微囊藻毒素合成机理的研究进展

微囊藻毒素合成机理的研究进展（精选12篇）

篇1：微囊藻毒素合成机理的研究进展

对于MC的研究目前主要集中在毒理学,生态影响,及监测、检测技术等研究领域之中.由于MC产毒藻种类繁多,再加上多达60几种的异构体的存在,每一MC产毒藻类体内其mcy基因并不完全一致,所以对于MC的产毒合成机理研究非常困难.但近几年对MC的产毒合成机理已经有了突破:三种最主要的`MC产毒藻的MC合成过程已经被阐明.

作 者：钟启升 李元 杨良 ZHONG Qi-sheng LI Yuan YANG Liang 作者单位：钟启升,李元,ZHONG Qi-sheng,LI Yuan(云南农业大学资源与环境学院,云南,昆明,650201)

杨良,YANG Liang(云南省环境监测中心站,云南,昆明,650034)

刊 名：环境科学导刊英文刊名：ENVIRONMENTAL SCIENCE SURVEY年，卷(期)：27(3)分类号：X52关键词：微囊藻毒素 生物合成 铜绿微囊藻 浮游蓝丝藻 鱼腥藻

篇2：微囊藻毒素合成机理的研究进展

微囊藻毒素的研究进展

摘要：随着大量含氮和磷的废水流入湖泊和江河,导致淡水蓝藻水华污染现象日趋严重.如何有效控制蓝藻水华污染和去除微囊藻毒素是摆在中外环境科学领域的一个难题.主要针对 MC 的产生、物化性质、毒性、检测方法和处理方法的`国内外最新研究进展进行了综述, 并对重要的研究领域进行了展望.作 者：梁佳 曹明明 LIANG Jia CAO Ming-ming 作者单位：西北大学,环境科学系,陕西,西安,710127期 刊：地下水 Journal：GROUND WATER年，卷(期)：2010,32(2)分类号：X524关键词：微囊藻毒素 毒性 检测 展望

篇3：微囊藻毒素合成机理的研究进展

沿岸浅水区是水生脊椎动物早期生命阶段生活的地方, 在水生动物的个体发育中, 早期生命阶段的发育是最为重要的。而水华经常就发生在沿岸浅水区, 这对水生动物胚胎发育产生极大的影响。

在过去10年中, 数项研究已经完成, 评估了蓝藻毒素在水生生物体内的生物积累对水生生物的影响。目前, 虽然对微囊藻毒素的毒性研究已经取得初步成果, 但对鱼类胚胎发育的影响国内未见报道, 本文简要综述了微囊藻毒素的结构、其对胚胎发育的影响及其致毒的分子机制。

1 微囊藻毒素的结构

M C是一类由蓝藻产生的天然的神经毒素, 这些蓝藻包括Microcystis、Anabaena、P l a n k t o t h r i x、a n a b a e n o p s i s、N o s t o c、Aphanocapsa和Hapalosiphon。MC的结构于20世纪80年代初被确认[1], 是一组环状七肽类物质, 因为这类化合物首先从一种蓝藻——铜绿微囊藻 (Microcystis aeruginosa) 中分离到的, 因而被命名为“microcystin”。微囊藻毒素的结构通式为环状 (D-丙氨酸-L-X-赤-β-甲基-D-异天冬氨酸-L-Z-A d d a-D-谷氨酸-N-甲基脱羟基丙氨酸) [2], 其中, Adda (3-氨基-9-甲氧基-2, 6, 8-三甲基-1 0-苯基-4, 6-二烯酸) 是一种特殊的含有20个碳原子的氨基酸, 由于Adda-谷氨酸部分在与蛋白磷酸酶键合时起着重要作用, 所以Adda侧链是毒素的生物活性表达的重要基团, 其共轭立体结构也会影响其毒性, 去除Adda后微囊藻毒素的毒性大大降低[3]。

目前, 已发现70多种微囊藻毒素的异构体, 常见的是MC-LR, MC-RR MC-YR3种毒素[4~5], L、Y、R分别是亮氨酸, 络氨酸和精氨酸, 其中, 代表亚型是MC-LR, MC-LR的毒性最强[6]。

2 微囊藻毒素对胚胎发育的毒理学效应

MCs具有多器官毒性、遗传毒性和致癌性。MCs造成的持续伤害依赖于体内毒素的含量和肝脏对毒素的吸收和解毒作用。对大多数器官分析的数据显示, MCs干扰后期胚胎组织分化。

2.1 致畸和致死作用

Oberemm[7]将斑马鱼卵暴露在藻毒素的粗提液中, 用0.5、5、50μg/L3种质量浓度处理斑马鱼胚胎, 发现鱼卵生存率和生长率降低, 器官发生迟缓、畸形。血流减速, 红细胞聚集在心脏附近的血管内, 导致明显水肿。尾巴背弓, 严重时还会出现外包异常 (表现为原肠外凸) , 不能发育成幼鱼。Celine[8]等对青鳉的受精卵显微注射2nl的100ng/ml的MCs后, 仅有约12%的的胚胎在孵化后成活, 但在孵化后3d没有幼体的成活。研究显示, MCs对鱼类胚胎的致致畸和致死性是剂量和时间依赖的。

2.2 肝毒性

肝脏是MCs作用的主要靶器官。胚胎孵化时, 肝脏主要负责维持正常浓度的血糖, 以肝糖的形式储存葡萄糖和降解肝糖产生葡萄糖, MCs已被证明能够抑制肝糖合成酶活性[9]。胚胎发育的后期, 因为早期葡萄糖的生成, 在孵化前胚胎的肝脏中就有大量的肝糖储存, 但在MCs处理过的胚胎中, 肝脏的体积明显减小, 这部分减小的区域可能是肝糖损耗的痕迹。MCs中毒的组织学特点是肝脏结构破坏, 急性使得肝内出血、坏死, 肝细胞固缩, 呈退行性空泡样, 细胞核破裂, 线粒体肿胀, 窦状结构丧失, 微丝网重组。在肝细胞中, MCs的肝毒性是蛋白磷酸酶抑制剂的直接结果, 血管内肝窦状内皮细胞完整性受到破坏是肝中毒的主要原因。

2.3 胰腺毒性

胰腺有两种类型的腺体组织分别进行生理外分泌和内分泌功能, 在对胰腺的检测中, 所有经MC-LR处理的胚胎其胰脏的体积减少, 腺泡损伤, 没有观察到腺泡单位、小叶内间质和小叶间胆管[10]。

2.4 肾毒性

肾脏是MCs除肝之外的另一个重要的靶器官, MCs会在肾中蓄积, 组织学检查发现染毒的肾近端小管上皮细胞空泡化、细胞核固缩、细胞凋亡, 肾小球的毛细血管簇遭到破坏, 肾小球、近曲小管和远曲小管的管腔扩大, 并且管腔中有大量的红细胞, 近曲和远曲小管的上皮细胞脱落到管腔内或消失, 许多管状上皮细胞的细胞质中出现液泡, 胞间隙中有淋巴细胞浸润[11]。

3 微囊藻毒素影响胚胎正常发育的分子机制

3.1 对蛋白磷酸酶的抑制

20世纪90年代初, 一些科学家几乎同时发现MC-LR能强烈地抑制蛋白磷酸酶的活性[12]。蛋白激酶 (PK) 和蛋白磷酸酶 (PP) 作用于蛋白质中的丝氨酸、苏氨酸和洛氨酸残基, 分别影响它们的磷酸化和去磷酸化, 所有有机体均借此调节各种细胞内生命过程。蛋白磷酸酶中磷酸化丝/苏氨酸残基的蛋白磷酸酶 (PPP) 进一步分为PP-1、PP-2 A、P P-2 B和P P-2 C四类, P P P存在于所有真核细胞中, 参与许多细胞过程的调控, 包括细胞周期进程、细胞增殖、蛋白质合成、转录调节、神经传递等。

