4-10min。表面有较厚蜡质层的的可加吐温-20或吐温-80等浸润剂(灭菌液的0.5%)。 ③无菌水冲洗3-5次。注：灭菌液要浸没材料 第三章 植物细胞全能性与形态发生
一、植物细胞全能性(totipotency)：植物体每个正常细胞都含有该植物的全部遗传信息，在适宜的条件下如同受精卵一样, 具有发育成完整植株的潜在能力。
细胞分化〔cell differentiation〕指由于细胞分工而导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。 细胞脱分化〔cell dedifferentiation〕培养条件下使一个已分化的细胞失去已分化细胞的典型特征，或消除了细胞分工，使之回复到分生细胞状态或胚性细胞状态的过程。或具有特异结构和功能的细胞转化成没有特异结构和功能的细胞的过程。
愈伤组织〔callus〕植物离体培养过程中脱分化后的细胞，经过细胞分裂，产生的无组织结构、无明显极性、松散的细胞团称为愈伤组织。多在外植体切面上产生。
愈伤组织的特征：细胞分裂快，结构疏散，缺少有组织的结构，颜色浅而透明。成功地脱分化将导致细胞分裂，形成愈伤组织或胚性细胞团。
植物胚胎干细胞：植物连续的器官分化是由顶端分生组织细胞发育而成，因此，植物顶端分生组织细胞具有较强的表达全能性的能力，被称为植物胚胎干细胞。
生理脱离效应;当细胞或组织脱离母体以后，在适宜的条件下将进行一些特殊的发育方式，如再生、复壮等，child将其称为生理脱离效应
(细胞)或(组织)与母体分离和激素的调控是细胞全能性表达的前提。 在离体培养条件下，细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的。脱分化是细胞全能性的表达前提，再分化是细胞全能性的表达最终体现。
静止细胞(G0细胞)启动分裂是分化细胞成功脱分化的重要标志。
细胞脱分化的三个阶段 ：1，启动阶段 细胞质增生并开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白出现。 2，演变阶段 细胞核向中央移动，质体转变为原质体 3，脱分化终结期，回复到分生组织。
细胞再分化〔redifferentiatio〕脱分化后无序生长的分生细胞在离体培养下，重新恢复细胞分化能力，经过细胞分化、组织分化和器官分化递进地进行，最后再生完整植株。
极性(polarity)：植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志(即细胞分化的标志)。 激素在植物生长发育中具有重要的调控作用，也是离体培养条件下，调控细胞脱分化和再分化的主要因素。其中生长素和细胞分裂素是两类主要的调控培养条件下细胞生长和分化的植物激素。
在离体培养条件下TEs则由愈伤组织薄壁细胞分化形成这是愈伤组织细胞分化器官的前提。 植物的离体器官发生：培养条件下的组织或细胞团(愈伤组织)分化形成不定根、不定芽等器官的过程。
离体培养中器官发生的方式
通过器官发生形成再生植株大体上有3种方式：
①先芽后根:是应该选择的方式.②先根后芽 ③根芽同长 植物细胞经再分化形成植株有2条途径：(在离体培养条件下)器官发生 体细胞胚胎发生 体细胞胚(胚状体、体胚)：指离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物。
胚状体有以下几方面的界定：
①体细胞胚是离体培养的产物，只限于在离体培养范围使用，以区别于无融合生殖胚;②体 3 细胞胚起源于非合子细胞，以区别于合子胚;③体细胞胚经过了胚胎发育过程，以区别与离体培中器官发生形成个体的途径。
经过愈伤组织的胚胎发生需要3个培养阶段： ①诱导外植体形成愈伤组织;②诱导愈伤组织胚性化 ，③体细胞胚形成。 体细胞胚的结构与发育特点
1、与器官发生途径相比，体细胞胚在组织学上有3个特征： ①体细胞胚最根本的特征是具有双极性，即在发育的早期阶段从方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都是单极性的;
②体细胞胚的维管组织与外植体现存组织无解剖结构上的联系，而不定根或不定芽与外植体或愈伤组织的维管组织有联系。
③体细胞胚胎的维管组织分布是独立的Y字形结构，不定芽维管组织无此结构。 人工种子：(狭义)植物离体培养中产生的体细胞胚，包裹在含有养分和具有保护功能的物质中，并在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。
(广义)在体细胞胚、微型营养变态器官、不定芽等微繁体之外加上必要的营养成分后，用具有一定通透性而无毒的材料将其包裹起来，形成的与天然种子相似的颗粒体。 第四章 离体培养下的遗传与变异
离体培养中的遗传与变异特点：
1、普遍性：变异可发生在各种培养类型中; 变异发生在各种植物的培养中;变异发生与培养类型有关。
2、局限性：一些单基因控制的性状不仅发生隐形突变，也发生显性突变。
3、嵌合性：是指同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞它是组织培养中常见的现象。 体细胞变异诱导材料的选择：其一，目标性状的可行性。体细胞突变的频率虽然较高，但对于某一个体来讲，变异的性状是个别的，因此选择综合性状良好的植物品种材料，通过诱变改变个别不良性状，是体细胞突变系选择的目的。其二，必需充分考虑试验植物的细胞培养技术水平，只有对起始材料有良好的培养技术，才有可能制定完满的诱变及选择方案。如果起始细胞的培养技术不成熟，不能再生整株，则不能进行后续的各项操作。 其三，适当的细胞类型亦是提高体细胞突变系筛选效率的重要条件。 第五章植物主要的组织培养技术 第一节快繁
