分子生物学检测方法

分子生物学检测方法（精选十篇）

分子生物学检测方法 篇1

1 基因探针检测方法

基因探针检测方法是分子生物学中一个重要的检测方法, 对于检验食品微生物具有显著的效果。人们又将其称为核酸分子杂交技术, 这一技术早在20世纪60年代就出现了, 建立在DNA分析相关方法的基础之上, 可以说这一技术在我国当前的应用中十分广泛, 是分子生物学中重要的技术之一。在该检测技术中, 首先应该对其工作原理具有一定的认识, 这样才能运用该技术更好的服务于食品微生物的检验工作。所谓的基因探针, 实际上是一种基因特异片段, 但是有所不同的是这一片段带有标记, 在运用这一检测技术的过程中, 主要是以碱基配对为基本的工作原理, 然后运用2条互补的核酸单链在退火的处理下形成了双链。之所以在食品微生物的检验工作中受到推广, 主要是因为该技术具有简单便捷的特点, 能够更加直接的将致命性微生物检验出来, 同时在检验过程中, 也不会受到非致命性微生物所带来的影响。

实际上, 我们可以将每一种病原体都看作是具有独特性的核酸片段, 在分离以及标记的前提下, 就能将上述的这些片段结合起来制备出探针, 标记物、核酸探针与检测样品结合起来进行杂交, 这样就能将标记物检测出来, 这是物品中具有特定病原体为前提进行检测所得的, 在这一过程中, 探针可以与核酸序列有机的结合在一起, 由此便能检测出样品中是否含有特定病原体。在该技术中, 主要具有两个优点, 一是特异性, 二是灵敏度高, 在这两个优点下, 同时还兼顾了能够准确发现组织化学染色的特性, 定位性也较强。因此, 在食品微生物的检测工作中, 主要是用来对致命性病原菌进行检验。

在我国当前的社会发展中, 基因探针检验技术应用十分广泛。例如通过对生物素的标记用以检验沙门菌的基因片段, 将其作为探针对食品安全进行检测, 实践证明具有显著的效果。又如, 运用自动化酶连接建立起了非放射性的DNA探针, 这一探针对于检验单核细胞增生李斯特菌具有显著的效果。除此之外, 在检验ESIEC大肠杆菌方面也具有十分明显的效果, 因此受到食品安全管理部门的青睐, 对于发展我国的食品行业起到重要的促进作用。

在当前的食品微生物检验工作中, 可以说这是一项应用十分广泛的技术, 可以将其作用于特异RNA以及基因序列的检测工作中, 是一种十分有效的工具。这一技术对于检验特定病原微生物具有显著的意义。在世界范围内, 以美国为例, 运用这一技术进行食品检验已经持续了一段较长的时间, 但是相对于其所具有的优势, 还是存在一定的不足之处的, 例如其中含有大量的放射性同位素, 能够对人体造成极大的不良影响, 并且对于反应废弃物也难以进行处理, 需要十分复杂的步骤等。

2 PCR技术

聚合酶链式反应技术诞生于1985年, PCR技术利用变性与复性原理, 在体外使用DNA聚合酶, 在引物的引导和脱氧核糖核苷酸的参与下将模板在数小时内进行百万倍扩增。该技术可选择性地放大特定的DNA序列, 因此被广泛应用于生命科学的众多领域, 在食品致病性微生物检测方面该技术也发挥着越来越重要的作用。常规的食品微生物检测主要通过增菌、分离培养、生化实验和血清学鉴定等4个步骤进行, 一般需要4d以上的时间才能得到结果。此外, 常规检测方法的特异性和灵敏度也不够理想, 这使得食品微生物检测结果具有一定的滞后性, 无法快速、正确地指导实践生产。PCR技术的出现, 为食品卫生检验带来了新的曙光, 使用该技术可及时、准确地检测出食品中的病原微生物。

随着分子生物学技术的不断发展, 多重PCR、标记PCR和不对称PCR等多种不同的PCR方法都被应用于食品病原微生物的检测中, 它们的应用使PCR技术拥有了更高的灵敏度和更短的周期。但普通PCR技术在检测中会受到模板制备、引物质量与特异性、酶的质量及PCR循环数等因素的影响, 实时荧光定量PCR技术在检测过程中会受到同异源DNA背景、寡核苷酸杂交特异性、Taq Man探针比例、SYBR GreenⅠ浓度大等因素影响, 可造成定量结果出现偏差或导致出现假阳性和假阴性结果。因此, 在实际应用中应尽量保证上述因素的稳定性, 并设置阳性对照, 以尽力避免错误结果的出现。

