猪伪狂犬病病毒

猪伪狂犬病病毒（精选十篇）

猪伪狂犬病病毒 篇1

1 临床症状

哺乳仔猪在出生后2~3 d发病, 腹泻日龄早, 最早可在1日龄。表现为肌肉震颤, 精神沉郁, 吮乳无力、, 流涎、眼睑水肿共济失调、呕吐、水样腹泻、消瘦, 黄色稀粥样粪便, 无恶臭味, 无过多的气泡, 未见眼观的血液成分。未见传染性胃肠炎样水样腹泻。呕吐物为黄白色凝乳块与胃液, 腹泻前多呕吐, 腹泻开始呕吐停止。发病1~2 d后, 病猪口吐白沫、磨牙、呆立或盲目行走, 抽搐、癫痫、角弓反张, 最后死亡, 往往全窝无一幸免, 病程约4~5 d。

2 流行病学

腹泻多发生于哺乳仔猪, 连续多批次发生, 发病率为50%~100%, 按病毒性腹泻或细菌性腹泻治疗死亡率80%~100%。其他猪均不发生, 产房的卫生管理与平时相同, 找不到相关原因, 同样也找不到外源性疾病传入的迹象, 主要发生在中、小猪场。不分季节, 四季均有发生, 但是以冬春多发。

3 病检变化

小肠、大肠黏膜有轻度至中度充血或出血, 肠壁不同程度变薄, 肠内容物呈稀粥样黄白色, 无特殊恶臭味, 部分病例无肠内容物;肠黏膜皱褶减少乃至消失, 肠系膜淋巴结髓样肿或轻度出血, 胆囊萎缩、内无胆汁, 或胆囊肿大壁薄, 内有不等的黄色至褐色稀薄胆液;肾脏肿大, 肾包膜时多有包膜纤维深入肾皮质而不易剥离, 肾上腺双侧性肿大, 皮质髓质有不同程度出血;心肌松软色淡, 心脏横径增大, 冠状脂肪呈胶冻样浸润, 其它脏器难见大体病变。部分病例剖检可见典型伪狂犬病病变或者猪瘟病变。

4 治疗效果

在感染本病的猪场, 一旦发现疑似猪伪狂犬病病毒感染引起的以哺乳仔猪为主的腹泻, 立即使用猪用转移因子10头/支 (大连三仪) +猪伪狂犬病疫苗1头份 (南京天邦) , 同时配合内服补液盐。通过对多批次哺乳仔猪的对比治疗, 总有效率达95%以上, 取得较好的治疗效果。

5 预防措施

市猪伪狂犬病净化实施方案 篇2

为做好猪伪狂犬病净化工作，探索猪伪狂病有效净化方案，特制定本方案。本方案将依据第一次全群使用的疫苗和监测结果而修改。

一、工作内容和目标

1、工作内容：通过采取检测-淘汰-监测-净化措施，2012～2014该场种猪每半年进行1次猪伪狂犬病血清学检测，对野毒感染抗体阳性猪进行扑杀或淘汰，对假定阴性猪群实施高密度普免，同时加强消毒和提高管理水平。

2、净化标准：无猪伪狂犬病临床病例，免疫抗体阳性率达100%以上，连续两年种猪伪狂犬病野毒抗体5%抽样检测和猪场（站）95%自检没有病原检出后，对种猪群连续进行100%、50%比例的检测，均没有猪伪狂犬病野毒感染抗体检出，视为达到净化标准。

3、净化目标：通过实施种猪净化，到2014年，使净化场达到猪伪狂犬病净化标准。

二、实施进度安排

2012年：全场猪实现100%监测，并对监测阳性猪进行淘汰。2013年：全场猪实施猪伪狂犬病免疫，并进行监测。

2014年：继续进行猪伪狂犬病监测，在年底时进行项目总结。1

2013年11月初到2013年12月底，自下而上进行工作总结，开展绩效评价，进行项目总验收，完成验收总结报告。

三、技术措施及要求

1、猪伪狂犬病净化前的要求

① 淘汰隔离场的准备。为减少淘汰损失和防止交叉感染，必须有一个单独的、距离养猪场（站）500米以上的隔离场，以隔离阳性猪。

② 猪伪狂犬病的免疫状况要求。如果没有使用疫苗或使用了gE基因缺失的疫苗，则可着手净化；如果使用全基因疫苗（如常规灭活苗），则必须换成gE基因缺失的疫苗，半年后方可着手净化。

③ 猪伪狂犬病野毒感染率的检测。通过抽样检测野毒感染率，预测需要隔离或淘汰的数量，计划场地及设施，评估经济效益，制定净化方案。一般而言，野毒阳性率≤15%，可一次性净化；野毒感染阳性率＞15%，可实施分步净化。

④ 养殖场周边环境调查。对养殖场周边养殖户饲养的母猪和肥猪全部采样监测猪伪狂犬病。

2、猪伪狂犬病的净化措施

①开展血清学检测。全场种猪和部分育肥猪在5天内完成猪的采血并分离血清，所有的血清均需备份并置于-20℃冰冻保存，采血过程及样品要防止污染并作唯一标记。对检测阳性猪进行扑杀或淘汰处理。

②确定净化步骤。根据野毒感染抗体阳性率，确定作一次净化还是分步净化处理。若野毒感染猪数量少（低于15%）可一次性淘汰处理；若野毒感染数量多（高于15%），则可实施分步净化，当减少到一定程度时（低于15%），可一次性淘汰净化。

③ 持续监测。每年进行2～3次猪伪狂犬双基因缺失苗普免，提高群体免疫水平。对种猪群每半年监测1次，检测是否有野毒感染。

④可疑猪重检。对于gE抗体判为可疑的生猪进行重检，若仍可疑，则应淘汰。

⑤加强仔猪选育。对于使用双基因缺失活疫苗种猪所产仔猪，应进行早期断奶，保育期间对留种用的仔猪做一次野毒感染检测，野毒感染抗体阴性的仔猪作种用，阳性仔猪则淘汰。

⑥加强种公猪和后备种母猪监测。每半年抽血样做野毒检测，阳性猪扑杀或淘汰。

⑦对引种严格把关，引进的种猪必须是从无猪伪狂犬病的猪场引进，要有《种畜禽生产合格证》和《检疫合格证明》，引进后隔离饲养30～60天经检测合格后才可混群饲养。

⑧做好疫苗免疫效果评价。种猪群分胎次以20%的比例抽样，仔猪分周龄以10%的比例抽样检测疫苗抗体，评价疫苗的免疫效果，免疫抗体阳性率达95%以上，视为免疫合格；合格率低于70%，分析是疫苗原因还是生猪自身原因，若是疫苗质量问题可更换疫

苗加强免疫一次，若是生猪自身原因，可加强免疫一次，仍不合格，淘汰免疫抗体阴性猪。

通过以基因缺失疫苗全面免疫并配合血样检测淘汰野毒抗体阳性猪的方法，首先将生产公猪群净化，然后将生产母猪群中野毒抗体阳性猪逐步淘汰，更新的后备猪群严格进行血检，逐步形成良性循环的更新淘汰机制，最终使生产种公母猪全部净化为阴性猪群。同时，使用高效优质的疫苗免疫，做好消毒灭源，保护好健康猪群，最终实现种猪猪伪狂犬病的净化目标。

