小分子伴侣

小分子伴侣（精选三篇）

小分子伴侣 篇1

1资料与方法

1.1 研究对象

选择2010年3月至2012年3月在我院剖宫产的24例子痫前期患者为研究对象(子痫前期组),子痫前期的诊断标准参照丰有吉主编的第7版8年制《妇产科学》[1]。其中轻度子痫前期组12例,平均年龄27.21±4.36岁,平均孕龄36.27±2.01周,新生儿平均体重2.788±0.607 kg;重度子痫前期组12例,平均年龄26.17±3.42岁,平均孕龄35.02±1.79周,新生儿平均体重2.506±0.367 kg。同时选取相应孕龄孕妇12例(无内外科合并症,因臀位破水、胎位不正和社会因素行剖宫产者)为正常对照组,平均年龄27.78±4.15岁,平均孕龄37.02±3.34周,新生儿平均体重2.980±0.579 kg。子痫前期各组孕妇年龄、分娩孕周与正常对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3组孕妇均为单胎、初产、剖宫产分娩,非辅助生殖受孕,无高血压、糖尿病、肝肾疾病、胎儿生长受限、妊娠期肝内胆汁淤积症、甲状腺功能亢进或减退等病史。

1.2 实验方法

1.2.1 标本采集

受检者均在剖宫产术中胎盘娩出后,在无菌状态下取胎盘母体面正中组织3份,每份约1 cm×1 cm×1 cm大小,注意避开出血、梗死及钙化区,用0.9%氯化钠液漂洗去掉血液,吸干0.9%氯化钠液后,第1份置于3%戊二醛固定液中,4℃保存,用于透射电镜扫描;第2份立即置于液氮中保存,用于逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测;第3份用于Western-Blotting检测。

1.2.2 透射电镜扫描观察子痫前期胎盘滋养细胞内质网超微结构

胎盘组织标本4℃条件下置于3%戊二醛中固定2小时,磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗,1%锇酸常温固定1小时,乙醇逐级脱水,用丙酮和包埋剂(1∶1)混合液室温下浸透1小时,然后再用Epon 812树脂包埋剂进行包埋、固化;先制备半薄切片(0.5～1.0 mm),定位后再制成超簿切片(50～100 nm),醋酸铀和柠檬酸铅双重染色,再经漂洗、分化后待干;采用H-600型透视电镜扫描观察内质网的形态变化。

1.2.3 胎盘组织ERdj1

mRNA表达检测 采用RT-PCR技术,Trizol一步法提取总RNA,设β-actin作为内参物,进行总RNA定量和纯度分析(Beckman DU-600紫外分光光度计)。逆转录反应(试剂为美国Promege,Inc与Allele Biotech & Pharmaceuticals,Inc.产品)按说明书操作。ERdj1上游引物:5′-GAACGAAGGCAGAGGTATGA-3′,下游引物:5′-GACCCACTGTGAGAATAATGAA-3′,扩增产物长度139 bp,β-actin 上游引物: 5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′,下游引物:5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′,扩增产物长度250 bp。PCR反应条件为:95℃ 5分钟,94℃ 30秒,55℃ 30秒,72℃ 30秒,28个循环。取5 μl PCR产物,2.0%琼脂糖/溴化乙锭凝胶电泳。UVP凝胶密度扫描仪及其分析软件(UVP,Inc.)进行半定量分析。

1.2.4 胎盘组织ERdj1

蛋白表达检测 采用蛋白印迹技术,将胎盘组织根据质量/体积比1∶6加入尿素裂解液,冰上匀浆处理15秒,重复5次,每次间隔10秒,冰上裂解1小时,4℃ 40000×g离心20分钟,上清即为胎盘组织总蛋白。Bradford法检测蛋白浓度。12% SDS-PAGE电泳分离蛋白,半干法转印至PVDF膜(40 mA 2小时),用含5 %脱脂奶粉的TBS室温封闭1小时,一抗ERdj1(兔抗1∶500,Abcam)和β-actin (兔抗1∶1000,Abcam),4℃过夜,二抗(羊抗兔1∶2000)37℃ 50分钟,ECL显影,凝胶成像系统扫描。通过软件测定其灰度值,同一样本ERdj1与β-actin灰度比值作为该样本ERdj1蛋白的相对量,用于统计学分析。