3 基因芯片技术

基因芯片技术是生命科学与信息科学的有机结合。基因芯片技术是采用原位合成或显微打印手段, 将数以万计的核酸探针固化于支持物表面, 与标记的样品进行杂交, 通过检测杂交信号来实现对样品的快速检测。基因芯片技术是基于芯片上的探针与样品中的靶基因片段之间发生的特异性核酸杂交。其主要步骤如下:将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面, 微生物样品经处理后进行核酸提取和核酸扩增, 再用荧光素对其进行标记, 然后与芯片上的寡核苷酸点杂交, 最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定微生物。基因芯片的基本原理与核酸杂交相似, 但它将大量按检测要求设计好的探针固化, 仅通过一次杂交便可检测出多种靶基因的相关信息, 具有高通量、多参数同步分析, 快速全自动分析, 高精确度、高精密度和高灵敏度分析的特点, 是目前鉴别有害微生物的最有效的手段之一。随着研究的不断深入, 基因芯片技术必将为食品科学研究开辟一个新的发展时代。

4 结论

综上所述, 本文重点对三种分子生物学中的检测技术进行了探讨, 每一项技术都具有优劣所在, 在今后的工作中, 希望相关人士能够进一步发展食品微生物的检测技术, 促进食品安全更好的发展, 保证人们的身体健康。

摘要：在现代社会发展的过程中, 国家对食品安全问题愈发重视, 因为食品安全关系到人们的生命健康, 所以如何有效的检测出食品是否存在安全隐患是本文探讨的重点。在食品检测过程中, 病原微生物的检测难度较大, 长期以来是检测中的难题, 针对这一情况, 本文提出了三种检测方法, 将其应用在食品微生物的检测过程中, 具有重要意义。希望在本文的论述下, 我国食品安全工作能够更上一层楼, 有效的检测出病原微生物在食品中的存在, 从而为今后检测方法的推广作出贡献。

关键词：基因探针检测法,基因芯片检测法,PCR检测法

参考文献

[1]王华, 刘斌.PCR技术在食品微生物检测中的应用[J].生物技术通报, 2010 (2) .

[2]叶思霞, 蔡美平, 罗燕娜.食品微生物检测技术研究进展[J].安徽农学通报 (上半月刊) , 2009 (19) .

分子生物学检测方法 篇2

最新上市3M分子检测系统将环介导等温核酸扩增技术(LAMP)和生物荧光实时检测技术(BART)结合在一起，这种创新技术全面提升了操作简便性，准确性，检测速度和性价比，在分子层面上实现了针对食源性致病菌准确、高效的检测。其检测灵敏度是普通PCR的10倍，引物设计远比普通PCR更加巧妙，检测结果也更加准确；扩增效率更高，检测时间更短，检测步骤更少，操作中发生人为污染和技术错误的概率大大降低；可以同时检测多个项目，是高通量、多检测项目的技术；实时且自动化的结果判读；对环境要求更低，适用范围更广。

产品原理

(1)环介导核酸等温扩增技术

整合了针对靶基因区域特殊设计引物及具有链置换活性的Bst酶，大大简化了工作步骤；只需要恒定温度就能完成扩增，无须PCR循环温度的变化。由于扩增反应全过程在同一温度下进行，因此使得对仪器的要求大大简化。

(2)采用创新性的生物荧光捕获技术

通过捕获DNA扩增反应过程中产生ATP而发出的生物荧光，自动化检测DNA扩增产物，无须后续步骤手动检测，对环境无污染，对操作人员无伤害。技术参数

(1)仪器原理：环介导核酸等温扩增生物荧光检测技术；

(2)检测项目：沙门氏菌、李斯特菌属、单增李斯特菌和大肠杆菌0157；

(3)检测容量：96个检测位置，可同时检测4个项目，最多一次可检测94个样品；

(4)仪器判读：96通道生物荧光检测器；

(5)检测灵敏度：lcfu／25g；

(6)前增菌时间：一步前增菌，各个检测项目增菌时间如下：沙门氏菌(8～18小时)、李斯特菌属(22～48小时)、大肠杆菌0157(8～墙小时)；

(7)仪器上机检测运行时间：阳性结果(10～20分钟)／阴性结果(75分钟)；

(8)仪器尺寸(主机)：350mm×230mm×100ram(长／宽／高)；

(9)仪器电压：220V／50Hz。

产品特点

该方法能够快速检测食品或环境样品中的沙门氏菌、李斯特菌属、单增李斯特菌和大肠杆菌0157等致病菌；无须离心及DNA纯度验证等步骤，节约设备成本；优化试剂盒保存条件，试剂盒可常温保存长达24个月；友好的操作界面，检测结果以图表和直观检测点两种形式来表示，并能通过软件进行趋势分析；通过AOAC认证。

分子生物学检测方法 篇3

1 核酸探针技术

核酸探针技术的基本原理, 是在适宜的温度和离子强度等条件下, 具有互补序列的两条单链核酸分子经过变性和复性的变化, 通过碱基互补配对形成氢键, 重新形成双链。新西兰Robinson A G等人在1981年, Andrew A M等人在1987年, 选择使用放射性同位素32P标记的探针, 证明核酸探针诊断技术敏感性较高和特异性较强。王延璞等人在2002年, 探针的选择使用光敏生物素和地高辛标记羊传染性脓疱病毒HCE毒株的DNA HindⅢ/A和B片段。筛选出标记的HindⅢ/A片段可用于羊传染性脓疱病毒的检测和诊断。使用光敏生物素和地高辛标记的核酸探针的保存时间长, 方便进行推广应用, 并且其安全性高。因为放射性同位素探针具有半衰期短、严重危害研究人员身体健康, 所以近年来核酸探针选用非放射性元素标记已经成为主要潮流。