3、猪伪狂犬病净化的配套管理措施

① 严格的防疫体系。必须确保生猪得到有效的防疫和隔离，避免接触到传染源而发生再次感染，同时，种猪场（站）要对猪舍、栏圈定期消毒。

② 实施早期断奶技术，降低或控制其他病原的早期感染，建立健康猪群。

③ 实施全进全出制度，生猪调入调出前后用不同的消毒药物彻底清洗消毒栏舍。

④ 对生猪实施部分清群。首先对能出售的生猪销售清空，其次对疫病多而复杂的生猪进行清群或分场管理，对频临淘汰的生猪及早淘汰。对于上述清群后的猪舍进行清洗、消毒、空舍等处理。

⑤ 禁止在养殖场内饲养其它动物，实施灭鼠措施。

猪伪狂犬病病毒泰州株的分离鉴定 篇3

关键词：猪伪狂犬病毒；分离；鉴定

中图分类号： S858.285.3 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）03-0200-03

伪狂犬病（pseudorabies，PR） 是由伪狂犬病病毒 （pseudorabies virus，PRV）引起多种家畜和野生动物以发热、奇痒（猪除外）和脑脊髓炎为主要症状的急性传染病[1]。以猪的感染最为普遍，该病毒能引起母猪的繁殖障碍，主要表现为流产、死胎、木乃伊胎等；新生仔猪发生感染时，死亡率可高达100%；此外，育肥猪感染往往致使其生长缓慢，种公猪感染则导致精液品质下降甚至丧失种用价值[2]。伪狂犬病最早在美国发现，我国于20世纪40年代末在猫中首次发现了该病毒，60年代初在猪群中也出现了该病毒流行。目前，该病在我国广泛流行，严重威胁着猪群的健康，并造成了养猪业严重的经济损失[3-4]。本研究对泰州市某猪场疑似伪狂犬病患猪采集肝、肾及脾等组织病料，进行PRV的分离、鉴定，以期为今后深入研究和科学地防控该病提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料

疑似伪狂犬病病猪的肝、肾及脾等组织，于2013年4月17日采自泰州市姜堰区某猪场。将采集的病料研碎，按 1 g ∶5 mL 加入无菌含双抗的PBS溶液，混匀，反复冻融3次，离心取上清，用孔径0.22 μm滤器过滤后，-20 ℃保存备用。

1.2 试剂、细胞、阳性血清及家兔

基因组DNA快速抽提试剂盒（动物）、Taq DNA聚合酶、dNTP Mix、25 mmol/L MgCl2及10×PCR buffer均为上海生工生物工程有限公司产品，100 bp DNA Ladder和6×DNA 凝胶载入染料（Loading Dye）购自Fermentas公司。PK15细胞由江苏省动物流行病学研究中心保存。猪源抗PRV阳性血清，购自VMRD公司，羊抗猪IgG-FITC，购自SANTN CRUZ公司。胰酶细胞消化液，购自上海碧云天生物技术有限公司；新生牛血清和DMEM培养基购自上海生工生物工程有限公司。健康的家兔4只，购自江苏农牧科技职业学院农场。

1.3 引物的设计与合成

根据文献[5]方法，合成1对PRV引物，片段针对PRV gH基因中的一段序列，扩增片段长355 bp。引物序列为：上游引物5′-GCGTGTACTGCGACTGCGTGTT-3′；下游引物 5′-CGACCTGGCGTTTATTAACCGAGA-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 病毒核酸的提取及PCR

用基因组DNA快速抽提试剂盒，按说明书上的操作方法提取组织病料DNA。以提取的组织病料DNA为模板进行PCR扩增，PCR采用50 μL反应体系：5 μL 10×buffer、3 μL 25 mmol/L MgCl2、1 μL 10 mmol/L dNTPs、20 μmol/L上下游引物各1 μL，用灭菌超纯水补足50 μL。反应条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。用15 g/L琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察电泳图谱，拍照记录结果。

1.5 病毒的分离

将上述“1.1”节处理的经PCR检测呈PRV阳性的病料悬液接种于PK15单层细胞上，37 ℃孵育1 h后弃接种液，加入含2%新生牛血清的DMEM培养液，置于37 ℃、50 mL/L CO2培养箱，每日观察，盲传至细胞病变稳定、病变率达80%时收毒，对收获的病毒液PCR检测PRV。

1.6 病毒的IFA鉴定

将分离毒接种至长满单层的PK15细胞，37 ℃孵育1 h后，吸取病毒液，PBS洗涤2次，加入维持液于37 ℃、5% CO2培养箱中培养72 h；同时以未接种病毒的PK15细胞作为阴性对照。待检细胞使用PBS洗涤3次，冰甲醇4 ℃固定 30 min；PBS洗涤3次，加入猪源抗PRV阳性血清，37 ℃孵育1 h；PBS洗涤3次，再加入FITC标记的羊抗猪抗体，37 ℃孵育1 h，PBS洗涤3次后，置于Olympus倒置荧光显微镜下观察。

1.7 病毒滴度测定

将病毒液稀释成10-1～10-10，分别接种到96孔培养板中长成融合单层的PK15細胞上，每个稀释度接种8孔，培养板最后2列孔接种稀释液作对照，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，96 h后观察细胞病变，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50。

1.8 家兔接种试验

用PRV分离毒株腹侧皮下接种2只家兔，2 mL/只；另取2只作为阴性对照组，分别注射细胞维持液，2 mL/只。试验组和对照组隔离饲养，每日观察记录家兔的临床表现。

2 结果与分析

2.1 病料的PCR检测

对疑似PRV感染猪组织病料提取DNA，然后进行PCR检测，扩增出片段大小为355 bp的目的条带，与预期结果相符（图1）。

2.4 病毒滴度

统计不同稀释度的分离毒在96孔细胞板上PK15细胞中出现的致细胞病变效应（cytopathic effect，CPE），按Reed-Muench法测得分离毒滴度可达108.12 TCID50/mL。

2.5 家兔感染试验

2只试验组家兔在接种细胞病毒液后约48 h表现奇痒症状，不断啃咬腹侧注射部位，掉毛出血；接种后62 h时出现角弓反张而死亡。注射细胞维持液的对照组家兔观察7 d后均无异常表现。死亡兔剖检可见脑膜充血、肺瘀血，并有大小不等的出血斑点，气管环充、出血，肝瘀血肿大、有坏死灶等（图4）。

3 结论与讨论

PR是危害养猪业的重要传染病[6]，我国是一个养猪大国，因而对该病病原的深入研究具有非常重要的意义。

PCR技术是从分子水平对病毒进行诊断的一种方法，能检出痕量病毒。PCR具有快速、敏感、特异性强等优点，不仅可以检测细胞培养的PRV，而且可以直接检测临床样品[7]。本试验先对临床PR可疑病猪采集病料进行PCR检测，检测阳性后才接种到细胞，提高了细胞分离的成功率。

PRV具有泛嗜性，能在许多细胞中增殖。猪的PK-15、SK6、PS细胞，仓鼠的BHK-21，猴的Vero细胞、GMK细胞和兔的EP细胞等都能用于增殖该细胞，其中PRV对猪肾细胞和兔肾细胞最为敏感，生产上常使用猪细胞系PK-15或 SK-16 细胞进行PRV的培养。本试验选用PK-15细胞分离培养，除了PRV对其具有较强的敏感性外，该细胞还具有易培养、增殖速度快等特点[8]。

IFA是我国目前用于PR快速诊断的一种较好方法，该方法具有特异性高，不与细小病毒、腺病毒、血凝性脑炎病毒及肠道病毒发生交叉反应，以及敏感性较高等特点[9]。对本次细胞病毒的鉴定采用了IFA方法，发现分离病毒感染PK15后呈现明显的特异性绿色荧光，而未接种PRV的PK15细胞没有观察到任何特异性荧光。

