结晶操作技术应用

结晶操作技术应用（精选9篇）

篇1：结晶操作技术应用

连铸结晶器维修安全操作规程

1、遵守“一般钳工”安全操作规程，严格按照钳工常用工具和设备安全操作规程进行操作。

2、将要装配的零部件有秩序地放在零件存放架或装配工位上，不得堆放过高。

3、按照结晶器装配工艺文件要求更换或修复零部件并进行测量。

4、结晶器维修多人操作时，要有专人指挥，同行车工密切配合。停止维修时，不许有大型零部件吊悬于空中或放置在有可能滚动的位置上。中间休息应将未安装就位的大型工件用垫块支稳。

5、结晶器维修中不准将手伸入两件连接的通孔或不得接触合研面，以防止工件移位挤伤手指。

6、工作中注意周围及上下检修人员及自身安全，防止因挥动工具，工具脱落、工件及铁屑飞溅造成伤害。

7、用行车吊运工件，不准超负荷起吊。把钢丝绳挂牢后方可离开，并用手势指挥行车工把工件放到某一位置，吊物不准从维修人员上方通过，较大工件必须放稳支牢。

8、结晶器吊上台架后，应立即恢复台架护栏。不允许在无护栏的台架上做检修活动。

9、在台架上检查、测试铜板，上下检修人员必须正确戴好安全帽，注意保持作业面足够的照明。

10、在铜板合装操作时，铜板支撑必须保持平稳不得倾斜，防止铜板滑落伤人。

11、用簪子剔工件时要戴眼睛，对面不能有人，应设置必要的保护网，工具顶部不能有凸起毛刺、不得淬火，以免打飞伤人。手锤要安装牢固并随时检查，握锤的手禁止戴手套。

12、使用大锤时，应先检查锤柄与锤头是否松动，是否有裂纹，锤头上是否有卷边或毛刺，如有缺陷必须修好后再使用，手上、手柄上、锤头上有油污时，必须擦干净后方可进行操作。

13、使用电动工具时，应检查是否有漏电现象，工作时应接上漏电开关，并且注意保护导电接线，避免发生触电事故。使用电动工具时必须戴绝缘手套。使用手提式电动砂轮打磨铜板时，操作人员必须戴上防尘面罩，以降低粉尘对人造成的危害。

14、用压缩空气清扫结晶器时，要照顾周围同志安全。必要时操作人员及周围人员必须戴上耳塞及防尘面罩，以减少作业环境职业危害。清扫结束关闭压缩空气闸阀。

15、用水试压时，要照顾周围同志安全。试压结束关闭水管闸阀。

16、用蒸汽升温测试结晶器铜板时，操作人员必须戴上防烫伤手套，铜板升温测试结束关闭蒸汽闸阀，同时按相关规定停炉。蒸汽开启前锅炉操作严格按锅炉安全操作规程执行。

17、用压力机校平结晶器铜板时，严格按压力机安全操作规程执行。

18、使用气割、焊接工艺时，严格按气割、焊接安全操作规程执行。

19、工作完毕，必须清理工作场地，将工具和零件整齐地堆放在指定位置上。将保护渣等废弃物按分类入斗。定期清扫地面油污，保持工作场地整洁有序，防止滑倒摔伤。

篇2：结晶操作技术应用

现在移民希腊非常简单，只需购买希腊25万欧元的房产，3-6个月就能拿希腊永居，一家三代畅行26申根国。关于移民希腊小编为大家整理了很多细节问题，让您更了解希腊，更喜欢希腊。

1.能在希腊工作或者做生意吗？

答：不能在希腊工作，但可以在希腊合伙做生意。可以成立公司，以公司股份持有人的身份管理公司

2.成功移民希腊后，多长时间可以加入希腊国籍？ 答：7年之后就可以申请了

3.希腊房产价格如何？

答：希腊房产是分地区的，各个地区的房价也都是不同的，平均价格大概在3000-4000欧元每平米。

4.希腊那里的生活环境怎么样？

答：这个问题相比不管是移民到哪一个国家都是会提问到的。希腊是有着历史文化底蕴非常高的国家，奥林匹克的发源地，优美的自然环境、浪漫的爱琴海、湛蓝的海水都是希腊的特色。这里没有污染，交通发达，人民友善和平，完善的法律和福利制度也是一大享受。

5.除了25万欧元的投资额外，还有那些附加条件？

答：除了购房外，申请人还需要是18周岁以上的非欧盟成员国公民，同时需要购买一份医疗保险。简单的不能再简单了！

6.通过当地开发商可以省去律师费吗？

答：在希腊律师费是绝对不可以省去的，希腊甚至有强制性的法律规定购房者必须聘请买方律师。由于希腊是欧盟国中唯一一个没有建立中央登记系统的国家，所以在希腊投资一定要有负责自己的律师，保障购房者的权益不受影响。

7.所获得的居留权的性质是什么？ 答：可续期的永居签证，续期条件为：申请人名下拥有价值不低于25万欧元的房产，因为投资者们可以买卖房产，所以只需要不间断的持有价值25万欧元的房产即可。

8.移民希腊后可以享受哪些福利？

答：未成年子女可以免费入读希腊公立学校，购买医疗保险后可以享受和当地人一样的医疗福利，这是希腊的医疗系统，针对所有在希腊居住的居民和公民。

9.携带子女有年龄要求吗？超过后怎么办？

答： 居留申请可携带21岁以下子女。在居留有效期内满21周岁的话，可以获得每年续签的单独居留，直至满24周岁。

如父母把价值25欧元以上的房产出售给成年子女，子女可作为投资人获得永居，而父母可作为家庭成员获得永居。

10.随行子女如何就学？

答：子女可申请入读当地知名国际学校，学费在7000-12500欧元之间。如选择公立学校都是免费的。

11.我的居留许可证签发之后，我可从户籍国直接前往申根国旅游吗？我需要先到希腊吗？ 答：您可以直接前往想去的任何申根国家。

12.希腊消费怎么样？

答：普遍低于其他欧洲国家，生活花费不高。一家三口的月均消费500欧元左右。

13.如定居在希腊，要是生病了怎么办？

答：希腊医疗体系发达，通过购房移民取得希腊居留许可的投资者可和当地公民一样享受免费公立医疗服务。另外，如果客户需要更高层次的医疗服务，可以选择私立医院，也可以在私立医院需要购买医疗保险。

医疗保险价格都不高，每年仅几百欧元左右，可覆盖常见疾病、手术及住院所产生的费用。对于常住客户，也有保额更高、覆盖整个欧盟的保险可供选择。

14.希腊的房产未来升值空间大吗？

答：因欧债危机的影响，希腊房产价格总体趋低。而随着希腊居留身份这一救世政策影响，房产市场逐渐回暖，未来升值空间很大，而且产权永久，可世代传承保值。

15.希腊投资移民项目有什么优势？ 答： ①投资低：只需购买25万欧元以上房产。

②周期短：审理速度快，只要6个月即可获得永居。③无移民监：没有居住要求。

④要求简单：无年龄、学历、语言要求，无需提供无犯罪证明、健康证明和财产来源证明。

⑤欧盟申根国成员之一：自由通行26个申根国。⑥社会福利：一人申请，全家都可享受当地基本福利。⑦房产产权：房产与土地拥有永久产权，出租收益稳定。

16.在希腊25万欧元可以买个什么样的房子？

答：25万欧元在雅典市中心可以买到80-120平方米的公寓（这其中不包含赠送的阳台、花园、储藏室、车库的面积），可以在雅典的南部或北部富人区买到60-90平方米的公寓。

17.可以将房地产出租给第三方吗？希腊房屋租赁有什么费用？

答：依据已提交的法律草案“批准移民及社会融合法典中的一项规定，拥有希腊房地产的第三国公民将有权出租名下房产。房屋租赁收入税是阶梯型的，以12000欧元为分界线。年租金收入低于12000欧元的，缴纳11%的收入税。

超过12000欧元的，前12000欧元缴11%的收入税，即1320欧元，超过部分收33%的税。18.希腊房产年租金回报率为多少？

答：希腊旅游资源丰富，每年都接待着数千万国际游客，这些游客多来自附近欧洲国家或如果用来出租的话，收益也颇丰，年租金回报率在3-5%。

19.允许多个家庭共同购买一套房产，一起申请移民吗?

答：希腊移民新政允许多个家庭凭借一套房申请移民，只要每个家庭的投资额达到25万欧元即可。

20.对随行亲人的工作及婚姻状况有要求吗?

希腊移民政策对于申请人随行家人的要求比较宽松，既不要求父母退休，也不要求子女未婚，能证明血缘关系即可。

21.是否允许出售房产?