2 PCR诊断技术

聚合酶链式反应技术 (PCR) , 将特定的DNA片段进行扩增, 进行生物体外的特殊DNA复制。李会荣等人在2003年, 建立了羊传染性脓疱病毒PCR检测方法。刘云志等也建立用于羊传染性脓疱病毒检测PCR方法。聚合酶链式反应技术作为诊断方法具有速度快、敏感性好、特异性高、稳定性强等特点, 目前, PCR诊断技术已成为快速检测羊传染性脓疱病毒最有效、最常用的方法之一。

3 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术 (LAMP) 是Notomi等在2000年, 开发的一种在恒温条件下进行核酸扩增的方法, 该方法针对目的基因的6~8个特异区域, 设计4~6条特异性引物, 使用Bst DNA聚合酶在等温条件下完成核酸扩增。反应结束后可通过离心观察沉淀、加入荧光染料观察颜色变化或取少量扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳来判定靶基因是否扩增。核酸扩增反应在60~65℃的恒温水浴锅中即可进行。LAMP技术因操作简便、对仪器设备要求不高, 目前已被广泛应用于细菌或病毒等病原体的检测和传染病的临床诊断等领域。向志龙等人建立了一种针对检测羊传染性脓疱病毒 (CEV) B2L基因的LAMP检测方法, 为CEV的检测与羊传染性脓疱的临床诊断提供一种高灵敏度、高特异性且操作简单快捷的检测方法。

使用易瑞沙前需做分子检测 篇4

大家有盼头吗？

易瑞沙瞄准非小细胞肺癌

易瑞沙（Iressa）是由英国阿斯利康公司开发的一种靶向抗肿瘤小分子化合物（苯胺喹钠唑啉化合物），其化学名字叫吉非替尼（Gefitinib），易瑞沙是商品名。

从本质上讲，易瑞沙是一种表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂。酪氨酸激酶主要与信号通路的转导有关，信号转导异常可导致细胞生长、分化、代谢和生物学行为异常，引发肿瘤。近80%的致癌基因都含有酪氨酸激酶编码，抑制酪氨酸激酶受体可以有效控制下游信号的磷酸化，从而抑制肿瘤细胞的生长。

易瑞沙为分子靶向药物，其作用靶点的分子结构与药物的有效性密切相关，使用前需作相应的分子检测。

靶向药物的作用机理是怎样的呢？肿瘤的发生归根结底是细胞调控的异常，主要表现是细胞增殖的失控，而这种失控在细胞内部主要体现在信号转导通路的失调，从而导致的细胞无限增生，针对肿瘤特异的信号传导途径中异常分子的药物，将可选择性的杀伤肿瘤细胞，这样具有靶向性的肿瘤治疗药物可达到高选择性、低毒性的治疗效果，从而克服传统细胞毒药物的选择性差、毒副作用强、易产生耐药性等缺点。

副作用小——易瑞沙的显著优势

易瑞沙于2002年7月在日本首次上市，用于治疗非小细胞肺癌（NSCLC）。于2003年5月被美国食品与药物管理局（FDA）批准用于治疗经铂类和紫杉醇处理无效的晚期非小细胞肺癌患者。目前临床主要用于对非小细胞肺癌的治疗，另外用于对其它恶性肿瘤的治疗也在临床试验阶段，如：前列腺癌、食管癌、肝细胞癌、胰腺癌、膀胱癌、肾细胞癌、卵巢癌、头颈部癌、恶性黑色素瘤等。

与传统化疗药物的比较发现，易瑞沙治疗的副作用很小，最常见不良反应是痤疮样皮疹和腹泻，最严重不良反应是间质性肺病，发生率为3％～5％。

易瑞沙的准入条件

美国2005年该药对大规模的肺癌患者的随机治疗研究发现，该药治疗后患者的生存率与安慰剂没有显著性差异，两种方法治疗的生存率也没有明显的差异。基于这种情况，随后FDA对该药的应用进行了一定的限制，即医生认为该药治疗有效的患者才可以继续使用。随后通过对其作用靶分子的进一步研究发现，凡是治疗显著有效的患者，他们肿瘤细胞中的表皮生长因子受体（EGFR）的基因绝大多数均出现突变，而非突变患者则治疗效果不明显。这样对该药在早期大规模临床试验不理想的结果可归结为是没有筛选适应的人群。由此拉开了针对靶向药物适应人群开展分子检测的序幕。这就是为什么医生在决定是否应用该药时，通常需要对患者进行EGFR基因突变进行检测的原因，也就是所谓的“准入”条件。该药对EGFR基因突变的患者治疗效果显著，而对非突变患者则不建议使用。

