伪狂犬病病毒

伪狂犬病病毒（精选十篇）

伪狂犬病病毒 篇1

1 发病情况

奎屯地区某猪场饲养母猪18头, 仔猪及育肥猪131头。自2011年10月15日以来, 该猪场有8头母猪, 31头仔猪相继发病, 到19日已有3头母猪流产, 7头仔猪育肥猪死亡。发病猪多为断奶40~60d的50kg体重以上的。主要表现为被毛粗乱, 食欲减退, 进行性消瘦, 体温高热40~41.5℃, 呼吸困难, 耳朵发绀, 背臀部和下腹部发红、发紫有血点, 指压不褪色。粪便干燥呈球状, 个别发病猪便秘和下痢交替进行, 尿少赤黄, 有些猪死前出现神经症状, 经问诊, 了解到发病猪群均接种过猪瘟、口蹄疫、高致病性蓝耳病等疫苗, 未接种圆环病毒、伪狂犬病等传染病疫苗。

2 剖检变化

剖检病死猪仔猪1头、育肥猪2头, 可见颌下淋巴结、腹股沟淋巴结肿大, 有充血出血;肺部肿胀有出血点;肝脏表面有白色坏死灶和出血点;脾脏梗死, 边缘有出血点。肾脏表面有针尖大小出血点;部分猪小肠有出血, 回肠、大肠有大小不一的溃疡。

3 实验室诊断

3.1 细菌学诊断

无菌采集病料涂片, 革兰氏染色, 未见革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

3.2 血清学诊断

无菌采集发病猪血清, 用深圳市康百得生物科技有限公司生产的猪圆环病毒 (Ⅱ) 型抗体快速检测卡, 猪伪狂犬病毒抗体快速检测卡;猪瘟抗体快速检测卡, 猪蓝耳病抗体快速检测卡进行检测, 结果表明该样品猪圆环病毒、猪伪狂犬病、猪瘟、猪蓝耳病抗体均为阳性。

3.3 病原学诊断

无菌采集发病猪血清, 采用分子生物学检测技术, 用圆环病毒PCR试剂盒进行病原检测, 5份血清样品中, 3份呈阳性。

由于发病猪群均接种过猪瘟、口蹄疫、高致病性蓝耳病等疫苗, 未接种圆环病毒、伪狂犬病等传染病疫苗。根据圆环病毒、伪狂犬病血清抗体阳性、圆环病毒病原阳性, 并结合以上临床症状、剖检变化, 综合诊断该猪场主要由猪圆环病毒Ⅱ型与猪伪狂犬病混合感染引发疾病。

4 控制措施

(1) 立即对病猪或疑似病猪进行隔离;对病死猪及其污染物进行无害化处理。

(2) 对病猪采用圆蓝多抗进行治疗, 每头猪肌肉注射2ml, 每天1次, 连用5d, 配合使用头孢类、青霉素类抗菌药物, 以控制细菌性继发感染, 在每吨饲料中添加黄芪多糖粉500g、强力霉素300g, 同时拌入三仙汤1套 (用于清瘟败毒) , 连用7d, 提高猪体免疫抗病力, 补充电解质和多种维生素等措施对症治疗。

(3) 加强疫苗免疫接种工作。对未发病的猪群立即紧急免疫猪伪狂犬病疫苗, 7d以后免疫猪圆环病毒疫苗。

(4) 加强猪场饲料管理, 彻底清除猪舍内粪便并进行无害化处理, 按1:300的比例用碘制剂、百毒杀等喷雾消毒, 每天1次, 连续5d。保持猪舍干燥和通风, 降低饲养密度, 减少猪群转圈和混群次数, 不使用霉变和劣质饲料, 保障充足的营养。

伪狂犬病病毒 篇2

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)和伪狂犬病(pseudorabies,PR)是两种严重危害养猪业的重要病毒性的.传染病.而引发PR的伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)是构建基因工程疫苗优良的活病毒载体[1].已有报道将表达猪瘟病毒(hog cholera virus, HCV)囊膜蛋白E1基因的重组PRV(rPRV)二价基因工程疫苗免疫猪后, 能同时抵抗HCV和PRV的强毒攻击[2],显示了PRV作为活病毒载体的可行性和“一针防两病”的独特优点.由ORF5基因编码的囊膜糖蛋白GP5是猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)最主要的免疫保护性抗原蛋白[3].

作 者： 赵武 肖少波 方六荣 江云波 宋云峰 严琳 余晓岚 陈焕春 ZHAO Wu XIAO Shao-bo FANG Liu-rong JIANG Yun-bo SONG Yun-feng

刊 名： 病毒学报  ISTIC PKU 英文刊名： CHINESE JOURNAL OF VIROLOGY 年，卷(期)： 2006 22(1) 分类号： Q786 关键词： 牛疱疹病毒1型VP22   猪繁殖与呼吸综合征病毒   ORF5M基因   重组伪狂犬病毒

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猪伪狂犬病病毒泰州株的分离鉴定 篇3

关键词：猪伪狂犬病毒；分离；鉴定

中图分类号： S858.285.3 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）03-0200-03

伪狂犬病（pseudorabies，PR） 是由伪狂犬病病毒 （pseudorabies virus，PRV）引起多种家畜和野生动物以发热、奇痒（猪除外）和脑脊髓炎为主要症状的急性传染病[1]。以猪的感染最为普遍，该病毒能引起母猪的繁殖障碍，主要表现为流产、死胎、木乃伊胎等；新生仔猪发生感染时，死亡率可高达100%；此外，育肥猪感染往往致使其生长缓慢，种公猪感染则导致精液品质下降甚至丧失种用价值[2]。伪狂犬病最早在美国发现，我国于20世纪40年代末在猫中首次发现了该病毒，60年代初在猪群中也出现了该病毒流行。目前，该病在我国广泛流行，严重威胁着猪群的健康，并造成了养猪业严重的经济损失[3-4]。本研究对泰州市某猪场疑似伪狂犬病患猪采集肝、肾及脾等组织病料，进行PRV的分离、鉴定，以期为今后深入研究和科学地防控该病提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料