答：持永居卡期间必须持有房产，入籍后可出售房产

22.居住多久后可以申请入籍?入籍条件有哪些？

答：在希腊境内拥有长期居住权的外籍成年人士，无犯罪记录，申请前已经在希腊连续合法居住至少七年，通过希腊语及希腊文化的测试即可申请入籍。

23.拿到PR的孩子可以在欧美读书吗？

在获得希腊居留权后，孩子可以免费在希腊就读当地政府学校。同时希腊也有一些很好的私立学校和英美德等学校。很多欧洲的孩子就读于希腊英美私立学校，在高中后他们将有更多的选择对美国、英国等高校的选择。

24.买房后多久可以拿到居留权？

在希腊购置房产后一般3个月就可以获得希腊绿卡，获得绿卡后只要房产属于你，居留权将永远有效。

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篇3：溶液结晶技术概述

关键词：溶液结晶,过饱和度

1 溶液结晶的种类

1.1 冷冻结晶

冷冻结晶是指利用物质间凝固点的差异, 即不同的温度梯度有不同的结晶顺序, 将待分离的体系进行降温冷却, 达到结晶的目的。冷冻结晶相当比较简单, 所以工业应用的历史较长, 分离对二氯苯采用冷冻结晶法的工业化装置在很早就已经投产。

1.2 盐析结晶

盐析结晶是指在结晶体系中, 添加某种水合作用比原溶液较强的特定电解质盐析剂, 使溶液中自由水分子数减小, 因此增加了溶液中欲结晶物质的有效浓度, 使原溶液中欲结晶物质以结晶析出。

1.3 溶析结晶

溶析结晶是指通过向已知盐溶液中加入能降低溶质在原溶剂中溶解度的添加剂 (媒晶剂) , 从而加速溶质的析出, 达到液固分离的目的。在次过程中, 溶析结晶过程受添加剂或沉淀剂的种类影响较大。王静康、高毅颖等根据不同类型媒晶剂对硫酸铵晶体形态学指标的影响, 获得了动态测定结晶动力学方法, 依据这套动力学方法提出了一套简单可行、准确性好的媒晶剂评选新方案。

1.4 高压结晶

高压结晶是一种新型分离精制技术, 它是指通过在增加压力下, 体系中液相和固相的变化规律不相同, 从而实现分离提纯的目的。高压结晶技术在应用到从低浓度体系中分离获得高纯度产品时, 不受其他操作条件的限制, 并且目标组分的回收率可以提高。

2 溶液结晶的推动力

溶液结晶的推动力是过冷或者过饱和。过饱和溶液是指溶液的实际浓度超过理论平衡浓度亦溶解度。溶液浓度超过的实际部分即为过饱和度。

S-稳定区;M I和M 2-第一和第二介稳区;L-不稳定区;1-溶解度曲线;2、3-第一、第二介稳定界限的曲线

由德国物理化学家Wilhelm Ostwald, 在1897年第一个观察到过饱和现象。他将一个十分清洁的溶液在空气中也不含任何微尘的环境中, 且不受任何外界扰动, 慢慢冷却得到过饱和溶液。然后他观察到澄清的过饱和溶液当超过某个限度后, 就会开始析出晶体。

他提出:介稳态状态 (Labile Region) 是一部分排除外来晶核的过饱和溶液, 在一定条件下和一段不确定的时间内保持澄清;另外一部分过饱和溶液, 即使排除外来晶核因素, 经过一段时间仍会结晶, 这种状态称为不稳态 (Metastable) 。

3 结晶成核

结晶过程是由几个阶段组成的。它们分别是过饱和体或过冷溶液的形成、晶核的形成出现、晶体的生长和再结晶。但是各个阶段在出现的时间次序不尽相同 (如图1) 。

首先, 稳定态及其相应的区域, 其浓度不高于溶解度 (S区) 。其次, 介稳态 (1和3曲线之间) 又可分为亚稳过饱和区和不稳过饱和区。其中亚稳过饱和区介于平衡浓度与低于它就基本上不可能发生均相成核的浓度之间 (M1区) ;与不稳过饱和区相对应的浓度则是要经过某一时间间隔才有可能发生自发成核的浓度 (M1区) 。介稳区宽度是极限浓度 (即自发成核开始的浓度) 与平衡浓度 (即溶解度) 之差。然后, 由母相生成新相也并不是马上发生的, 存在一相变过程, 该过程阶段是潜伏转变的, 称为诱导期。最后, 不稳定态是指溶液在这种状态下结晶马上就会开始 (L区) 。

4 影响结晶的因素

4.1 晶种

在生产实践证明, 在亚稳过饱和区 (M1区) 内结晶可获得大颗粒产物。添加晶种的目的是有效地避免一次成核, 同时也能有效地抑制二次成核。1925年Griffith就提出“添加晶种控制结晶”的方法, 认为加入适量的晶种同时维持体系适度的过饱和度, 以抑制晶核产生, 让溶质只在晶种表面生长。

4.2 温度

由无机化学知识可知, 饱和度是物质的特性, 随温度变化而变化。温度不同, 则溶液的饱和度不同。温度通过影响溶质的溶解度, 进而影响饱和度。对于大多数溶质来说, 是伴随着温度的升高溶解度增加 (如氢氧化钠) ;也有少部分的溶解度受温度影响较小 (如食盐) ;也有少部分会随温度升高溶解度反而降低 (如氢氧化钙) 。

4.3 杂质

杂质对结晶过程的影响程度, 取决于杂质的性质和结晶物质的性质。宫海燕, 李彩虹等人“溶液结晶过程影响”做了相关研究。其研究表明, 为了控制颗粒形貌、粒径和粒度分布, 采用结晶法制备晶体物质时, 可采取向原溶液加入特定的杂质的方法来调节晶体成核和生长速率, 进而防止颗粒团聚。

4.4 搅拌

对于高粘度溶液的结晶, 搅拌可以促进晶核成长, 然而对与低粘度溶液, 搅拌的作用不大。在高粘度溶液中, 搅拌的作用通过影响结晶器内的流场存在, 从而影响结晶的传质过程, 所以要得到大颗粒的晶体适当的搅拌是必要的。然而搅拌速度过大时, 由于桨叶和晶体的碰撞, 导致晶体破碎, 进而产生二次成核, 最终是晶体表小。所以尤其是对于一些针形的晶体, 搅拌速度影响更为明显。

5 结语

由于社会的不断进步, 计算技术也随之不断发展, 从而促进了计算机在结晶领域的应用。利用计算机模拟生产可以对结晶生长参数的求取、检验测试参数的可靠性、最优化理论在结晶成核和结晶过程, 进而大大降低劳动生产成本, 缩短研究周期等。计算机模拟在结晶领域的这些相关应用也已经成为近年的研究热点之一。

参考文献

[1]大连理工大学无机化学教研室.无机化学[M].北京:高等教育出版社, 2001.

篇4：经验与技术的结晶

结构剖析

M95型面具由M95型面罩和M95型滤毒罐组成（图3），另有饮水装置、视力矫正镜片等一些功能部件。该型面具对维修的要求不高，维修非常简单易行，其至关重要的呼气阀，也是易于拆除的，不用工具即可更换。它在配备有饮水装置和通话器的NBC防护面具中具有特别低的呼吸阻力。因此可以更长时间且非常舒适地佩戴M95型面具和滤毒罐。

面罩

它分中号和小号两种规格，采用双目式、单反折边密合框结构，罩体采用特别设计的卤化丁基胶（Halo-bu tylrubber）制造，增强了对所有已知的化学和生物战剂的防护能力。罩体是防毒面具的一个重要零件，是使面罩各部件有机地组成统一整体的骨架。M95型面罩在设计、制造过程中采用了先进的计算机辅助设计/制造（即CAD/CAM）技术，它是在大量头型尺寸调查和统计分析的基础上进行的，由此获得了异常精确的面罩结构（图４），因而其佩戴气密性和舒适性都非常优异。

面罩在下颌处有一支撑点，可保证面具佩戴稳定，在剧烈的作战行动中，面罩的密合框部位也不会出现漏气现象。在面罩密合框的下颌部位开有一小孔，可将人员佩戴过程中积存的汗液等通过呼气通道排出。

阻水罩

采用硅橡胶材料制造，提供对皮肤舒适的密合，使有害空间减少到最小（M95面具的CO2含量为0.7%），大大改善了人员的佩戴生理性能。

眼窗镜片

采用聚酰胺制造，视野非常宽广，下方视野也很好，并具有非常优良的匹配性能，可与野战条件下的战术装备良好匹配，例如光学和通信器材或武器，以及防毒服和安全头盔，可保证人员和武器装备效能的最大发挥。面罩内设计有安装矫正镜片的眼镜架，可以很方便地安装到面罩内，方便了有视力障碍的人员使用。

网状头带

目前国际流行的佩戴稳定性和舒适性俱佳的固定系统结构。弹性网状头带为６爪结构，由聚酯/莱克拉（Lycra）弹性纤维材料制成，优良的伸展性能使佩戴者感觉舒适，特别是在长期佩戴时。弹性头带具有抗化学品侵蚀和耐老化的能力。

滤毒罐

外壳由增强聚酰胺制造，具有较高的抗冲击性能和优良的阻燃性能。滤毒罐由装填层和滤烟层组成。装填层为性能优良的浸渍活性炭，滤烟层由高效玻璃纤维过滤纸制成。因此，该滤毒罐可防护化学战剂、生物战剂和工业有毒物质，具有非常高的微粒（气溶胶）过滤能力和效率。由于它具有极高的物理吸附和化学吸收能力，因此对毒剂气体和蒸气的吸着效率非常高。在面罩两侧都设计有滤毒罐接口，可将滤毒罐安放在面罩的左侧或右侧，以便于不同据枪习惯的人员瞄准射击或进行其他操作。不安装滤毒罐的接口可安装有保护装置的通话膜，以便于通话联络。优化的结构设计使得M95型面具可在10s之内完成整套戴脱面具的动作。