为何易瑞沙为二线用药

随着临床数据的积累，发现东方女性不吸烟患者有效率较高，其主要表现为疾病无进展和生存期明显延长。分子检测发现该类人群EGFR基因的突变率确实较高。西方早期临床数据显示，该药与传统的化疗药物对患者的总生存率的影响差别不大，正是由于这种原因临床上目前将其作为治疗的二线药物，最近日本两家机构对其作为EGFR突变患者的一线药物研究发现，疗效虽然具有明显的个体差异，但总体指标比较显示该药优于传统的化疗。

2009年，口服易瑞沙在欧洲获准用于治疗EGFR基因突变的非小细胞肺癌患者，包括诊断后的一线治疗。这意味着EGFR基因突变的患者将第一次拥有一种优于化疗的一线治疗。自此以来，欧洲获准对非小细胞肺癌做一线治疗癌病例超过10万例。所以虽然传统上将其作为治疗的二线药物，但对EGFR基因突变的患者也提倡将其作为一线用药，以期已达到最好的治疗效果。

另外，由于靶向药物对细胞的增殖调控的影响是通过信号传导途径中不同分子的传递而实现的，EGFR处于该信号传导途径中最外层的分子，正常情况下对其活性抑制将导致细胞增殖能力的下降甚至导致细胞的死亡。但如果该信号传导途径中的其它分子出现异常，如KRAS突变，将可能造成下游分子不受调控的持续性激活，从而造成该药物对肿瘤细胞抑制能力的下降甚至无效，如KRAS突变患者则疗效不佳。这样在对靶向药物适应人群的分子检测时，通常需要对该信号传导途径中的多个分子进行综合检测。

慎选易瑞沙的“国籍”

易瑞沙是由英国的阿斯利康公司研发的，不能说有印度版、中国版之分。印度NATCO制药公司生产的易瑞沙是仿制药，从本质上讲成分与英国产的药品是一样的。而印度版易瑞沙不具备知识产权，所以只限于印度国内销售，包括我国在内的印度以外的国家是不被允许公开合法经销的，所以它的安全性和有效性都无法确保。英国原版易瑞沙昂贵的价格对于大多数患者家庭来说难以承担，而印度来源的产品由于价格便宜（约为英国产易瑞沙的十分之一），这样在我国就有了一定的市场。但由于印度产的药物来源非常混乱，仅从外观上难以鉴别真伪，建议没有证实可靠的来源途径不要使用，以免延误治疗时机。

易瑞沙是处方药，患者可以在正规医院以及大型药店购买到英国产的易瑞沙，目前货源很充分。英国阿斯利康公司为连续服用正品易瑞沙满6个月且未产生耐药的患者提供免费赠药，但往往多数患者在此期间会产生耐药。

中国也有“易瑞沙”

中国自主研制的第一个小分子靶向抗肿瘤药品命名为盐酸埃克替尼，商业名为凯美纳，从其化学结构上与易瑞沙有一些区别，即一些修饰基团不同，这样也就形成了国内自主性的知识产权。目前主要用于晚期肺癌的治疗，其疗效与易瑞沙相当，安全性更好，给药剂量和方案更适合中国人，价格也较为便宜。

分子生物学检测方法 篇5

文献标识码:A文章编号:1001-9561 (2009) 04-0415-03

自1982年首次发现肠出血性大肠杆菌O157:H7在北美引起出血性肠炎以来, 与肠出血性大肠杆菌O157:H7病原菌相关疾病的发生率逐年上升, 尤以发达国家病例为多, 这可能与其饮食习惯和监测报告系统完善有关。大多数O157:H7肠出血性大肠杆菌的感染是食用了被牛粪污染的食物和饮水引起的, 临床症状主要表现为腹部痉挛性疼痛和出血性结肠炎。近些年已经报道过多起由肠出血性大肠杆菌O157:H7引起的暴发流行, 因儿童和老年人患者有时会在腹泻后继发诸如溶血性尿毒综合征等严重的并发症而死亡率较高。O157:H7是肠出血性大肠杆菌的主要血清型别, 但是其他的血清型如O111:H8, O104:H21等也能够引起人的腹泻。非O157血清型的肠出血性大肠杆菌广泛存在于我们的生活环境中, 多有在生牛肉, 猪肉, 鸡肉和奶酪等食品中被检出的报道。流行病学研究表明, 在所有的肠出血性大肠杆菌所引起的感染中, 20%~50%是由非O157血清型引起的。这些血清型的细菌也能够引起血样便和溶血性尿毒综合征, 并且在年龄幼小的患者体内发现非O157血清型的肠出血性大肠杆菌, 相对O157血清型而言有着更高的引起严重感染的危险, 因此有必要对非O157血清型的肠出血性大肠杆菌所引起的感染给予重视。比较常见的对人致病的非O157血清型包括O26:H11、O103:H22、O111:NM及O113:H21等。

肠出血性大肠杆菌的预防策略要求建立完善的预防性食品处理措施及加强对暴发的监测。地域上分散病例的流行病学之间的联系对于判明传染来源和控制疾病非常重要。暴发调查包括传统的流行病学方法和常规的实验室方法。由于人口流动性增强等客观原因, 传统的流行病学方法对于传染来源的追踪存在着很多局限。诸多分子生物学分型方法的应用, 为菌株来源的判明提供了可能。