无性繁殖途径：
1、无融合生殖：即不经过减数分裂和受精而形成种子。
2、营养繁殖：即由母株的营养体部分再生出新的植株 植物离体快速无性繁殖：利用离体培养技术,用优良植株的外植体进行培养,在短期内获得大量遗传一致的个体的方法，这种离体无性繁殖方法由于繁殖速度快，又称离体快速无性繁殖。所获得的株群称单株无性系或单芽无性系
初代培养 ：芽、茎段、叶片等外植体在离体培养条件下诱导愈伤组织、侧芽或不定芽、胚状体过程。即接种某种外植体后，最初的几代培养。
生根培养：将芽苗转接到生根培养基上培养成为完整植株的过程 植物快繁常见问题及对策：
(一)污染的原因及预防：原因：细菌、真菌为病源菌;污染途径有外植体带菌，培养基及器皿灭菌不彻底，操作人员未遵守操作规程，环境不清洁。 预防措施：(1)防止材料带菌：避免阴雨天在室外采集外植体;春秋组培;材料预培养。(2)严格外植体灭菌(3)接种用具灭菌彻底(4)严守无菌操作规程(5)保持培养室清洁
(二)褐变的原因及预防原因(1)植物品种(基因型)(2)生理状态(3)培养条件(4)材料转接季节 防止措施(1)选择适宜的外植体(2)连续转接3)先液体培养再固体培养(4)加抗氧化剂(5)选择合适的培养条件加活性炭或 暗处培养。
(三)玻璃化的原因及预防原因：
(1)激素浓度(尤其CTK)高(2)琼脂浓度低(3)光照弱(4)温度高(5)通风条件不好(6)培养基离子种类及比例不适宜 预防措施：(1)适当控制培养基中无机盐成分，适当提高蔗糖和琼脂浓度，减少含氮化合物的用量，降低培养基的水势。(2)适当降低CTK的浓度。考虑加入适当的脱落酸。(3)增加自然光照;增加容器通气，控制温度。(4)加入活性炭、多效唑或CCC等物质。 第二节、植物脱毒快繁技术 1热处理脱毒原理：
①病毒是DNA大分子，病毒进入植物细胞后，随植物细胞DNA一起复制。热处理并不能杀死细胞，只是钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，而失去病毒的侵染能力。
②热处理是一种物理效应，可加速植物细胞分裂，在激烈分裂的细胞中正常核蛋白合成占优势，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。因此加速分生组织细胞的分裂，能够获得无病毒植株。
2、热处理脱毒方法：(1)温汤浸渍处理 适用于休眠器官，在50℃左右的温水中浸渍10min至数小时，方法简便易行，但易使材料受伤。(2)热空气处理 热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好。将生长的盆栽植株移入温热治疗箱内(35-40℃)处理时间因植物而异，短则几十分钟，长可达数月。
分生组织不带病毒，可能有4方面的原因：
1、植物体病毒的移动主要靠2条途径：一是通过维管系统，而分生组织中尚未形成维管系统;二是通过胞间连丝，但这条途径病毒移动速度非常慢，赶不上茎尖和根尖细胞不断分裂和活跃的生长速度。
2、当植物细胞分裂DNA复制时，病毒DNA随着复制。因此，植物细胞分裂和病毒繁殖之间存在相互竞争。在旺盛分裂的分生组织中，代谢活动很高，正常核蛋白合成占优势，使病毒无法进行复制。
3、茎尖中存在高水平内源激素，可抑制病毒的增殖。
4、在植物体内存在有一种“病毒钝化系统”，在分生组织中的活性最高，因而使分生组织不受侵染。
第三节 花药和花粉的培养
花药培养:将花粉发育至一定阶段的花药培养在人工培养基上，诱导其花粉粒改变发育进程，形成花粉胚或愈伤组织，进而分化成苗的过程。(器官培养) 花粉培养(小孢子培养)：将发育至一定阶段花粉从花药中分离出来成为分散或游离状态，花粉脱分化后再生成苗。(细胞培养)
单倍体：具有配子体染色体数的孢子体。
单倍体植物3个明显特点：
1、体细胞染色体数减半
2、生长发育弱，体形小
3、雌雄配子严重不育
花药、花粉培养的意义
1、迅速获得纯合型材料，提高选择效率，缩短育种年限
2、获得育种中间材料
3、突变体选育
4、体细胞融合
5、遗传研究
6、获得染色体异附加系和代换系
7、遗传工程受体 花粉植株再生途径：
1、经由成愈伤组织再生植株
2、经由胚状体再生植株 花粉分离收集：
由于花粉包于花药内，必须将它们从花药中分离、收集才能进行培养。方法： 1)花粉漂浮自然释放法:将花药接种于液体培养中，使花粉自然释放。 2)人工挤压法:用玻璃棒捣碎花药使花粉释放。
5 3)机械法:用磁力搅拌器打碎花药释放花粉。
释放的花粉粒→ 尼龙网(孔径20—60um)过滤，除去药壁等组织 → 500-1000转/分离心1-5分钟，收集花粉。
花药培养过程中花药为什么要经过低温处理 低温处理的作用机理：
1)预处理引起花药、花粉内源激素发生变化，改变了小孢子(花粉粒)第一次有丝分裂的轴向发育(正常发育时，两次有丝分裂形成三核花粉粒)，进而形成愈伤组织或胚状体。 2)提高小孢子的生活力，延缓退化速度，而提高了诱导率。
3)引起小孢子孤立化，即小孢子从花药中分离。因为低温处理过程中，花药内薄壁细胞和绒毡层逐渐退化，从而切断与小孢子之间的联系。 花药培养时为什么要用较高浓度蔗糖和较低浓度激素?