饮水装置

为适应人员在高温炎热的染毒环境中长时间地佩戴面具的战场需求，M95型面具设计有饮水装置。与其他国家的防毒面具不同，该面具的饮水装置没有长长的橡胶软管，但有防泄露机构，饮水流量高达250ml/min（图5）。

防护范围

M95型防毒面具的防护对象包括：(1)化学战剂，可防沙林及其他神经性毒剂、芥子气、氰、三氯化砷、光气等；(2)生物战剂，可防细菌和病毒；(3)工业有毒物质，可防护多种工业有毒化学品、气体、有机气体和蒸气、无机气体和蒸气，例如氯气、氰化氢、硫化氢等；有机酸和无机酸，例如蚁酸、二氧化硫、氟化氢、氯化氢等；也可防护放射性的和高毒性的微粒或气溶胶。

其他型号

M95型面具还有一种防暴型面具，也可作为警察、军队和民防的训练器材

使用（图6）。这种M95型面具没有饮水装置和通话膜，并将滤毒罐更换为专用的防暴滤毒罐，可对催泪瓦斯、CN、CS等控暴剂进行防护，并可对有机蒸气和气体、高毒性的放射性固态和液态微粒、细菌和病毒进行有效地防护。

主要技术诸元

滤毒罐

高度90mm

直径109mm

质量250g

壳体材料 增强聚酰胺

气溶胶透过性能(%)

30l/min时对DOP<0.0003

95l/min时对石蜡油<0.003

95l/min时对氯化钠<0.001

对毒气的防毒时间(min)

30l/min时对光气 >40

30l/min时对氯化氰 >40

30l/min时对三氯硝基甲>55

对芥子气 >50

对四氯化碳 >50

通气阻力(Pa)

30l/min时 <120

95l/min时 <400

防毒面罩

材料

罩体 卤化丁基胶

阻水罩 硅橡胶

阀片 硅橡胶

镜片 聚酰胺

防护因数>10000

对化学战剂的防护>48h呼吸阻力（Pa）

30l/min的吸气阻力<45

95l/min的吸气阻力<100

160l/min的呼气阻力<120

二氧化碳含量 <0.36%

视场 >80%

适用温度范围 -50℃～70℃

储存寿命 20年

质量 460g

注：防护因数（ProtectionFactor）：亦称"防护系数"。外界被染毒空气浓度与进入防毒工事或化学防护器材内部的污染所造成的浓度的比值，是评价各种防护器材、设施和装备防护性能的一项指标。

DOP：邻苯二甲酸二异辛酯。

DOP法：用前向光散射仪和穿透计的光电管来比较DOP气溶胶通过受试验样品前后的浓度测出透过率。

篇5：花凤鸡养殖技术结晶

花凤鸡是利用贵妃鸡公鸡与褐壳蛋鸡父母代母鸡杂交而形成的一个特色蛋鸡配套系。该鸡体型较小，体重较轻，性情温驯，黑脚，成活率高，蛋肉兼用，抗病力强；蛋个头小，蛋品风味独特，蛋白细腻，蛋壳粉里透红，产蛋率介于普通良种蛋鸡和土鸡之间，饲养密度较高，可节约鸡笼、饲养场地近20%。

花凤鸡鸡具有以下几个特点：

1.蛋肉兼用，淘汰鸡价值高。“花凤鸡”毛色玉白，泛黑点，红色双凤冠，青脚细胫，五爪，体形小巧，成鸡重1.25~1.5公斤，蛋头小，大小均匀，蛋壳坚硬，呈粉红色，蛋黄深红，蛋青浓稠，口味优越，天然香，无腥味。

2.花凤鸡产蛋率介于普通良种蛋鸡和土鸡之间，初产周龄16~17周，达50%产蛋率为21周，高峰期产蛋率85%以上，65周产蛋数210~230只，平均蛋重49.8克，蛋料比2.5:1。

3.抗病力强，成活率较高，产蛋期成活率95%以上，产蛋期日耗料85克/只。

4.饲养密度较高，可节约鸡笼、饲养场地 20%。

农户可以发展普通零散养殖，也可以发展规模化养殖。

对于养成后花凤鸡的收益情况

1.投入。（1）苗鸡费用：每只花凤鸡苗鸡3元；（2）饲料费用：每只蛋鸡年消耗饲料26公斤，每公斤饲料价格2.9元，共75.4元。（养殖过程中可能会上下浮动）；（3）防疫及医药费用：每只蛋鸡需3元左右；（4）水电燃料费用：每只蛋鸡需5元左右；（5）设备折旧及管理费用：每只蛋鸡需6元左右；（6）人工费用：按每月工资2000元，全年养殖5000只计，每只人工费4.8元，在生产过程中每只鸡需投入约97.2元。

2.产出。（1）花凤鸡年产蛋数约165只，约8.25公斤，按照平均价格13元/公斤计算，收入约107元；（2）淘汰老鸡按每只价格12元/公斤计算，收入16.8元。合计123.8元。

3.收益。123.8元-97.2元=26.6元。

篇6：结晶操作技术应用

己二酸是是一种重要的有机化工原料, 在实际的生产中, 己二酸的分离是整个流程中的重要步骤。在己二酸的分离工艺中, 结晶分离相对于其他分离方法, 具有能分离出高纯或超纯的晶体且能耗低的优点。多级闪蒸结晶器 (Standard Messo结晶器) 是己二酸结晶分离装置中的最重要的设备, 它是由多个结晶室组成的多级结晶器, 操作温度及压力逐室降低, 以减少能耗。

某制造厂承制的己二酸结晶器属于多级闪蒸结晶器, 该设备由12个结晶室组成, 主体材料S30403, 筒体壁薄, 直径较大且顶部带有12套搅拌装置。此设备制造既要满足设备的特殊工艺要求, 又要避免薄壁不锈钢体的焊接变形, 还要保证搅拌装置的准确装配, 这是制造中的关键。本文根据多级闪蒸结晶器的监造实践, 综合论述了该设备的制造难点及检验监造重点。

一、多级闪蒸结晶器技术特性及结构特点

多级闪蒸结晶器技术参数见表2-1, 外形结构见图2-1。

此结晶器由安装了12个搅拌装置的腔室组成, 每个腔室设视镜和液位报警器用来观察和控制液位, 各腔室之间用虹吸管连通, 各室之间靠压力差进行虹吸。每个腔室分别与顶部冷凝器及真空系统连接, 以保持每个腔室真空度的不同。氧化产物经泵送结晶器, 在结晶过程中, 第1室至第12室压力从40KPa降至1KPa, 腔室间的压差提供原料虹吸的动力;液体温度从90℃降至20℃, 此过程放出结晶热和显热。结晶器每个腔室内部安装有搅拌装置, 设置于虹吸管附近。

二、多级闪蒸结晶器制造重难点分析与措施

此设备的物料粘稠度很高, 流动的动力主要靠压差虹吸, 所以设备的抛光精度要求很高 (Ra=0.2μm) ;此设备壁厚较薄 (δ=12mm) , 自重产生的变形较大, 另外由于奥氏体不锈钢材料本身特点, 在焊接过程中变形较大, 所以设备的卷板、组对及焊接要求较高;此设备属于多级串联的搅拌设备, 所以搅拌装置的预组装很重要;该设备结构上有一定的特殊性, 所以典型部件的制造检验要求较高。

1. 多级闪蒸结晶器的抛光

己二酸结晶分离中物料粘稠度特别高, 各腔室之间用虹吸管连通, 各室之间靠压力差进行虹吸, 结晶过程中在设备内部易结疤形成附着层, 这些附着层逐渐积累, 最后使整个腔室空间减小, 结晶效果很差。所以结晶器内部抛光精度达到了Ra=0.2μm的要求。为了保证抛光效果, 制造过程中必须要严格按照合理的制造及抛光工序执行。

(1) 主要的抛光工作在卷板前完成, 首先运用80#砂带将板材表面氧化皮及原始凹坑和麻点打磨掉, 再用100#砂带将80#砂带的痕迹覆盖, 然后逐级提高砂带的级别, 直至600#砂带, 最后用保护膜覆盖保护。

(2) 设备制作完成以后, 需要进行补充性的抛光, 主要针对设备所有焊缝, 先将焊缝打磨平整, 然后按照板材的抛光程序执行, 最后对设备内部抛光面上抛光蜡, 运用400#砂带反复抛光, 直至抛光蜡均匀地附在表面, 达到图纸要求。

2. 多级闪蒸结晶器筒体的制造筒体的成型

(1) 下料

该设备筒体为壁薄 (δ12mm) , 为了控制薄壁筒体对口错变量, 要求严格控制下料允差 (长、宽允差0~1mm, 对角线允差0~1.5mm) , 并且采用定尺板, 减少焊缝数量, 把误差控制的越小越能控制筒节环缝错边和焊接变形。

(2) 卷板

筒节卷制时, 用吊车辅助, 避免自重产生的变形和折弯现象, 组对直缝时采用样块检查, 错边量控制在0.5mm内, 采用密点方式点焊牢固, 直缝焊接前, 在跨焊缝位置按500mm间距焊接防变形板, 以防止纵缝在焊接时产生过大的收缩棱角, 影响筒节校圆。筒节校圆时, 用专用工具辅助筒体, 防止由自重产生的变形, 用样板测量筒体的圆度, 使筒壁与样板完全贴合。