疑似伪狂犬病病猪的肝、肾及脾等组织，于2013年4月17日采自泰州市姜堰区某猪场。将采集的病料研碎，按 1 g ∶5 mL 加入无菌含双抗的PBS溶液，混匀，反复冻融3次，离心取上清，用孔径0.22 μm滤器过滤后，-20 ℃保存备用。

1.2 试剂、细胞、阳性血清及家兔

基因组DNA快速抽提试剂盒（动物）、Taq DNA聚合酶、dNTP Mix、25 mmol/L MgCl2及10×PCR buffer均为上海生工生物工程有限公司产品，100 bp DNA Ladder和6×DNA 凝胶载入染料（Loading Dye）购自Fermentas公司。PK15细胞由江苏省动物流行病学研究中心保存。猪源抗PRV阳性血清，购自VMRD公司，羊抗猪IgG-FITC，购自SANTN CRUZ公司。胰酶细胞消化液，购自上海碧云天生物技术有限公司；新生牛血清和DMEM培养基购自上海生工生物工程有限公司。健康的家兔4只，购自江苏农牧科技职业学院农场。

1.3 引物的设计与合成

根据文献[5]方法，合成1对PRV引物，片段针对PRV gH基因中的一段序列，扩增片段长355 bp。引物序列为：上游引物5′-GCGTGTACTGCGACTGCGTGTT-3′；下游引物 5′-CGACCTGGCGTTTATTAACCGAGA-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 病毒核酸的提取及PCR

用基因组DNA快速抽提试剂盒，按说明书上的操作方法提取组织病料DNA。以提取的组织病料DNA为模板进行PCR扩增，PCR采用50 μL反应体系：5 μL 10×buffer、3 μL 25 mmol/L MgCl2、1 μL 10 mmol/L dNTPs、20 μmol/L上下游引物各1 μL，用灭菌超纯水补足50 μL。反应条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。用15 g/L琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察电泳图谱，拍照记录结果。

1.5 病毒的分离

将上述“1.1”节处理的经PCR检测呈PRV阳性的病料悬液接种于PK15单层细胞上，37 ℃孵育1 h后弃接种液，加入含2%新生牛血清的DMEM培养液，置于37 ℃、50 mL/L CO2培养箱，每日观察，盲传至细胞病变稳定、病变率达80%时收毒，对收获的病毒液PCR检测PRV。

1.6 病毒的IFA鉴定

将分离毒接种至长满单层的PK15细胞，37 ℃孵育1 h后，吸取病毒液，PBS洗涤2次，加入维持液于37 ℃、5% CO2培养箱中培养72 h；同时以未接种病毒的PK15细胞作为阴性对照。待检细胞使用PBS洗涤3次，冰甲醇4 ℃固定 30 min；PBS洗涤3次，加入猪源抗PRV阳性血清，37 ℃孵育1 h；PBS洗涤3次，再加入FITC标记的羊抗猪抗体，37 ℃孵育1 h，PBS洗涤3次后，置于Olympus倒置荧光显微镜下观察。

1.7 病毒滴度测定

将病毒液稀释成10-1～10-10，分别接种到96孔培养板中长成融合单层的PK15細胞上，每个稀释度接种8孔，培养板最后2列孔接种稀释液作对照，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，96 h后观察细胞病变，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50。

1.8 家兔接种试验

用PRV分离毒株腹侧皮下接种2只家兔，2 mL/只；另取2只作为阴性对照组，分别注射细胞维持液，2 mL/只。试验组和对照组隔离饲养，每日观察记录家兔的临床表现。

2 结果与分析

2.1 病料的PCR检测

对疑似PRV感染猪组织病料提取DNA，然后进行PCR检测，扩增出片段大小为355 bp的目的条带，与预期结果相符（图1）。

2.4 病毒滴度

统计不同稀释度的分离毒在96孔细胞板上PK15细胞中出现的致细胞病变效应（cytopathic effect，CPE），按Reed-Muench法测得分离毒滴度可达108.12 TCID50/mL。

2.5 家兔感染试验

2只试验组家兔在接种细胞病毒液后约48 h表现奇痒症状，不断啃咬腹侧注射部位，掉毛出血；接种后62 h时出现角弓反张而死亡。注射细胞维持液的对照组家兔观察7 d后均无异常表现。死亡兔剖检可见脑膜充血、肺瘀血，并有大小不等的出血斑点，气管环充、出血，肝瘀血肿大、有坏死灶等（图4）。

3 结论与讨论

PR是危害养猪业的重要传染病[6]，我国是一个养猪大国，因而对该病病原的深入研究具有非常重要的意义。

PCR技术是从分子水平对病毒进行诊断的一种方法，能检出痕量病毒。PCR具有快速、敏感、特异性强等优点，不仅可以检测细胞培养的PRV，而且可以直接检测临床样品[7]。本试验先对临床PR可疑病猪采集病料进行PCR检测，检测阳性后才接种到细胞，提高了细胞分离的成功率。

PRV具有泛嗜性，能在许多细胞中增殖。猪的PK-15、SK6、PS细胞，仓鼠的BHK-21，猴的Vero细胞、GMK细胞和兔的EP细胞等都能用于增殖该细胞，其中PRV对猪肾细胞和兔肾细胞最为敏感，生产上常使用猪细胞系PK-15或 SK-16 细胞进行PRV的培养。本试验选用PK-15细胞分离培养，除了PRV对其具有较强的敏感性外，该细胞还具有易培养、增殖速度快等特点[8]。