在传统的实验室方法中, 一直采用血清学方法和噬菌体分型方法对菌株进行分型。其后, 随着新一点分型方法的引入, 质粒指纹图谱[1], 核糖体分型[2], 以聚合酶链式反应 (PCR) 为基础的分型方法, 如随机扩增多态性DNA-PCR (RAPD) [3], 扩增片段长度多态性 (AFLP) [4], 对染色体DNA酶切图谱进行分析的核酸脉冲场凝胶电泳 (PFGE) [5]及以测序为基础的多位点序列分型 (MLST) 都在肠出血性大肠杆菌检测中得到了应用。

在普通的琼脂糖凝胶电泳中, 大于一定碱基对的DNA分子会以相同的速率泳动, 称为“限制动力性”, 不能被凝胶所区分。在泳动中如果周期性地改变电场的方向, 就可以对超过限制碱基对大小的DNA分子进行区分[6]。有几种系统可以对电泳改变方向, 但是最常应用的是轮廓固定的同质电场[7]。已经有几种PFGE的商品化产品投入应用, 在凝胶中可以对小于1 000碱基对的DNA进行区分。对于酶切图谱的PFGE的阐释系统也已经建立[8]。随机扩增多态性DNA-PCR (RAPD) , 也称为AP (任意引物) -PCR, 是能够对细菌菌株进行区分的分子分型方法之一[9,10]。在这种方法中, 与引物同源的夹在反转重复序列之间的DNA片段被随机扩增[11]。由于菌株的染色体序列彼此不同, 因此电泳后扩增条带的图谱也是不同的, 这样可以对菌株进行区分。AFLPTM (扩增片段长度多态性) 技术以限制性DNA片段的选择性PCR扩增为基础, 已经在几种不同的微生物中得到了应用[12,13,14], 并且被认为是高度敏感的DNA分型方法之一。在1996年日本发生万人感染肠出血性大肠杆菌O157:H7的大流行后, 渡边治雄[15]等人应用这三种方法及噬菌体分型方法对自大阪, 和歌山和京都分离的与暴发相关联的菌株及与暴发不关联的和散发的肠出血性大肠杆菌菌株进行了分析。研究结果表明, PFGE是分离流行病学上非关联暴发和散发病例的菌株的最有力的方法。然而, 这种方法需要一天或一天以上才能得到可靠的结果。AFLP看起来可以得到与PFGE相比较的结果, 然而它需要对DNA的序列进行分析。RAPD-PCR可以快速地得到结果, 然而在对仅有极少差别菌株的区分上, 敏感性不很高。噬菌体分型是一种更为经典的方法, 但相对于PFGE而言, 也是一种敏感的方法。每一种方法都具有各自的优点和缺点, 可以根据每一个人的环境条件而加以选用。然而, 这些方法的综合应用会提高对菌株的区分能力, 并且有助于确定菌株间的相关性[14,16]。Noller[17]在对MLST的研究中发现, 虽然MLST以其易于标准化及自动化而成功地用于肺炎链球菌、沙门氏菌及脑膜炎奈瑟氏菌的分型, 但却不能够区分肠出血性大肠杆菌O157菌株, 在7个相关基因中没有发现不同, 在两个表面蛋白质基因中也只发现些微差异。

Pulse Net是在美国疾病预防控制中心倡导下成立的学术性组织, 是美国监控食品相关疾病的亚型分级网络。它由HHS/CDC、若干卫生部门及实验室于1996年组成。目标是推广标准化的病原性细菌分子分型技术, 为细菌性传染病实验室监测提供技术和方法, 以防范传染病的跨地区和国际间的传播, 有助于传染病暴发流行的调查、追踪、溯源和应对。该网络代表了病原菌监测和实验室监测应用于传染病预防控制的发展方向, 并已在一些发达国家建立起来并应用于传染病暴发流行的预警、监测和控制。Pulse Net主要功用是提供流行病学方面的食品相关病原体亚型分级。Pulse Net能识别疾病发生的潜在可能性, 尤其是那些分布广泛的病原。这在以前是不可能被发现的。目前在对肠出血性大肠杆菌的监测中, Pulse Net监测主要是采用PFGE技术。由于PFGE能够对整条染色体进行分析, 稳定性好, 分辨率高, 因而相对于其他诸多的分子分型方法而言, 近几年已作为一种肠道细菌的基础分型方法在世界范围内被广泛采用。用PFGE对肠出血性大肠杆菌进行分子分型, 建立资料库, 通过国际互联网, 在各实验室之间进行DNA图谱的快速传递与比较, 由此可以对许多地域上发生不同的病例进行流行病学上的追踪。虽然Pulsenet的成功有据可查[18], 但PFGE的数据作为连续性的片段大小的结果对于数据库的比较并不特别适合[19]。另外, 即便在应用两种核酸限制性内切酶处理后, 也通常会因为产生同样的条带而不能为密切相关的菌株提供最大限度的分辨力。因此多位点串联重复序列 (MLVA) 作为一种以串联重复序列在不同的菌株间出现的次数为基础的分型方法近年来广受关注。它在采用多种引物进行PCR后, 对扩增产物进行序列分析, 鉴别菌株间的异同, 结果比较客观, 不像PFGE基于条带的位置和数目进行判断具有主观性。目前发现二者的分辨力是一致的。MLVA是一种快速的分析多位点串联重复序列的易操作的方法, 而多位点串联重复序列是细菌的基因组快速进化的区域。MLVA包括确定多个位点的串联重复序列的数目, 因此可以对同种菌株间的基因关系的评价提供一种有力的方法。由于进化关系是在多个位点上进行估计, 这样分析的准确性很高, 且由特殊位点引起的集聚性判断的可能性就会降低[19]。另外, MLVA的输出结果非常客观, 易于对暴发快速检查的数据进行自动化计算机分析, 易于对实验室间的结果进行比较。用MLVA方法, 可以区分用其他方法不能区分的基因类型, 且从种系发生上将关系密切的菌株定义为相关菌株。