(3) 环缝组对

环缝组对前应先将设备内部的球形隔板点焊到设备内部, 以对每节筒体进行刚性加固, 保证筒体较好圆度。组对筒节, 控制错边量, 进行密集点焊。

筒体的焊接

此设备材质为S30403的奥氏体不锈钢薄壁容器, 焊接中极容易出现塑性变形, 还容易产生气孔、晶间腐蚀和热裂纹等缺陷。

(1) 预防焊接缺陷

在保证焊接质量的前提下, 宜采用小电流、快速焊和短弧窄焊道, 以减少热影响区范围和熔池产生过热和烧穿现象, 焊材应选用超低碳的焊条和焊丝。

(2) 预防焊接变形

焊接筒体环缝的时候, 要采取小线能量焊接, 最好每道焊缝分四点对称焊接, 并且严格按照合理的焊接顺序, 分多次焊接, 每条环缝最后在设备内部采用一道盖面焊控制变形。

3. 多级闪蒸结晶器的预组装

机械搅拌是影响结晶分离的重要因素, 该设备采用了最简单的桨叶搅拌器, 搅拌装置的功能是提供过程中所需要的能量和适宜的流动状态, 促进高粘度原料的上下流动, 同时可以避免晶簇形成, 并使物料流动方向有规律, 避免过度湍动造成晶粒磨损。影响搅拌效果的因素很多, 在制造厂内主要关注搅拌器的几何尺寸, 包括以下方面:

(1) 搅拌器直径、搅拌器距离容器筒壁的距离;

(2) 桨叶宽度、桨叶倾斜角、桨叶数等;

(3) 影响设备搅拌运行时的震动及噪音等的关键容器尺寸。

因此, 设备的预组装及其准备工作至关重要。

设备预组装的准备工作

(1) 设备制造前应组织搅拌装置制造厂家和容器制造厂家进行技术协调, 明确各方的要求。

(2) 设备制造过程中严格控制搅拌口与球形隔板的距离, 以防碰撞。

(3) 设备上组焊搅拌口时必须保证搅拌口法兰的水平度≤0.5mm (设备到达现场组装前将进行法兰面修正) , 应保证鞍座底面与搅拌口法兰平面平行, 偏差≤1mm, 建议制造过程中先行组焊搅拌口接管, 然后组焊搅拌口法兰, 将误差降到最低。

设备的预组装

(1) 搅拌装置组装完毕后借助吊车与设备预装到一起后, 检查装配法兰螺栓孔是否匹配, 检查装配法兰的间隙是否均匀。

(2) 进入腔室内部检查搅拌装置与腔室器壁的距离, 包括桨叶与容器底部、容器四周的最小距离, 搅拌轴与球形隔板的最小距离。

设备的运转试验一般安排在安装现场进行。

4. 多级闪蒸结晶器典型部件的制造与检验

多级闪蒸结晶器是一种具有独特结构的设备, 因此, 该设备包含很多典型的独特部件。

虹吸管

虹吸管是整个结晶器的关键部件, 它实现了各腔室之间的连通, 但是由于形状特殊, 体积狭小等问题, 虹吸管的制造要求很高。

(1) 结构尺寸

虹吸管是一种两支管不在同一平面的“人”字结构的连通管, 如下图3-1所示。

由于虹吸管需要装配到筒体上, 并且方位尺寸无法调整, 所以主体结构尺寸很重要, 实际生产中必须要借助专门的定位工装来保证结构的准确一致性, 通常而言, 整体成型以后最好与设备进行预组装, 以保证偏差降到最低。而盘管只需要保证间距及圈数即可。对于冲洗管, 冲洗水口方向应根据虹吸管实际情况确定, 以便以最佳角度 (冲洗口应该直对虹吸管中心界面轴线) 对虹吸管内部进行冲洗, 见下图3-2。

(2) 内部抛光

虹吸管作为腔室连接、物流流动的一部分, 对抛光有着极高的要求Ra=0.2μm, 而虹吸管结构上不易抛光, 因此制造工序一定要控制好。首先管料下料以后 (变径管卷制以前) 就进行抛光, 待满足抛光要求以后, 组装成型, 再在冲洗管组焊以后再次进行抛光, 即可较好满足抛光要求, 根据监造实践, 冲洗管部位抛光较差, 但虹吸管的抛光不易检测, 可以借助标准试块进行比对。另外将变径管分成两截对弯管及冲洗管部位的抛光有极大的帮助。

喷淋管及蒸汽隔舱

结晶器结晶过程中, 在设备的内部筒壁上易结痂形成附着层。需要定期引入90℃热母液水冲洗各室, 并在每个腔室上设有定时冲洗管路, 除冲洗四壁外, 还冲洗视镜、温度计、液位计报警器等易结晶沉积的地方。喷淋管的制造应该严格遵循图纸, 首先喷淋孔的开孔方位、大小及数量应与设计相符, 其次, 由于喷淋管处于设备内部, 故外表面的抛光要求与设备一致, 均为Ra=0.2μm。对于蒸汽隔舱, 制造检验中常常忽略进行气密试验, 将影响实际使用, 根据监造实践, 此处气密的合格率很低, 应是监造的重点。

结束语

实践表明, 己二酸结晶器虽然属于类外容器, 但是制造过程囊括了典型压力容器生产过程中的的重点难点。由于此类设备结构及工艺要求的特殊性, 监造过程中进行了众多有益的讨论和探索, 丰富了非标设备监造及管理的思维和认识。

参考文献

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篇7：头孢拉定结晶工艺技术分析

【关键词】头孢拉定 结晶工艺 现状

【中图分类号】TQ465 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5158（2013）01—0346-02

20世纪70年代，头孢拉定进入医药市场，是第一代头孢菌素类抗生素，可制成口服制剂以及注射剂，特点显著。临床常会遇到药品的质量稳定性的问题，头孢拉定临床上产品的质量稳定性常与其结晶性有很大的关系，晶型的形成过程可直接导致成品品质，继而直接影响到药效的作用。产品的晶型好，则其包含的杂质少，其色级性相对较好。所以头孢拉定的结晶工艺技术是产品成品的关键所在，从结晶温度、晶种的加入、结晶pH、结晶的搅拌、转速等工艺技术对改善头孢拉定的色级进行论述，通过工艺技术的改善，摸索出了最佳的头孢拉定结晶工艺技术条件，提高头孢拉定的产品质量，满足社会需求。

1 影响头孢拉定结晶的因素

根据结晶工艺的理论分析，影响结晶的因素以下方面：

1.1 结晶温度。

1.2 析晶总的pH值。

1.3 晶种的使用。

1.4 结晶液的粘度。

1.5 搅拌的速度和形式。

1.6 结晶液表面的压力等。

以上六个方面都对头孢拉定的结晶产生一定的影响。通过技术分析目前生产工艺在头孢拉定的结晶过程中结晶液的温度是一个最关键因素。结晶过程中为放热过程，升高温度有利于抑制结晶过程过快而将杂质包裹在晶体中从而影响晶体的生长，另一方面结晶温度过高会使头孢拉定部分分解，同时料液的分子碰撞过于激烈，晶核产生过多，造成杂质增多色级升高含量下降，温度过低也不利于晶体的形成，结晶的温度适宜是最关键的。

析晶总pH也是很重要的影响因素，如果析晶总pH过高则在超过一点（界稳区）的时候就会造成在瞬间产生大量爆发晶核，并导致晶核中含有大量杂质最终导致晶体产品不佳。而晶种的加入对头孢拉定晶体的形成有利，晶型好的部分将晶种引进可以使头孢拉定晶体在一个相对比很好的基础之上，有利于晶体在一个温和有利的环境生长。结晶过程中搅拌的传动使终处于均匀的状态，并且使晶体互相碰撞增加晶体生长的物理环境，因此合适的搅拌转速也是晶体形成最好的工艺条件之一。

以上各方面都将会影响到头孢拉定结晶的质量。鉴于以上因素，我们设计出更好的头孢拉定优化工艺。

2 工艺流程设计

先将头孢拉定反应液放到结晶罐中升温到30℃开始滴加三乙胺，调其pH至2.5-3.0使晶体析出，继续滴加三乙胺，控制pH至4.5-5.5，至晶体完全析出，控制结晶罐液位，培养数小时后降温至0-5℃分离，真空抽滤，洗涤三次，50-6℃真空干燥至水分合格，粉碎分装。

我们将以上工艺付诸实施，并做三批成品与原工艺成品作对照检验，其成品结果均优于原工艺。

3 各方面因素结晶工艺的影响

温度

原引进的结晶工艺温度为30℃左右，但后来经考察发现温度对产品的色级有着较大的影响作用，所以，我们对原结晶温度进行修正，经多次调整，最终得出最佳温度为40℃。

析晶点pH

析晶点pH对头孢拉定产品晶型有一定的影响，头孢拉定的原结晶点的pH是2.5-3.0，范围比较宽，生产时不易控制。所以，我们就在其他结晶条件不变的情况下，取不同的析晶点pH考察析晶点pH的色级，经过多次试验，得出结论，头孢拉定色级最佳的pH为2.8。