蔗糖浓度 培养基中蔗糖浓度比其它组织培养高，尤其早期培养，一般5%—10%原因是花粉母细胞的渗透压比花丝等体细胞高，即高浓度的蔗糖不利于药壁、花丝等体细胞的生长，而利于花粉的生长。
激素 花药壁分化程度高，重新分裂需要较高的激素浓度才能启动。因此，花药培养基的激素水平要相对较低才能抑制二倍体细胞的分裂。确定适宜的激素浓度，以促使花粉细胞分裂的同时又抑制花药二倍体细胞分裂是成功获得单倍体的关键。 第四节 胚胎培养
胚胎培养类型 胚培养 胚乳培养 子房培养 胚珠培养
胚培养概念：无菌条件下，把胚从种子、子房或胚珠中分离出来，在培养基上进一步生长发育形成幼苗的过程。
成熟胚培养：是指子叶已形成的种胚。仅提供一定的温度、湿度就可以发芽生成植物体。如种子的发育
成熟胚培养意义：克服发芽障碍;打破种子休眠，缩短育种周期等。 幼胚培养：胚龄处于原胚期、球形胚、心形期、早鱼雷期的培养。
幼胚培养意义：
1、克服远缘杂交不育
2、克服珠心胚干扰，提高育种效率
3、幼胚具有较高再生能力，可通过体细胞胚胎发生产生大量的再生植株。
4、为原生质体培养、细胞融合及基因转化提供试验材料。 幼胚培养时胚的发育方式有哪几种?各有何特点?
① 胚性发育：幼胚的离体培养，仍按在活体内的发育方式发育，最后形成成熟胚，然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株，这种途径发育的幼胚一般一个幼胚将来就是一个植株
② 早熟萌发：离体胚不继续胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗，通常称为早熟萌发。在大多数情况下，一个幼胚萌发成一个植株，但有时会由于细胞分裂产生大量的胚性细胞，以后形成许多胚状体，从而可以形成许多植株，这种现象就是所谓的丛生胚现象。
③愈伤组织：在许多情况下，幼胚的离体培养首先发生细胞增殖，形成愈伤组织。一般来讲由胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织，这种胚性愈伤组织很容易分化形成植株。 胚乳按发育初期是否形成细胞壁分为①核型胚乳②细胞型胚乳③沼生目型胚乳 试管受精：培养未受精的胚珠或子房并在试管内撒播花粉，使其受精形成具有生活力的种子。 未授粉胚珠子房培养与授粉后胚珠子房培养有何不同?
根据培养的胚珠是否受精将胚珠培养分为受精胚珠的培养和未受精的胚珠的培养。(1)未受精的胚珠的培养,目的是为试管受精提供雌配子体。(2)受精后胚珠的培养,胚珠内胚的发育处于早期阶段,从两个细胞的原胚开始至球形胚阶段。
6 第六章 植物细胞培养及次生产物代谢生产
植物细胞培养：是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养使其 增殖的技术. 培养方法：培养规模:小规模培养 大批量培养
培养方式:悬浮培养 平板培养 看护培养 产物不同:诱变培养 次生产物培养
培养方式：悬浮培养、单细胞培养、植物细胞的规模化培养及有用物质生产
悬浮培养(cell suspension culture)悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基进行培养增殖的技术。
成功的悬浮细胞培养体系必须满足3个条件：
1、浮悬培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。
2、均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。
3、细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚至更短时间便可增加1倍。
培养周期的概念 具有一定起始培养密度的单细胞，从开始培养到细胞数目和总重量增长停止这一过程，称为一个培养周期。
悬浮细胞培养的同步化：指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。(植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相当困难。)
细胞同步化的方法：①分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。
②饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。
③抑制剂法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期—G1期的同步化细胞。 ④低温法：冷处理也可提高培养体系中细胞同步化程度。
单细胞培养
1、平板培养
2、看护培养
3、微室培养
4、双层滤纸培养 植物次生代谢产物：植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。
植物细胞大规模培养的技术要求：从细胞生长与培养技术方面讲必须满足以下3个条件
1、培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物。
2、细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的终产物。
3、代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中。 固定化培养系统--固定化培养技术的优点在于：
1、可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研究特定的代谢途径，并便于调节;
2、细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处的状态，相互间接触密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次生产物的合成;
3、由于细胞固定在支持物上，培养基可以不断更换，可以从培养基中提取产物，免除了培养基中因含有过多的初生产物对细胞代谢的反馈抑制，也由于细胞留在反应器中，新的培养基可以再次利用这些细胞生产初生产物，从而节省了生产细胞所付出的时间和费用;
4、正是由于细胞固定在一定的介质中，并可以从培养基中不断提取产物，因此，它可以进行连续生产。