1.3 统计学处理

应用SPSS 11.5统计软件,计量数据以均数±标准差undefined表示,采用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 正常胎盘与子痫前期胎盘滋养细胞超微结构

正常胎盘滋养细胞中内质网呈条索状,无扩张及肿胀,线粒体椭圆或球状,有嵴;子痫前期组胎盘滋养细胞中内质网扩张、肿胀、质膜间隙增宽,电子密度减低,线粒体肿胀,嵴断裂甚至消失。见图1。

2.2 3组孕妇胎盘组织中ERdj1

mRNA的表达水平 轻、重度子痫前期组胎盘组织中ERdj1 mRNA的表达水平高于正常对照组,差异有高度统计学意义(P<0.01),重度子痫前期组胎盘组织中ERdj1 mRNA的表达高于轻度子痫前期组,差异有统计学意义(P<0.05) 。见图2和表1。

①与正常对照组比较,P<0.01;②与轻度子痫前期组比较,P<0.05

2.3 3组孕妇胎盘组织中ERdj1蛋白的表达水平

轻、重度子痫前期组胎盘组织中ERdj1 蛋白的表达水平高于正常对照组,差异有高度统计学意义(P<0.01),重度子痫前期组胎盘组织中ERdj1蛋白的表达高于轻度子痫前期组,差异有统计学意义(P<0.05) 。见图3和表1。

3讨论

子痫前期是指妊娠20周以后出现的以高血压、蛋白尿、水肿为主要临床表现的一组临床症候群,尤其重度子痫前期可引起妊娠妇女及围生儿严重的并发症,是导致妊娠期母婴发病率及病死率上升的重要原因之一,严重危害母婴健康。子痫前期病因复杂,具体发病机制仍不完全清楚,对其病因和发病机制的研究一直是产科研究的热点。目前大量证据表明,子痫前期患者胎盘滋养细胞存在显著的凋亡现象,且凋亡指数显著增高,滋养细胞侵入受限,胎盘着床变浅。因此,认为子痫前期的发病机制与胎盘滋养细胞凋亡有着密切的关系。但这些研究大多集中在细胞内线粒体和细胞外死亡受体两条通路,很少有关于内质网应激介导的滋养细胞凋亡的相关报道[7,8,9]。

内质网是真核细胞中最重要的蛋白质合成折叠场所和钙离子的主要储存库。它主要参与细胞蛋白质量控制、糖基化修饰、细胞凋亡、蛋白质降解以及钙离子稳态等多种生物学功能。近年研究发现,葡萄糖或营养物质缺乏、脂质过度负荷、病毒感染、药物、毒素和分泌蛋白合成增加等均可打破内质网的稳态,其功能紊乱时出现错误折叠与未折叠蛋白在腔内聚集以及Ca2+平衡紊乱的状态,引起从内质网到胞质和胞核的信号传导,最终导致适应性存活或凋亡,称为内质网应激[6,10]。