M C-L R能强烈的抑制P P-1和P P-2 A的活性, MC与PP-1和PP-2A的结合最初是非共价的, 经过数小时后MC与PP-1和P P-2 A形成共价结合, 导致P P-1和P P-2 A的不可逆的改变。在胚胎发育过程中, 信号分子的磷酸化和去磷酸化的平衡高度的调节着细胞的分化, PP1和PP2是影响胚胎发育的重要调节因子[13~14]。

3.2 对钠钾泵的阻滞

对鱼鳃微粒体碎片的研究发现, MC可能作用与毒毛旋花甙相同的位点, 阻止K+依赖性的磷酸酶的水解, 抑制细胞膜两侧Na+和K+的交换。MC不仅可阻滞磷酸化蛋白丝氨酸和色氨酸的水解, 而且可能抑制纳钾泵上天冬氨酸的去磷酸化。钠钾泵在机体内具有重要的生理意义, 既是神经、肌肉膜可兴奋性的基础, 也是组织氨基酸及葡萄糖的传送基础, 其作用受到阻滞后, 鱼体内的离子平衡被打破, 从而导致鱼类大批死亡[15]。

3.3 对细胞骨架动态变化的干扰

细胞骨架的动态变化在胚胎的发育中起着重要的作用。微囊藻毒素进入细胞后能够作用于细胞骨架, 使得细胞骨架中的动力蛋白和微管蛋白过度磷酸化[16~17], 同时, 微囊藻毒素可能直接和微管蛋白亚单位中的半胱氨酸残基结合, 使细胞质中游离的微管蛋白增加, 微管蛋白m RNA的稳定性降低, 从而使细胞微管蛋白减少, 细胞骨架的功能遭到破坏, 引起了细胞的变形[18]。形态学上表现为胞膜泡出现, 最后细胞凋亡或是坏死。因此MC有可能通过干扰胚胎细胞骨架的动态变化来破坏胚胎的早期发育。

3.4 对卵裂球一致性的破坏

在细胞与细胞的粘接中, 钙粘蛋白对组装和粘着起到最重要的作用[19]。用吗啉敲除钙粘蛋白会导致卵裂球的卵裂面不规则定位, 细胞大小不相等, 减少了卵裂球间的粘着, 降低了胚胎的紧密结合。在Pei-Jen W a n g[20]的研究中发现, M C-L R通过干扰β-catenin和钙粘蛋白的粘着和装配及其在胚胎中的定位, 减少了卵裂球的数量并破坏分裂球的一致性, 最终导致斑马鱼胚胎和幼鱼畸形和死亡。

3.5 对细胞的氧化损伤

微囊藻毒素明显降低鱼体内谷胱甘肽 (GSH) 的含量, 说明微囊藻毒素引起了谷胱甘肽的消耗。谷胱甘肽是广泛存在于细胞内的三肽有机化合物, 它参与许多物质的解毒作用。Wiegand[21]等人通过14C标记的M C-LR来研究其对斑马鱼早期不同阶段的影响, 并监测解毒酶、微粒体及可溶性谷胱甘肽-S-转移酶以及谷胱甘肽过氧化物酶的改变。发现解毒酶的活性在个体发生时不断变动, 但MC对它们活性的增强或抑制在各个阶段都是一致的。可溶性谷胱甘肽S-转移酶的活性略有增强, 谷胱甘肽过氧化物酶的活性显著增强, 而微粒体谷胱甘肽过氧化物酶的变化则不显著。这些结果表明在斑马鱼的早起胚胎发育中有MC的吸收, 由体内的解毒体系对此做出的反应可推测谷胱甘肽S转移酶 (GST) 可能参与了MC在动物体中的代谢, 因为MC分子中的Adda部分有亲电性的不饱和羧基, 能与GSH结合, 而且结合后毒性大大降低。解毒过程中能量需求增大而器官发生尚未完成, 导致了胚胎发育期间的生长缓慢。

4 研究展望

一直以来, 关于MCs的研究, 大多数集中在MCs对哺乳动物的毒害以及对人类健康的影响上。围绕于此, 人们在微囊藻毒素的产生、检测、环境行为、对陆生生物的毒性等方面进行了许多研究。但微囊藻毒素产生于水体, 其对水生生物的影响才是最直接的, 鱼类作为水生态系统的次级消费者, 藻毒素可能通过直接的摄食活动或生物累积作用在鱼体中累积下来, 并通过食物链危害到人类健康。近年来, 微囊藻毒素对鱼类的生态毒理学效应研究逐渐引起科学家的关注和重视。

但对以下方面的认识还不够, 还需深入研究: (1) 进一步研究产毒藻类本身的特点及毒素的降解, 建立早期藻类污染监测预警系统, 加强水体中藻毒素监测工作, 寻找清除藻毒素的有效手段; (2) 长期低剂量经口摄入MCs, 对人体的潜在危害的研究仍不充分; (3) MCs是由什么受体以及经怎样的途径进入胞内发挥作用的, 需明确转运机制和代谢情况。

摘要：微囊藻毒素是富营养化水体中对水生生物繁殖和发育影响极大的一种细胞内毒素, 它通过抑制蛋白磷酸酶的活性, 打破细胞内蛋白磷酸化/去磷酸化的平衡, 引起细胞损伤甚至坏死, 从而影响鱼类胚胎的正常发育。本文就微囊藻毒素对鱼类胚胎发育的影响及其致毒的分子机制进行综述。

篇4：微囊藻毒素合成机理的研究进展

关键词：微囊藻毒素；单克隆抗体；间接竞争ELISA；检测

中图分类号： X17文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0340-04

我国是世界上藻灾最为严重的国家之一，藻毒素严重威胁居民饮水安全和食品安全。我国主要的淡水藻毒素是微囊藻毒素（microcystin，MC），微囊藻毒素是淡水蓝藻产生的一类生物活性物质，能够对人体多个器官产生危害，危害最严重的靶器官是肝脏，长时间低剂量接触MCs会导致肝损伤和诱发癌症[1-2]。有研究表明，我国肝癌多发区与当地水中高含量的微囊毒素有关[3-4]，MCs引发的急性肝中毒症状表现为肝细胞损伤、肝出血[5]。

预防藻毒素侵害最主要是保持水体清洁，防止藻类过量生长；同时，能够精确及时地检测毒素也是预防毒素污染的有效方法。我国淡水微囊藻毒素污染严重，但迄今为止尚没有一种较合适于现场使用的藻毒素检测方法，因此研制我国自主知识产权的检测淡水中微囊藻毒素的方法已成为当务之急。

藻毒检测方法主要有色谱检测、生物检测、细胞检测[6-8]，这些检测技术或是需要昂贵的仪器、或是需要较长的检测时间、或是准确率不够。与其他检测方法相比，酶联免疫法具有灵敏度高、特异性好、重复性高和检测准确快速的优点，在现场快速检测上具有开发前景，近年来在赤潮藻毒素快速检测方面得到重视和发展。笔者所在实验室在成功制备高效价MC-LR单克隆抗体的基础上，初步建立了检测 MC-LR 的间接竞争酶免疫学检测方法，为研制具有自主知识产权的相关检测试剂盒奠定了基础。

1材料与方法

1.1材料与试剂

微囊藻毒素单克隆抗体由笔者所在课题组研制；其他试剂均为国产分析纯。

1.2包被抗原的制备

用兔血清白蛋白（rabbit serum albumin，RSA）制备包被抗原MC-LR-RSA[9]，冰箱保存备用。

1.3抗原、抗体最佳稀释浓度的确定

在96孔ELISA板上，检测抗原按纵向排列，抗体按横向排列。检测抗原用包被缓冲液（pH值9.6，0.05 mol/L碳酸盐缓冲液）稀释为1 ∶1 000、1 ∶2 000、1 ∶4 000、1 ∶8 000这4个浓度，每浓度3个重复，每孔100 μL，4 ℃过夜；洗涤液后静置1 min，重复洗涤3次；用0.1% BSA（用包被液进行稀释）的封闭液进行封闭，每孔120 μL，37 ℃1 h，洗涤3次，拍干。