IFA是我国目前用于PR快速诊断的一种较好方法，该方法具有特异性高，不与细小病毒、腺病毒、血凝性脑炎病毒及肠道病毒发生交叉反应，以及敏感性较高等特点[9]。对本次细胞病毒的鉴定采用了IFA方法，发现分离病毒感染PK15后呈现明显的特异性绿色荧光，而未接种PRV的PK15细胞没有观察到任何特异性荧光。

动物接种试验是PR常用的检测方法。将病料或分离的病毒上清液皮下接种到家兔或小鼠，根据家兔或小鼠的临床症状做出判定。若接种液中含有PRV，家兔会不停啃咬接种部位，随即后肢麻痹，卧地不起，最后抽搐死亡；小鼠接种含有PRV的病料，也会出现神经症状，最后死亡。本试验使用学校牧场饲养的健康家兔，接种细胞毒后3 d内发病死亡，观察到典型的神经症状，且解剖见到明显的内脏病理变化。

本试验将PCR检测后PRV阳性的病料接种PK15细胞，经IFA鉴定、病毒滴度测定及家兔接种试验，结果成功分离出一泰州株PRV。该毒株的获得，为今后深入研究该病毒的分子生物学特性及开发有效的免疫制剂提供了科学的参考依据。

参考文献：

[1]斯特劳 B E. 猪病学[M]. 8版.赵德明，译. 北京：中国农业大学出版社，2000：239-253.

[2]初小辉. 吉林省猪伪狂犬病流行病学调查与防控措施的研究及应用[D]. 长春：吉林大学，2011.

[3]Tamba M，Calabrese R，Finelli E，et al. Risk factors for Aujeszkys disease seropositivity of swine herds of a region of northern Italy[J]. Preventive Veterinary Medicine，2002，54（3）：203-212.

[4]童 武，张青占，郑 浩，等. 免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定[J]. 中国动物传染病学报，2013，21（3）：1-7.

[5]胡 慧，贾艳艳，杨春华，等. 多重PCR检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的研究[J]. 河南农业大学学报，2010，44（4）：421-424.

[6]彭金美，安同庆，赵鸿远，等. 猪伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定及抗原差异性分析[J]. 中国预防兽医学报，2013，35（1）：1-4.

[7]Echeverría M G，Pecoraro M R，Pereyra N B，et al. Rapid diagnosis of pseudorabies virus infection in swine tissues using the polymerase chain reaction（PCR）[J]. Revista Argentina de Microbiología，2000，32（3）：109-115.

[8]吳云飞，朱 玲，徐志文，等. 伪狂犬病病毒四川株的分离鉴定及增殖特性[J]. 中国兽医科学，2013，43（6）：557-564.

伪狂犬病病毒 篇4

1 临床症状

哺乳仔猪在出生后2~3 d发病, 腹泻日龄早, 最早可在1日龄。表现为肌肉震颤, 精神沉郁, 吮乳无力、, 流涎、眼睑水肿共济失调、呕吐、水样腹泻、消瘦, 黄色稀粥样粪便, 无恶臭味, 无过多的气泡, 未见眼观的血液成分。未见传染性胃肠炎样水样腹泻。呕吐物为黄白色凝乳块与胃液, 腹泻前多呕吐, 腹泻开始呕吐停止。发病1~2 d后, 病猪口吐白沫、磨牙、呆立或盲目行走, 抽搐、癫痫、角弓反张, 最后死亡, 往往全窝无一幸免, 病程约4~5 d。

2 流行病学

腹泻多发生于哺乳仔猪, 连续多批次发生, 发病率为50%~100%, 按病毒性腹泻或细菌性腹泻治疗死亡率80%~100%。其他猪均不发生, 产房的卫生管理与平时相同, 找不到相关原因, 同样也找不到外源性疾病传入的迹象, 主要发生在中、小猪场。不分季节, 四季均有发生, 但是以冬春多发。

3 病检变化

小肠、大肠黏膜有轻度至中度充血或出血, 肠壁不同程度变薄, 肠内容物呈稀粥样黄白色, 无特殊恶臭味, 部分病例无肠内容物;肠黏膜皱褶减少乃至消失, 肠系膜淋巴结髓样肿或轻度出血, 胆囊萎缩、内无胆汁, 或胆囊肿大壁薄, 内有不等的黄色至褐色稀薄胆液;肾脏肿大, 肾包膜时多有包膜纤维深入肾皮质而不易剥离, 肾上腺双侧性肿大, 皮质髓质有不同程度出血;心肌松软色淡, 心脏横径增大, 冠状脂肪呈胶冻样浸润, 其它脏器难见大体病变。部分病例剖检可见典型伪狂犬病病变或者猪瘟病变。

4 治疗效果

在感染本病的猪场, 一旦发现疑似猪伪狂犬病病毒感染引起的以哺乳仔猪为主的腹泻, 立即使用猪用转移因子10头/支 (大连三仪) +猪伪狂犬病疫苗1头份 (南京天邦) , 同时配合内服补液盐。通过对多批次哺乳仔猪的对比治疗, 总有效率达95%以上, 取得较好的治疗效果。

5 预防措施

一起猪伪狂犬病的诊治体会 篇5

伪狂犬病是由伪狂犬病毒引起的多种哺乳动物、野生动物和人易感染的.一种高度接触性急性传染病.以发热及脑脊髓炎为主要特征.仔猪表现呕吐、腹泻及神经症状,母猪表现流产、死胎,育肥猪呈隐性经过.