动物接种试验是PR常用的检测方法。将病料或分离的病毒上清液皮下接种到家兔或小鼠，根据家兔或小鼠的临床症状做出判定。若接种液中含有PRV，家兔会不停啃咬接种部位，随即后肢麻痹，卧地不起，最后抽搐死亡；小鼠接种含有PRV的病料，也会出现神经症状，最后死亡。本试验使用学校牧场饲养的健康家兔，接种细胞毒后3 d内发病死亡，观察到典型的神经症状，且解剖见到明显的内脏病理变化。

本试验将PCR检测后PRV阳性的病料接种PK15细胞，经IFA鉴定、病毒滴度测定及家兔接种试验，结果成功分离出一泰州株PRV。该毒株的获得，为今后深入研究该病毒的分子生物学特性及开发有效的免疫制剂提供了科学的参考依据。

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猪伪狂犬病病毒 篇4

关键词：伪狂犬病毒,gE基因,PCR,检测

猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)属于疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科, PRV只有1个血清型,可感染多种动物,其中猪最敏感,发病也最严重,常呈流行性感染。猪伪狂犬病的临诊症状受年龄和感染毒株毒力的影响而有很大区别,仔猪表现为发热、呕吐、呼吸因难、间歇性痉挛等症状,病死率很高;母猪发生流产及产木乃伊胎、死胎[1,2]。成年猪感染该病毒后多耐过,不发病而呈隐性感染,造成长期带毒、排毒,成为极危险的传染源,因此做好该病的诊断显得尤为重要。

目前,国内外已经建立的实验室检测方法有病毒分离试验、琼脂免疫扩散试验(AGID)、中和试验(SN)、ELISA、乳胶凝集试验(LAT)等[3,4,5],与这些方法相比,PCR具有敏感性高、特异性好、快速、简便、病料采取方便等优点,能同时检测大批量的样品,是最常见和最普遍的诊断方法。现在,对于该病的防治普遍采用缺失gE基因的基因工程疫苗[6]。本研究根据PRV Min-A株gE基因的一段序列,在保守区域设计1对引物,拟建立针对PRV野毒感染的PCR诊断技术,为兽医临床提供一种快速、准确、实用的PRV检测方法,也为基层展开大规模流行病学调查与疫情监测提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株

猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)等参考毒株,均由四川农业大学动物生物技术中心保存。

1.1.2 主要试剂

DNA提取试剂盒,购自北京博迈德生物公司;2×GC Buffer、rTaq DNA 聚合酶、dNTP、pMD19-T载体、DL-2 000 Marker和胶回收试剂盒,均购自宝生物工程(大连)有限公司;其余试剂均为国产或进口分析纯。

1.1.3 病料

43份猪淋巴结病料,于2009年9—10月份采自四川省简阳、 遂宁、眉山等地区的规模化猪场。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计

参照 GenBank的全基因序列中的PRV Min-A株(登录号为AF170318.1)gE基因的保守区序列设计1对特异性引物,序列为P1 5′-GCTCTGCGTGCTGTGCTCC-3′,P2 5′-GGGTCCATTCGTCACTTCCG-3′,预扩增的片段大小为348 bp。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2.2 PCR反应模板的制备

提取PRV Min-A株细胞毒DNA并作为PCR反应模板,提取方法参照细胞基因组DNA提取试剂盒说明书进行。测定OD值并计算使DNA的浓度为1 000 ng/mL,-20 ℃保存,备用。

1.2.3 PCR反应条件的优化

以PRV Min-A株提取的细胞病毒 DNA为模板,在保持其他参数一致的条件下,通过改变单一因子来筛选某个最佳参数,分别对退火温度、Mg2+浓度、引物浓度进行筛选。在对PCR反应参数进行筛选时, 其他参数设定按如下体系:2×GC Buffer (5 mmol/L Mg2+)12.5 μL,dNTPs (10 mmol/ L) 4.0 μL,上、下游引物(25 pmol/ L)各1.0 μL,rTaq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.5 μL,DNA模板2.0 μL,补ddH2O至25.0 μL。PCR反应程序:95 ℃ 5 min; 95 ℃ 45 s, 55 ℃ 40 s,72 ℃ 45 s, 共30个循环;72 ℃ 10 min。电泳观察结果。

1.2.4 PCR产物的克隆、鉴定

对PCR产物进行琼脂糖电泳检测,切下特异性目的条带,用胶回收试剂盒进行回收。取回收产物与pMD19-T 载体进行连接、转化,挑选阳性重组质粒,送上海英骏生物技术有限公司测序。将所得的序列与NCBI网站上GenBank中的序列进行Blast比对、分析。

1.2.5 特异性试验

采用优化后的反应体系,用同样方法对PRRSV、PCV2、CSFV、PPV等参考毒株进行RT-PCR或PCR操作,以验证该方法的特异性。

1.2.6 敏感性试验

采用优化后的反应体系,分别选择以下模板量100 ng、50 ng、10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg进行PCR扩增,验证该方法的敏感性。

1.2.7 重复性试验

采用优化后的反应体系,将提取的PRV 细胞毒DNA在相同条件下重复进行5 次PCR检测,以验证该方法的重复性。

1.2.8 临床应用

用反应条件优化后的PCR方法对采自四川省部分地区的43份病料进行PCR检测。

2 结果

2.1 各参数的优化结果

试验以PRV Min-A株细胞毒DNA为模板进行PCR扩增,对其退火温度、 Mg2+浓度、引物浓度进行优化。结果表明,退火温度为50～62 ℃、引物浓度为0.2～ 0.9 μmol/L、 Mg2+浓度为2.5～5.0 mmol/L时都能扩增出长约348 bp的预期片段, 电泳条带明亮、清晰,非特异性条带少,具体见图1～3。

M.DL-2 000 Marker;1～7.温度分别为50,52,54, 56,58,60,62 ℃。

M.DL-2 000 Marker;1～8.引物浓度分别为0.2,0.3, 0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9 μmol/L。

M.DL- 2 000 Maker;1～6.Mg2+浓度分别为2.5,3.0, 3.5,4.0,4.5,5.0 mmol/L 。

从以上PCR优化结果来看,PCR反应在如下体系、反应程序中都能扩增出明亮、清晰、特异的条带。反应体系:2×GC Buffer (5 mmol/L Mg2+)12.5 μL,2.5 mmol/L Mg2+0～3 μL,10 mmol/L dNTPs 4.0 μL上、下游引物0.2～0.9 μmol/L,DNA模板2.0 μL,5.0 U/μL rTaq DNA聚合酶 0.5 μL,最后用去离子水补至25.0 μL。反应程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 45 s, 50～62 ℃ 40 s,72 ℃ 45 s, 共30个循环;72 ℃ 10 min。

2.2 PCR产物的序列测定及Blast在线比对结果

经BLAST 在线比对分析证实,扩增产物确为PRV gE基因片段, 其核苷酸序列与GenBank中PRV gE基因序列的同源性为98%,见图4。

2.3 特异性试验结果

对PRRSV、PCV2、CSFV、PPV参考毒株进行RT-PCR或PCR反应,同时用阴性Vero细胞提取的DNA作为阴性对照,发现只有 PRV参考毒株的PCR产物在348 bp附近有1条与预期大小相符的条带,而PRRSV、PCV2、CSFV、PPV参考毒株和阴性对照都没有条带,具体见图5。