既往研究显示,子痫前期胎盘组织存在氧化应激,继而引发内质网应激,最终导致滋养细胞凋亡,因此内质网应激介导的滋养细胞凋亡可能是子痫前期发病的又一重要机制[11]。CC Ni等[12]证实,GRP78被公认为是内质网应激的标志性蛋白之一,它能增强内质网对蛋白质的折叠能力,阻止未折叠蛋白质进一步积聚,其表达异常可明显加重内质网应激,引起细胞损伤。王耸等[3]及及孙丽洲等[4]研究发现,子痫前期孕妇的胎盘组织中GRP78的mRNA及蛋白表达水平显著高于正常胎盘。子痫前期胎盘组织中可能发生了滋养细胞内质网应激性反应,从而诱导GRP78高表达,进而滋养细胞可能启动了内质网应激相关性细胞凋亡。因此,GRP78可能参与内质网应激介导的滋养细胞凋亡,GRP78的高表达与子痫前期发病密切相关。然而GRP78在内质网应激中并不能单独行使功能,必须在ERdj1等一些重要的分子伴侣的共同参与下才能发挥作用。ERdj1的N末端具有一定高度保守的J结构域,该结构域与GRP78相互作用,激活GRP78的ATP酶活性,C未端能够结合待折叠蛋白,协助糖蛋白质正确的折叠和装配;参与蛋白质量控制系统与蛋白质降解[5,6]。

本研究采用RT-PCR技术与蛋白印迹法检测了正常孕妇、轻度及重度子痫前期孕妇胎盘组织中内质网应激标志性因子GRP78的分子伴侣ERdj1的表达。结果表明,子痫前期组胎盘组织中ERdj1 mRNA及蛋白表达水平均显著高于正常对照组胎盘组织中的表达水平,差异有高度统计学意义(P<0.01),且随着子痫前期严重程度的增加,其表达量显著升高(P<0.05)。以上结果提示,内质网应激相关的凋亡可能是子痫前期发病的一个重要机制,分子伴侣ERdj1在子痫前期胎盘内质网应激导致的凋亡中可能发挥重要作用,这为揭示子痫前期的发病机制提供了重要的理论依据,有助于临床寻找子痫前期诊治的新靶点。

摘要：目的:探讨胎盘组织中内质网应激相关分子伴侣ERdj1的mRNA及蛋白的表达,及其与子痫前期发病的关系。方法:收集剖宫产分娩36例孕妇的胎盘,其中正常足月妊娠妇女12例(正常对照组),轻度子痫前期患者12例(轻度子痫前期组),重度子痫前期患者12例(重度子痫前期组)。应用透射电镜扫描观察子痫前期胎盘组织中滋养细胞内质网超微结构改变,通过RT-PCR技术检测胎盘组织中ERdj1 mRNA的表达,蛋白印迹法检测胎盘组织中ERdj1蛋白的表达。结果:①正常对照组胎盘滋养细胞中内质网体积无明显增大,内质网无肿胀;子痫前期组胎盘滋养细胞中内质网体积增大、扩张及液泡化。②轻、重度子痫前期组ERdj1 mRNA的表达水平(2.1327±0.4855,2.3064±0.1004)显著高于正常对照组(0.2809±0.0064),差异有高度统计学意义(P<0.01);重度子痫前期组与轻度子痫前期组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。③轻、重度子痫前期组ERdj1蛋白表达水平(3.8412±0.8423,4.9421±0.9810)显著高于正常对照组(1.5678±0.2315),差异有高度统计学意义(P<0.01);重度子痫前期组与轻度子痫前期组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:子痫前期胎盘滋养细胞内质网有明显扩张及肿胀性改变;内质网应激相关分子伴侣ERdj1参与了子痫前期的病理生理过程,可能是子痫前期发病的重要机制之一。