7 利用细胞培养生产有用物质的一般程序
1、选材 应注意条件：①药效肯定②对其有效成分有充分的了解④市场短缺或价格昂贵;③有测定有效成分和药理的可靠方法⑤取有药效成分的部位，且该部位较易形成愈伤组织。
2、细胞株系建立
3、大量培养
4、产品提取与纯化 第七章 原生质体培养与融合 原生质体(Protoplast)：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。
亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。
核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体(miniprotoplast)。
胞质体(cytoplast)：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。
原生质体材料预处理 (暗处理，预培养和低温处理)原因：预质壁分离可使胞壁内表层充分暴露，增加胞壁降解酶与胞壁的接触面而提高胞壁降解速度;降低原生质体内电解质渗漏，防止在分离期间外来酶被吸入细胞内，降低原生质体对酶液中可能存在的有害影响的敏感，提高原生质体的稳定性和存活率。 原生质体纯化方法有：
离心沉淀法 原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。 漂浮法 原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。
接口法 原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液的密度大于原生质体的密度，另一种溶液的密度小于原生质体的密度，原生质体介于两种溶液之间。 原生质体培养方法
1、固体包埋培养(原生质体纯化后，离心，用培养基稀释至一定密度，再与0.6%琼脂或低溶点琼脂糖(37C左右)混合，培养于培养皿中。)
2、固体平板培养
优点：可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于统计原生质体分裂频率。 缺点: 操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必需合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏低则琼脂糖凝固太快原生质体不易混合均匀。
3、液体浅层培养(将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进行培养。) 优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基转移培养物。 缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。
4、固、液培养 优点：固体培养基中的营养物质可缓慢释放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中加一定量的活性炭，则还可以吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。
缺点：不易观察细胞的发育过程。
5、共培养法(将生长迅速的原生质体培养物与难于培养的原生质体混合)
6、琼脂糖珠培养
7、饲养层培养
原生质体再生：再生细胞壁、细胞分裂和生长、植株再生(愈伤组织形成)
原生质体融合又称体细胞杂交是指将植物不同种、属甚至科间的原生质体通过人工诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。 融合方法
1、NaNO3法 NaNO3的作用：中和质膜的负电荷，使原生质体不再相互排斥，而紧密结合 8 在一起 不足：诱导频率不高。
2、高pH-高Ca离子法 优点：杂种产量高。不足：高pH值对细胞有毒害作用
3、PEG法 特点：融合频率高、可重复性强、诱发融合无特异性、毒性较低
4、电融合法 特点 不存在对细胞毒害的问题、融合效率高、融合技术操作简便 原生质体的融合过程包括3个主要阶段：1)两个或多个原生质体的质膜彼此靠近; 2)局部区域质膜紧密粘连，彼此融合;3)融合完成，形成球形的异核体或同核体。 供体-受体式细胞融合包括非对称杂交和细胞质杂交两种方式。
非对称杂交是一亲本的细胞核和细胞质与另一亲本的少量核物质(1～2条染色体)和全部细胞质融合;
细胞质杂交是一亲本的细胞核和细胞质及另一亲本的全部细胞质融合，可能使两种来源不同的核外遗传成分(细胞器)与一个特定的核基因组结合在一起，这种杂种叫细胞质杂种。 第九章后
1, 超低温通常是指-80℃以下的低温。常用的保存介质或容器有：超低温冰箱(-80～-150℃)、液氮(-196℃)和液氮蒸汽箱(-140℃液氮)等。
2, 用于离体超低温保存的植物材料一般有愈伤组织、悬浮细胞、胚、花粉和茎尖等。 3, 细胞内外水的冻结状态时细胞冻存技术的关键。
4, 种质超低温保存的关键是降温冰冻过程中避免细胞内结冰。在降温过程中必须使细胞发生适当程度的保护性脱水，使细胞内外的水流到细胞外结冰，并且在化冻过程中防止细胞内次生结冰。因此针对不同种类的植物材料，筛选合适的冰冻保护剂，采用适当的降温冰冻速度和化冻方式可能使细胞不受损伤或使损伤减小到最低程度。
5, 超低温保存植物种质资源的程序包括培养材料的准备、预处理、冰冻及保存、化冻处理、细胞活力和变异的评价及植株再生等几个步骤。
6, 降温方法从降温方式来看，有快速冰冻法、慢速冰冻法、两步冰冻法和逐级冰冻法等。 7, 玻璃化：是指液体转变为非晶体的固化过程。使溶液玻璃化得两条途径：大幅度提高冷却速率和增加溶液的浓度。
8, 玻璃化溶液(PVS1),其中包含了20.5%的DMSO、15.5%的乙酰胺、10%的1,2-丙二醇以及6%的聚乙二醇，他们分别起到冰冻保护、毒性中和、强化玻璃化和非渗透聚合的作用。 9, 超低温保存方法主要有：玻璃化法、包埋玻璃化法、干燥法、预培养法、预培养-干燥法和包埋脱水法。
10, 包埋脱水法的三个步骤：先将材料用藻酸钙包埋，然后将包埋后含有保存材料的藻酸钙小珠在含有高浓度(或梯度浓度)蔗糖的培养基上预培养，最后侵入液氮。