1～4.PPV、CSFV、PCV2、PRRSV PCR产物;5.PRV PCR 产物;6.阴性对照;M. DL- 2 000 Marker。

2.4 敏感性试验结果

采用优化后的条件,分别选择以下模板量100 ng、50 ng、10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg 进行PCR扩增。模板量大于10 ng 时扩增条带非常明亮,模板量为10 pg时也可见扩增条带,1 pg时不能检测出,具体见图6 。

1～6.模板量分别为10 pg、100 pg、1 ng、10 ng、 50 ng、100 ng;7.阴性对照;M.DL- 2 000 Marker。

2.5 重复性试验结果

按同样的方法分别将提取的DNA 样品在相同条件下重复进行5次PCR扩增,结果均出现相同的检测结果,具体见图7。

M.DL- 2 000 Marker;1～5.PRV PCR产物。

2.6 临床样品的检测结果

用此次试验建立的PCR方法对采自四川省部分地区的43份病料进行PCR检测,结果发现28份病料呈阳性,检出率为 65.12%。各地区病料 PRV检出率的结果见表 1。

3 讨论

猪伪狂犬病毒能引起妊娠母猪流产及产木乃伊胎、死胎和弱仔,使初生仔猪出现神经症状,感染率和病死率可达100%,是养猪业的一种重要繁殖障碍性传染病。PRV引起的疾病的临床症状与 CSFV、PRRSV、PPV和PCV2所引起的疾病的临床症状具有相似性,极易混淆,另外成年猪感染后多耐过,呈隐性感染,不表现临床症状,不利于该病的诊断,因此建立一种快速、特异、敏感的检测方法对该病的预防将发挥极其重要的作用[8]。

目前, 国内外对PRV的诊断方法进行了大量研究, 并取得了一定进展, 主要包括血清学诊断方法和病原学诊断方法,这些方法各有其优点,但也存在一定的不足之处。市售的国内外生产的gE- ELISA试剂盒虽能检测野毒感染,但其重复性较低,敏感性不高,对隐性感染动物往往漏检,且各个厂商的试剂盒所测结果差别较大;病毒分离和病毒抗原检测是诊断PRV感染的重要方法,但只能用于出现病毒散播的急性感染期;而间接荧光抗体技术非特异性较高,重复性、稳定性还需进一步改进,而且价格昂贵[9]。

与这些检测方法相比,PCR具有操作简便、特异性和敏感性较高、快速等优点。研究根据PRV gE基因的DNA序列设计1对引物,用 PCR方法扩增出了长为348 bp 的条带。目前,缺失gE基因的基因工程疫苗是预防PRV 的首选疫苗,gE基因已被用作PCR诊断的最佳基因[10,11],该检测方法能特异地检测出PRV野毒株感染的动物。试验使用PCR方法通过对PCV2、CSFV、 PRRSV、PPV进行扩增检测,结果以上病毒无任何目的条带检出,表明用设计的引物进行 PCR 扩增具有良好的特异性。试验所建立的PCR方法在DNA 模板量为10 pg时仍能扩增出目的条带,表明检测灵敏度很高。多次重复性试验仍能得到同样的结果,表明试验所建立的针对 PRV 的PCR快速检测方法具有很好的重复性。用该方法对四川地区部分猪场送检的43份疑似PRV感染的样品进行检测,其中28份样品能扩增出与预期大小相符的PCR产物,阳性率达65.12%。综上所述,该检测方法可用于PRV的分离鉴定、临床病料的检测以及大规模流行病学调查,为我国 PRV疫情监测提供了相应的技术支持。

参考文献

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第3讲 猪伪狂犬病的防控技术 篇5

猪伪狂犬免疫技术

伪狂犬病是由伪狂犬病毒引起的一种猪和其他动物共患的以发热、脑脊髓炎及奇痒等位特性的急性传染病。

一、流行特点

猪伪狂犬病广泛分布于世界各地，给畜牧业造成了损失。成年猪症状极轻微，很少死亡。病猪、带毒猪及带毒鼠是重要的传染源，传播途径是经过消化道、呼吸道、粘膜、皮肤伤口等，通过交配等感染此病。母猪感染后6～7日乳中有病毒，持续3～5天哺乳母猪吃母乳而感染。妊娠母猪感染，常侵害胎儿，发生流产。本病多发生于春秋两季，猪的易感性与年龄有明显的关系，10～20日龄的仔猪死亡率可达到95%以上。本病在猪群流行的时间很短，大猪群2～3周便可停息，小猪群则更短。

二、临床症状

猪伪狂犬病表现有四大症状：

(1)妊娠母猪发生流产、产死胎、木乃伊胎，其中以产死胎为主。部分猪有奇痒感，靠在圈舍墙壁或饲槽擦痒，颈部、前肢、后肢、尾根及坐骨结节等处被毛完全脱落，裸露污秽的红创面。后期完全拒食，不能饮水。部分病猪在唇、齿龈、等处出现浅溃疡。

(2)伪狂犬病引起新生仔猪大量死亡，主要表现在刚生下的仔猪第1天还很好，从第2天开始发病，3～5天内是死亡高峰期，有的整窝死亡。死亡初生仔猪的日龄已观察到19日龄。发病仔猪表现出高热、食欲废绝、明显的神经症状、昏睡、呜叫、流涎、呕吐、拉稀、抑郁震颤，继而出现运动失调、间歇性抽搐、昏迷以至衰竭死亡，一旦发病，1～2天内死亡。15日龄以内仔猪死亡率可高达100％。剖检主要是肾脏布满针尖样出血点，有时见到肺水肿、脑膜表面充血、出血。

(3)伪狂犬病病毒引起断奶仔猪发病死亡，发病率在20％～40％，死亡率10％～20％，主要表现为神经症状、拉稀、呕吐等。成年猪一般为隐性感染，若有症状也很轻微，易于恢复。主要表现为发热、精神沉郁，有些病猪呕吐、咳嗽，一般于4～8天内完全恢复。病猪横卧于地，作“划船”动作。

(4)种猪不育症。母猪不发情、配不上种，返情率高达90％，有反复配种数次都屡配不上，耽误了整个配种期。此外公猪感染伪狂犬病病毒后，1

北京市平谷区峪口镇中桥村农民田间学校工作站提供

表现不育、睾丸肿胀，萎缩，丧失种用能力。

三、剖检变化

尸体表皮瘀斑明显，特别见于耳尖、吻突、胸腹下部、四肢末端及尾根等处。全身淋巴结肿大、出血，切面可见针尖大的白色坏死小点。肝略肿大，色泽变深，部分肝小叶呈现小叶性出血。肝脏表面及实质内有粟粒大至绿豆大坏死灶，病灶周围有红色晕圈。脾略肿大，色泽变深，有粟粒大白色坏死灶，个别出现脾脏边缘梗死。肾肿大，色泽深，表面有大的坏死灶，肾皮质及髓质均可见小点出血。膀胱粘膜有小点出血。鼻腔有卡他性或化脓性出血性炎症，肺水肿，上呼吸道有泡沫状液体。病程稍长可见咽炎和喉头水肿，喉头软骨有浆液性胶样浸润。仔猪有支气管肺炎。心内膜有时见出血，有明显出血区。小肠粘膜充血水肿，大肠块状出血，浅层溃疡。脑膜充血水肿，部分猪灰质处出现小点性出血。

四、临床诊断

患病仔猪有神经症状，体温升高，共济失调，抽搐转圈。母猪流产、死胎、木乃伊胎。公猪睾丸炎。剖检见急性坏死性鼻炎，扁桃体炎，气管炎和肺炎，可以作出诊断，必要时进行实验室检验。