MLVA作为近年来新出现的一种分型方法, 已经在一些细菌的分型中有所应用, 如流感嗜血杆菌、鼠疫耶尔森氏菌、炭疽杆菌、布鲁氏杆菌、结核分枝杆菌等。MLVA在国外的研究开展较多, 在国内只在结核分枝杆菌有过分型的报道。对于肠出血性大肠杆菌, 仅对O157, O55血清型有过分型的研究, 对其他的血清型尚未见相关报道。Keim[19]在对O157及O55血清型肠出血性大肠杆菌的多位点串联重复序列的研究中, 采用已发表的29种引物, 对56株细菌进行了分型的研究。结果发现位点的多态性是0.23~0.95, 等位基因的数目在2-29之间。通过与PFGE的分型结果对比发现, 两种方法的基因相似性高度相关, 且对于PFGE分型类似值近似1.0的菌株, MLVA具有更为细致的区分能力。Noller[20]在对O157肠出血性大肠杆菌的MLVA的分型研究中, 在7个位点中发现6-30个等位基因。研究结果表明, MLVA具有与PFGE相同的敏感性, 且具有更好的特异性。Lindstedt[21]对O157的MLVA进行分型, 表明MLVA实验快速, 各步骤都可自动化且对O157菌株具有高的分辨力。

亚太区病原细菌分子分型网络于2003年成立后, 每年召开一次会议, 先后在美国、中国香港、日本和中国南京举办。于2006年12月19~21日在江苏南京举行的第四次亚太区病原细菌分子分型网络Pulse Net Asia Pacific工作会议上, 亚太区的13个国家和地区 (澳大利亚、菲律宾、韩国、马来西亚、孟加拉、日本、泰国、新西兰、印度、越南及我国大陆、香港和台湾地区) 及美国疾病预防控制中心 (CDC Atlanta) 、美国公共卫生实验室协会 (APHL) 、加拿大卫生部国家微生物实验室的约32名代表参加了会议。在美国CDC的倡导下, 包括日本, 新西兰及我国香港在内的几个国家和地区的代表在2005~2006年对MLVA在肠出血性大肠杆菌O157中的应用进行了尝试, 并且在会议上发表了各自的研究结果, 为丰富Pulse Net的实验室网络监测技术提供了新的思路, 也为这种分子分型方法在肠出血性大肠杆菌检测中的推广应用奠定了基础。

农产品安全检测中的分子生物学技术 篇6

民以食为天, 食以安为先。农产品安全性要求农产品中不应含有可能损害或威胁人体的物质或因素, 它关系到人体健康和社会稳定。随着世界经济全球化、贸易自由化和农产品国际贸易的迅速发展, 农产品安全已成为事关人民健康和构建和谐社会的重大战略问题, 及时、安全、准确地检测出农产品中的病原微生物是农产品安全检测的重要内容。随着农产品分析物质的不断微量和痕量化, 农产品基质的不断复杂, 仅使用传统分析技术已难以解决所有的问题。分子生物学技术不仅可以简化前处理过程、而且操作简便、检测成本低、安全可靠, 且能进行特异性处理分析, 其在农产品分析中占据越来越高的比例[1], 目前在农产品检测中常用的技术包括:酶联免疫分析技术 (ELISA) 、基因芯片技术、分子印迹技术、聚合酶链式反应 (PCR) 技术、试纸条快速检测技术、流动注射免疫分析技术、生物传感器技术 (biosensor) 等。分子生物学技术解决了传统农产品前处理所不能解决的问题, 特别是在农产品中有毒有害物质检测中发挥了重要的作用。