MC-LR抗体浓度调为7.5 mg/mL，用高纯水稀释成如下梯度浓度：0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、20 μg/L共11个点；依次加入酶标板上的1号至12号孔中，抗体体积为100 μL/孔，37 ℃温育后洗涤3次；加入HRP标记的羊抗鼠IgG，酶标二抗羊抗鼠IgG浓度选择为1 ∶6 000，每孔加入100 μL，37 ℃温育1 h，洗涤4次；显色液为TMB；终止液为 2 mol/L H2SO4。在酶标仪上测定D450 nm值，确定最佳包被抗原与抗体浓度。

1.4标准曲线的测定

根据“1.3”节所得到的最佳包被抗原浓度和最佳抗体稀释倍数，以及最佳二抗浓度，用标准系列稀释的MC-LR（0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、20 μg/L），按照间接竞争ELISA测定。采用n=3个平行试验，获得标准曲线。

1.5一抗最佳反应时间的确定

根据“1.3”节试验选取最佳的抗原、抗体稀释度，包被抗原浓度为0.5 μg/mL，对应的抗体稀释度为1 ∶20 000，作为ELISA的反应条件。将MC-LR标准品用高纯水配制成如下梯度浓度：0、0.2、0.5、1、2、4 μg/L，共6个点，进行标准曲线测定，每孔50 μL标准品；同时加入用PBS配制好的单抗溶液，每孔50 μL，放入37 ℃培养箱中温育，一抗反应时间设定为30、60、90 min 3个组，每组3个平行；二抗体反应时间固定为60 min。每个时间内标准曲线设置2个平行。反应结束后分别洗涤3次，拍干。

加二抗：酶标二抗采用HRP标记的羊抗鼠IgG，采用PBS稀释，每孔加入100 μL，37 ℃温育1 h，洗涤4次，拍干。

显色：加入新配制的底物液（TMB-H2O2），每孔100 μL，室温下固定反应10 min。测定D450 nm值，选择最佳一抗反应时间。

1.6实际水样的检测（准确度和精密度验证）

1.6.1水样的采集和预处理选取上海市不同来源的水样，包括饮用水、地下水、景观娱乐用水（游泳池和公园水样）以及地表水（城市河道水体）14个样品，每个水样采集体积为10 mL，对较混浊的样品采用0.45 μm的滤膜过滤。

1.6.2水样的添加-回收测定在14个水样中添加标准微囊藻毒素，每个样品毒素的最终浓度分别为0.2、0.5、1.0 μg/L ，共3个不同浓度。采用直接竞争ELISA测定样品中毒素含量，每个水样平行测定5次，根据标准曲线计算水样中MC-LR浓度。同时测定原水中的毒素含量，结果进行比较，并计算回收率。回收率的计算方法如下：每个样品平行测定5次，计算吸光度的平均值，样品添加浓度（最终浓度）用X表示，未添加标准品的样品测定平均值为x1，添加了标准品的样品测定平均值为x2，则回收率计算如式（1）。当原水样ELISA测定浓度超出本方法的检测限，即小于0.1 μg/L时，视为未检出，此时均按照x1=0计算回收率。

回收率=x2-x1X×100% 。（1）

1.7一致性检验

按照确定的ELISA标准曲线测试方法，对所包被的单条可拆酶标板，同一个人分3 d（2014年4月7—9日）进行同样的试验。

试验过程描述如下：包被抗原浓度为0.5 μg/mL，对应的抗体稀释度为1 ∶20 000，微囊藻毒素-LR标准品：0、0.2、05、1、2、4 μg/L共6个点，进行标准曲线测定，每孔50 μL标准品；同时加入用PBS配制好的单抗溶液，每孔50 μL，放入37 ℃培养箱中温育，时间60 min；每个标准品设置2个平行。反应结束后洗涤3次，拍干。加二抗：酶标二抗采用HRP标记的羊抗鼠IgG，采用PBS稀释，每孔加入100 μL，37 ℃温育1 h，洗涤4次，拍干。显色：加入新配制的底物液（TMB-H2O2），每孔100 μL，室温下固定反应10 min。终止：向每孔中加入50 μL的2 mol/L的硫酸溶液。测定：用酶标仪测定其在450 nm的吸光度D450 nm。

2结果与分析

2.1包被抗原和抗体最佳浓度的确定

本试验结果包被抗原浓度为0.5 μg/mL，对应的抗体稀释度为1 ∶20 000左右，可以作为ELISA良好的反应条件。酶标二抗工作稀释度为选择1 ∶6 000。

2.2标准曲线的绘制和分析

间接竞争ELISA的标准曲线如图1所示，误差线为n=3次平行试验的标准偏差，试验重复性良好，相对标准偏差（变异系数）均在10%以内。从图1可以看出，曲线呈现明显的反S形。

由标准曲线可以分析：（1） 半抑制浓度IC50=（0.81±0.05） μg/L。（2） 检测限。间接竞争ELISA的最低检测限LOD是结合率y=10%时所对应的目标物质的浓度，即LOD=0.10 μg/L；最高检测限HOD是结合率y=90%时所对应的目标物质的浓度，即HOD=8.00 μg/L。（3） 定量检测区间。靠近中点处（x0）的一段区间是线性的，称之为定量检测区间，间接竞争ELISA的定量检测区间是结合率为80%～20%所对应的目标物质的浓度区间，即LQD为0.20～4.00 μg/L。

2.3最佳一抗反应时间的确定

一抗反应30 min的结果（图2）表明，吸光度偏低，同时在较高浓度范围内，吸光度变化不是太明显，标准曲线有拖尾的现象。一抗反应60 min的结果（图3）表明，标准曲线线性较好，能满足实际检测的需要。

一抗反应90 min的结果（图4）表明，吸光度较高，说明反应充分；同时标准曲线的线性度也较好，也能满足实际检测要求。但是90 min相对来说时间较长，不推荐在实际操作中应用。

2.5一致性试验

试验结果（图5、图6、图7）表明，各标准曲线的斜率较为接近；吸光度虽然略有差异，但这应该是由试验过程中显色-终止时间的微小差异决定的，不可避免。总体来说，所建立的微囊藻毒素ELISA方法，一致性较好。

3讨论

微囊藻毒素目前已经分离出80多种异构体[10]，其中MC-LR是目前毒性最大、存在最广泛、研究最多的一种，也是我国最常见的微囊藻毒素种类[11]。目前MC-LR被定为检测微囊藻毒素污染的指标。为了降低MCs对人和水生动物的毒性及潜在危害性，世界卫生组织（WHO）推荐水中微囊藻毒素的安全指导值MC-LR是1 000 ng/L[12]。

常用的藻毒素检测方法是高效液相色谱法（HPLC）、免疫学法以及生物毒性法（MBA）。HPLC法精确灵敏，但需要复杂的设备和专业的操作人员；MBA法简单直观，但精确性和灵敏性较差。免疫学技术利用抗原抗体之间的特异性进行样品捕获和检测，被应用于检测领域后取得了显著的效果，具有快速、

灵敏、操作简单、不需要复杂仪器设备、价格低廉、便于制成可携带的检测纸板和试剂盒等优点，成为我国攻克藻毒素现场快速检测的首选方法。国际上已经有关于免疫检测技术在藻毒素检测的研究报道，并且已经制备出了部分藻毒素的ELISA试剂盒，如美国、日本、欧洲一些国家有微囊藻毒素（microcystin）[13-14]和软海绵酸（okadaic acid，OA）的ELISA检测试剂盒销售[15-16]，但价格昂贵，检测成本高，不适合大量样品的检测；近年我国也有学者研究藻毒素的免疫检测技术，如盛建武等将MC与BSA偶联制备免疫原MC-LR-BSA，用其研制的抗体建立的ELISA，最低的检测限为 10 ng/L[17]。赵晓联等采用人KLH作为载体制备免疫原MC-LR-KHL，其抗体建立的ELISA最低检测限为0.01 ng/mL[18]。

本研究选取我国典型微囊藻毒素（microcystin-LR）为研究对象，采用碳二亚胺缩合方法分别合成了毒素的完全抗原MC-LR-KLH，利用制备的单克隆抗体发展建立了有效的MC-LR间接竞争酶联免疫检测，最佳包被抗原浓度为 0.5 μg/mL，对应抗体稀释度为1 ∶20 000左右，酶标二抗工作稀释度选择为1 ∶6 000；检测区间LQD为0.20～4.00 μg/L，最低检测限LOD为0.10 μg/L，最高检测限HOD为8.00 μg/L，特异性较好。

应用该方法对4个加标水样进行检测，各水样原水均未检测出MC-LR（<10 ng/L），检测结果相对标准偏差均小于10%，与投加的标准MC-LR相关系数大于0.98，样品的回收率在综合回收率为（98.0±10.7）%。该ELISA方法准确度良好，精密度优良。

参考文献：

[1]许川，舒为群，曹佳. 我国水环境微囊藻毒素污染及其健康危害研究[J]. 癌变·畸变·突变，19（3）：202-205.