晶种的引入

晶种的量对头孢拉定的色级也有影响，晶种的量不同，所得头孢拉定产品色级明显不同，所以，当晶种投入量与7-ADCA比例为5：125时，得到的头孢拉定产品色级最佳。

搅拌转速的选择

试验可看出，当搅拌速度为9nom/min时，头孢拉定产品的色级最佳。

优化的工艺条件

将结晶的工艺条件定位为：结晶温度40℃，加入三乙胺使pH达到2.8，搅拌速度9nom/min，晶种采用2.5ka，使晶体大量析出，继续滴加三乙胺至pH4.9，养晶30分钟后将结晶料降温至0-5℃，进行抽滤、洗涤、干燥、粉碎、出粉。

优化后的结晶工艺结出的晶体呈短棒状，形状较规则。分装时无静电，产品流动性好。此结晶用于大生产后，头孢拉定的质量有了很大的改观，保证了有效期内产品的质量。

4 头孢拉定结晶工艺现状

反应结晶法一般为头孢拉定的结晶方法，为酸碱中和反应，也称沉淀结晶，是化学反应中饱和结晶的过程。此类方法为制药工业常用的结晶方法，由于国内结晶技术水平相对落后，反应结晶产品普遍结晶收率偏低，颗粒分布宽，晶体流动性差等问题。

反应结晶是工业结晶中最难控制和掌握的，头孢拉定的结晶又是难点中的难点，是否能很好的控制和掌握对产品的最终质量有着决定性的影响。在国外，头孢拉定的结晶是计算机自动控制的，用软件控制结晶的全过程，再用模糊专家系统、自适应预测模拟和滚动优化控制系统对工艺条件进行精确智能化控制。尽管如此，却还是不能避免中和反应和小晶粒、碎晶的产生。与国外相比，国内的头孢拉定的生产还停留在原始的人工操作上。

头孢拉定的结晶方法分两大类，一种是酸溶碱析法，另一种是碱溶酸析法，目前，工业以酸溶碱析法为主，此方法的副反应为氧化反应，氧化生成头孢氨苄。

（1）酸溶碱析法

（2）碱溶酸析法

根据对头孢环已烯结晶的酸溶碱析和碱溶酸析法的对比结果，可知前者的晶型、品体大小、比容、收率、纯度和色泽普遍较后者为优。这主要是因为在碱性条件下头孢环已烯的副反应比酸性条件下要强。但碱溶酸析法的粒度分布却比酸溶碱析法要相对集中一些，这可能是因为副反应增强使结晶反应速度下降，从而间接导致晶体生长速率降低，有利于晶体的生长集中，可同时副反应加剧又使体系中二次成核的机率增大，晶核数量的增加致使晶体不能充分长大，故而碱溶酸析法所得晶体比酸溶碱析法所得晶体的粒度较小但分布集中。但碱溶酸析法体系的比容、收率和固晶纯度比较酸溶碱析法差，这可能也与碱性环境中副反应加剧有关。鉴于在绝大多数体系中碱溶酸析法显然所得的结果要差，目前已知的厂家在工业生产中都选用了酸溶碱析法。

经过对不同酸溶碱析结晶体系的比较选择，以浓HCl-二甲胺/乙二胺（1：2，V/V）酸溶碱析体系为头孢拉定的结晶体系最佳。

5 加晶种的控制结晶

早年由Griffith出的“加晶种的控制结晶”，为了控制晶体的生长，获得较均匀的晶体产品，就必须防止意外的晶核生成，所以将溶液的过饱和度控制在介稳区内，使之不出现成核现象，并且向溶液中加入适当数量适当粒度的晶种，然后温和的搅拌，使晶体均匀的析出，这样就避免了二次成核现象。在整个过程中，加入晶种时要控制好溶液的温度或浓度，这个方法被称为“加晶种的控制结晶”。

传统的晶种制备方法有球磨法、粉碎法等，制得的晶种有以下缺点：①数目难以准确控制（总是伴随着二次成核现象），磨（粉）碎的晶体表面凸凹不平的枝丫、片状粒子在投种过程中会因碰撞、冲击脱落产生大量微细新晶，使数目难以控制；②晶核外差，尺寸分布范围很大。而加晶种的控制结晶恰能克服这些缺点。现在该技术在国内头孢拉定的生产中应用较少，具有较大的发展潜力。

由华南理工大学开发成功的溶剂超声波协同成核法是一种全新的晶种制备法一它是通过在溶液中加入成核溶剂降低溶质的溶解度、间接提高过饱和度，并利用超声波的分散效应和空化效应加速溶质分子之间的碰撞，促进成核。

结论

篇8：用于蛋白质结晶的分子改造技术

随着结构生物学的发展,晶体学仍然是解析生物大分子原子细节结构的主要方法,而获得晶体及提高晶体质量一直以来都是此领域的限速步骤。为了解决这两个问题,结构生物学领域的专家做了大量的研究,通过改变溶液中的一些参数[1,2]及附加各种物理场[3,4,5,6,7,8,9]来改变蛋白质的结晶性能,从而提高蛋白质的筛选成功率及晶体的衍射质量。这些努力虽然已取得了显著成效,但仍然有很多的蛋白质难以结晶或获得衍射质量的晶体。

某些蛋白质在较宽的范围内就可以结晶,而其它的一些蛋白质经过成千上万次筛选也很少能获得晶体[10,11],这种现象可能与蛋白质分子本身的表面性质有关。通过对分子表面进行改造,有可能促进分子之间的相互作用,从而影响蛋白质结晶。在这种思路的指导下,分子改造技术被应用在蛋白质结晶中,并取得了成功。目前,在蛋白质结晶研究中,分子改造技术的努力方向主要集中在目标蛋白质稳定结构域的结晶。因为只针对其稳定结构域,更容易实现结晶及获得较高衍射质量的晶体[12]。已有的研究结果表明,采用蛋白质工程技术,如定点突变[13,14,15]、还原甲基化修饰[16,17,18]、剪切或删除构象柔顺性环区[19,20,21]、融合蛋白[22,23,24]、复合物共结晶[25,26,27]以及原位蛋白质水解[12,28,29]等,对蛋白质进行表面改性,可以改变蛋白质本身的结晶性能,这就为部分难以结晶或获得高质量晶体的蛋白质提供了一种有效的方法。由于蛋白质结晶过程总是伴随有热力学的变化,而且某些分子改造技术下的结晶热力学已有研究,因此,本文首先对蛋白质结晶过程中的热力学驱动力进行了归纳总结,继而对近年来分子改造在蛋白质结晶中的应用进行了综合评述。

1 蛋白质结晶中的热力学驱动力

任何相变都要经历热力学的平衡过程,蛋白质结晶也不例外。蛋白质结晶过程受制于吉布斯自由能ΔGundefined的变化:当ΔGundefined为负值时,结晶可以自发进行;而当ΔGundefined为正值时,蛋白质不可能结晶。根据Gibbs-Helmholtz方程:

ΔGundefined=ΔHundefined-T(ΔSundefined+ΔSundefined)cryst (1)

可知结晶的热力学过程是焓变和熵变共同作用的净效应[30]。

Vekilov等[31,32]的研究表明,结晶过程中ΔHundefined一般为较小的负值,不可能决定结晶的方向。Derewenda等[33]测定了蛋白质结晶中的焓变和熵变,以确定结晶过程中的热力学驱动力。结晶过程中蛋白质分子的有序化是一个熵减的过程,即ΔSundefined为较大的负值,为-300~-100J·mol-1·K-1,在室温下会形成30~100kJ·mol-1的能量势垒,非常不利于蛋白质的结晶。

Vekilov等[34]研究了蛋白质分子周围溶剂的显微结构(如图1所示)。他们的研究证明,蛋白质分子周围有几个埃厚度的水结构[33,34],称为生物层(Biological layer)。在该层内,水分子以两种状态存在,即结合水(即稳固依附在蛋白质分子表面的水分子)和自由水,这两种水分子之间存在动力学平衡。此外,生物层和本体溶液中的水分子也存在动力学平衡关系。这些水分子之间的相互转换会导致熵的变化,如释放一个结合水分子,会导致熵增,约为2J·mol-1·K-1[34]。Derewenda[33]的研究表明,ΔSundefined为较大的正值,为100~600J·mol-1·K-1,即对应于结晶过程,每个蛋白质分子要释放5~30个水分子。可见,从蛋白质分子表面释放水分子是结晶中主要的热力学推动力。

2 分子改造在蛋白质结晶中的应用

2.1 定点突变-表面熵降低策略

定点突变是利用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)或商业化定点突变试剂盒(如Quikchange系列)对目标蛋白质的基因进行改造的一种技术。突变基因在大肠杆菌中表达、然后纯化得到目标蛋白质,再通过各种商业结晶筛选试剂盒对蛋白质进行结晶筛选、优化,获得适宜衍射的蛋白质晶体[35]。通常某些蛋白质表面会存在较长侧链的氨基酸,使其表面构象熵比较高。定点突变就是通过分子改造使这些蛋白质表面的构象熵降低[36],因此这种方法也被称为表面熵降低(Surface-entropy reduction, SER)策略。迄今为止,通过表面熵降低策略解析的晶体结构有160多种。在解析的160多种蛋白质中,包括60种新蛋白质、7种蛋白质与蛋白质的复合物、2种膜蛋白,以及许多蛋白质与小分子的复合物,其中蛋白质与小分子复合物的结构信息已经成功应用于药物设计[37]。