五、预防

猪伪狂犬病活疫苗可用于预防猪伪狂犬病，注射疫苗后第6日产生免疫力，免疫期为12个月。

对妊娠后期母猪（产前21天～28天）进行预防接种，所生仔猪的母源抗体可持续21～28天，此后的仔猪或断奶仔猪仍需接种。

若母猪未注射疫苗，所生仔猪应在7日龄内接种，并在断奶后再接种一次，可提高猪对此病的免疫力。

凡发现可疑病猪应及时报告有关防疫部门，采集病料及时送检。确诊为伪狂犬病时应立即封锁，禁止人员、车辆、设备等来往，控制犬、猫及其他野生动物接触病猪。病猪与健康猪应立即分群隔离。对患病仔猪和发生过流产、死胎的母猪均进行淘汰处理。对疑似病猪进行隔离，并全面接种疫苗。对出生至7日龄的仔猪注射高免血清。猪舍及场地用2%火碱或5%来苏儿等喷洒消毒后全面清扫，必要时再消毒。

六、治疗

猪伪狂犬病的特点与防控 篇6

1. 病原。伪狂犬病病毒主要存在于病猪的脑组织中。处于发热期的病猪,其鼻液、唾液、乳汁、阴道分泌物、血液及实质脏器中都含有病毒。伪狂犬病病毒耐干、耐酸、怕碱,因此碱性消毒剂对其有杀灭作用。

2. 流行情况。猪伪狂犬病一年四季都可发生,但以冬、春两季多发,常呈散发或地方性流行。临床中发现,仔猪发病年龄最小为9日龄、最大为65日龄,以1月龄刚断奶不久的仔猪发病最多,病猪和隐性感染猪带毒时间较长,是主要传染源。

3. 临床症状。①仔猪。哺乳仔猪和断乳仔猪症状明显,主要为神经症状,病程急剧,病死率高,1月龄左右的仔猪常发此病型。有的仔猪有半天左右的前驱症状(高热、少吃或不吃乳、呼吸快、精神沉郁、离群独立),后出现神经症状,有的未见任何前驱症状即出现神经症状。有的表现为精神兴奋,攀登圈栏,无目的地行动,乱撞,但此种病例较少见。常见的呈阵发性痉挛,转圈运动,前肢或四肢叉开站立,角弓反张,卧地,四肢呈泳状划动,出现这些症状数分种后即可消失,但又复发。有的表现为行走不稳,斜走,卧地或呈犬坐姿势,后躯麻痹,叫声嘶哑或叫不出声,最后昏迷而死。在整个病程中,仔猪体温多在38.5~41℃,有的稽留微热,有的体温不高。病仔猪还出现结膜潮红、流泪、间有脓性分泌物、视力减退或丧失、呼吸促迫、流清鼻汁、咳嗽、打喷嚏的症状。有的口吐白沫,有的呈腹式呼吸,多数病猪病初粪便干燥,部分病猪排稀便。多数病仔猪在出现神经症状后1~2天死亡,少数病程发展缓慢和轻症的病例,常经2~3周痊愈,但都有后遗症,如步调不稳、生长发育不良等。②大猪。通常不表现症状或只出现轻微症状,一般不引起死亡,这是猪伪犬病的流行特点之一,有助于初步诊断。有的仅现微热,减食或停食,呼吸快,一般经2~3天恢复正常,因此易被误诊为猪流行性感冒,但这些隐性感染猪在接触病原后2~11天从其鼻液或尿液中排毒,成为该病在猪场中扩大传播的传染源。③母猪。妊娠母猪感染后常流产、产木乃伊胎或死胎,产出的胎儿大多甚为新鲜,大小相差不显著。在妊娠后期感染的母猪,常产出活力较差的弱胎,出生后2~3天死亡。母猪流产前后大多无明显临床表现。

二、猪伪狂犬病的防控

1. 加强猪场管理,建立生物安全体系。①生产区应分为后备猪区、配种怀孕区、产房区、保育区、育肥区5部分,区间间距不少于100米,每个区相对独立,实行单元式饲养、全进全出的单向流动,切断交叉感染途径。②严格执行各项生物安全措施,最大限度地控制传染源的传入和切断传播途径。定期做好灭鼠、灭蚊、灭蝇、杀虫等工作,场内严禁饲养猫、狗和其他动物,注意驱赶鸟类及其他野生动物。搞好猪舍内外环境卫生,保持猪舍干燥,注意通风换气。根据实际情况,有计划地对猪群及周边环境进行消毒,病死猪进行无害化处理。③控制人流和物流。禁止外来人员及车辆进入猪场,工作人员进入生产区,必须经过严格消毒(有条件的可淋浴),更换衣服、鞋、帽后定向进入猪舍,不准串舍。物品经过消毒后才能在生产区使用,生产区的运料车和运猪专用车只能在生产区用。卖猪时,必须重视对买猪车辆及有关人员、上猪台的消毒。

2. 严抓引种管理,培育好健康后备猪。猪场应尽可能自繁自养,如需引种一定要从伪狂犬病抗体阴性或野毒感染阴性种猪场引入,并严格隔离检疫2个月,经采血检测伪狂犬病抗体或野毒感染阴性者方可混群,以后每年进行2次血清学检测。对检测出的野毒感染抗体阳性的猪要隔离饲养,注射疫苗后作育肥处理,不能留作种用。后备猪必须按猪场免疫程序进行伪狂犬病疫苗免疫,经检测伪狂犬抗体阴性的方可留种。

3. 合理选择疫苗,健全防疫体系。据笔者多年猪场工作实践,疫苗接种是防控猪伪狂犬病主要措施之一。原则上猪伪狂犬病阴性场最好不接种疫苗,但在实际养猪生产中,阴性猪场也要将该病列入猪场免疫计划中,选择质量稳定的猪伪狂犬基因缺失苗,不能随便更换疫苗(一旦确认某品牌的疫苗适合本场,就要沿用下去),笔者一直用德国勃林格殷格翰生产的猪伪狂犬病活疫苗,种猪群(含后备猪)每年免疫3次,每头每次肌注1头份(2毫升),仔猪8~10周龄时肌注1头份(2毫升),经检测,猪伪狂犬病抗体一直为阴性。

4. 定期监测淘汰,实现猪群净化。猪场伪狂犬病的净化需要采取综合措施,包括免疫接种、检测—淘汰、加强饲养管理、生物安全措施等。使用质量好的猪伪狂犬基因缺失苗对全部种猪群(含后备猪)进行免疫,免疫后逐头采血检测,对猪伪狂犬病野毒感染的阳性猪只全部淘汰,以后按免疫程序免疫,每隔3~6个月监测1次抗体,淘汰检出的阳性猪,如此反复进行,一般1~2年可净化。净化后的猪群,继续按原来的免疫程序进行免疫,从而控制猪场伪狂犬病的发生及发展。