[2]隋海霞，严卫星，徐海滨，等. 武汉东湖微囊藻污染及其在鱼体内的动态研究[J]. 卫生研究，2004，33（1）：39-41.

[3]陈刚，俞顺章，卫国荣. 肝癌高发区不同饮用水类型中微囊藻毒素含量调查[J]. 中华预防医学杂志，1996，30（1）：6-9.

[4]张明东，俞顺章，梁任祥. 广西扶绥县原发行肝癌病例对照研究[J]. 中华流行病学杂志，1993，14（1）：14-17.

[5]俞顺章，赵宁，资小林. 饮水中微囊藻毒素与我国原发行肝癌关系的研究[J]. 中华肿瘤杂志，2001，23（2）：96-99.

[6]Poon G K，Griggs L J，Edwards C. Liquid chromatography-electrosprayionization-mass spectrometry of cyanobacterial toxins[J]. Journal of Chromatography，1993，628（2）：215-233.

[7]Mails M，Budde W L. LC/MS methord for the determination of cyanobacteria，toxins in water[J]. Analytical Chemistry，2004，76（5）：1342-1351.

[8]Quilliam M A，Wright J L C. The amnesic shellfish poisoning mystery[J]. Analytical Chemistry，1989，61（18）：1053-1059.

[9]盛建武，何苗，钱易，等. 微囊藻毒素-LR完全抗原的设计及制备[J]. 环境科学，2005，26（3）：33-37.

[10]An J，Carmichael W W. Use of a colorimetric protein phosphatase inhibition assayand enzyme linked immunosorbent assay for the study of microcystins and nodularins[J]. Toxicon，1994，32（12）：1495-1507.

[11]Shen P P，Shi Q，Hua Z C，et al. Analysis of microcystins in cyanobacteria blooms and surface water samples from Meiliang Bay，Taihu Lake，China[J]. Environ Int，2003，29（5）：641-647.

[12]WHO.Guidelines for drinking-water quality[R]. Geneva：World Health Organization，1998.

[13]Chu F S，Huang X，Wei R，et al.Production and characterization of antibodies against microeystin[J]. Appl Environ Miembiol，1989，55：1928-1933.

[14]McDermott C M，Feola R，Prude J.Detection of cyanobaeterial toxins（microcystins） in waters of northeastem Wisconsin by a new immuno-assaytechnique[J].Toxicon，1995，33：1433-1442.

[15]Tagmouti-Talha F，Moutaouakkil A，Taib N，et al. Detection of paralytic and diarrhetic shellfish toxins in moroccan cockles（Acanthocardia tuberculata）[J]. Bull Environ Contam Toxicol， 2000，65：707-716.

[16]Llamas N M，Stewart L，Fodey T，et al . Development of a novel immunobiosensor method for the rapid detection of okadaic acid contamination in shellfish extracts[J]. Anal Bioanal Chem，2007，389（2）：581-587.

[17]盛建武，何苗，余少青，等. 水体中微囊藻毒素-LR的间接ELISA检测[J]. 环境科学，2006，27（6）：1166-1170.

篇5：微囊藻毒素合成机理的研究进展

-对连年发生比较严重水华的官厅水库进行了2 a的浮游植物动态监测,并在206-8月应用酶联免疫吸附法检测了主要水华藻类--铜绿微囊藻藻毒素质量浓度及其季节变化,初步探讨了微囊藻毒素质量浓度与铜绿微囊藻细胞密度之间的.关系.实验结果表明,水库中的浮游植物细胞密度高,平均值为1 308.35×104 cells/L,年达1 599.49×104 cells/L,同时呈现出明显的季节变化,在夏末秋初形成高峰.产毒的铜绿微囊藻为夏季最主要的优势水华种类,其细胞密度在7月达到最高,为4 748.58×104 cells/L;微囊藻毒素的质量浓度在7月亦达到最高值,为20 μg/L,都显著高于6月和8月(p<0.05).水体中微囊藻毒素质量浓度与微囊藻细胞密度呈正相关关系(R=0.926).其结果为全面了解官厅水库水质状况以及对水污染进行治理,恢复其饮用水源的功能提供了科学依据.

作 者：张娟 梁前进 周云龙 包智泓 李启军 ZHANG Juan LIANG Qian-jin ZHOU Yun-long BAO Zhi-hong LI Qi-jun 作者单位：张娟,梁前进,周云龙,ZHANG Juan,LIANG Qian-jin,ZHOU Yun-long(北京师范大学生命科学学院,北京,100875)

包智泓,李启军,BAO Zhi-hong,LI Qi-jun(北京市水利科学研究所,北京,100044)

篇6：微囊藻毒素合成机理的研究进展

随着世界各国对微囊藻毒素的重视,中国也在相关水质标准里新增了微囊藻毒素这项指标.因此,水环境中微囊藻毒素的检测和控制变得非常重要,而检测更是控制的基础.比较详细地综述了目前国内外在微囊藻毒素检测方面的.各种不同的研究方法和成果;并在总结这些研究的基础上,展望了微囊藻毒素检测的发展方向.

作 者：盛建武 何苗 施汉昌 钱易 Sheng Jianwu He Miao Shi Hanchang Qian Yi  作者单位：清华大学环境科学与工程系,环境模拟与污染控制国家重点联合实验室,北京,100084 刊 名：环境污染与防治  ISTIC PKU英文刊名：ENVIRONMENTAL POLLUTION AND CONTROL 年，卷(期)： 28(2) 分类号：X5 关键词：水环境   微囊藻毒素   检测技术  

篇7：微囊藻毒素RR的制备及鉴定

以野外收集的水华蓝藻为原料,建立了以75%甲醇溶液提取、快速色谱和半制备色谱分离为主要步骤的微囊藻毒素分离纯化方法,并用HPLC、分光光度计和电喷雾质谱对所得毒素的纯度和结构进行了鉴定.结果表明,所得毒素为MCRR,纯度大于95%,其紫外吸收光谱在239nm处有特征吸收,分子组成为环(Ala-Arg-MeAsp-Arg-Adda-Glu-Mdha),分子量为1037.