在形成晶体过程中,蛋白质表面分子相互接触并相互作用而结合在一起,但是构象熵大的蛋白质表面不易相互作用形成晶体。常用的突变有从赖氨酸到丙胺酸、从谷氨酸到丙胺酸、从谷氨酸到天冬氨酸、从赖氨酸到色氨酸等[13,15,20,37,38,39]。Derewenda[37]全面综述了SER在蛋白质结晶中的应用,指出SER在蛋白质结晶中的应用有两种很明显的趋势:①对于一些新蛋白质或其复合物、难以结晶的野生型蛋白质,可通过表面熵降低策略进行结晶。如Yip等[40]将定位突变用于EscJ蛋白质的结晶。采用Quikchange突变试剂盒,完成由谷氨酸到丙氨酸、赖氨酸到丙氨酸、谷氨酸到丙氨酸(E62A/K63A/E64A)3个位点的突变,这3个突变点位于蛋白质表面溶剂暴露的柔顺环区,突变后成功获得了EscJ蛋白质晶体,其衍射分辨率达1.8Å,且研究表明,突变不影响EscJ蛋白质的功能。②在药物公司的应用方面,突变型蛋白质可生长出较高衍射数据的晶体或新的晶形,比野生型蛋白质更适合于药物的发现。如对HIV-反转录酶和BACE-1蛋白质(阿尔茨海默病的靶向蛋白)表面进行SER改造可获得用于药物设计的靶向蛋白质晶体。

统计学表明[37],通过表面熵降低策略获得的90%的晶体中,减少蛋白质表面高的构象熵残基易形成热力学上有利的分子间接触。如从赖氨酸到丙氨酸的突变,可使蛋白质表面柔性侧链减少,靠近溶剂的酰胺基和羰基基团易与水分子形成氢键。突变表面构象熵大的残基有利于晶格接触的形成,即可有序化表面侧链残基,此过程伴随有熵的减少。这也表明某种蛋白质表面若存在大的亲水残基(如赖氨酸或谷氨酸),很可能会形成一种高构象熵的保护,从而阻碍结晶所必需的分子间接触。用低构象熵或没有构象熵的疏水残基(如丙胺酸)选择性取代构象熵大的残基很可能会克服此能量势垒,从而更利于分子间接触,这可能是突变型比野生型蛋白质更容易结晶的原因之一[37]。

赖氨酸和谷氨酸主要分布于蛋白质的表面,在蛋白质内部的含量仅为6%和12%。亲水性赖氨酸到疏水性丙氨酸的突变大多降低了蛋白质的溶解性,而且突变型蛋白质没有野生型蛋白质稳定,此方法不适合于膜蛋白的结晶[15,37]。已有的例子证明该方法具有很好的应用前景,很可能在结构生物学领域产生重大影响。当一种野生型蛋白质可溶性好且具有一定的稳定性,经大量结晶筛选后,仍难以获得晶体或提高晶体的衍射分辨率时,定点突变法可能更加有效[33]。

2.2 赖氨酸甲基化

赖氨酸甲基化是将一定量还原剂二甲胺合硼烷复合物(Dimethylamine-borane complex, ABC)和甲基化试剂(如甲醛)加入到蛋白质溶液中,将其表面赖氨酸进行甲基化修饰,再将蛋白质进行纯化、结晶,从而改进蛋白质结晶成功率的一种技术[16,18]。表面赖氨酸甲基化是一种简单、快速的用于蛋白质结晶的方法,已经成功用于生长高质量的蛋白质晶体,但其促进结晶的具体机制尚不清楚。

Sledz等[18]的研究表明,对天然蛋白质进行甲基化修饰后,仍然能维持其生物学功能。由于修饰几乎发生在表面,在PDB数据库中,对非甲基化和甲基化的10种蛋白质结构的比较表明,10对结构都是同型的,仅仅是柔顺环区构造有微小的变化。一些蛋白质只有甲基化以后才能结晶,通常甲基化修饰后的衍射分辨率较高。Sledz等[18]认为甲基化修饰促进蛋白质结晶的原因可能是:①引入甲基化基团可能影响了电子密度,从而形成新的晶格接触。甲基化的赖氨酸残基诱导了明显的结构重排,形成新的氢键,使蛋白质表面更稳定,促进了晶体的有序化堆积。Shaw等[41]也成功地用还原甲基化法结晶了核酸酶,结晶的关键是形成了新的接触,显著改变了蛋白质的结晶性质,其晶体衍射分辨率达1.2Å。②单一赖氨酸残基在室温下表面构象熵能量势垒大概是8.36kJ/mol,分子模拟估算的研究表明二甲基化的赖氨酸比赖氨酸有更高的侧链构象熵,大概是3.5J·mol-1·K-1,其对晶体堆积本身创造了更高的能量势垒。但是二甲基化的赖氨酸在蛋白质表面会形成大的溶剂层,在结晶过程中的熵增大概是4J·mol-1·K-1,比赖氨酸的熵增要大,这就克服了二甲基化赖氨酸本身的侧链构象熵,二甲基赖氨酸可能形成了更稳定的非共价键。

Kim等[17]将还原甲基化用于370种序列不同蛋白质的结晶,这些蛋白质没有结构同源性,但具有大于30%的序列相似性。在370种蛋白质中,269种蛋白质以前没有获得适于结构测定的晶体,85种蛋白质以前无法结晶,16种蛋白质以前没有筛选结晶。还原甲基化修饰以后,获得了40种衍射质量的晶体,并解析了26种蛋白质的结构。他们比较了天然态和甲基化状态下的4种蛋白质结构,观察到甲基化以后各向同性温度因子B减小,这很可能导致更多有序的晶体堆积。同时证明蛋白质还原甲基化修饰后,其结晶成功率与赖氨酸的数量、等电点或分子质量没有关系。Walter[16]将10种难以结晶的蛋白质还原甲基化修饰,5种蛋白质生长出晶体,其中4种蛋白质晶体获得衍射数据。在结晶的蛋白质中,两种以前没有获得晶体,甲基化以后获得了衍射质量的晶,其中一种甲基化后结晶的蛋白质、晶胞尺寸减少,蛋白质在溶液中大多以低聚物形式存在。这大概是由于在低聚物态下还原,蛋白质的晶体形貌发生改变。实验表明甲基化后蛋白质一般在高盐浓度下结晶且溶液的等电点pI都降低,在甲基化的位点产生了晶格接触。分析认为,甲基化后自由酰胺基的化学变化影响了其他的生物物理性质,降低了蛋白质的溶解性及改变了低聚物的状态。可见赖氨酸甲基化应用于蛋白质结晶中的机理是比较复杂的,但此方法大大提高了蛋白质结晶的成功率,有望在蛋白质结晶中作为普通的技术使用。

2.3 剪切或删除柔顺环区

从纯化蛋白质到获得衍射质量的晶体总体成功率仅约15%。在过去的几十年,随着质谱学和分子生物学的发展,结构生物学家开拓了使用蛋白质碎片或结构域来生长蛋白质晶体的方法。与完整的蛋白质相比,蛋白质碎片或结构域更易结晶,且易得到X射线衍射质量的晶体[29]。

由于绝大多数解析的蛋白质结构中多肽类结构的尺寸少于20kDa,表明较小的多肽可能更容易生长晶体。较大的蛋白质通常由许多结构域组成,不同结构域之间通过柔顺性区域连接[20,42]。生长晶体过程需要将蛋白质内在的无序化元素如柔顺末端或环肽链有序化,这在晶格接触点进一步增加了熵的消耗。然而蛋白质表面有序水分子的释放有利于晶格接触,补偿了有序化过程的熵损失,最终提供了晶体生长的驱动力。蛋白质中大的柔顺区域在结构中可能会产生异质成分,删除蛋白质末端或内部的柔顺区域,降低了这些无序化元素在结晶中的熵消耗,使蛋白质趋于稳定化。稳定的蛋白质比内部含有柔性结构或表面具有柔性的蛋白质容易结晶,因此为了获得这种蛋白质的稳定化结构信息,很有必要对其剪切分别结晶。

降低蛋白质任何微观不均一性,可通过3种方式完成:剪切N端或C端的多肽,删除内部的柔顺环区,或从多结构域蛋白质中提取单个的结构域进行结晶,经过修正的蛋白质可能更有助于结晶[19,21]。在结晶的情况下,构象的不均一性起因于结构域之间的运动,这严重妨碍了蛋白质的结晶过程。蛋白质的构象不均一性与其三维结构的测定相关,使结构生物学家将注意力转向研究蛋白质结构域。蛋白质结构域有其额外的特征:首先,单个结构域在细菌重组形式蛋白质中更容易表达,单个结构域表达具有更高的水平,比多结构域的蛋白质更加可溶。其次,蛋白质结构域一般由不到150个氨基酸组成,不管是X衍射结晶学还是核磁共振技术(NMR)都很容易进行结构分析[42]。有限蛋白质水解在蛋白质结构解析中已经应用了几十年,此方法是在纯化的目标蛋白质中加入痕量蛋白酶(蛋白酶与目标蛋白质量比为1∶1000),通过水解可实现将蛋白质内部柔顺区域、末端无序的区域剪切,或分离出单个结构域,通过质谱确定蛋白酶分裂的位点和多肽链精确的质量,再纯化、结晶,从而解析蛋白质的结构[43,44,45]。