猪伪狂犬病病毒 篇7

1检测原理与方法

猪伪狂犬病病毒gp I试验使用两培稀释 (1:2) 的血清在PRV抗原包被的微孔中进行, 在第一次的孵育阶段, 存在于血清中的包括抗gp I抗体在内的PRV抗体, 与塑料板孔上的抗原反应, 洗涤后, 酶标抗PRV gp I单克隆抗体加到微孔板中, 并在第二次孵育中竞争结合gp I病毒抗原。如果被检血清中没有gp I抗体, 酶标gp I抗体可与gp I抗原由反应。相反, 如果被检血清中存在gp I抗体。则酶标gp I单克隆抗体与抗原的反应被阻断。孵育后, 没有反应的标记物被洗去, 加入底物/显色剂溶液后, 在酶的存在下, 底物转变为一种能与显色剂反应产生蓝色的物质。使用分光度计测量650nm的吸收值A (650) 。被检样品的A (650) 值除以阴性对照的平均A (650) 值, 计算得出样品/阴性值 (S/N) 。样品中gp I抗体的含量。

1.1检测仪器和材料

1.1.1从本镇某猪场采集疑似伪狂犬病病发典型症状的母猪和仔猪的血样。

1.1.2将血样带回化验室, 分离出血清。

1.1.3使用美国IDEXX公司生产的猪伪狂犬病病毒gp I抗体ELISA检测试剂盒。

1.1.4仪器分别是, 分离血清离心机、离心管架和离心管、10~100μL微量移液器和相应型号的吸嘴、配制洗涤液的量筒、蒸馏水或去离子水、DDFK/SB-189酶标仪。

1.2适用范围

适用于检测猪血清中伪狂犬病病毒 (PRV) gp I抗体水平。用于区分免疫基因缺失疫苗的猪群抗体和野毒感染后抗体, 作为控制猪伪狂犬病的重要检测方法。

1.3检测操作步骤

1.3.1标准对照与样品稀释:在血清稀释板中按1:2的体积稀释阴、阳对照血清与待检血清 (用60μL样品稀释液中加60μL阴、阳对照血清与待检血清混匀即可) 。

1.3.2在A1, B1孔内加入100μL两倍稀释 (1:2) 的阴对照, 在C1, D2孔内加入100μL两倍稀释 (1:2) 阳对照。

1.3.3在其余的孔内分别加入100μL以1:2稀释好的待检血清, 在室温下孵育1h。

1.3.4洗涤液配制:使用前, 浓缩的洗涤液应恢复至室温 (25℃左右) , 并摇动使沉淀的盐溶解后用蒸馏水或去离子水作10倍稀释 (例如:每板用30m L浓缩液加上270m L水) 。

1.3.5甩掉板孔中的溶液, 用大约300μL/孔洗涤液洗板3~5次, 每次静置3min倒掉, 再在干净吸水纸上拍干, 然后在没孔加入100μL辣根过氧化物酶标记抗PRV gp I抗体。室温下孵育20min, 在漂洗5次, 切记每次在干净吸水纸上拍干。

1.3.6每孔加入100μL TMB底物液。室温下避光孵育15min, 每孔加入终止液50μL, 10min内测定结果 (检测前在震动器上轻轻震动一下) 。

1.3.7测量并且记录待检样品和对照物。

2结果与分析

2.1判断结果的有效性

阴性对照A (650) 的平均值减去阳性对照A (650) 的平均值必须大于或等于0.3, 试验方能有效。如果试验无效, 试验操作可能有误, 试验应重做。 (见表1、2)

2.2公式计算

2.3结果判断

如果S/N值低于或等于0.60, 样品应判定为PRV gp I抗体阳性。

如果S/N值大于0.6但小于或等于0.70, 样品应重测。如果试验结果不变, 间隔一定时间后重新采样、检测。

如果S/N值大于0.70, 样品应判定为PRV gp I抗体阳性。

OD值>0.773判断为阴性, 0.6834

3综合防治措施

猪伪狂犬病的治疗到目前为止尚没有特效的方法, 紧急情况下用高免血清治疗, 可降低死亡率。主要做好防疫工作是对本病主要防治措施。

3.1坚持自繁自养

不从在其他猪场引种, 如果必须引种, 要严格把好检疫关。不从疫区引种, 引进后要隔离饲养, 最好采用人工授精配种方法。母猪配种前24h左右注射赛福龙3mg/kg·bw一次, 防止配种早期感染, 净化产道致病菌, 提高配种受精率。

3.2免疫预防

强制疫苗接种是防治猪伪狂犬病的有效手段。种猪接种猪伪狂犬病g E基因缺失疫苗或野毒灭活苗, 仔猪使用弱毒灭活苗。免疫程序:母猪在配种前7d, 肌内注射猪伪狂犬病g E基因缺失苗2头份;到距预产期还有20d左右时, 再注苗2头份。种公猪每3个月一次肌内注射猪伪狂犬病g E基因缺失苗2头份, 乳猪出生未吃初奶之前, 肌内注射猪伪狂犬病弱毒疫苗0.5m L, 注射后1h再吃奶。但靠疫苗接种不能消灭本病, 无本病的猪场一般禁用疫苗。

-代表阴性参考+代表阳性参考

3.3严格把好检疫关

猪场要严格遵守检疫程序, 定期进行猪伪狂犬病病毒gp I抗体ELISA检测, 采样随机抽样检疫法。坚持每6个月做一次检测, 对存栏母猪20%, 公猪50%的比例抽检, 检测到阳性的种猪立刻淘汰, 直到全群阴性, 目的是为了阻止疾病的发生, 减少病毒扩散, 坚持自繁自养对引种的猪只采血检测抗gp I抗体, 阴性方可引进。ELISA试验在我市是作为诊断该病的标准方法。

3.4严格消毒

PRV对环境的抵抗能力非常强, 在猪舍内的病毒, 在夏季存活30d, 冬天可达60d, 病毒在p H4~9之间保持稳定。55~60℃经30~60min才能灭活。如果有疫情发生, 消毒液可以使用2%~3%的烧碱溶液或者20%新鲜石灰水进行消毒, 但0.5%石灰乳或0.5%碳酸钠也可以杀死病毒。

3.5防灭鼠患

鼠是伪狂犬病病毒的携带者, 它通过污染饮水、饲料及猪舍用具, 使猪受到感染, 因此防鼠灭鼠对控制本病有重要的意义, 但要注意的是要使用对人畜无害的鼠药, 以免发生鼠药中毒。

4总结

4.1实验室检测要求操作认真细致, 要做到精益求精, 不能马虎了事, 严格按照检测实验的每一个步骤, 确保检测实验得数值的准确, 参照标准数值合理计算分析那些数值是阳性, 那些是阴性。如果得出的数值有误差应要重做抗体检测。

4.2检测试验得出的结果, 从茶山某猪采样48个血清样本, 有10个呈阳性反应, 比例高达20.8%属于高危水平, 我们对猪场认真负责的态度, 建议猪场将伪狂犬病呈阳性反应的猪只进行淘汰处理, 还要对猪场的所有种猪 (包括公猪母猪) 再进行一次详细的伪狂犬病病毒gp I抗体检测, 将野毒感染阳性者清理出去, 净化种猪群。

4.3 PRV传染必须依靠猪的易感性, 而且PR疫苗免疫后存在病毒潜伏感染和排毒等问题, 所以要彻底根除本病。须重视检疫和检测, 淘汰野毒感染的猪只, 还需要合理地进行免疫接种, 做到每头种猪建立免疫档案。特别注意消毒、灭鼠工作, 防止疾病的传播。该猪场接纳我们的建议后, 伪狂犬病得到有效地控制, 取得了一定的成果。

4.4血清学检测手段, 尤其是研制成功的LAT和部分ELISA试剂盒操作简单、方便, 不需要使用昂贵复杂的仪器, 已经被广泛应用, 特别是鉴别ELISA试剂盒可鉴别野毒感染和疫苗免疫动物, 但一些ELISA方法还不够完善仍是有待解决的问题。分子生物学方法特别是PCR技术, 随着研究的深入将更加趋于敏感、简便、快速、实用化。目前, 美国和欧盟国家已经启动了PR扑灭计划。建立和完善可用于我国PR的控制以致最终消灭该病的诊断方法, 是我国广大兽医科技工作者面临的重大课题之一。

参考文献

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[3]GB/T.伪狂犬病诊断技术[J].18641-2002.