作 者：陈晓国 肖邦定 徐小清 CHEN Xiao-guo XIAO Bang-Ding XU Xiao-qing  作者单位：陈晓国,CHEN Xiao-guo(武汉理工大学资源与环境工程学院,湖北,武汉,430070)

肖邦定,XIAO Bang-Ding(中国科学院水生生物研究所,湖北,武汉,430072;中国科学院研究生院,北京,100039)

篇8：微囊藻毒素合成机理的研究进展

1 微囊藻毒素结构与特性

微囊藻毒素 (MCs) 是一种具有生物活性的单环状七肽类干毒素, 其分子结构通式如图1所示, 其中, Adda侧链3-氨基-甲氨基-2, 6, 8-三甲基-10-苯基-4, 6-癸二烯酸是MCs表达生物活性必不可少的, 属于一种特殊β-氨基酸。2和4位的X、Y均为可变L-氨基酸残基, 在X、Y和Adda侧链甲基化、去甲基化等结构差异化中, 形成多种MCs及其异构体, 最为常见且毒性较大的是MC-RR、MC-LR[1]。

微囊藻毒素具有较好的水溶性, 水中溶解度大于1g/L, 可长期存在于15℃~30℃的富营养化水体中, 且不易沉淀或被吸附, 在甲醇、丙酮等溶液中也容易溶解;同时, MCs还具有较强的耐热性, 在300℃水温中, 依然可以稳定存在;另外, MCs对于蛋白质水解有较强抗性, 在阳光照射下依然保持稳定。

2 微囊藻毒素的物理控制法

2.1 活性炭吸附法

活性炭是一种良好的水处理剂, 能够有效吸附相对分子量在500~3000间的有机物, MCs的相对分子量为800~1100左右, 可以使用活性炭进行吸附, 从水中脱除出来。

根据相关研究表明, 不同原料制作的活性炭对MCs的吸附能力也有所差异, 中孔容积越大的, 吸附能力越强。在一般情况下, 活性炭对MCs的脱除率在30%~60%左右, 但由于活性炭本身工作周期较短、容易受到含藻水体中PH值、其它有机物等的干扰, 活性炭吸附的效果并不完全理想[2]。

在实际应用当中, 通常会将活性炭结合其他方法一起使用, 比如在活性炭结合Ti O2, 可以同时进行吸附与光催化氧化, 提高对MCs降解效果;活性炭结合生物降解可以延长活性炭工作周期, 加强对MCs的降解能力。

2.2 混凝沉淀法

混凝沉淀法是利用硫酸铝之类的混凝剂, 通过将水体中的蓝藻去除来控制MCs的方法, 但其本身对MCs去除率较低, 甚至在搅拌过程中, 会增强蓝藻释放MCs强度, 引起水体MCs浓度升高。

经实践表明, 使用氯化铁和硫酸铝作为混凝剂, 不会对藻细胞造成破坏, 能够完整地将大部分藻细胞去除, 且不会引起MCs浓度的增加;将混凝与沉降、过滤工艺一起使用, 可以起到去除藻细胞内MCs的效果, 比如使用硫酸铝混凝后, 经沉降与过滤后, 能够将96%的MCs脱除。

2.3 膜分离技术

膜分离技术是现代污染物分离常用的技术手段, 具有高效分离、浓缩、提纯和净化等功能。使用膜分离技术处理富营养化水域的MCs, 借助微滤膜或超滤膜, 可以将98%以上的藻细胞脱除, 对MCs的脱除效果也较好, 且藻细胞不会出现大量破坏, 水体MCs的浓度没有明显增加。如果将滤膜换成纳滤膜和反渗透膜, 藻细胞内、外MCs的脱除效率能够超过99.6%。

2.4 超声波法

超声波法是一种新型的MCs降解方法, 其优点在于操作简单、容易控制、能够实现自动化操作、无需引入其他物质造成二次污染、处理效率高、反映条件温和等。

超声波法对MCs的降解能力与声波辐射功率成正相关关系, 在功率115W、20k Hz时, 5min~6min时间段内可完成60%以上的降解, 但是, 这种正相关不是无限增大的, 在降解效果达到一定程度后, 就不会再有显著变化, 呈现出饱和趋势。

在实际应用当中, 经常会将超声波法与紫外线法联用, 利用紫外线能够缩短MCs半衰期的作用, 来强化超声对MCs的降解作用, 对MCs的脱除率在20min内能够达到88.7%。

3 微囊藻毒素的氧化降解法

3.1 化学氧化降解

顾名思义, 化学氧化降解就是通过利用化学氧化试剂, 来破坏MCs多肽环状结构将其转化为无毒或低毒小分子物质进而实现降解的方法, 常用的化学氧化试剂有双氧水、高锰酸钾和氯气、液氯等, 是当前应用较为成熟的一种技术。

在化学氧化降解中, 应用较为广泛的是氯处理技术, 在氯投放量足够、有余氯的条件时, 可以将大部分MCs降解, 其降解效果如图2所示。但由于氯化物容易与水体中有机物反应生成三氯甲烷等有害物质, 给其应用造成了一定限制[3]。

另外, 在各种化学氧化试剂中, 降解效果最佳的是臭氧, 但是, 由于臭氧的水溶性较差, 应用成本相对较高。

3.2 高级氧化降解

高级氧化降级是通过利用高活性的自由基, 比如-OH, 与大分子有机物反应取代其中部分结构, 造成有机物分子结构的破坏, 最终实现氧化降解有机物的目标, 紫外光条件下的化学反应和其它光化学新技术均属于此范畴, 有多相氧化和均相氧化之分, 主要有紫外线条件下直接光解UV, UV/H2O2、Ti O2光催化等。

其中, 以25℃、0.425m W/cm2UV254照射为条件时, MC-RR的半衰期是2min, 将UV254照射强度提升至0.85m W/cm2并持续60min, MC-RR可以被降解98.9%, 同时, MC-RR的降解并不会受到p H值的显著影响, 虽然在偏酸性条件下, MC-RR降解反应比中性、碱性条件略好。

使用Ti O2光催化技术降解Ti O2光催化, 在反应过程中, 通过-OH的作用, 可以断开Adda侧链中的共轭双键, 得到毒性较低的产物, 起到良好的降解效果, 将水中藻毒素有效去除。

3.3 光催氧化降解

在光照充足情况下, 利用色素处理MCs, 可以起到良好的光降解催化作用, 在2~6个星期中, MCs的浓度可以降低90%, 色素的浓度和种类决定着降解的效果。但是, 在纯水和自然光照条件下, MC-RR、MC-LR和MC-YR的浓度恒定不变, 加上腐殖质后, 浓度有了显著降低, 主要是由于腐殖质具有光敏剂的作用, 吸收波长在290nm-可见光范围内的阳光, 形成能够激发惰性污染物光化学反应的高反应性分子。

4 微囊藻毒素的生物降解法

生物降解法即微生物降解法, 具有安全性强、成本低、利于生态修复等优点, 对于富营养化水域微囊藻毒素的控制去除有着极为重要的意义。

微生物降解根据使用微生物种类的不同, 可以分为纯种菌降解和混合菌降解两种, 其中纯种菌降解是利用土壤和天然水体中某种能够改变或打开微囊藻毒素结构的特殊细菌, 包括铜绿假单胞菌、青苦菌等, 实现降低或降解MCs毒性目标。以鞘氨醇单细胞菌为例, 其对MC-RR、MC-LR的降解速率分别能够达到13mg/L/d和5.4mg/L/d;而食酸戴尔福特菌降解效能力更强, 初始浓度在90.2mg/L和39.6mg/L的MC-RR、MC-LR, 可以在两天内被完全降解[4]。

混合菌降解是针对单一菌降解效果局限问题提出的, 是通过将多种不同的菌种混合使用, 同时对微囊藻毒素进行降解, 提升降解效率的方法。

微生物降解法的基本原理是通过破坏MCs的Adda侧链双键, 打开MCs的环状结构使其变成线性结构, 然后借助微生物降解作用, 使线性结构降解成为短肽, 进而降低或消除MCs的毒性。但是, 微生物降解法也存在一定的不足, 容易受到p H、温度和溶解氧等因素的干扰, 影响到降解效率和效果。

5 结语

综上所述, 近些年来, 随着人们对环境污染重视程度越来越高, 科学技术快速发展, 对微囊藻毒素的研究也日益深入, 研究出了许多种控制去除的技术, 虽然这些技术在实际应用中还存在着一定局限性, 无法完全有效的将微囊藻毒素去除, 但可以通过对技术的综合运用来提高控制去除水平, 为人们的生命安全提供保障。

参考文献

[1]苏雅玲, 邓一荣.富营养化湖泊中微囊藻毒素及其控制去除技术[J].环境科学与技术, 2013, 06:62-66+84.

[2]邓方, 万新军.富营养化水体中微囊藻毒素的降解方法研究进展[J].巢湖学院学报, 2013, 03:61-65.