11, 玻璃化法是将生物材料经极高浓度的玻璃化溶液快速脱水后直接投入液氮，使生物材料连同玻璃化溶液发生玻璃化转变，进入玻璃态。
12, 材料的基本特性包括植物的基因型、抗冻性及器官、组织和细胞的年龄及生理状态。 13, 冰冻保护剂具有的特点：易溶于水、对细胞无毒，容易从组织细胞中清除。冰冻保护剂的作用主要表现在：增加膜透性，加速细胞内的水流到细胞外结冰，稳定细胞膜结构，阻止低温伤害，降低冰点，提高容液的粘滞性，阻止冰晶生长。
第四篇：医学细胞生物学_重点名词解释
unit menmbrane单位膜 细胞膜性结构在电镜下观察呈现出较为一致的3层结构，即电子致密度高的内外两层之间夹着电子致密度较低的中间层，称为单位膜。
fluid mosaic model流动镶嵌模型该模型认为细胞膜由流动的脂双层和嵌在其中的蛋白质组成，具有液晶态特性。磷脂分子以疏水性尾部相对，极性头部朝向水相组成膜骨架;脂双层构成膜的连续主体，既具有晶体分子排列的有序性，又具有液体的流动性;球形蛋白质分子以各种形式与脂质双分子层结合。糖类附在膜外表面。强调细胞膜的流动性和不对称性。
Cell surface细胞表面 人们把细胞膜、细胞外被、细胞膜内面的胞质溶胶、各种细胞连接结构和细胞膜的一些特化结构统称为细胞表面。
fluidity细胞膜的流动性是指膜脂和膜蛋白处于不断运动的状态。这是生物膜的基本特征之一。
cell coat细胞外被 细胞膜上的糖蛋白和糖脂上所有糖类都位于膜的外表面。在大多数真核细胞膜的表面，富糖类的周缘区常被称为细胞外被或糖萼。细胞外被中的寡糖和多糖能吸附水分，形成黏性表面，可以保护细胞表面免受机械损伤和化学损伤;而且细胞外被在细胞与细胞间的识别和黏附方面也有重要作用。
cell junction 细胞连接多细胞生物的已经丧失了某些独立性，为了促进细胞间的相互联系，相邻细胞膜接触区域特化形成一定的连接结构，称为细胞连接，其作用是加强细胞间的机械联系，维持组织结构的完整性，协调细胞间的功能活动。分为闭锁连接、锚定连接、通讯连接。
amphipathic molecule双亲媒性分子：既亲水又疏水的分子叫做双亲媒性分子。比如磷脂，头部为由磷酸和碱基组成的磷脂酰碱基，极性很强，有亲水性;尾部是两条非极性的脂肪酸链，有疏水性。 liposome脂质体：为了进一步减少双分子层两端疏水尾部与水接触的机会，脂质分子在水中排列成双分子后形成一种自我封闭的双层球型结构。
Endomembrane内膜系统位于细胞之中的膜性结构将细胞内部区域化，形成执行不同功能的膜性细胞器，如内质网、GC、溶酶体、过氧化物酶体以及小泡和液泡等，统称为内膜系统。
lysosome溶酶体一层单位膜构成，囊泡状，内含多种酸性水解酶类。
matrix 基质线粒体内腔充满了电子密度较低的可溶性蛋白质和脂肪等成分，称之为基质。
elementary particle基粒 即ATP酶复合体。内膜的内表面附着许多突出于内腔的颗粒，头部具有酶活性，能催化ADP磷酸化生成ATP。 molecular chaperone分子伴侣是一类能够协助其它多肽进行正常折叠、组装、转运、降解的蛋白，并在DNA的复制、转录、细胞骨架功能、细胞内的信号转导等广泛的领域都发挥着重要的生理作用。 A site。A部位也称氨酰基部位或受位，主要位于核糖体大亚基上，是接受氨酰基-tRNA的部位。
P site。P部位又称肽酰基部位或供位，主要位于核糖体小亚基上，是肽酰基-tRNA移交肽链后，tRNA释放的部位。
polyribosome多聚核糖体 当进行蛋白质合成时，大、小亚基必需结合在一起才能发挥作用，而且常常是多个核糖体结合在一条mRNA分子上，称为多聚核糖体。
chromatin染色质 是间期细胞遗传物质的存在形式，由DNA、组蛋白、非组蛋白及少量RNA等构成的细丝状复合结构，形状不规则，弥散分布于细胞核内。
chromosome染色体 是指细胞在有丝分裂或减数分裂过程中，染色质经复制后反复缠绕凝聚而成的条状或棒状结构，借以保证DNA被准确的分配到子代细胞中，对物种遗传性状稳定性的维持起到重要作用。
nuclear skeleton核骨架 它是真核细胞间期核中除核膜、染色质与核仁以外的部分，是一个以非组蛋白为主构成的一个纤维网架结构。核骨架与核纤层、中间纤维相连形成一个网络体系，是贯穿于细胞核与细胞质之间的一个独立结构系统 nuclear lamina核纤层 内层核膜靠核质一侧的一层由纤层蛋白组成的纤维状网络结构，称为核纤层。 核仁周期 指核仁在细胞周期中出现的一系列结构与功能的周期性变化，进行周期性消失与重建的过程。
karyotype核型是指某一个体细胞的全部染色体在有丝分裂中期的表型，包括染色体的数目、大小和形态特征。
loop model襻环模型该模型认为30nm的染色质纤维折叠成襻环，襻环沿染色体纵轴由中央向四周放射状伸出，环的基部集中在染色单体的中央，连接在非组蛋白支架上。
extracellular matrix,ECM细胞外基质：机体发育过程中由细胞合成并分泌到细胞外的生物大分子所构成的纤维网状物质，分布于细胞与组织之间、细胞周围或形成上皮细胞的基膜，将细胞与细胞或细胞与基膜相联系，构成组织与器官，使其连成有机整体。包括胶原与弹性蛋白，非胶原糖蛋白，氨基聚糖和蛋白聚糖等。 basement membrane基底膜 上皮细胞下面特化的细胞外基质，由Ⅳ型胶原、层粘连蛋白及硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等构成的网状结构。对上皮细胞、内皮细胞等的生命活动具有重要影响。
GAG氨基聚糖:由氨基己糖和糖醛酸(硫酸角质素中是半乳糖)二糖结构单位重复排列，聚合形成的无分支长链多糖。包括透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素和硫酸角质素6种。 anchorage dependence锚定依赖性正常真核细胞除了成熟血细胞外，大多须黏附于特定的细胞外基质上才能抑制凋亡而存活，称为锚定依赖性。