作 者：赵永明  作者单位：榆树市动物卫生监督所,吉林,榆树,130400 刊 名：吉林畜牧兽医 英文刊名：JILIN ANIMAL HUSBANDRY AND VETERINARY MEDICINE 年，卷(期)：2009 30(10) 分类号：S858.28 关键词： 

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猪伪狂犬病的防制 篇6

关键词：猪伪狂犬病；防制

中图分类号：S858.3 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2014）02-0049-02

猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒（PRV）引起仔猪脑脊膜炎、败血症、母猪流产、产死胎和木乃伊胎等症状的一种传染病。近年来，有效的疫苗免疫极大地减少了典型的伪狂犬病临床症状，但是国内猪群的野毒阳性率仍然很高，在免疫失败（如疫苗质量差、免疫程序不合理、操作不规范及其它免疫抑制因素等）、饲养管理不好，带毒猪会排毒引起新的传染，导致伪狂犬病流行。笔者2013年接诊了2例猪伪狂犬病，现将情况报告如下。

1 病例1

1.1 基本情况

该户饲养有母猪80余头，从事养猪8年，场地建在远离村庄、三面环山的山坡上，防疫条件较好。未进行伪狂犬疫苗免疫。

1.2 临床症状

2013年7月初，部分母猪在配种后65～75 d发生流产，产死胎、木乃伊胎，半月内先后出现10来头，且母猪配种返情率高；之后产房小猪出现精神倦怠，发烧（41～42 ℃），厌食，不吃奶，口吐白沫，呼吸困难，共济失调，四肢抽搐，出生15 内仔猪死亡率100%，一月内损失哺乳期仔猪180余头。

1.3 现场剖检

见扁桃体有白色坏死点，肝脏和脾脏有疱疹样黄白色坏死点；肺表面有坏死点，脑膜充血。

1.4 诊断

结合免疫情况、临床症状、病理剖检变化，初步诊断为猪伪狂犬病。用病料研磨成混悬液皮下接种兔子，注射部位出现“奇痒”致死现象。

1.5 治疗

全部母猪用伪狂犬疫苗紧急免疫注射2头份/头，间隔一个月相同剂量加强一次，之后每隔3个月一次；初生仔猪伪狂犬疫苗滴鼻一头份/头，同时肌肉注射一头份/头，2 h后再让仔猪吃奶；母猪紧急免疫20 d后，初生小猪不进行超免，所生仔猪已全部成活。

2 病例2

2.1 基本情况

该户饲养母猪110头，自繁自养大猪出售。母猪免疫猪瘟、猪蓝耳苗，猪伪狂犬疫苗，每年二次，每次一头份，母猪偶尔有流产。

2.2 临床症状

产房小猪初生较好，5～7 d出现后出现腹泻，眼角膜炎，抗菌素治疗效果差；被毛粗乱无光，小猪逐渐消瘦，死亡率20%～30%，产房腹泻长时间、未能解决；保育小猪生长不整齐，被毛松乱，打喷嚏，咳嗽，采食量低，生长缓慢；生长猪不整齐，咳嗽，部分腹式呼吸，眼结膜炎，分泌物多，生长较慢，饲料报酬低。

2.3 诊断

经腾骏生物技术研究所广西大学分所（南宁）实验室检验，猪伪狂犬病原检测PCR检测呈阳性；猪蓝耳病病原RT-PCR检测呈阴性；猪瘟病原RT-PCR检测呈阴性，诊断为猪伪狂犬病。

2.4 治疗

全部母猪用伪狂犬疫苗免疫注射3头份/头，间隔4周加强一次，之后母隔3个月免疫一次。初生仔猪12 h内伪狂犬疫苗滴鼻一头份/头，同时肌肉注射一头份/头。

出生40日龄时用伪狂犬疫苗2头份加强一次，解决保育猪生长不整齐，被毛松乱，打喷嚏，咳嗽，采食量低，生长缓慢。出生90～100日龄用伪狂犬疫苗2头份∕头再加强一次，解决生长猪的不整齐，咳嗽，眼结膜炎，分泌物多。经上述方法处理一月后，哺乳期仔猪明显改善，下痢大幅度减少，成活率上长至93%；二个月后回访，房产、保育生产成绩均达95%；三个月后再回访，生长猪的呼吸道症状明显下降，各环节生产成绩均达95%以上。

3 小结

伪狂犬病病毒 篇7

关键词：伪狂犬病毒,gE基因,PCR,检测

猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)属于疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科, PRV只有1个血清型,可感染多种动物,其中猪最敏感,发病也最严重,常呈流行性感染。猪伪狂犬病的临诊症状受年龄和感染毒株毒力的影响而有很大区别,仔猪表现为发热、呕吐、呼吸因难、间歇性痉挛等症状,病死率很高;母猪发生流产及产木乃伊胎、死胎[1,2]。成年猪感染该病毒后多耐过,不发病而呈隐性感染,造成长期带毒、排毒,成为极危险的传染源,因此做好该病的诊断显得尤为重要。

目前,国内外已经建立的实验室检测方法有病毒分离试验、琼脂免疫扩散试验(AGID)、中和试验(SN)、ELISA、乳胶凝集试验(LAT)等[3,4,5],与这些方法相比,PCR具有敏感性高、特异性好、快速、简便、病料采取方便等优点,能同时检测大批量的样品,是最常见和最普遍的诊断方法。现在,对于该病的防治普遍采用缺失gE基因的基因工程疫苗[6]。本研究根据PRV Min-A株gE基因的一段序列,在保守区域设计1对引物,拟建立针对PRV野毒感染的PCR诊断技术,为兽医临床提供一种快速、准确、实用的PRV检测方法,也为基层展开大规模流行病学调查与疫情监测提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株

猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)等参考毒株,均由四川农业大学动物生物技术中心保存。

1.1.2 主要试剂

DNA提取试剂盒,购自北京博迈德生物公司;2×GC Buffer、rTaq DNA 聚合酶、dNTP、pMD19-T载体、DL-2 000 Marker和胶回收试剂盒,均购自宝生物工程(大连)有限公司;其余试剂均为国产或进口分析纯。

1.1.3 病料

43份猪淋巴结病料,于2009年9—10月份采自四川省简阳、 遂宁、眉山等地区的规模化猪场。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计

参照 GenBank的全基因序列中的PRV Min-A株(登录号为AF170318.1)gE基因的保守区序列设计1对特异性引物,序列为P1 5′-GCTCTGCGTGCTGTGCTCC-3′,P2 5′-GGGTCCATTCGTCACTTCCG-3′,预扩增的片段大小为348 bp。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2.2 PCR反应模板的制备

提取PRV Min-A株细胞毒DNA并作为PCR反应模板,提取方法参照细胞基因组DNA提取试剂盒说明书进行。测定OD值并计算使DNA的浓度为1 000 ng/mL,-20 ℃保存,备用。

1.2.3 PCR反应条件的优化

以PRV Min-A株提取的细胞病毒 DNA为模板,在保持其他参数一致的条件下,通过改变单一因子来筛选某个最佳参数,分别对退火温度、Mg2+浓度、引物浓度进行筛选。在对PCR反应参数进行筛选时, 其他参数设定按如下体系:2×GC Buffer (5 mmol/L Mg2+)12.5 μL,dNTPs (10 mmol/ L) 4.0 μL,上、下游引物(25 pmol/ L)各1.0 μL,rTaq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.5 μL,DNA模板2.0 μL,补ddH2O至25.0 μL。PCR反应程序:95 ℃ 5 min; 95 ℃ 45 s, 55 ℃ 40 s,72 ℃ 45 s, 共30个循环;72 ℃ 10 min。电泳观察结果。

1.2.4 PCR产物的克隆、鉴定

对PCR产物进行琼脂糖电泳检测,切下特异性目的条带,用胶回收试剂盒进行回收。取回收产物与pMD19-T 载体进行连接、转化,挑选阳性重组质粒,送上海英骏生物技术有限公司测序。将所得的序列与NCBI网站上GenBank中的序列进行Blast比对、分析。

1.2.5 特异性试验

采用优化后的反应体系,用同样方法对PRRSV、PCV2、CSFV、PPV等参考毒株进行RT-PCR或PCR操作,以验证该方法的特异性。

1.2.6 敏感性试验

采用优化后的反应体系,分别选择以下模板量100 ng、50 ng、10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg进行PCR扩增,验证该方法的敏感性。

1.2.7 重复性试验

采用优化后的反应体系,将提取的PRV 细胞毒DNA在相同条件下重复进行5 次PCR检测,以验证该方法的重复性。

1.2.8 临床应用

用反应条件优化后的PCR方法对采自四川省部分地区的43份病料进行PCR检测。

2 结果

2.1 各参数的优化结果

试验以PRV Min-A株细胞毒DNA为模板进行PCR扩增,对其退火温度、 Mg2+浓度、引物浓度进行优化。结果表明,退火温度为50～62 ℃、引物浓度为0.2～ 0.9 μmol/L、 Mg2+浓度为2.5～5.0 mmol/L时都能扩增出长约348 bp的预期片段, 电泳条带明亮、清晰,非特异性条带少,具体见图1～3。

M.DL-2 000 Marker;1～7.温度分别为50,52,54, 56,58,60,62 ℃。

M.DL-2 000 Marker;1～8.引物浓度分别为0.2,0.3, 0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9 μmol/L。

M.DL- 2 000 Maker;1～6.Mg2+浓度分别为2.5,3.0, 3.5,4.0,4.5,5.0 mmol/L 。

从以上PCR优化结果来看,PCR反应在如下体系、反应程序中都能扩增出明亮、清晰、特异的条带。反应体系:2×GC Buffer (5 mmol/L Mg2+)12.5 μL,2.5 mmol/L Mg2+0～3 μL,10 mmol/L dNTPs 4.0 μL上、下游引物0.2～0.9 μmol/L,DNA模板2.0 μL,5.0 U/μL rTaq DNA聚合酶 0.5 μL,最后用去离子水补至25.0 μL。反应程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 45 s, 50～62 ℃ 40 s,72 ℃ 45 s, 共30个循环;72 ℃ 10 min。

2.2 PCR产物的序列测定及Blast在线比对结果

经BLAST 在线比对分析证实,扩增产物确为PRV gE基因片段, 其核苷酸序列与GenBank中PRV gE基因序列的同源性为98%,见图4。

2.3 特异性试验结果

对PRRSV、PCV2、CSFV、PPV参考毒株进行RT-PCR或PCR反应,同时用阴性Vero细胞提取的DNA作为阴性对照,发现只有 PRV参考毒株的PCR产物在348 bp附近有1条与预期大小相符的条带,而PRRSV、PCV2、CSFV、PPV参考毒株和阴性对照都没有条带,具体见图5。

1～4.PPV、CSFV、PCV2、PRRSV PCR产物;5.PRV PCR 产物;6.阴性对照;M. DL- 2 000 Marker。

2.4 敏感性试验结果

采用优化后的条件,分别选择以下模板量100 ng、50 ng、10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg 进行PCR扩增。模板量大于10 ng 时扩增条带非常明亮,模板量为10 pg时也可见扩增条带,1 pg时不能检测出,具体见图6 。