[3]孔赟, 徐向阳, 等.环境水体微囊藻毒素微生物降解技术研究进展[J].应用生态学报, 2011, 06:1646-1652.

篇9：微囊藻毒素合成机理的研究进展

微囊藻毒素含量与自然水体环境影响因子的相关性

摘要：研究了太湖流域湖州段、杭州市贴沙河和某水华池塘等自然水体的微囊藻毒素水平,利用相关性分析、主成分分析、聚类分析等统计方法,探讨了自然水体中微囊藻毒素MCLR和MCRR与环境影响因子的相关性.结果表明,3处水体的微囊藻毒素MCLR水平为0.049～12.30μg/L,MCRR为0.032～7.90μg/L,底层水中微囊藻毒素的含量显著高于表层水;水体中MCLR的`平均浓度与TN、NH4+-N、NO2--N和TP呈显著正相关(p＜0.01),与水温、DO和氮磷比呈显著负相关(p＜0.01),MCRR的平均浓度与NO3--N和氮磷比呈显著正相关(p＜0.01),与pH、DOC、高锰酸盐指数、光密度呈显著负相关(p＜0.01);TP和NO2--N是影响MCLR生物合成的主导因子,NO3--N和氮磷比是影响MCRR生物合成的重要因子;NO2--N和NO3--N可能分别是MCLR和MCRR生物合成中利用的主要无机氮源.作 者：张杭君    张建英    陈英旭    蕉荔    ZHANG Hang-jun    ZHANG Jian-ying    CHEN Ying-xu    JIAO Li  作者单位：张杭君,张建英,陈英旭,ZHANG Hang-jun,ZHANG Jian-ying,CHEN Ying-xu(浙江大学环境与资源学院,杭州,310028)

蕉荔,JIAO Li(杭州市环境监测中心站,杭州,310007)

期 刊：环境科学  ISTICPKU  Journal：CHINESE JOURNAL OF ENVIRONMENTAL SCIENCE 年，卷(期)：2006, 27(10) 分类号：X131.2 关键词：微囊藻毒素    环境因子    淡水水体   

篇10：微囊藻毒素合成机理的研究进展

改性淀粉絮凝去除铜绿微囊藻及其机理初探

选取水体富营养化中最为常见、难去除、危害大的.铜绿微囊藻为除藻处理对象,研究了以天然高分子淀粉通过丙烯酰胺与二甲基二烯丙基氯化铵接枝共聚改性,制备除藻絮凝剂,研究其对铜绿微囊藻除藻效果.实验结果表明,淀粉接枝共聚物对含藻水体有较好的治理效果,并初步分析了淀粉接枝共聚物对藻细胞的絮凝机理.

作 者：施国键 乔俊莲 王国强 张普 Shi Guojian Qiao Junlian Wang Guoqiang Zhang Pu  作者单位：施国键,王国强,张普,Shi Guojian,Wang Guoqiang,Zhang Pu(同济大学化学系,上海,92)

乔俊莲,Qiao Junlian(同济大学环境科学与工程学院,上海,200092)

刊 名：河南科学  ISTIC英文刊名：HENAN SCIENCES 年，卷(期)： 27(6) 分类号：O636.1+2 X52 关键词：铜绿微囊藻   淀粉   改性   絮凝机理  

篇11：纳米银抑制铜绿微囊藻的机理研究

关键词：铜绿微囊藻,纳米银,丙二醛,实时荧光定量PCR

0引言

由于人类的活动造成的淡水富营养化而导致的水华已成为世界性的环境问题[1,2]。在欧洲、非洲、 美洲等淡水湖泊都受到了不同程度的富营养化影响, 蓝藻暴发日益频繁严重; 在中国的太湖、滇池、巢湖等淡水湖近 几年也常 暴发严重 的水华,尤其是太 湖[1,3]。水华暴发会导致水生态系统崩溃,水生生物窒息而死[1]。铜绿微囊藻是水华中的优势菌,有些种类的铜绿微囊藻能产生藻毒素,被微囊藻毒素污染的水能导致鱼类、家畜死亡,使人致病[4]。因此,研究一种杀灭铜绿微囊藻的有效方法已经成为亟待解决的问题。另外,由于抗生素的过度使用,大量种类细菌对抗菌试剂产生了耐药性[5,6],纳米银具有成为新型抗菌及藻类药物的潜力[6]。因此,纳米银的抗菌机制需要深入研究,以利于更好地用于药物开发。

单凤娟等[7]在测定经纳米银处理的铜绿微囊藻中叶绿素a的含量,指出当培养基中的纳米银浓度大于或等于9. 825mg /L时,铜绿微囊藻的叶绿素a合成完全被抑制,藻细胞随着纳米银浓度增大而减少; 扫描电镜结果显示被纳米银作用后的铜绿微囊藻,细胞呈不规则形状,有的呈裂解状态。但仅通过检测叶绿素a含量变化,并不能阐明纳米银抑制叶绿素a的合成及铜绿微囊藻生长的机理,因为叶绿素a的含量受多种因素的影响。叶绿素a含有共轭的不饱和双键结构,极易发生羟基自由基反应,也易发生氧化、分解等生化反应[8,9,10,11]。最新实验证明纳米银诱导的自由基可以破坏细菌细胞壁、细胞膜等成分[12,13],纳米银也能吸附于细胞膜并进入细胞内,进而杀死细胞[14]。本研究检测了纳米银对铜绿微囊藻的细胞膜、基因组及叶绿素a合成基因表达量的影响,初步揭示了纳米银抑制铜绿微囊藻的生化和分子生物学机理。

1材料与方法

1.1材料

1. 1. 1实验材料: 铜绿微囊藻Microcystis aeruginosa FACHB - 905 ( 购自中国科学院水生生物研究所 ) ; BG11培养基培养,置于光照培养箱 ( 模拟日 - 夜光照强度t光: t暗= 12h: 12h) 中培养,温度28℃ 。

1. 1. 2试剂: 纳米银( 1g / L,由宇辰新能源材料科技无锡有限公司提供) ; 琼脂糖 ( Biowest,西班牙进口) ; Bacterial DNA Kit( Omega) ; Trizol、Prime ScriptTMRT reagent Kit with g DNA Eraser,( Ta KaRa,大连宝生物工程有限公司) ; 丙二醛( MDA) 测试盒( 南京建成生物工程研究所) ; 其他化学试剂为分析纯,国药集团。

1. 1. 3仪器: 光照培养箱( GZX - 250BS ,上海新苗医疗器械制造有限公司) ; 超声破碎仪( JY92 - 2D宁波新芝 科器研究 所 ) ; 紫外可见 分光光度 计 ( WV8500,上海光学仪器有限公司) ; 冷冻离心机( H - 1850R,长沙湘仪离心机仪器有限公司) ; 立式压力蒸汽灭菌锅( YXQ - LS - 50SII ,上海博讯实业有限公司医疗设备厂) ; 凝胶电泳仪( 北京六一) ; 凝胶成像仪( SYNGENE,G - Box) ; 7500型实时荧光定量PCR仪( ABI,USA) 。

1.1.4培养基

BG11培养基[7]。

1.2方法

1.2.1细胞膜氧化产物丙二醛含量测定实验

将2瓶铜绿微 囊藻培养 至对数期 ( OD650= 0. 588) ,向一瓶中加入纳米银至浓度为10mg / L,另一瓶作为对照,在光照培养箱中继续培养过夜( 12h) 。 用Bradford法测定铜 绿微囊藻 细胞中蛋 白质浓度[15]。用丙二醛( MDA) 测试盒测试2瓶中铜绿微囊藻细胞膜受氧化情况,每组实验平行做3次重复。 最后计算丙二醛浓度。

1.2.2铜绿微囊藻基因组提取及电泳检测实验

将2瓶铜绿微 囊藻培养 至对数期 ( OD650= 0. 514) ,向一瓶中加入纳米银至浓度为10mg / L,另一瓶作为对照,在光照培养箱中继续培养过夜( 12h) 。 取5ml藻液,离心,取藻细胞。用E. Z. N. A.TMBacterial DNA Kit提取铜绿微囊藻基因组DNA。用琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组结果。