simple diffusion 单纯扩散不消耗细胞代谢的能量，不依靠专一性膜蛋白分子，只要物质在膜的两侧保持一定的浓度差即可发生的最简单的运输方式。 ligand-gated channel 配体闸门通道仅在细胞外的配体与细胞表面结合时发生反应，引起通道蛋白构象发生改变时开放的闸门通道称为配体闸门通道 voltage-gated channel电压闸门通道仅在膜电位发生变化时才开放的闸门通道称为电压闸门通道
carrier protein载体蛋白是镶嵌于膜上的运输蛋白，具有高度的特异性，其上有结合点，能特异的与某一种物质进行暂时性的可逆结合。
facilitated diffusion帮助扩散借助于细胞膜上载体蛋白的构象变化而顺浓度梯度的物质运输方式称为帮助扩散。
Membrane flow膜流 指由于膜泡运输，真核细胞生
物膜在各个膜性细胞器及质膜之间的常态性转移。
co-transport伴随运输有些物质逆浓度主动运输的动力不是直接来自ATP水解，而是由离子浓度梯度中储存的能量来驱动的。人们把这种由Na+等离子驱动的主动运输过程称为伴随运输。
constitutive pathway of secretion结构性分泌途径：在真核细胞中不断产生分泌蛋白，它们合成后立即包装如高尔基复合体的分泌囊泡中，然后被迅速带到细胞膜处排出，这种分泌过程称为结构性分泌途径。
regulated pathway of secretion调节性分泌途径一些细胞所要分泌的蛋白或小分子，储存于特定的分泌囊泡中，只有当接收细胞外信号的刺激时，分泌囊泡才移到细胞膜处，与其融合将囊泡中分泌物排出，这种分泌过程称为调节性分泌途径。
signal patch信号斑：存在于完成折叠的蛋白质中，构成信号斑的信号序列之间可以不相邻，折叠在一起构成蛋白质分选的信号。
G-protein-coupled receptorG蛋白偶联受体: 一种膜蛋白受体，可以激活G蛋白，介导许多细胞外信号的传导。其结构特征包括：
1、一条多肽链构成，7个跨膜的α螺旋区;
2、N端朝向胞外，C端朝向胞内;
3、N端有糖基化位点，C端的第三袢环和C端有磷酸化位点。
G protein.G蛋白 是一类在信号转导过程中，与受体偶联的、能与鸟苷酸结合的蛋白质，位于细胞膜胞质面，为可溶性的膜外周蛋白，由αβγ三个蛋白亚基组成，有GTP酶的活性，可结合GDP。G蛋白的功能主要是通过其自身构象的变化，激活效应蛋白，进而实现信号从胞外向胞内的的传递。
adenylate cyclase, AC腺苷酸环化酶：是G蛋白的效应蛋白，可催化ATP生成cAMP，是cAMP信号传递系统的关键酶。 cellular respiration细胞呼吸：糖、蛋白质、脂肪等有机物，逐步分解释放能量，最终生成CO2和H2O;与此同时，分解代谢所释放出的能量储存于ATP中，这一过程称为细胞呼吸，也称为生物氧化或细胞氧化。
substrate-level phosphorlation底物水平磷酸化 由高能底物水解放能，直接将高能磷酸键从底物转移到ADP或其他核苷二磷酸上使其磷酸化的作用，称为底物水平磷酸化。
chemiosmotic coupling hypothesis化学渗透假说 ： ATP合成的一种机制。氧化磷酸化偶联的基本原理是电子传递中的自由能差造成H+穿膜传递，暂时转变为横跨线粒体内膜的电化学质子梯度。然后，质子顺浓度梯度回流并释放出能量，驱动结合在内膜上的ATP合酶，催化ADP磷酸化成ATP。
电子传递链 在线粒体内膜上有序的排列成相互关联的链状的传递电子的酶体系，它们能够可逆的接受和释放质子和电子。
ATP synthase ATP合酶 是线粒体内膜的内表面附着的球形基粒，将呼吸链电子传递过程中释放的电子能量用于使ADP磷酸化成ATP的关键装置，是多种多肽结构的复合体，称为ATP合酶。分为头部、柄部、基片。
axonal transport轴突运输发生在轴突内的物质运输称为轴突运输，目前已知的轴突运输是沿着微管提供的轨道进行的。
acrosomal reaction顶体反应 卵细胞表面覆盖着胶状物，为了越过这道屏障，精子细胞首先伸出一个顶体突起，穿透胶质层和卵黄层，使精卵细胞膜融合而完成受精，这个过程称为顶体反应。
kinesin驱动蛋白：是微管动力蛋白，其分子结构由2条重链和2条轻链聚合而成。
myosin肌球蛋白：微丝的动力蛋白，每个肌球蛋白分子有一条重链和数条轻链组成，分为头部、颈部、尾部。
dynein动位蛋白：微管动力蛋白，包括胞质动位蛋白和纤毛动位蛋白。
transposon转座子 是从染色体的一个位置转移到另一位置或者在不同染色体之间移动，又称为移动基因。
gap gene间隔基因：基因转录区中位于编码基因之间的，与蛋白质翻译无关的序列。 overlapping gene重叠基因：同一DNA序列中2个基因的核苷酸序列相互重叠。
split gene割裂基因：在真核生物细胞基因中，编码序列常常被非编码序列隔断，呈现分裂状。
genetic codon遗传密码：mRNA上相邻的3个碱基排列形成一个密码子，一个密码子决定一种氨基酸的形成，所有的密码子统称遗传密码。
translation翻译 mRNA从细胞核进入细胞质后，在核糖体上进行蛋白质合成的过程即为翻译(translation)。
cell proliferation细胞增殖：细胞通过生长和分裂获得具有与母细胞相同遗传特征的子代细胞，从而使细胞数目成倍增加的过程。它是细胞发育过程中的一个阶段，也是细胞生命活动的一种体现，使生命得以延续。
Restriction point限制点。正常细胞的G1期有某些特殊的调节点，起到控制细胞增殖周期开关作用的，被称为限制点。
MPF有丝分裂促进因子 M期细胞质中存在某种成分能使间期细胞提前进入M期，这种成分后来被命名为有丝分裂促进因子。它是调节细胞进出M期所必须的的蛋白质激酶，具有广泛的生物学功能，通过促进靶蛋白的磷酸化而改变其生理活性。
mitotic apparatus有丝分裂器 在中期细胞中，由染色体、星体、中心粒及纺锤体所组成的结构被称为有丝分裂器。中期以后发生的染色体分离、染色体向两极的移动及平均分配到子代中，有丝分裂器起到了关键性的作用。
growth factor生长因子是一大类与细胞增殖有关的多肽类信号物质。目前发现的生长因子多数有促进细胞增殖的功能，少数兼具双重调节作用，能促进一类细胞的增殖，而抑制另一类细胞。
synapsis联会减数分裂偶线期同源染色体发生配对现象，称为联会。联会的结果是每对染色体形成一个紧密相伴的二价体bivalent。