1～6.模板量分别为10 pg、100 pg、1 ng、10 ng、 50 ng、100 ng;7.阴性对照;M.DL- 2 000 Marker。

2.5 重复性试验结果

按同样的方法分别将提取的DNA 样品在相同条件下重复进行5次PCR扩增,结果均出现相同的检测结果,具体见图7。

M.DL- 2 000 Marker;1～5.PRV PCR产物。

2.6 临床样品的检测结果

用此次试验建立的PCR方法对采自四川省部分地区的43份病料进行PCR检测,结果发现28份病料呈阳性,检出率为 65.12%。各地区病料 PRV检出率的结果见表 1。

3 讨论

猪伪狂犬病毒能引起妊娠母猪流产及产木乃伊胎、死胎和弱仔,使初生仔猪出现神经症状,感染率和病死率可达100%,是养猪业的一种重要繁殖障碍性传染病。PRV引起的疾病的临床症状与 CSFV、PRRSV、PPV和PCV2所引起的疾病的临床症状具有相似性,极易混淆,另外成年猪感染后多耐过,呈隐性感染,不表现临床症状,不利于该病的诊断,因此建立一种快速、特异、敏感的检测方法对该病的预防将发挥极其重要的作用[8]。

目前, 国内外对PRV的诊断方法进行了大量研究, 并取得了一定进展, 主要包括血清学诊断方法和病原学诊断方法,这些方法各有其优点,但也存在一定的不足之处。市售的国内外生产的gE- ELISA试剂盒虽能检测野毒感染,但其重复性较低,敏感性不高,对隐性感染动物往往漏检,且各个厂商的试剂盒所测结果差别较大;病毒分离和病毒抗原检测是诊断PRV感染的重要方法,但只能用于出现病毒散播的急性感染期;而间接荧光抗体技术非特异性较高,重复性、稳定性还需进一步改进,而且价格昂贵[9]。

与这些检测方法相比,PCR具有操作简便、特异性和敏感性较高、快速等优点。研究根据PRV gE基因的DNA序列设计1对引物,用 PCR方法扩增出了长为348 bp 的条带。目前,缺失gE基因的基因工程疫苗是预防PRV 的首选疫苗,gE基因已被用作PCR诊断的最佳基因[10,11],该检测方法能特异地检测出PRV野毒株感染的动物。试验使用PCR方法通过对PCV2、CSFV、 PRRSV、PPV进行扩增检测,结果以上病毒无任何目的条带检出,表明用设计的引物进行 PCR 扩增具有良好的特异性。试验所建立的PCR方法在DNA 模板量为10 pg时仍能扩增出目的条带,表明检测灵敏度很高。多次重复性试验仍能得到同样的结果,表明试验所建立的针对 PRV 的PCR快速检测方法具有很好的重复性。用该方法对四川地区部分猪场送检的43份疑似PRV感染的样品进行检测,其中28份样品能扩增出与预期大小相符的PCR产物,阳性率达65.12%。综上所述,该检测方法可用于PRV的分离鉴定、临床病料的检测以及大规模流行病学调查,为我国 PRV疫情监测提供了相应的技术支持。

参考文献

[1]殷震,刘景华.动物病毒学[M].2版.北京:科学出版社,1997:1180-1183.

[2]斯特劳B E,阿莱尔S D.猪病学[M].8版.赵德明,等译.北京:中国农业大学出版社,2000:239-253.

[3]YOON HA,EO S K,ALYAS A G,et al.Investigation of Pseudora-bies virus latency in nervous issues of seropositive pigs exposed tofield strain[J].J Vet Med Sci,2006,68(2):143-148.

[4]娄高明,杜伟贤,廖筱萍,等.PCR检测伪狂犬病病毒DNA[J].中国生物化学和分子生物学报,2001,17(4):519-523.

[5]王莉娟,陆明哲,陈义平,等.PR病检测技术研究进展[J].中国畜牧兽医,2005,32(6):42-43.

[6]张建永,祖立岩.猪伪狂犬活疫苗基因缺失株综述[J].北方牧业,2007(23):27.

[7]周斌,苏鑫铭,张素芳,等.PCR快速检测伪狂犬病病毒野毒感染[J].中国病毒学,2004,19(6):612-615.

[8]焦明,赵玉军,庄金秋,等.猪伪狂犬病诊断方法研究进展[J].动物医学进展,2007,28(1):88-91.

[9]MAES R K,BEISE C E,SPATZ S J,et al.Polymerase chain reactionamplification of pseudorabies virus DNAfromacutely and latently in-fected cells[J].Vet Microbiol,1990,24(3/4):281-295.

[10]HEFFNER S,KOVACS F,KLUPP B G,et al.Glycoprotein gp50-negative pseudorabies virus:a novel approach toward a nonspreadinglive herpesvirus vaccine[J].J Virol,1993,67(3):1529-1537.

伪狂犬病病毒 篇8

1材料与方法

1.1细胞及病毒

猪睾丸传代细胞 (ST) 、BHK-21细胞、猪肾传代细胞 (PK-15) 、非洲绿猴肾传代细胞 (Vero) 均由本实验室保存。

猪伪狂犬病病毒PRV由本实验室分离鉴定并保存。

1.2试剂

DMEM、新生犊牛血清均购自GIBCO公司。

1.3方法

1.3.1病毒增殖将培养的ST、BHK-21、PK-15、MVero等细胞置于显微镜下观察, 待细胞长成致密单层后即可用于病毒繁殖。每种细胞取三瓶, 弃去生长液, 两瓶用于病毒增殖, 一瓶作为对照。每个细胞瓶中按维持液的1%接种PRV病毒, 置于37℃孵育1h, 弃去病毒液, 每瓶加入10m L含2%新生犊牛血清的维持液, 置于37℃、5%CO2培养箱中培养。每天观察细胞病变情况, 当80%细胞发生病变时收毒, 将细胞瓶置于-20℃冰箱中反复冻融3次, 保存于-70℃备用。

