蛋白质的PEG化学修饰

自20世纪50年代以来蛋白质空间结构和生物学性质功能关系的开展, 使得蛋白质化学修饰研究逐渐成为热点[1]。至20世纪70年代后期, PEG蛋白质化学修饰已有很多报道[2,3]。例如Abuchowski的研究[4]表明:聚乙二醇 (polyethylene glycol, PEG) 修饰的蛋白质作为药物比未修饰蛋白质有效得多。此后, 蛋白质的PEG修饰进入了飞速的发展时期。

1 化学修饰原理

蛋白质的PEG修饰主要包括:蛋白质分子的侧链基团的改变和蛋白质分子中主链结构的改变两个方面。关于侧链基团修饰的研究较多。化学修饰反应的活性和选择性主要由蛋白质功能基的反应活性及修饰剂的反应活性决定[5]。其中蛋白质功能基的活性由微区极性和空阻效应决定。修饰剂的反应活性主要取决于修饰剂分子中官能团的类型。

2 化学修饰方法

PEG修饰的基团主要是氨基、巯基和羧基等。现已获得一些PEG定向修饰蛋白质的方法。下面主要介绍常用的一些方法。

2.1 氨基修饰

蛋白质分子表面的游离氨基 (主要为Lys残基侧链的氨基) 具有较高的亲核反应活性。因此Lys残基的氨基成为最方便, 最常用的被修饰基团。PEG的分子量大多为5k D。目前最常用的活化剂有氰尿酰氯 (亦称三聚氯氰) (见图1) 和N-羟基琥珀酰亚胺 (见图2) 。

(1) 氰尿酰氯法特点是试剂易得、活化简单、反应时间短、方便经济。但其对有些酶 (例如:SOD) 的活性有影响。这种活化中间物有两种形式:一种是一分子氰尿酰氯与一分子PEG偶联 (PEG1) ;另一种是一分子氰尿酞氯与两分子PEG偶联 (PEG2) 。通常PEG2修饰的蛋白质效果要更好。它可以在较低的修饰程度下获得解除免疫原性产物, 而且生物活性保留明显高于PEG1修饰的产物。

(2) 在p H=7~9条件下, P E G的N-羟基琥珀酰亚胺酯类化合物可以直接修饰残基上的氨基。将PEG上的羟基转化为羧基, 其中最常用的是通过羟基与琥珀酸酐反应所得衍生物化合物为PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯[6]。

此外, N-末端氨基修饰也是一种常用的修饰方法。蛋白质N端氨基的p Ka (7.6~8.0) , 小于蛋白质其他部位的氨基 (如赖氨酸的p Ka为10.0~10.2) 。因此, 在较低p H值 (如p H 5.0) 溶液中, PEG-醛主要与N-端氨基反应生产希夫碱, 后被还原为仲胺。

2.2 巯基修饰

蛋白质上的修饰基团多为亲核性的其活性的顺序是:巯基>α-氨基>ε-氨基>羟基。所以可以选取能够特异性PEG修饰剂对数目稀少巯基进行定向修饰。此类PE G修饰剂主要有:

(1) PEG-马来酰亚胺 (PEG-maleimide) (见图3) ;

(2) P E G-邻-吡啶-二硫醚 (P E G-o r t h o-p y r i d y l-d i s u l p h i d e) ;

(3) PEG-乙烯基砜 (PEG-vinyl sulfone) ;

(4) PEG-碘乙酰胺 (PEG-idoacetamide) 。其中, PEG-马来酰亚胺应用较多。但产物在水中不够稳定, 容易发生开环反应。Winslow[7]等在PEG与马来酰亚胺之间添加芳香环作连接基团, 并用来修饰血红蛋白质, 取得了更佳的修饰专一性。

对于缺少巯基的蛋白质, 可以通过基因工程在蛋白质的合适位置引入巯基, 再用相应PEG进行修饰。常用的引入位置有糖基化蛋白质的糖基化位置、蛋白质的抗原决定簇和蛋白质末端等。此外, 还可用Traut试剂处理蛋白质引入巯基。此方法方便可靠, 目前应用最为广泛。但缺点是半胱氨酸在蛋白质内多为重要活性基团。因此这样修饰有可能影响活性。

2.3 羧基的修饰

把PEG分子中的羟基转化为氨基, 然后在羧二亚胺存在下与蛋白质的羧基缩合, 得到修饰的蛋白质 (见图4) 。

对蛋白质进行修饰时, 关键是修饰剂的选择和修饰路线的确定。修饰路线的确定, 要考虑使修饰蛋白质能最大限度地保留原来生物活性, 要能使其免疫原性降至最小程度, 甚至完全解除, 其中最佳修饰度的确定非常重要。修饰剂的选择要考虑其结构与性质, 还要考虑其分子量大小。所以这两方面的选择是很重要的。

3 展望

PEG修饰的研究新方向集中在以下几个方面:

(1) 增强PEG和蛋白质连接基团的稳定性。

(2) PEG上可与蛋白质连接的新的活性基团。

(3) 新的连接技术和避免反应中药物生物活性的损失上[8]。随着PEG修饰化学的高速发展以及多种PEG衍生物的商品化、PEG修饰蛋白质药物的陆续上市, 可以预测药物的PEG修饰研究将得到越来越广泛的重视。

摘要：目的蛋白、多肽等药物分子免疫原性和毒副反应的存在及体内作用时间短等问题限制了其应用, 这可以通过化学修饰部分或全部加以克服。随着蛋白质构效关系的揭示, 蛋白质的化学修饰的研究飞速发展。此文对蛋白质、多肽等药物分子化学修饰的国内外研究进展和发展方向加以评述。

关键词：蛋白质,多肽,化学修饰,聚乙二醇

参考文献

[1] 王琳芳, 杨克恭.蛋白质与核酸[M].北京:北京医科大学, 中国协和医科大学联合出版社, 1999:1～18.

[2] Kodera Y, Matsushima A, Hiroto M, et al.Pegylation of proteins andbioactive substances for medical and technical applications[J].ProgPolymer Sci, 1998, 23:1233～1271.

[3] Inada Y, Furukawa M, Sasaki H, et al.Biomedical and biotechnological ap-plications of PEG～modified proteins[J].Trends Biotechnol, 1995, 13:86～91.

[4] Abuchowski A, Van ET, Palczuk NC, et al.Alteration of immunological prop-erties of bovine serum albumin by covalent attachment of poly (ethylene glycol) [J].J Biol Chem, 1977, 252:3578～3581.

[5] 陶慰孙, 李惟, 姜涌明.蛋白质分子基础[M].北京:高等教育出版社, 1995:122～157.

[6] 王艳强, 等.蛋白质的化学修饰研究进展[J].现代化工, 2001, 21 (8) :25～28

[7] Manjula BN, Tsai A, Upadhya R, et al.Site～specific PEGylation of hemoglo-bin at Cys293 (beta) :correlation be-tween the colligative properties of the PEGylated protein and the length of the conjugated PEG chain[J].Bioconjug Chem, 2003, 14 (2) :464～472.

[8] 姜忠义, 高蓉, 许伟松, 等.药物蛋白的聚乙二醇修饰[J].中国药学杂志, 2002, 37 (6) :409～412.