猪伪狂犬病病毒 篇8

1材料

1.1细胞 PK-15、ST、Vero细胞购自中国兽医药品监察所, 由广东大华农动物保健品股份有限公司传代、冻存、鉴定。鸡胚成纤维细胞 (CEF细胞) 按现行《中国兽药典》制备方法获得。

1.2毒种 猪伪狂犬病病毒毒种 (Bartha-K61株) 购自中国兽医药品监察所, 由本公司扩繁、鉴定、保存。

1.3试剂 DMEM购自美国Gibco公司, 胎牛血清购自内蒙古金源康生物工程有限公司, 胰酶、细胞消化液胰酶-EDTA溶液均为本公司自配。

细胞生长液:DMEM+10%胎牛血清

细胞维持液:DMEM+2%胎牛血清。

2方法

2.1细胞传代:按常规方法培养细胞[2]。取生长良好的PK-15、ST、Vero细胞。

用细胞消化液消化后, 按1:3比例传代, 分别分装至75 cm2细胞培养瓶置37℃、5%CO2培养箱培养待长成单层备用。

CEF细胞制备:按药典附录制备方法制备CEF, 24 h成单层备用。

2.2病毒增殖:弃去细胞生长液, 将猪伪狂犬病病毒按1%接种量接种上述4种已长成单层的细胞, 加细胞维持液, 置37℃、5%CO2培养箱培养, 观察细胞病变 (CPE) , 当CPE达到80%收获病毒, 置-20℃冻融3次, 测定TCID50。试验重复2次。

3结果

3.1猪伪狂犬病毒在四种细胞上的病变情况

将猪伪狂犬病毒接种PK-15、ST、Vero、CEF细胞均引起细胞病变, 细胞产生病变的时间大约分别在17 h、24 h、20 h、24 h, 与健康对照细胞比较, 可见病变细胞变圆、变大, 折光度增强。2次试验结果一致。

3.2猪伪狂犬病毒TCID50测定

将在PK-15、ST、Vero、CEF细胞上增殖的猪伪狂犬病毒分别用各自对应的细胞进行病毒含量测定, 结果如下:

4讨论

猪伪狂犬病病毒 (Bartha-K61株) 接种PK-15、ST、Vero、CEF细胞均出现了明显的细胞病变, 说明该毒株可在多种细胞上增殖。从我们实验结果看, PK-15、ST细胞增殖效果明显优于Vero和CEF细胞, 彭丽英等[3]和王大伟等[4]研究证实猪伪狂犬病毒还可以在幼仓鼠肾细胞 (BHK-21) 上增殖, 但以病毒含量作比较, 彭丽英等[3]的研究结果显示猪伪狂犬病病毒 (Bartha-K61株) 在BHK-21细胞上的增殖效果和在CEF细

胞上的增殖效果差不多。由于本实验室未保存BHK-21细胞, 因此未开展猪伪狂犬病病毒 (Bartha-K61株) 在BHK-21细胞上的增殖研究, 结合本实验室研究结果和彭丽英等[3]的研究结果, PK-15、ST细胞是最适宜猪伪狂犬病病毒 (Bartha-K61株) 增殖的细胞。本实验室较早建立了ST细胞库, 有详细的细胞鉴定记录, 而且生产和检验方面使用ST细胞的频率也很高, 如果以后开展猪伪狂犬病活疫苗 (Bartha-K61株) 相关质量研究的课题, 在病毒培养方面, 选择ST细胞作为猪伪狂犬病病毒 (Bartha-K61株) 的增殖细胞应该是最合适的。

参考文献

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猪伪狂犬病病毒 篇9

我国自1947年首次报道发现猪的伪狂犬病以来,到目前为止,已有24个省( 市) 、自治区( 包括台湾省和香港特别行政区) 报道发现该病[4],给养殖业带来了巨大的损失。目前,在短时间内净化伪狂犬病并不容易,通过检测gE抗体逐步淘汰阳性猪只,从而达到净化猪场或局部地区的猪伪狂犬病的目的,是较为常用的、可行的方法[5]。

为了摸清楚雄地区散养户猪伪狂犬病阳性率,从而有效指导养殖户预防和控制猪伪狂犬病的发生,笔者对楚雄地区3个规模化养殖场以及18个散养户的360头不同品种、性别、种类、年龄的猪进行了PRV血清学调查,以期为防控和净化楚雄地区猪伪狂犬病提供理论依据,以保障养猪业的健康发展。

1材料

1. 1血清样本

2012年9—12月份从楚雄地区3个规模化养殖场以及18个散养户随机采集360份血清,其中规模化猪场196份、散养户164份; 长白猪167份,约克猪193份; 公猪117份,母猪243份; 育肥猪168份、仔猪134份、怀孕母猪58份。置- 20 ℃ 冰柜中保存, 备用。

1. 2检测试剂

猪伪狂犬gE鉴别ELISA检测试剂盒,购自深圳市康百得生物科技有限公司。

2方法

2. 1检测方法

采用间接ELISA方法,严格按照检测试剂盒的说明书进行操作,通过配制洗涤液,稀释样品,设置阴性、阳对照,加样,温育,洗板,加酶结合底物显色,于450 nm处测定各孔的吸光度( OD值) 。

2. 2结果判定

以空白孔调零,当阳性对照孔平均OD450值≥ 0. 4,阴性对照孔平均OD450值≤0. 1时试验成立。被检血清样品OD450值≥0. 2时判为阳性,OD450值<0. 2时判为阴性。

2. 3数据统计分析

不同时间或不同分组间抗体阳性率的比较采用Pearsom χ2检验,P <0. 05时为差异显著,P <0. 01为差异极显著,统计分析使用SPSS10. 0。

3结果

3. 1总体检测结果( 见表1)

3. 2不同品种猪PRV的血清检测结果( 见表2)

3. 3不同性别猪PRV的血清检测结果( 见表3)

3. 4不同生长时期、类别猪PRV的血清检测结果( 见表4)

4讨论

现阶段在生猪养殖过程中,伪狂犬病是当前我国猪场最常见的传染病之一,该病可引起种猪的繁殖障碍、呼吸系统症状,尤其是与常见病原如蓝耳病病毒、 圆环病毒2型以及肺炎支原体等混合感染,严重影响猪群的生产性能,显著降低生猪养殖的利润,同时也给该病在兽医临床防治加大了难度[6]。防治该病的最终目标是将该病净化根除[7]。目前,对于猪伪狂犬病的免疫,采用的是PRV gE基因缺失苗,而运用猪伪狂犬gE鉴别ELISA检测,如检测到这些缺失蛋白的抗体,能够特异反映PRV野毒感染情况,给进一步净化该病提供强有力的工具[8]。在欧美等西方国家,通过使用基因缺失疫苗和相应的鉴别诊断方法, 已成功地控制或净化了该病[8 -9]。