1.3.2病毒含量测定用DMEM培养液将病毒液作10倍系列稀释, 即10-1、10-2……10-8, 分别取100μL加至96孔细胞培养板, 每个稀释度作6个重复, 然后, 每孔加入100μL经胰蛋白酶-EDTA消化分散的BHK21细胞悬液, 并设正常细胞对照, 置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养, 逐日观察细胞病变和细胞对照, 观察2~4d, 记录细胞病变的孔数, 并按照Reed-Muench法计算病毒液的TCID50。

2结果

2.1细胞病变情况

2.2病毒含量 (TCID50) 测定结果

注:表中的数据为3次重复的平均数, 以log10的负对数表示。

由表2可以看出PRV在BHK-21细胞上增殖的病毒含量较高, 达到108.6 TCID50/m L, 在PK-15细胞上增殖较慢, 仅为107.2 TCID50/m L。

3讨论

伪狂犬病病毒 篇9

1材料

1.1细胞 PK-15、ST、Vero细胞购自中国兽医药品监察所, 由广东大华农动物保健品股份有限公司传代、冻存、鉴定。鸡胚成纤维细胞 (CEF细胞) 按现行《中国兽药典》制备方法获得。

1.2毒种 猪伪狂犬病病毒毒种 (Bartha-K61株) 购自中国兽医药品监察所, 由本公司扩繁、鉴定、保存。

1.3试剂 DMEM购自美国Gibco公司, 胎牛血清购自内蒙古金源康生物工程有限公司, 胰酶、细胞消化液胰酶-EDTA溶液均为本公司自配。

细胞生长液:DMEM+10%胎牛血清

细胞维持液:DMEM+2%胎牛血清。

2方法

2.1细胞传代:按常规方法培养细胞[2]。取生长良好的PK-15、ST、Vero细胞。

用细胞消化液消化后, 按1:3比例传代, 分别分装至75 cm2细胞培养瓶置37℃、5%CO2培养箱培养待长成单层备用。

CEF细胞制备:按药典附录制备方法制备CEF, 24 h成单层备用。

2.2病毒增殖:弃去细胞生长液, 将猪伪狂犬病病毒按1%接种量接种上述4种已长成单层的细胞, 加细胞维持液, 置37℃、5%CO2培养箱培养, 观察细胞病变 (CPE) , 当CPE达到80%收获病毒, 置-20℃冻融3次, 测定TCID50。试验重复2次。

3结果

3.1猪伪狂犬病毒在四种细胞上的病变情况

将猪伪狂犬病毒接种PK-15、ST、Vero、CEF细胞均引起细胞病变, 细胞产生病变的时间大约分别在17 h、24 h、20 h、24 h, 与健康对照细胞比较, 可见病变细胞变圆、变大, 折光度增强。2次试验结果一致。

3.2猪伪狂犬病毒TCID50测定

将在PK-15、ST、Vero、CEF细胞上增殖的猪伪狂犬病毒分别用各自对应的细胞进行病毒含量测定, 结果如下:

4讨论

猪伪狂犬病病毒 (Bartha-K61株) 接种PK-15、ST、Vero、CEF细胞均出现了明显的细胞病变, 说明该毒株可在多种细胞上增殖。从我们实验结果看, PK-15、ST细胞增殖效果明显优于Vero和CEF细胞, 彭丽英等[3]和王大伟等[4]研究证实猪伪狂犬病毒还可以在幼仓鼠肾细胞 (BHK-21) 上增殖, 但以病毒含量作比较, 彭丽英等[3]的研究结果显示猪伪狂犬病病毒 (Bartha-K61株) 在BHK-21细胞上的增殖效果和在CEF细

胞上的增殖效果差不多。由于本实验室未保存BHK-21细胞, 因此未开展猪伪狂犬病病毒 (Bartha-K61株) 在BHK-21细胞上的增殖研究, 结合本实验室研究结果和彭丽英等[3]的研究结果, PK-15、ST细胞是最适宜猪伪狂犬病病毒 (Bartha-K61株) 增殖的细胞。本实验室较早建立了ST细胞库, 有详细的细胞鉴定记录, 而且生产和检验方面使用ST细胞的频率也很高, 如果以后开展猪伪狂犬病活疫苗 (Bartha-K61株) 相关质量研究的课题, 在病毒培养方面, 选择ST细胞作为猪伪狂犬病病毒 (Bartha-K61株) 的增殖细胞应该是最合适的。

参考文献

[1]郝鹏, 阿兰.PK-15、ST细胞增殖伪狂犬弱毒效果的比较[J].首届中国兽药大会-兽医生物制品学、兽医微生物学学术论坛论文集 (2008) , 339~340.

[2]司徒镇强, 吴军正.细胞培养[M].第1版.西安:世界图书出版西安公司, 2004, 78~80.

[3]彭丽英, 倪建平.猪伪狂犬病病毒在不同细胞中增殖的研究[J].上海农业学报, 2011, 27 (4) 67~69.