cdk细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶：为一类必须与细胞周期蛋白结合后才具有激酶活性的蛋白激酶，通过磷酸化在细胞周期调控中起关键核细胞中一些功能相似的同源蛋白，由一个相关基因家族编码，能随细胞周期进程周期性的出现及消失。在细胞周期各特定阶段中，不同的周期蛋白相继表达，并与细胞中的其他蛋白结合，对细胞周期相关活动进行调节。
check point 细胞周期检测点为了保证细胞染色体数目的完整性及细胞周期正常运转，细胞中存在着一系列监控系统，可对细胞周期发生的重要事件及出
现的故障加以检测，只有当这些事件完成或故障修复后，才允许细胞周期进一步进行，该监控系统即为检测点。
dertermination决定：细胞从分化方向确定开始到出现特异形态特征之前这 细胞全能性是单个细胞在一定条件下增殖、分化发育成为完整个体的能力，具有这种能力的细胞称为全能性细胞(totipotent cell)
induction诱导一部分细胞对邻近细胞的形态发生影响，并决定其分化方向。
inhibition抑制在胚胎发育中，分化的细胞受到临近细胞产生抑制物质的影响。
housekeeping gene管家基因是维持细胞最低限度的功能所必不可少的基因，但对细胞分化一般只有协助作用。
luxury gene奢侈基因指与各种分化细胞的特殊性状有直接关系的基因，丧失这类基因对细胞的生存并无直接影响。
oncogene癌基因是控制细胞生长和分裂的正常基因突变的一种形式，能引起正常细胞癌变。
homobox gene,Hox同源框基因：是一种同源异型基因，在胚胎发育过程中将空间特异性赋予身体前后轴不同部位的细胞，进而影响细胞分化
Cleavage卵裂：多细胞动物早期胚胎，自受精卵至囊胚早期的细胞有丝分裂。在此阶段，胚胎的体积与受精卵差别不大。再生regeneration是生物体受损后组织或器官在原有基础上重新形成已失去部分的过程，也是修复的一种。
Stem cell干细胞：是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。
它的主要功能是控制和维持细胞的再生。全能干细胞Totipotent stem cell：具有自我更新和分化形成任何类型细胞的能力，能发育成为有ige完整个体的发育全能性早起胚胎细胞。受精卵和8细胞器之前的每一个胚胎细胞都是全能干细胞多能干细胞puripopent stem cell：囊胚内细胞团细胞具有分化为成熟个体中所有细胞类型的潜能，但没有形成一个完整个体的能力，这种早期胚胎细胞成为多能干细胞
专能干细胞 multipopent stem cell：由多能干细胞分化而来的具有特殊功能的细胞群体单能干细胞 unipopent stem cell：只能产生一种类型细胞的干细胞
Embryonic germ stem cell胚胎干细胞 机体在发育过程中存在处于不同分化等级的干细胞，囊胚内细胞团中的细胞具有分化为机体任何一种组织器官的潜能，故称之为胚胎干细胞。 somatic成体干细胞：出现在已特化的组织中的未分化的细胞，能够自我更新，并且能分化产生该组织的各种特化类型的组织细胞。
对称分裂symmetry division：干细胞分裂产生同类型细胞，如两个子细胞都是干细胞或都是分化细胞 不对称分裂asymmetry division:干细胞分裂产生不同类型细胞，如两个子细胞中一个是干细胞另一个是分化细胞
stem cell niche干细胞巢：一系列的干细胞与细胞外所有物质共同构成的细胞生长的微环境，又称为干细胞巢。
Trans-differentiation转分化：一种组织类型的干细胞，在适当条件下分化成另一组织类型的细胞。 Dedifferentiation去分化：干细胞向其前体细胞的逆向转化。
transit amplifying cell过渡放大细胞：干细胞分裂时必须要经过快速的增殖期产生过渡放大细胞。过度放大细胞介于干细胞和分化之间，分裂较快，经过若干次分裂后产生分化细胞，其作用是通过较少的肝细胞产生较多的分化细胞。
cell fusion细胞融合：是在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。
differential centrifugation差速离心法：根据颗粒大小和密度的不同存在的沉降速度差别，分级增加离心力，从试样中依次分离出不同组分的方法。
第五篇：基因工程和细胞工程
专题八 现代生物科技专题
第一讲 基因工程和细胞工程
1.(2009·浙江卷，1)用动、植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是(
) A.都需要用CO2培养箱 B.都需要用液体培养基 C.都要在无菌条件下进行 D.都可体现细胞的全能性
2.下列关于运用植物组织培养技术产生新个体的叙述，错误的是
A.属于无性生殖
B.主要理论依据是植物细胞具有全能性
C.培养过程中由于人工培养基含大量营养，不需光照就能发育成完整植株
D.人工培养基中含植物生长发育所需的全部营养物质，包括矿质元素、糖、维生素等 3.(2009·安徽卷，4)2008年诺贝尔化学奖授予了“发现和发展了水母绿色荧光蛋白”的三位科学家。将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因，再将该融合基因转入真核生物细胞内，表达出的蛋白质就会带有绿色荧光。绿色荧光蛋白在该研究中的主要作用是
(
) A.追踪目的基因在细胞内的复制过程 B.追踪目的基因插入到染色体上的位置 C.追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布 D.追踪目的基因编码的蛋白质的空间结构
4.限制酶是一种核酸内切酶，可识别并切割DNA分子上特定的核苷酸序列。下图为四种限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ和BglⅡ的识别序列和切割位点：
(
)
切割出来的DNA黏性末端可以互补配对的是
A.BamHⅠ和EcoRⅠ B.BamHⅠ和HindⅢ C.BamHⅠ和BglⅡ D.EcoRⅠ和HindⅢ
5.对于不同的生物，将重组基因导入受体细胞的方法有差异，下列方法不合适的是