1 应用于农产品安全检测中的分子生物学技术

1.1 酶联免疫分析技术

酶联免疫分析技术是20世纪70年代初期由荷兰学者Weeman与Schurrs和瑞典学者Engvall与Perlman几乎同时提出的。最初ELISA主要用于病毒和细菌的检测, 20世纪70年代后期开始广泛应用于抗原、抗体的测定, 范围涉及到一些药物、激素、毒素等半抗原分子的定性定量检测。它是在RIA理论的基础上发展起来的一种非放射性标记免疫分析技术。它利用酶标记物同抗原抗体复合物的免疫反应与酶的催化放大作用相结合, 既保持了酶催化反应的敏感性, 又保持了抗原抗体反应的特异性, 极大的提高了灵敏度, 且克服了RIA操作过程中放射性同位素对人体的伤害。酶联免疫分析法在农产品安全检测中最为常用[2]。农兽药残留免疫分析方法的建立包括待测物选择、半抗原合成、人工抗原合成、抗体制备、测定方法建立、样本前处理方法和方法评价等步骤。ELISA具有样品前处理简单, 纯化步骤少, 大量样本分析时间短, 适合于做成试剂盒现场筛选等优点, 使其可试验快速现场监测, 是现阶段农产品安全检测领域应用较多的一项检测技术。目前酶联免疫检测的农、兽药残留种类主要包括:有机磷农药、拟除虫菊酯类农药、有机氯类农药、氨基甲酸酯类、兽药类等。

1.2 PCR技术 (聚合酶链式反应技术)

该技术诞生于1985年, 由美国Cetus公司和加州大学联合创建。PCR技术利用变性与复性原理, 在体外使用DNA聚合酶, 在引物的引导和脱氧核糖核苷酸 (d NTP) 的参与下将模板在数小时内进行百万倍扩增。该技术可选择性地放大特定的DNA序列, 因此在农产品致病性微生物检测方面发挥着越来越重要的作用[3]。实时定量PCR技术是近年发展起来的新型技术, 该技术通过直接测定PCR过程中荧光信号的变化, 利用电脑分析软件对PCR过程中产生的扩增产物进行动态监测和自动定量, 从而成功地实现了PCR从定性到定量的飞跃。而且, 使用实时定量PCR技术不需要进行凝胶电泳, 避免了交叉污染, 使反应具有更强的特异性和更高的自动化程度。随着分子生物学技术的不断发展, 多重PCR[4]、标记PCR和不对称PCR等多种不同的PCR方法都被应用于农产品检测中, 它们的应用使PCR技术拥有了更高的灵敏度和更短的周期[5]。

1.3 试纸条快速检测技术

试纸条与试剂盒相比较具有更加易于携带、检测更加迅速等优势。在实际检测过程中, 特别是现场快速检测, 并不一定需要对每个样品都获得定量数据而只需要定性地判别出某个样品是否含有某种农兽药, 含量是否超过规定标准既可[6]。因此只需要几分钟或十几分钟就可以获得结果的快速检测试纸条是最为合适的检测工具[7]。试纸条技术与试剂盒相类似, 其特点是以微孔膜作为固相载体。标记物可用酶或各种有色微粒子, 如彩色乳胶、胶体金、胶体硒等, 以红色的胶体金最为常用。固相膜的特点在于其类似滤纸的多孔性。液体可穿过固相膜流出, 也可以通过毛细管层析作用在膜上向前移行。常用的固相载体膜为硝酸纤维素膜、尼龙膜等。试纸条技术主要包括酶标记免疫检测技术 (immunoenzyme labeling technique) 和胶体金标记免疫检测技术 (immunogold labelling technique) 。酶标记免疫检测技术是以酶为示踪标记物, 而胶体金标记免疫检测技术是以胶体金作为示踪标记物, 应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。

1.4 流动注射免疫分析技术

流动注射免疫分析法是将速度快、自动化程度高、重现性好的流动注射分析与特异性强、灵敏度高的免疫分析集为一体。这种分析方法具有分析时间短、需要样品量小和操作简便等特点[8]。利用FIIA对一些样品分析, 测定耗时不足1min。FIIA有:均相FIIA和非均相FIIA。流动注射免疫分析主要包括:流动注射脂质体免疫分析技术、流动注射荧光检测、流动注射化学发光检测、流动注射分光光度检测和流动注射电化学检测。利用FIIA是一种灵敏性、专一性、准确性好、快速、节约成本的方法, 样品也不需要预处理和富集。

2 结语

随着经济的全球化发展和农产品的跨区域、跨国际流通, 对农产品病原菌的检测要求也越来越高。从定性和定量两方面出发, 准确、快速、经济的检测方法是农产品安全检测的发展方向。尽管分子生物学检测方法具有诸多优点, 但目前它们大多处于实验室阶段, 不能广泛应用于实践, 仅能作为标准检测方法的参考。因此, 在今后的工作中应进一步加快研究步伐, 建立真正实用的农产品快速检测方法。产品快速检测方法。

摘要：本文主要介绍了酶联免疫分析技术、聚合酶链式反应技术、试纸条快速检测技术、流动注射免疫分析技术等分子生物学检测技术的原理、开发及其在农产品中有毒有害物质检测中的应用。