伪狂犬病毒载体的研究进展 篇10

1 猪伪狂犬病毒基因组结构

猪伪狂犬病毒 (PRV) 属于疱疹病毒科中的猪疱疹病毒Ⅰ型。病毒基因组为线状双链DNA, 长度为150kb, C+G含量约为74%, 由长独特区 (UL) 和短独特区 (US) , 以及US两侧的重复序列 (TRS) 与内部重复序列 (IRS) 所组成。US和UL区段, 含有至少70个基因, 可编码70~100种蛋白质, 成熟的病毒粒子只含有约50种蛋白质[2]。

在PRV中已发现11种糖蛋白, 分别命名为g B (gⅡ) 、gc (gⅢ) 、g D (gp50) 、g E、g G (g X) 、g H、g I (gp63) 、g K、g L、g M和g N, 它们已被定位和测序[3]。病毒增殖的必需的糖蛋白主要有g B、g D、g H、g L、g K;非必需糖蛋白是决定毒力因素的因子, 主要有g E、g I、g G、g C、g M、g N等, 除g G外均为成熟病毒粒子的结构成分, g G常存在于感染细胞分泌物中[4]。

2 伪狂犬病毒表达载体的优越性

基因组庞大, 含有多个复制非必需区, 其容量可高达40Kb, 可在其感染的细胞中忠实的进行修饰, 外源基因的表达产物可以诱导机体产生持续时间较长的体液与细胞免疫反应。除此之外, 伪狂犬病毒的宿主范围较大, 能感染多种动物和野生动物, 这就为一苗多用打下了很好的基础。最为重要的是在重组伪狂犬病毒中所表达的蛋白质可以进行翻译后加工、修饰, 其中许多过程与体内相类似, 因此表达产物具有天然蛋白质的活性, 并且保留了其相应的抗原性、免疫原性及功能。

3 重组伪狂犬病毒的构建

3.1 构建原理

重组伪狂犬病毒的构建应分两部分进行:第一步是构建重组质粒。此质粒应含有启动子, 下游接表达的外源基因, 有时为筛选方便, 还要插入有启动子标记的基因如Lac Z等, 它们的两侧是伪狂犬病毒特异的DNA同源序列;第二步是将重组质粒导入伪狂犬病毒感染的细胞中, 伪狂犬病毒DNA与重组质粒中的同源序列在细胞内发生同源重组, 从而将外源基因装到伪狂犬病毒基因组的特定部位, 构建出重组病毒。

3.2 筛选方法

目前最常用的方法是通过化学底物及颜色变化等来筛选重组病毒, 即插入报告基因法, 将β-半乳糖苷酶 (Lac Z) 基因或者抗生素基因等与外源基因同时导入伪狂犬病毒基因组中, 通过在培养液中加入Xgal、G418等试剂来筛选重组病毒。

3.3 外源基因的表达调控结构

目前, 构建重组伪狂犬病毒所选用的主要是g G、g E启动子, 因其结构独特且活性较强。一般说来, 启动子序列距外源基因起始密码子越近时表达效果越好。

3.4 构建重组病毒注意事项

复制非必需区TK、g G、g E基因是目前应用较多的同源序列。再者, 还必须做好亲本病毒株的选择, 它应该是目前常规使用的疫苗株, 从而才能够不引起宿主发病;再就是考虑其亲本株的宿主特异性, 以对其它动物不构成威胁为前提。最后还要考虑到它所诱导的保护性免疫应答的类型, 是全身性免疫应答还是局部的黏膜免疫应答。

4 猪伪狂犬病毒载体的研究进展

4.1 PRV载体的构建

目前, PRV基因缺失疫苗株常常是通过缺失g E、g I、g G、g C、TK等非必需基因, 缺失分为单基因缺失和多基因缺失。 (1) 第1代基因缺失疫苗株。第1代基因缺失疫苗是指缺失PRV TK基因的疫苗, 世界上第1个获得批准使用的基因弱毒疫苗就是伪狂犬的TK缺失疫苗株BUK2dl3[5], 该病毒株通过基因工程技术在TK基因引入缺失, 在细胞培养上不能回复为TK+, 对猪不仅没有毒力而且具有较好的免疫原性。 (2) 第2代基因缺失疫苗株。第2代基因缺失疫苗以缺失TK基因为基础, 进而缺失编码非必需糖蛋白g E、g I、g G、g C等基因, 使该疫苗免疫的动物不能产生相应的抗体, 有利于通过血清学方法区分强毒感染猪和疫苗免疫猪, 这也是其最显著的特点, 因此该种疫苗又被称为标记疫苗[6], 从而为净化和根除伪狂犬病提供了有力的工具。TK-/g C-疫苗株:1987年Kit S等[7]报道在PRVBUK2d13株的基础上通过缺失g C基因Sa II片段的1100bp构建出了缺失TK、g C基因的PRVdlg C/dl TK株。TK-/g E-疫苗株:该疫苗株是从NIA23和NIA24发展而来的。首先将无毒株NIA24株基因组的Hind III片断与野毒株NIA23基因组的被引入缺失HindⅢB片断共转染PK22细胞, 病变后, 空斑筛选病毒, 然后将其基因组与一个TK基因的Eco RI位点引入有Eco RI接头的质粒共转染PK22细胞, 在Brd U存在下筛选在TK基因含有Eco RI位点的重组病毒。将此重组病毒的基因组用Eco RI完全酶切后共转染PK22细胞, 即得到重组病毒TK-/g E-即“783”[8]。

在国内, 郭万柱教授率先系统地开展了伪狂犬病病毒 (PRV) 分子生物学研究[9], 首次构建了PRVFa株TK基因缺失株, PRVFag I-/g I-基因缺失株, PRVFag I-/g I-/Lac Z+基因缺失株, 又将构建的PP63lac Z转移载体质粒与PRVFa DNA经磷酸钙转染, 在MDBK细胞内同源重组获得PRVFag E-/g I-/TK-/Lac Z+三基因缺失疫苗株 (PRV2SA215) , PRV2SA215是我国首次成功研制出的Fag E-/g I-/TK-/Lac Z+三基因缺失疫苗株, 填补了我国在这一领域的空缺。

4.2 外源基因在载体中的表达