2.4 融合蛋白

融合标签技术是20世纪末发展起来的一种基因重组技术,主要是利用基因重组技术将目标蛋白和某种融合标签结合后在宿主细胞中表达,从而改进目标蛋白的溶解性、稳定性及可结晶性,此技术已成功用于蛋白质的结晶[24,46]。融合标签通常被用于异源蛋白质的表达,目的是为了促进折叠和溶解性,使有利于纯化。融合标签包括两种,一种是短的寡肽,如6-组氨酸,具有独特的亲和性质,主要用于纯化中;另一种是高度表达的可溶性蛋白质,如谷胱甘肽(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)及硫氧还蛋白等,可提高目标蛋白的可溶性。融合标签被插入到表达载体,其与目标蛋白之间通过连接序列结合,表达的融合蛋白可通过酶切分离目标蛋白或直接将融合蛋白纯化后结晶[47]。

当目标蛋白的溶解性很差或难以结晶时,采用融合蛋白技术可以提高目标蛋白的溶解性及促进晶格形成。Corsini等[23]采用融合蛋白技术结晶了Puf60-UHM结构域。实验中应用硫氧还蛋白作为融合标签,主要是因为硫氧还蛋白具有3点优势:①其本身很容易结晶;②在细菌中高表达;③其C端接近于溶剂,以至于对融合蛋白的折叠没有阻碍作用。两个融合结构域之间应选用较短的连接序列以限制它们之间的相对构象柔性;同时连接序列必须足够长,使两个结构域可以独立折叠。以上述原则为基础,设计了Puf60-UHM结构域N端和硫氧还蛋白C端的融合,两种结构域之间采用了两种连接序列,各自是GSAM和GSPPM。仅GSAM的连接经融合表达后获得了衍射质量的晶体。其促进结晶的原因可能是两个结构域之间的融合有利于晶格的形成。MBP融合在蛋白质结晶中的应用也非常成功,如Center等[48]采用MBP融合结晶了人类T细胞白血病病毒1-型gp21胞外域片端。实验中MBP的C端与gp21的N端连接,两个融合蛋白之间的连接序列仅为3个丙氨酸。Ullah等[49]对MBP进行表面改性(E359A、 Asp82A、Lys83A、 Lys239A 突变以及剪切掉Asn367),将突变型MBP的C端与拟南芥信号转导调控因子RACK1A的N端融合,两个蛋白之间的连接序列也是3个丙氨酸。天然的RACK1A不能产生晶体,RACK1A与突变型MBP融合后成功结晶了RACK1A,其衍射分辨率达2.4Å。研究表明,在晶体结构中不存在RACK1A-RACK1A的晶格接触,可见,突变型的MBP用于蛋白质结晶中,可降低表面熵和有助于晶格接触的形成。

2.5 复合物共结晶

复合物共结晶就是将结晶辅助蛋白与靶蛋白结合形成非共价复合物,从而促进靶蛋白的结晶。复合物的形成可增加靶蛋白的可溶性、降低其表面构象不均一性,有助于晶格接触的形成[47,50]。结晶辅助蛋白一般来源于形成的单克隆抗体片段或其他蛋白质。首先,结晶辅助蛋白通过与靶蛋白的一种特殊构象结合,降低其表面的构象不均一性(如图2(a)所示)。其次,结晶辅助蛋白可延伸靶蛋白的表面,有利于晶格接触的形成,靶蛋白与辅助蛋白只有在形成复合物以后才能结晶(如图2(b)所示)[50]。

目前结晶辅助蛋白主要有3种类型[50]:(1)半合成抗体结晶辅助蛋白。采用动物免疫和重组技术混合制备单克隆抗体片段。单克隆抗体的Fv或Fab片段通过cDNA克隆,在大肠杆菌中重组表达。Ostermeier等[25,51]最初将抗体片段Fv用于细菌细胞色素c氧化酶的结晶,研究表明,Fv片段与靶蛋白形成复合物后扩增了靶蛋白的亲水性表面,增加了靶蛋白的可溶性。但是由于传统方法存在的局限性,如单克隆抗体的制备困难等,此方法没有得到广泛的应用。Tereshko等[52]应用噬菌体或酵母表面展示技术合成VHH 抗体(Camelid single-domain antibody),并将其用于核糖核酸酶(RNaseA)的结晶,RNaseA-VHH复合物结晶产生了6种晶型。VHH抗体作为结晶辅助蛋白比Fv和Fab片段具有更高的优势,其比Fv和Fab片段更容易表达,可广泛用于膜蛋白结晶中。(2)合成抗体结晶辅助蛋白。采用噬菌体展示或核糖体展示或酵母展示技术用于抗体的克隆、表达,即通过非免疫的手段获得所需要的抗体。Uysal等[27]将合成的Fab片段用于KcsA的结晶。KcsA是一种钾离子通道蛋白,由一个跨膜结构域和细胞质C端结构域组成。过去通过剪切C端结构域后获得了KcsA的晶体结构,但是研究表明C端结构域在KcsA执行功能是非常重要的。将合成的Fab抗体片段作为结晶辅助蛋白,测定了FL KcsA(Full-length KcsA)结构,分辨率达3.8Å。单独的C端结构域与Fab的复合物结晶后分辨率达2.6Å。研究表明在Fab抗体片段之间形成了广泛的分子间接触。(3)非抗体结晶辅助蛋白。此结晶辅助蛋白保持了抗体的亲和性和特异性,比抗体具有更高的稳定性和表达量,是近年来发展的一种新的结晶辅助蛋白。DARPin(Designed ankyrin repeat protein) 是目前使用最多的一种非抗体结晶辅助蛋白,可通过噬菌体或核糖体展示技术和重组技术合成。Sennhauser[26]指出应用DARPin作为结晶辅助蛋白已经解析了5种蛋白质的结构。其中,在过去的研究中,Plk-1(Polo-like kinase-1)只有在突变以后才能获得晶体,而与DARPin复合后成功结晶了野生型Plk-1,衍射分辨率达2.3Å。 DARPin与Plk-1复合后,掩盖了Plk-1表面不利于晶格接触的精氨酸、谷氨酸和赖氨酸。同时DARPin也成功地用于膜蛋白AcrB的结晶。

膜蛋白的溶解度很低,且结晶很困难,而商业药物靶蛋白的60%都是膜蛋白[53]。因此,此技术的发现对于结晶膜蛋白并提高其质量有很大价值。复合物结晶为膜蛋白的结晶提供了一种非常有用的方法,过去由于使用动物免疫和杂交瘤技术制备单克隆抗体费用昂贵、生产量低,使此方法没有得到很好的发展。噬菌体展示技术及重组技术的出现解决了这个问题,使复合物结晶展现出很好的发展前景。

2.6 原位蛋白质水解

原位蛋白质水解就是在目标蛋白质的结晶溶液中加入痕量的蛋白酶(如糜蛋白酶、胰岛素),利用质谱技术确定蛋白质的水解位点,通过改变蛋白质本身的性质来促进结晶的一种技术,该技术大大提高了获得晶体的机会[12,29]。

Bai Y等[28]在鼠科亚基CstF-77的结构测定中,偶然间发现将被菌类所感染的商业试剂盒(已在实验室存放2年)用于CstF-77蛋白质的筛选中,在长有真菌的条件下获得了晶体,而用相同的自身配制的新鲜溶液却未能长出晶体,他们认为真菌类对于这种蛋白质的结晶是至关重要的。质谱分析表明部分CstF-77在结晶过程中发生了水解,推断这很可能是被某种隐藏的蛋白酶所催化。真菌蛋白酶可以用枯草杆菌蛋白酶替代,于是在CstF-77结晶过程中,加入枯草杆菌蛋白酶(二者的比例为5000∶1),采用坐滴法进行结晶实验筛选,获得了衍射质量的晶体。此外,他们发现在大部分通常的防冻液下CstF-77晶体总是被破坏,经过广泛的研究表明,55%葡萄糖可作为此蛋白质的防冻液来维持晶体的衍射质量,衍射分辨率达到2.8Å。

Dong等[29]采用原位蛋白质水解研究了55种细菌蛋白质和14种人类蛋白质的结晶,采用的蛋白酶为糜蛋白酶和胰岛素,所选的69种蛋白质全部是在传统方法下不能结晶或获得的晶体衍射质量比较差的蛋白质,其中10种蛋白质生长了衍射质量高的晶体。此方法解析了人类GART蛋白质的AIRS结构域。GART由3个结构域组成,仅仅是中间的AIRS结构域的结构未能测定,原位蛋白质水解作用下使其结构得以解析。Wernimont等[12]拓展了使用蛋白酶的种类,将糜蛋白酶、胰岛素、V8蛋白酶、木瓜蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶用于275种蛋白质(包括200种酵母和细菌蛋白质、70种人类蛋白酶和5种人类寄生蛋白质)的结晶,其中2/3的蛋白质是以前不能够结晶的,剩下的1/3是无法获得衍射质量的蛋白质。应用原位蛋白质水解获得了34种蛋白质的结构,其中26种蛋白质结构使用的是糜蛋白酶或胰岛素,5种蛋白质结构得自于V8蛋白酶,2种蛋白质结构应用的是嗜热菌蛋白酶,只有1种结构应用的是木瓜蛋白酶。