1.2.3检测铜绿微囊藻叶绿素a合成基因表达情况实验

因实验所用的铜绿微囊藻Microcystis aeruginosa FACHB - 905的叶绿素a合成基因还未报道,在Cyano Base网站上查找Microcystis aeruginosa NIES - 843的叶绿素a合成相关基因,从Genbank上找出一致性较高的原核蓝藻的叶绿素a合成相关基因,用DNAstar软件进行序列比对,根据保守区,运用primer 5. 0设计引物。用铜绿微囊藻基因组为模板,进行PCR反应,检测所合成引物在铜绿微囊藻中是否能扩增出相应的基因片段,并送上海生工测序。实验最终设计的引物为不依赖光的原叶绿素酸酯还原酶铁蛋白亚基编码基因chl L( Light - independent protochlorophyllide reductase iron protein subunit chl L) :

LC1 5’- GGAAAAGGTGGTATTGGTAAATC - 3’;

LC2 5’- GCAGGAGGTCCACCAGCTTC - 3’。

退火温度为56℃。该基因表达产物为原叶绿素酸酯还原酶的一个亚基。原叶绿素酸酯还原酶和其它几种酶共同催化原叶绿素酸酯还原为叶绿素酸酯a( 见表1)[16]。

扩增内参16S r DNA引物:

Eub341F 5’- CCTACGGGAGGCAGCAG - 3’;

Eub534R 5’- ATTACCGCGGCTGCTGGC - 3’。

退火温度56℃,片段195 bp左右。

将2瓶铜绿微 囊藻培养 至对数期 ( OD650= 0. 544) ,向一瓶中加入纳米银至浓度为10mg / L,另一瓶作为对照,在光照培养箱中继续培养过夜( 12h) 。 取10ml藻液,离心,取藻细胞。用Total RNA提取试剂盒提取铜绿微囊藻总RNA。用提取的总RNA进行逆转录反应,得到产物c DNA。用c DNA为模板,用引物LC1、LC2进行实时荧光定量PCR反应( SYBR Green Assay) ,每次设2个平行重复,共重复做3次。 用比较CT法( 2﹣ΔΔCt法) 进行相对定量[17],内参为16S r DNA。

2结果与分析

2.1细胞膜氧化产物丙二醛含量测定

当将铜绿微囊藻培养至第6d,吸光度OD650为0. 279时,进入对数生长期。见图1铜绿微囊藻生长曲线。

直接取铜绿微囊藻培养液进行超声破碎后检测MDA浓度,或者离心出除去培养液,用蒸馏水悬浮藻细胞后超声破碎检测再检测MDA浓度。从图2中可看出,相对于未经纳米银作用的铜绿微囊藻,经纳米银作用后的铜绿微囊藻无论是在细胞中还是在培养液中,MDA含量都较高。经纳米银作用后,铜绿微囊藻细胞膜或细胞内的不饱和脂肪酸确实被氧化了。 这一结果可能是纳米银产生的活性氧而造成的。纳米银可以产生活性氧,而活性氧已被证明可以通过氧化细胞 膜中的不 饱和脂肪 酸而损坏 细胞膜[12,13,18,19,20,21]。细胞膜的损毁可改变其对物质的通透性,干扰光合作用链与呼吸链及其它生命活动,进而导致细胞的死亡。

2.2铜绿微囊藻基因组的电泳检测

提取经纳米银作用后的铜绿微囊藻的基因组,电泳检测呈现smear( 见图3) 。添加纳米银12h,铜绿微囊藻基因组显示明显断裂。说明纳米银的作用导致了铜绿微囊藻基因组的断裂。具体作用原因可能是纳米银通过产生的活性氧损毁铜绿微囊藻细胞膜, 接着进入细胞直接吸附于基因组,导致基因断裂,或活性氧的作用使基因断裂,或者是两者的共同作用。 细胞基因组断裂使其不能完成正常的生命活动,导致细胞死亡。

2.3铜绿微囊藻叶绿素a合成相关基因chlL表达水平

对照组与实验组在PCR 40个循环后的熔解曲线均为单一 峰值,可知PCR扩增特异 性较高。以Eub341F、Eub534R为引物扩增的16S r DNA片段熔解曲线峰值出现的温度较低,以LC1、LC2为引物扩增的叶绿素a合成基因片段熔解曲线峰值出现的温度较高,如图4所示。扩增的16S r DNA片段约为195 bp,扩增的叶绿素a合成基因DNA片段约为250bp。此结果与该PCR产物的电泳结果一致,均为单一条带。

实时荧光定量PCR分析结果表明未经纳米银作用的铜绿微囊藻不依赖光的原叶绿素酸酯还原酶铁蛋白亚基chl L基因表达量与经纳米银作用后的表达量的 ΔΔCt为10. 849,2﹣ΔΔCt法进行相对定量,经纳米银处理组( Ag) 的叶绿素a基因表达水平与未经纳米银处理组( control) 叶绿素a基因相对表达量存在明星的差异。经纳米银作用的chl L基因表达量显著下降,纳米银干扰了该基因的表达( 图5) 。

M,marker: λ - Hind Ⅲ digest; 1,经纳米银处理 12h 后的铜绿微囊藻基; 2,未经纳米银处理的铜绿微囊藻基因组。M,marker; λ - HindⅢ digest; 1,genome of Microcystis aeruginosa exposed to SNPs for 12 hours; 2,genome of Microcystis aeruginosa without exposure to SNPs.

检测铜绿微囊藻叶绿素a合成基因表达情况的实验结果较好地显示,经纳米银作用12h后的铜绿微囊藻叶绿素a合成基因———不依赖光的原叶绿素酸酯还原酶铁蛋白亚基chl L基因( Light - independent protochlorophyllide reductase iron protein subunit,chl L ) 表达量显著下降,结果表明纳米银干扰了该基因的表达。其具体作用方式可能同在检测铜绿微囊藻基因组变化情况的实验所得的结果一样,由于纳米银的作用,使该基因断裂,或者可能是纳米银作用于复制或转录该基因的酶等因子而阻止了该基因的表达。

3讨论

纳米银对细菌、真菌、甚至一些病毒等的抑制作用已是公认的,但纳米银对这些微生物的抑制机理还在研究中。纳米银与细菌的相互作用有三种主要的假说: a、释放银离子,银离子使细胞产生ROS,破坏细胞膜与膜蛋白; b、与细胞膜蛋白相互作用,影响它们的正常功能; c、直接进入细胞内部,使细胞内产生ROS并释放银离子,损毁DNA[18]。有实验证明纳米银诱导的 自由基可 以破坏细 胞壁、细胞膜等 成分[12,13],纳米银也能吸附于细胞膜并进入细胞内,进而杀死细胞[14]。也有人证明纳米银对细胞的毒性主要是损失细胞膜、诱导氧化应激、引起DNA损伤、诱发细胞凋亡等[19,20,21]。Anda R Gliga发现肺组织细胞DNA经纳米银作用24h后受到了严重的损毁,但没有检测到活性氧的产生[22]。谢小宝等用透射电镜观察了经纳米银处理过的大肠杆菌,指出纳米银可在大肠杆菌细胞壁上形成小孔,并通过小孔进入细胞后使DNA呈浓缩状态; 同时也指出,纳米银破坏了细胞膜,并且浓度增大时也会增加对大肠杆菌DNA降解程度[23]。上述不同结果可能是实验所用纳米银浓度、粒径、作用时间及作用对象等的不同而造成的。 纳米银的抗菌活性与其作用浓度、大小、形状、结晶度等,以及所在溶剂的各种性质有关[18]。在亚微摩尔浓度,纳米银释放的银离子可以进入细胞,与细胞内蛋白的巯基反应,导致ATP合成与氧化作用解耦联, 降低质子动力,干扰磷酸化系统; 在毫摩尔水平,纳米银可导致细胞膜与细胞质分开,使细胞释放内含物并使DNA凝聚,降低复制能力,细胞产生的ROS可导致氧化应激,使膜质与DNA受损,最后,纳米银使细胞膜通透性增加,进入细胞内部,受到上述所阐述的假说的一种或多种影响[18]。我们实验也印证了纳米银作用后铜绿微囊藻的细胞膜受到了一定程度的氧化,基因组DNA降解成小的片段。