(
) A.以质粒为运载体，利用大肠杆菌生产人的胰岛素时，可用氯化钙处理大肠杆菌 B.以噬菌体为运载体，利用大肠杆菌生产人的凝血因子时，可使其直接侵染大肠杆菌 C.以质粒为运载体，利用转基因羊生产人的乳铁蛋白时，可用显微注射技术将重组基 因导入受精卵
(
) D.以质粒为运载体，培育转基因植物时，可借鉴质粒侵染细胞的途径，用重组质粒侵染植物细胞
6.蛋白质工程与基因工程相比，其突出特点是(
) A.基因工程原则上能生产任何蛋白质
B.蛋白质工程能对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质
C.蛋白质工程可以不通过转录和翻译来实现
D.蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程 7.如图所示为农作物新品种的育种方式，相关叙述错误的是(
)
A.②③过程分别称为脱分化和再分化 B.①过程代表植物体细胞杂交 C.⑤过程中常用的基因表达载体是质粒
D.图中育种方式突出优点是克服了远缘杂交不亲和的障碍 8.下列关于原代培养、传代培养的叙述，错误的是(
) A.都属于动物细胞体外培养，需要一定的培养条件
B.第一次分瓶之前的培养属于原代培养，以后的培养均属于传代培养 C.50代以后的培养，少部分细胞会获得不死性 D.培养至50代以后的细胞称为细胞株
9.(2010·江苏卷，18)下列关于转基因植物的叙述，正确的是(
) A.转入到油菜的抗除草剂基因，可能通过花粉传入环境中 B.转抗虫基因的植物，不会导致昆虫群体抗性基因频率增加 C.动物的生长激素基因转入植物后不能表达
D.如转基因植物的外源基因来源于自然界，则不存在安全性问题
10.番木瓜，俗称木瓜，有“百果之王”的美称，在人们所食的38种常见水果中，营养价值居首位，从种植到结果只要9～15个月，所以人们一直希望找到与番木瓜果实质量、产量、抗病性、环境适应性等有关的基因，更难得的是它是第一种进行转基因实验的水果。2004年12月，我国南开大学与美国夏威夷大学共同主持番木瓜的基因组测序工作，30余家单位参与该工作，并于2008年4月在《自然》杂志上以封面文章的形式发表了《转基因热带水果植物——木瓜的基因组草图》的成果论文。请回答下列有关问题：
(1)研究组首先从番木瓜细胞中提取出DNA，使用“鸟枪法”将其打成碎片，需要用的工具酶是______________。经过定位和测序后，再重新连接成整体，用到的工具酶是__________________________。
(2)“抗环斑病毒的番木瓜”细胞中的抗病毒基因的表达过程(图解表示)是： ______________________________________________________。
(3)将已导入抗病毒基因的木瓜细胞培养成植株，需要通过下列过程①――→②――→③―→④，①能被培养成为④的根本原因是________________。这个过程中需要用到
脱分化
再分化____________________(激素);②表示__________，它的特点是______________________。
11.(2011·海南卷，31)回答有关基因工程的问题：
(1)构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA后，可能产生黏性末端，也可能产生________末端。若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生________(相同、不同)黏性末端的限制酶。
(2)利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是________________________________________________________。 在用表达载体转化大肠杆菌时，常用________处理大肠杆菌，以利于表达载体进入;为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNA，可用标记的胰岛素基因片段作探针与mRNA杂交，该杂交技术称为________________。为了检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译成________，常用抗原—抗体杂交技术。
(3)如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的________中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的________上。
12.下图是单克隆抗体制备流程示意图。
(1)______________技术是单克隆抗体技术的基础。
(2)根据培养基的用途分类，图中培养基属于________培养基。
(3)单克隆抗体与常规的血清抗体相比，最大的优越性是__________________。 (4)动物细胞融合除了采用植物细胞原生质体融合常用诱导剂外，还可以采用____________。
(5)选出的杂交瘤细胞既具备骨髓瘤细胞______________________的特点，又具备浆细胞的________________________的特点。
(6)淋巴细胞是由动物体________中的________细胞分化、发育而来的。 (7)杂交瘤细胞从培养基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是__________。 答案
1.C 2.C 3.C 4.C 5.D 6.B 7.B 8.D 9.A
10.(1)限制性核酸内切酶(限制酶) DNA连接酶 (2)
(3)细胞具有全能性 生长素和细胞分裂素(缺一不可) 愈伤组织 细胞排列疏松而无规则，高度液泡化，呈无定形状态的薄壁细胞
11.(1)平 相同 (2)提供RNA聚合酶识别和结合的位点，驱动基因转录 Ca2 DNA
+-RNA分子杂交 胰岛素原(蛋白质) (3)T-DNA 染色体
12.(1)动物细胞培养 (2)选择 (3)特异性强，灵敏度高
(4)灭活的病毒 (5)在体外大量增殖 分泌特异性抗体 (6)骨髓 造血干 (7)主动运输