关键词：内质网应激相关分子伴侣ERdj1,胎盘滋养细胞,子痫前期

参考文献

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小分子伴侣 篇3

1 材料与方法

1.1 材料选择

1.1.1 临床标本

选择新疆医科大学第一附属医院2007~2009年维吾尔族慢性宫颈炎、CIN和宫颈癌患者活检组织标本共152例,全部标本甲醛固定,石蜡包埋。组织病理学诊断由病理医师确诊,其中慢性宫颈炎25例,CIN 64例(CINⅠ31例,CINⅡ~Ⅲ33例),宫颈癌63例(高分化鳞癌32例,中低分化鳞癌31例)。1.1.2试剂和仪器DNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司,SP试剂盒及DAB显色剂购自北京中杉金桥公司。分子伴侣抗体分别为:鼠抗人HLA-Ⅰ抗体(1∶100稀释,SantaCruz公司);兔抗人CNX单抗(1∶50稀释,SantaCruz公司);兔抗人CRT单抗(1∶50稀释,SantaCruz公司);鼠抗人ERp57抗体(1∶50稀释,Abcam公司);鼠抗人tapasin抗体(1∶100稀释,Abcam公司)。高速低温离心机(Bechmann公司)、核酸/蛋白快速测定仪(GeneQuantⅡ,GE公司)、PCR仪(iCycler,Biorad公司)和核酸凝胶成像系统(GelDocXR,Biorad公司)。

1.2 方法

1.2.1 聚合酶链反应(PCR)

应用DNA提取试剂盒提取不同宫颈石蜡组织标本中的DNA,并用核酸蛋白分析仪检测DNA的含量和纯度。以提取的每份DNA为模板,应用HPV 16特异性通用引物进行PCR扩增(上游引物5′-TCAAAAGCCACTGTGTC-CTG-3′和下游引物5′-CGTGTTCTTGATGATCTG-CA-3′)。反应体系为:10×PCR缓冲液2.5μl,0.5μmol/L的引物,1.2μl的各种dNTP和0.5UTaqDNA聚合酶,加双蒸水至25μl。反应条件:95℃预变性4分钟,94℃变性45秒,52.4℃复性45秒,72℃延伸45秒,共35个循环,然后72℃再延伸7分钟取5μlPCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳(电压120V),30分钟后在紫外线凝胶成像仪下观察结果并

1.2.2 HLA-Ⅰ类分子和分子伴侣蛋白的检测

应用免疫组化SP法检测,切片常规二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化后微波炉抗原修复,滴加适量H2O2阻断内源性过氧化物酶,然后滴加一抗,4℃冰箱过夜(以PBS作为阴性对照)。第2天加二抗(各步间隔PBS缓冲液冲洗10分钟)。DAB显色,苏木素复染,常规脱水、透明封片。

1.3 结果判断

采用双盲法由两位病理医师分别观察免疫组化结果,以阳性细胞数和染色程度为判断标准。光学显微镜下全视野观察,按阳性细胞数在上皮细胞内所占比例分为4个分值,染色细胞数少于5%视为0分,5%~25%为1分,26%~75%为2分;大于75%者为3分。染色强度判定:不显色或显色不清为0分,浅黄色为1分,棕黄色为2分,深棕色为3分。综合积分按公式计算:综合积分=(染色细胞分数+染色强度分数)/2。综合判定:积分小于0.5分为表达缺失,0.5~1.5分为表达下调,大于1.6分为正常表达。在分析内质网分子伴侣与HLA-Ⅰ类分子表达和HPV 16感染的关系时,综合判定积分<1分为阴性,≥1分为阳性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 15.0软件对各种数据进行统计处理,资料分析采用卡方检验;相关分析采用Pearson相关。

2 结果

2.1 宫颈病变中HPV 16感染情况

PCR结果发现,HPV 16的检出率随着宫颈病变的进展而增加,在慢性宫颈炎、CIN和宫颈癌组织中阳性表达率分别为8.0%(2/25)、67.2%(43/64)和77.8%(49/63),各组间阳性表达差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.2 HLA-Ⅰ分子和内质网分子伴侣在宫颈病变组织中的表达以及与临床病理特征之间的关系