本调查结果显示,楚雄地区猪伪狂犬病病毒野毒株阳性率为35. 00%,与王军等[10]2012年在河南省猪伪狂犬病流行病学调查中得到的阳性率( 30. 97%) 相近; 但是,明显高于杨尚斌等[11]在2010年对大理地区散养户猪伪狂犬病调查的结果( 8. 04%) ,说明在楚雄地区,对猪伪狂犬病的净化效果并不十分理想,有必要采取一定的防控及净化措施。另外,不同生长时期与不同性别猪PRV的阳性率显示,仔猪的阳性率为23. 88%,高于怀孕母猪的阳性率( 12. 07%) ,与杨睿等[12]对重庆地区PRV调查的情况类似,但阳性率偏高。而育肥猪的阳性率为51. 78% ,明显高于仔猪与怀孕母猪的阳性率; 公猪阳性率略高于母猪,此结果在某种程度上说明了该地区不同生长时期以及不同性别猪对PRV血清学反应存在差异性。在相同饲养、管理、防疫条件下,提示防控侧重点应在育肥猪与公猪。结果还表明,长白猪与约克猪两者的阳性率相近,说明这两个品种猪对PRV的感染性相差不大。

在规模化养殖中,猪伪狂犬病的阳性率为23. 98% ,明显低于散养户( 48. 17% ) ,说明散养户在饲养环境、管理水平和防疫措施等方面与规模化养殖之间存在明显的差异。从本次调查结果看,散养户的阳性率相对较高,表明以后在采取防控措施时,应将防控重点放在散养户。此外加大对散养户的生产养殖技术的培训,树立现代的健康良性养殖理念也是非常必要的。

摘要：为了调查云南楚雄地区猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒株感染的阳性率,从楚雄地区3个规模化养殖场以及18个散养户随机采集360份血清,采用间接ELISA方法对血清样本进行PRVgE抗体的检测。结果表明:360份猪血清中抗PRV抗体阳性率为35.00%。规模化猪场的196份样品中,阳性47份,阳性率为23.98%;散养户共164份样品,阳性79份,阳性率为48.17%。说明楚雄地区散养户饲养猪只PRV阳性率较规模化猪场高。

猪伪狂犬病病毒 篇10

1 资料与方法

(1) 临床资料。 选取我国多个省份的13 个PR免疫猪场送检的156 份病毒样品进行PRV病毒的分离鉴定和血清中和实验及g E基因序列分析, PRV经典强毒双城株和PRV疫苗株都在本院实验室进行保存。 对来自我国河南、内蒙古、吉林、黑龙江、江苏等多个省区的13 个PR免疫猪场送检的怀疑是PR的猪脑组织156 份病毒样品, 选取适量猪脑组织进行匀浆, 依据临床操作准则, 一部分匀浆液体用于病毒的分离鉴定, 一部分用于提取病毒基因组的DNA进行PCR鉴定。

(2) 实验对象和细胞。 实验猪和小鼠购买自兽医研究所, Vero细胞在本实验室进行保存。

(3) 引物的设计和合成。 依据GenBank中所登记的PRV基因序列分别设计用来gE全基因扩增和序列分析的引物和扩增部分的gE基因的检测引物。

(4) 病毒基因组的提取和PCR扩增以及病毒的分离。 病毒基因组的提取和PCR扩增参考文献[1]所描述的方法进行临床操作。 病毒的分离是将PCR鉴定为阳性的脑组织匀浆, 采用过滤器进行过滤和除菌以后, 取接种的Vero单层细胞, 进行孵化孕育1 小时后, 更换含有2%的胎牛血清的DMEM培养液体, 观察细胞的病变, 等待70%左右的细胞出现CPE时收毒, 进行冻融一次以后, 连续在Vero细胞中传代扩大培养。

(5) 电镜观察病毒粒子。 选取Vero细胞培养的病毒液体, 采用2%的磷钨酸负染, 在电镜下观察病毒的粒子形态。

(6) 小鼠的感染实验。 选取6~8 周的55 只小鼠, 25 只接种10×倍比稀释的PRV-S强毒株, 25 只接种10×倍比稀释的F5 代分离株, 经过腹股沟皮下接种0.1m L, 对另外5 只小鼠注射等体积的DMEM培养液体来作为阴性对照。 观察小鼠的临床症状和死亡状况, 依据Reed Muench方法进行计算其LD50。

(7) 病毒的中和实验。 对新分离的病毒接种猪血清和疫苗株Bartha k61 接种猪血清, 采用固定病毒稀释血清方法测定两株病毒的中和抗体。

2 结果

病毒资料检测。 将疑似PR病毒的发病猪的脑部组织进行匀浆, 提取其DNA进行PRV检测, 发现各个猪场都存在病毒感染。

病毒的分离及鉴定。 将少部分猪脑脑组织匀浆液体过滤除菌接种Vero细胞, 48 小时可以观察到网状的细胞病变。 进行PCR鉴定, 可以扩增到预期的大小片段, 采用猪圆环病毒、猪繁殖、猪瘟和呼吸综合征病毒特异性物扩增, 都呈现阴性反应。 电镜检测, 观察到病毒的粒子呈圆形, 临床体征有实心和中心, 分为没有囊膜和有囊膜两种。

gE基因序列的分析。 最近分离的PRV都处于相对独立的分支中, 和以往分离的病毒株亲缘关系比较远。

小鼠的感染实验。 小鼠接种的PRV-S强毒株和F5 代分离株都出现了PR临床症状, 发病白鼠撕咬接种的部位, 致使局部皮肤出血、皮毛脱落、撕咬肢体, 病毒接种量达到103.0~106.0 的TCID50 的小鼠72 小时后死亡, F5 代分离株小鼠的LD50 为103.37TCID50, PRV-S小鼠的LD50 为103.83 TCID50 , 注射DMEM培养液体的对照组小鼠没有临床症状。

血清交叉中和实验。 疫苗株Bartha k61 接种猪血清产生的中和抗体水平和病毒接种猪血清相比比较低, 可以50%中和自身病毒的血清稀释度都在1∶20~1∶40。 对于分离病毒接种猪血清的中和能力更加低, 分离病毒接种猪感染2 周就可以产生高水平的中和抗体, 50%中和病毒的血清稀释度都在1∶80 以上, 对两种病毒的中和能力都比较。

3 讨论

危害养猪业的严重传染病就包括猪伪狂犬病, 对猪伪狂犬病的预防主要依靠基因缺失疫苗的接种[2]。

采用微量中和实验进行血清学进行分析, Bartha k61 接种猪血清所产生的中和病毒接种猪血清产生的中和抗体水平比较低, 对新分离的病毒接种猪血清产生的抗体水平较高, 表明PR当下流行的病毒株和疫苗株之间在抗原性上存在一定的差异。

摘要：我国多个省份的大规模养猪场都出现过新生仔猪神经疾病和死亡的案例, 为了确定是否猪伪狂犬病病毒的感染所致, 本次研究选取我国多个省份的13个PR免疫猪场送检的156份病毒样品, 采用PCR方法对死亡仔猪脑组织中扩增PRV的g E基因, 进行PRV病毒的分离鉴定和血清中和实验及g E基因序列分析。将疑似PR病毒发病猪的脑部组织进行匀浆, 提取其DNA进行PRV检测, 发现各个猪场都存在病毒感染。结论:依据本次实验结果进行推测, 当下各个猪场流行的PRV病毒可能存在一定的抗原变异。

关键词：猪伪狂犬病病毒,新流行株,分离鉴定,抗原差异性分析

参考文献

[1]彭金美, 王瑜, 田志军, 等.带BAC质粒的重组伪狂犬病病毒的构建及其体外生长特性研究[J].中国预防兽医学报, 2010, 31 (1) :10-15.