原位蛋白质水解已经应用于300多种以前未能解析结构的可溶性蛋白质结晶[12]。在这些蛋白质中,大约200种以前从未获得晶体,100种虽然结晶但无法解析结构。在未能结晶的蛋白质中,24种获得了结构,成功率大约为12%,而以前获得晶体的蛋白质中解析结构的成功率加倍,大约是21%。这种较大的差异可以通过蛋白质内在的稳定性进行解释,以前结晶的蛋白质在一定时间内必须是足够稳定的,然而从未结晶的蛋白质中可能包含一定数量不稳定的蛋白质,在结晶期内会变性或聚集。可见原位蛋白质水解显著提高了蛋白质结晶的成功率,此外其用于结晶中的重复性也比较好。此方法显著增加了PDB数据库中蛋白质结构的数量,是一种非常有用的蛋白质结晶方法。

3 结语

随着生命科学的迅猛发展,应用蛋白质工程进行分子改造逐渐成为一种通用的工具被用于生长蛋白质晶体,分子改造从本质上改进了蛋白质本身的结晶性。一些蛋白质经过成千上万次筛选后还是难以结晶,说明此蛋白质本身存在一定的问题,需要对其进行表面改性,如改进其微观不均一性、溶解性或降低表面构象熵。尽管近年来分子改造在蛋白质结晶中取得了重大发展,但是对于各种方法尚没有精确的选择标准。已有的经验表明,对于溶解性高、分子量较小且较稳定的蛋白质,一般选择表面熵降低策略或甲基化修饰。当蛋白质分子量较大、由多个结构域组成时,可选择用剪切或删除柔顺环区的方法或原位蛋白质水解法。融合蛋白和复合物共结晶可有效降低蛋白质表面的构象不均一性及增加目标蛋白的可溶性,对于低溶解度的蛋白质结晶是非常有效的,特别是复合物共结晶可广泛用于膜蛋白的结晶。分子改造法结合结晶过程的热力学分析,对蛋白质结晶过程机理的研究有一定的指导作用。

分子改造显著提高了蛋白质的结晶成功率和晶体的衍射质量,为PDB数据库提供了更多蛋白质的结构信息,指导了一些靶向药物的合成。但是分子改造在蛋白质结晶中的许多机制尚不明确,有待结晶学家的进一步探索。将分子改造用于某一类具有共性的可溶性蛋白质,尤其是膜蛋白的结晶实验,并将此技术进行推广,将是下一阶段研究的重点。蛋白质本身作为结晶中最重要的一个变量是不容忽视的,将分子改造用于蛋白质结晶将成为蛋白质结晶发展的主要方向之一。

摘要：获得晶体及提高晶体质量是蛋白质结晶方法学中的两大基本问题。为解决这两个问题,结构生物学家已发展了许多方法,其中针对蛋白质本身进行分子改造是非常重要的方法之一。通过蛋白质工程技术,如定点突变、还原甲基化修饰、剪切或删除构象柔性环区、融合蛋白、复合物共结晶、原位蛋白质水解等方法对蛋白质本身进行分子改造,可明显提高其结晶成功率及晶体质量。随着该方面成功案例的不断积累,分子改造技术越来越凸显出其在蛋白质结构解析中的重要作用,特别是对一些难以结晶或提高晶体质量的蛋白质而言,其应用价值更不可忽视。针对近年来分子改造技术在蛋白质结晶中的应用进行了回顾与总结,并展望了其未来的发展。

篇9：结晶及其在医药生产中的应用分析

关键词：结晶；重结晶；结晶设备；医药生产

中图分类号：R194 文献标识码：C 文章编号：1005-0515（2013）5-082-01

1.前言

结晶和重结晶都是制备化学药品和医学药品的有效方法，结晶过程具有良好的选择性。经过结晶溶液中的物质置换、过滤、洗涤等化学处理高度提纯药品，抗生素、维生素等医用药品就是经过多次结晶才拥有了高纯度。

2.结晶方法

2.1结晶

饱和溶液结晶一般有冷却结晶、蒸发结晶、盐析结晶和化学反应结晶4种方法，可单独或者结合起来用于工业生产，强化过饱和度制备较多高纯度的结晶，像共沸蒸馏结晶，结合了冷却结晶和蒸发结晶两种方法，在操作上有点复杂，结合药品成分构成和制备条件来确立使用，尤其适合抗生素生产，加入正丁醇形成饱和溶液共沸，蒸馏萃取含钾、含钠盐类青霉素；共沸蒸馏结晶法结晶收率高，易于过滤和洗涤，可以减少对青霉素的破坏，提高结晶质量，而且，饱和溶液共沸的温度较低，水分蒸发不剧烈，析出的晶体粗大疏松，质量良好。

2.2重结晶

重结晶是初析晶体融入溶剂中再结晶进而提高药品纯度的过程。初次结晶的药品含有较多杂质，在同温同压同条件下，一些与产品溶解度相近的物质也会析出混在产品中，甚至融合于产品的晶格中；或产品洗涤不完全，不能完全除去结晶中的母液，使母液中的杂质污染了晶体。因此，需要进行重结晶再提高产品的纯度。

2.3结晶设备

结晶设备总称结晶器，具有一定的流体力学环境。根据结晶方法和操作上的差异，结晶器可分为用于浓缩溶液以获得结晶的蒸发器和适用于用其它结晶方法的反应器两大类。结晶过程均需改变溶液的温度，无论哪种结晶设备都故附带热交换装置。除此之外，每种设备都附有搅拌机械或泵，用来给饱和溶液引流，使晶核从溶液中以统一的大小均匀析出。

根据操作方法来区分，结晶设备可分为间歇装置和连续装置两种。结晶操作的精准性直接影响产品的产量，用于制备抗生素的结晶设备一般由不锈钢或者搪玻璃构成，内壁光滑，才能避免晶体粘壁，也便于清洗和灭菌。

3.医药生产

结晶是用于医药生产提纯上最好的方法，常用于制备晶核、微粒晶体和，生产各种抗生素。生产抗生素最常用的设备是结晶罐，罐体上附有搅拌仪器和夹套，可根据结晶方法需要改变温度的高低。

药物的连续结晶使用多台串联设备组建严密的生产流程[1]。像制备青霉素钾盐，结合两种结晶法和设备（即共沸结晶）获取长针形、纯度高的晶体。青霉素钾盐在乙酸丁酯饱和液中的溶解度极小，溶入水的溶解度却很大，因此结晶时要尽量将乙酸丁酯中的水分处理。水和乙酸丁酯能形成共沸物，在真空下把共沸物蒸发出来，减少丁酯水分。为了延长结晶的时间，就要逐渐减小丁酯中的水分，就能获得较大的晶体，在丁酯中添加适量的水，然后在720mm汞柱的真空下质量浓度为20%的醋酸钾乙醇溶液，一边加溶液一边加热，在25。C的温度下首先蒸馏出来的是丁醇-水共沸物，在30℃温度下蒸馏出来的是丁醇-丁酯-水三元共沸物，在35℃温度下蒸馏出来的是丁酯一水共沸物，直到温度达到38～40℃，丁酯溶液的水分减小到0.6%上下。饱和溶液中的水分不断蒸发，结晶逐步析出粘附在搅拌仪器上。共沸结晶装置除了结晶罐，还附带冷凝器、冷凝液接受罐和真空泵等设备。

应用计算机辅助、控制药品的结晶过程，构成了新型的结晶装置，可实现自动调整设备的操作参数，生产出质量高的晶形产品。新型结晶设备在医药生产中的使用，显著提高青霉素产品的药效，增加单次5%的投料，青霉素G钾盐结晶和青霉素G钠盐的结晶收率分别高达93%和92%，可提高结晶器容30%以上的生产能力，大幅度降低溶剂的消耗量，大大缩减药品的生产成本，在价格上和质量上稳固我国生产的青霉素在国际销售市场上的地位。

另外，我国目前还研发了一种新型塔式液膜结晶装置[2]。新型塔式液膜结晶装置只是由填料和管板两部分组成，可以在反映塔内一次性完成药品的结晶、过滤、洗涤、干燥等功能，由于装置简单，操作最方便，已经成为国际工业产业通用的特种的提纯设备，用于高纯二苯得生产，年产量高达4200吨，产品分离出纯度高达99.9%色谱级。在设备的成本方面，新型塔式液膜结晶装置仅是进口专利设备成本的1/5～1/10，是国内医学生产提取高纯和超纯药品的重要设备。

4.结语

各种反应结晶器是医学上制取微细晶体、超纯晶体和大颗粒晶体的重要设备，结晶生产出来的医药均能达到国家、国际标准。结晶技术是我国乃至世界工业化学生产的一大支柱，也是支持医学药物生产的重要力量。

参考文献：

[1]窦智.宋传信.姚丽丽.结晶及其在医药生产中的应用[J].山东化工，2007，19（8）：1336～1337.