HLA-Ⅰ类分子阳性表达部位主要定位于细胞膜,少数为细胞质,上皮细胞和间质淋巴细胞染色呈黄色或棕黄色。分子伴侣Tapasin、CNX、CRT和Erp57主要表达于细胞质。与慢性宫颈炎相比,CIN和宫颈癌组织中所有分子伴侣成员和HLA-Ⅰ类分子表达明显减少,CIN中分子伴侣CNX、CRT、Tapasin、Erp57和HLA-Ⅰ抗原的表达下调和缺失率分别为15.6%/21.9%、21.9%/15.6%、28.1%/15.6%、20.3%/21.9%和31.2%/29.7%。在宫颈癌组织中表达下调和缺失率分别为22.2%/30.0%、20.6%/34.9%、23.8%/28.6%、30.0%/28.6%和31.7%/47.6%,表达水平随着宫颈病变的加重而减少,呈现递减趋势。尤其是在恶性度较高的中低分化癌和进展期肿瘤中表达下调和缺失更加显著,除了CNX以外,其他蛋白在各组间表达差异有统计学意义(P<0.05)。临床病理特征之间进行比较,发现HLA-Ⅰ类分子表达量与肿瘤的分化程度、临床分期以及是否有淋巴结转移密切相关;分子伴侣成员中CRT、ERp57与宫颈癌分化程度密切相关;Tapasin、CNX、ERp57与淋巴结转移密切相关;Tapasin的表达下调与FIGO临床分期密切相关,表达差异均有统计学意义(P<0.05),见表1。

2.3 内质网分子伴侣在宫颈病变中表达与HLA-Ⅰ类分子和HPV 16感染的关系

比较内质网分子伴侣Tapasin、CNX、CRT、ERp57与在HLA-Ⅰ类分子和HPV 16在宫颈病变中表达的相关性。在CIN中HLA-Ⅰ与CNX、CRT、ERp57表达下调呈正相关(相关系数分别为r=0.289,P=0.020;r=0.271,P=0.030;r=0.295,P=0.018),HPV 16感染与CRT、ERp57表达呈负相关(相关系数分别为r=-0.375,P=0.002;r=-0.327,P=0.008)。宫颈癌中HLA-Ⅰ与CRT、ERp57和Tapasin表达下调呈正相关(相关系数分别为r=0.491,P<0.001;r=0.299,P=0.017;r=0.412,P=0.001),HPV 16感染与Tapasin、CNX、CRT、ERp57表达呈负相关(相关系数分别为r=-0.450,P<0.001;r=-0.367,P=0.003;r=-0.408,P=0.001;r=-0.290,P=0.021)。

3 讨论

HLA-Ⅰ类分子广泛分布于体内绝大多数有核细胞表面,它作为抗原肽受体与结合和递呈抗原肽诱导产生免疫应答以及维持内环境稳定有密切关系。而内质网分子伴侣与不同的蛋白质折叠中间体相互作用,帮助HLA-Ⅰ多肽链的正确折叠和组装,对抗原的呈递过程发挥重要作用[5]。研究发现HLA-Ⅰ类分子在多种肿瘤中表达下调[6~10]。提示,肿瘤细胞利用HLA-Ⅰ类分子在细胞表面的表达缺陷,避免CD 8+CTL介导的抗原识别与杀伤作用。本研究就宫颈病变中内质网分子伴侣、HLA-Ⅰ类分子的表达情况以及与HPV 16感染的关系进行了分析。