篇12：微囊藻毒素合成机理的研究进展

关键词：富营养化,微囊藻毒素,水、鱼样品,污染调查

三峡水库上至重庆市江津区下至湖北省三斗平全长660多km,它集防洪、发电、通航、旅游观光为一体,是目前世界上最大的人工湖,水域面积上千平方公里。三峡成库以后,库区江面变宽,江水变缓,库区水体自净能力降低,水质污染加剧。为了解库区水体富营养程度与水中鱼体内Mc-Lr污染现状,我们于2010年9月对三峡库区(涪陵、丰都、万州、巫山等段面)开展了水及鱼、鸭Mc-Lr污染调查。

1 材料与方法

1.1 采样点布设和样品采集

1.1.1 采样点布设

选择三峡库区涪陵、丰都、万州、巫山等4区县江面为采样点。

1.1.2 样品的采集

水和鱼样的各采集点在当地渔民的协助下,用中国科学院水生生物研究所生产的有机玻璃采水器采集0.5 m以下的长江水样1 000 ml,经混匀后转入100 ml瓶中[1]。同时在各采样点附近购买渔民捕捞的不同品种长江鱼(白鲢、草鱼、鲤鱼)均为1 500~2 000 g左右,鲫鱼为200 g左右,取样后,将水及鱼样置于冰中保存,及时送回实验室,放-20℃冰箱中冷冻保存,待检。鸭样的采集:在上述各采样点分别购买农民饲养的池塘鸭3只以上,重量均约2 000 g,经宰杀后,分别取肌肉、肝脏样置冰中保存,送实验室-20℃冰箱中待检。

1.2 水样中Mc-Lr的测定

水样经0.45μm水系滤膜过滤后,采用中国科学院水生生物研究所生产的Mc-Lr酶联免疫吸附试剂盒(ELISA)法直接测定,详细操作见试剂盒说明书。

1.3 鱼、鸭(肌肉、肝脏)样品处理及测定[2]

取经捣碎的鱼、鸭(肌肉、肝脏)样品1.000 g于50 ml具塞三角瓶内,加80%甲醇10 ml,置振荡器上振摇提取30 min,将甲醇提取液转入离心管中,以8 000 r/min(离心半径=14.5 cm)离心10 min;重复提取3次,合并离心上清液,置旋转蒸发器中浓缩至10 ml,再次以8 000 r/min离心15 min。取10 ml甲醇加入sep-pak Cl8柱内进行活化,加20 ml超纯水洗涤柱子,然后将提取浓缩液转小柱中过滤,用10%甲醇15 ml洗涤柱子,再用0.1%TFA甲醇溶液解析,收集解析液于30 ml烧杯中并置75℃水浴中挥干甲醇溶液,加入超纯水洗涤烧杯并调节p H至中性,转2 ml具塞刻度试管中,根据样品Mc-Lr含量高低定容至一定体积;Mc-Lr含量测定采用ELISA法。

1.4 统计分析

采用SP 12.0进行统计分析。

2 结果

2.1 水、鱼、鸭样品中Mc-Lr检测结果

由表1可见,各采样点水样中均可检出Mc-Lr,结果均值分别为0.197、0.107、0.157、0.086μg/L,其中涪陵段面检出值最高,万州段面次之,丰都和巫山段面最低,涪陵段面Mc-Lr是巫山的2.3倍,差异有统计学意义(t=8.724,P<0.01)。尽管各采样点均受到了一定污染,但污染较轻,按国家生活饮用水卫生标准《GB 5749-2006》推荐值1.0μg/L,各采样点水样检出值也相差5~10倍。

涪陵、丰都、万州和巫山等各采样点附近鱼(肌肉)样品中均检出Mc-Lr,其中丰都和巫山采样点最低,为0.244和0.197μg/kg;万州次之,为0.270μg/kg;涪陵最高,为0.569μg/kg。涪陵与巫山比较,差异有统计学意义(t=4.845,P<0.01),显示鱼(肌肉)样品中Mc-Lr含量与水体富营养化程度有关。

涪陵、丰都和万州3个点鸭(肌肉)均检出Mc-Lr,其中万州最低,丰都次之,涪陵最高。仅管各采样点鸭(肌肉)样品受到不同程度的污染,但总体含量均不高。

各采样点鱼、鸭肝脏样品中Mc-Lr均高于肌肉样品,且鱼肝脏样品是鱼肌肉样品的1.5倍左右;鸭肝脏样品是鸭肌肉样品的1.5~4.0倍,差异有统计学意义(t=3.216,P<0.05)。2.2不同品种鱼样品中Mc-Lr检测结果表2可见,各采样点不同品种鱼样品中Mc-Lr含量不同,鲫鱼最低,草鱼和鲤鱼次之,白鲢最高,白鲢鱼(肌肉)是鲫鱼(肌肉)的2倍,差异有统计学意义(t=2.762,P<0.05)。显示不同品种鱼对Mc-Lr的富集量不同。

3 讨论

我们对三峡库区涪陵、丰都、万州和巫山等长江段面开展了水体Mc-Lr污染调查,由表1可见,各监测段面水体均检出McLr,其中涪陵和万州监测段面水体中Mc-Lr含量高于丰都和巫山2个段面,原因是涪陵、万州2采水点位于长江回水区域,而丰都及巫山2段面位于长江主干区,回水区域江水相对保持静态,且受各种污染源的污染,加之江面漂浮物的堆积,水体营养成分增加,使水体藻类等浮游生物的繁殖,造成水体Mc-Lr含量高于丰都及巫山段面。显示三峡库区水体受到不同程度Mc-Lr污染,但污染程度较轻。尽管目前认为饮水Mc-Lr污染对人体健康危害影响较大,但本次对三峡库区所设的4个监测点水体中Mc-Lr均不高,按涪陵监测点最高值0.197μg/L计,仅占国家生活饮用水卫生标准《GB 5749-2006》1μg/L的1/5,按人体饮水量最大值为2 L/d,照此推算,每天就直接饮用2 L长江水,也才摄入0.4μg左右:况且源水经严格的制水工艺处理后,饮用水中Mc-Lr含量更低,对此通过人体饮水中Mc-Lr接触产生的危害是有限的,就目前三峡库区水体作为生活饮用水源仍然较安全。

调查结果显示,本次所设库区4个段面采样点附近购置的鱼样中均检出Mc-Lr,仍以涪陵和万州高于丰都及巫山段面,不同种类的鱼样Mc-Lr含量不同,鲫鱼最低,草鱼和鲤鱼次之,白鲢最高,这与各段面水体监测结果基本一致,几种鱼样Mc-Lr富集量高低也符合不同鱼种的生活习性。尽管各段面捕获鱼样受到了不同程度Mc-Lr污染,但总体含量均不高,在目前国家尚无鱼类食品中Mc-Lr卫生标准,如果按人体一次最大进食量1 000g计,以涪陵最高平均检出值0.569μg/kg推算,食用三峡库区鱼,每次摄入Mc-Lr量也才0.6μg左右,仅占国家生活饮用水卫生标准1μg/L的60%;与水源较差的池塘中鱼样结果比较,相差1.92倍[3],且三峡库区鱼业资源有限,加之库区人的饮食习惯不是食用鱼类食品为主,即使偶尔食用含量较低鱼食品,对人群健康产生的危害也有限。

参考文献

[1]蒲朝文,韩林,封雷,等.重庆市涪陵区城乡饮用水中微囊藻毒素的污染[J].环境与健康,2007,24(3):153-155.

[2]蒲朝文,封雷,李恒.鱼、鸭样品中微囊藻毒素含量测定方法研究[J].职业与健康,2010,26(8):865-866.