结果显示,HPV 16的检出率随着宫颈病变的进展而增加,在慢性宫颈炎、CIN和宫颈癌组织中阳性表达率分别为8.0%、67.2%和77.8%,各组间阳性表达差异有统计学意义;HLA-Ⅰ类分子表达随着CIN分级的增加、宫颈癌分化程度的降低和宫颈FIGO分期的进展而表达减少,表达差异有统计学意义。这与我们先前应用RT-PCR法检测HLA-Ⅰ的转录表达水平一致[11],另外淋巴结转移的宫颈癌患者中HLA-Ⅰ类分子表达低于未转移的患者。证明HLA-Ⅰ类分子表达下调在宫颈癌的整个演进过程以及预后中起到重要作用。与抗原呈递相关的内质网分子伴侣Tapasin、CNX、CRT和ERp57随着CIN分级和宫颈癌恶性程度的增加表达减少,表达差异有统计学意义。其中,CRT和ERp57表达下调与宫颈癌的分化程度相关,Tapasin的表达下调与FIGO临床分期密切相关,CNX、Tapasin和ERp57表达下调与淋巴结转移密切相关。提示,内质网分子伴侣表达下调,影响了HLA-Ⅰ类分子的正确折叠和组装,以及对抗原的呈递作用,导致肿瘤细胞不能有效的被T细胞识别与降解。值得注意的是,在CIN阶段内质网分子伴侣和HLA-Ⅰ类分子主要以表达下调为主,而在宫颈癌组织以表达缺失为主,从而推测宫颈癌细胞中内质网分子伴侣通过抑制HLA-Ⅰ类抗原的表达促进肿瘤细胞逃避免疫监视,使得肿瘤细胞继续生长和发展。因此,内质网分子伴侣和HLA-Ⅰ类抗原的表达降低可以作为宫颈癌早期浸润的标志。

本研究比较了内质网分子伴侣Tapasin、CNX、CRT、ERp57在CIN和宫颈癌组织的表达与HLA-Ⅰ类分子和HPV 16感染的关系。在CIN组织中HLA-Ⅰ与CNX、CRT、ERp57表达下调呈正相关,HPV 16感染与CRT、ERp57表达呈负相关;宫颈癌组织中HLA-Ⅰ与CRT、ERp57和Tapasin表达下调呈正相关,HPV 16感染与Tapasin、CNX、CRT、ERp57表达呈负相关。提示在CIN和宫颈癌组织中内质网分子伴侣表达下调,是影响HLA-Ⅰ类分子在细胞表面正常表达的重要原因之一。而HPV 16也可能利用此途径逃避免疫监视,促进宫颈癌的发生和发展。

摘要：目的:探讨宫颈病变中内质网分子伴侣与HLA-Ⅰ和HPV16表达的关系。方法:通过免疫组化SP法检测内质网分子伴侣和HLA-Ⅰ类分子在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌患者石蜡包埋组织中的表达水平;以PCR技术检测相应标本中HPV16感染的情况。结果:CIN中分子伴侣钙连接蛋白(CNX)、钙网蛋白(CRT)、TAP相关蛋白(Tapasin)、蛋白质二硫异构体Erp57和HLA-Ⅰ抗原的表达下调和缺失率分别为15.6%/21.9%、21.9%/15.6%、28.1%/15.6%、20.3%/21.9%和31.2%/29.7%。在宫颈癌组织中表达下调和缺失率分别为22.2%/30.0%、20.6%/34.9%、23.8%/28.6%、30.0%/28.6%和31.7%/47.6%,并且随着宫颈病变的加重,其表达下调和缺失率增加(P<0.05)。CRT和ERp57与宫颈癌分化程度密切相关,Tapasin、CNX、ERp57与淋巴结转移密切相关,Tapasin与FIGO临床分期密切相关,表达差异均有统计学意义(P<0.05)。在CIN中HLA-Ⅰ与CNX、CRT、ERp57表达下调呈正相关,HPV16感染与CRT、ERp57表达呈负相关。宫颈癌中HLA-Ⅰ与CRT、ERp57和Tapasin表达下调呈正相关,HPV16感染与Tapasin、CNX、CRT、ERp57表达呈负相关。结论:在CIN和宫颈癌组织中内质网分子伴侣表达下调,可能是影响HLA-Ⅰ类分子在细胞表面正常表达的重要原因之一。而HPV16也可能利用此途径逃避免疫监视,促进宫颈癌的发生和发展。

关键词：宫颈癌,内质网分子伴侣,人类白细胞抗原Ⅰ,人乳头瘤病毒16

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