关键词：农产品,有毒有害物质,分子生物学,检测技术

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分子生物学检测方法 篇7

农产品安全性要求农产品中不应含有可能损害或威胁人体的物质或因素,它关系到人体健康和社会稳定。随着世界经济全球化、贸易自由化和农产品国际贸易的迅速发展,农产品安全已成为事关人民健康和构建和谐社会的重大战略问题,及时、安全、准确地检测出农产品中的病原微生物是农产品安全检测的重要内容。随着农产品分析物质的不断微量和痕量化,农产品基质的不断复杂,仅使用传统分析技术已难以解决所有的问题。分子生物学技术不仅可以简化前处理过程、而且操作简便、检测成本低、安全可靠,且能进行特异性处理分析,其在农产品分析中占据越来越高的比例[1],目前在农产品检测中常用的技术包括:酶联免疫分析技术(ELISA)、基因芯片技术、分子印迹技术、聚合酶链式反应(PCR)技术、试纸条快速检测技术、流动注射免疫分析技术、生物传感器技术(biosensor)、等。分子生物学技术解决了传统农产品前处理所不能解决的问题,特别是在农产品中有毒有害物质检测中发挥了重要的作用。

1 应用于农产品安全检测中的分子生物学技术

1.1 酶联免疫分析技术[2,3]

酶联免疫分析技术是20世纪70年代初期由荷兰学者Weeman与Schurrs和瑞典学者Engvall与Perlman几乎同时提出的。最初ELISA主要用于病毒和细菌的检测,20世纪70年代后期开始广泛应用于抗原、抗体的测定,范围涉及到一些药物、激素、毒素等半抗原分子的定性定量检测。它是在RIA理论的基础上发展起来的一种非放射性标记免疫分析技术。它利用酶标记物同抗原抗体复合物的免疫反应与酶的催化放大作用相结合,既保持了酶催化反应的敏感性,又保持了抗原抗体反应的特异性,极大的提高了灵敏度,且克服了RIA操作过程中放射性同位素对人体的伤害。酶联免疫分析法在农产品安全检测中最为常用。农兽药残留免疫分析方法的建立包括待测物选择、半抗原合成、人工抗原合成、抗体制备、测定方法建立、样本前处理方法和方法评价等步骤。ELISA具有样品前处理简单,纯化步骤少,大量样本分析时间短,适合于做成试剂盒现场筛选等优点,使其可试验快速现场监测,是现阶段农产品安全检测领域应用较多的一项检测技术。目前酶联免疫检测的农、兽药残留种类主要包括:有机磷农药、拟除虫菊酯类农药、有机氯类农药、氨基甲酸酯类、兽药类等。

1.2 基因芯片技术[4,5]

基因芯片技术是采用原位合成或显微打印手段,将数以万计的核酸探针固化于支持物表面,与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号来实现对样品的快速检测。基因芯片技术是基于芯片上的探针与样品中的靶基因片段之间发生的特异性核酸杂交。基因芯片的基本原理与核酸杂交相似,但它将大量按检测要求设计好的探针固化,仅通过一次杂交便可检测出多种靶基因的相关信息,具有高通量、多参数同步分析,快速全自动分析,高精确度、高精密度和高灵敏度分析的特点,是目前鉴别有害微生物的最有效的手段之一。近年来,许多学者利用基因芯片对常见致病菌进行了分析检测。

1.3 分子印迹检测技术[6,7]

分子印迹技术利用化学手段合成一种高分子聚合物—分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymer,MIP),MIP能够特异性吸附作为印迹分子的待测物,在免疫分析中可以取代生物抗体,被科学家誉为“人工抗体”。它具有一定的预定性,识别性和实用性等特点,在农产品安全检测中的潜力已引起了人们的关注。由于农兽药在农产品基质中的痕量残留性以及基质的复杂性,需要对待侧的农兽药物质进行分离,净化和富集。MIPs的固相萃取(MISPE)技术已被广泛应用于药物、生物、农产品、环境样品分析,作为监测药物、生物大分子、烟碱、除草剂、农药等的预富集处理。根据直接竞争免疫分析方法,采用荧光标记示踪物,灵敏度虽不及生物抗体免疫分析得到的结果,但分析时间缩短而且该放生抗体具有上百次的可再生使用次数。使用MIPs作为生物传感器的识别元件是另一具有发展前景的应用。较之抗体、受体或酶,MIPs制成的传感膜有明显的优越性,如适用范围广、能够长期稳定、耐高温和耐腐蚀。

1.4 PCR技术[8,9,10,11]

聚合酶链式反应技术诞生于1985年,由美国Cetus公司和加州大学联合创建。PCR技术利用变性与复性原理,在体外使用DNA聚合酶,在引物的引导和脱氧核糖核苷酸(dNTP)的参与下将模板在数小时内进行百万倍扩增。该技术可选择性地放大特定的DNA序列,因此在农产品致病性微生物检测方面发挥着越来越重要的作用。实时定量PCR技术是近年发展起来的新型技术,该技术通过直接测定PCR过程中荧光信号的变化,利用电脑分析软件对PCR过程中产生的扩增产物进行动态监测和自动定量,从而成功地实现了PCR从定性到定量的飞跃。而且,使用实时定量PCR技术不需要进行凝胶电泳,避免了交叉污染,使反应具有更强的特异性和更高的自动化程度。随着分子生物学技术的不断发展,多重PCR、标记PCR和不对称PCR等多种不同的PCR方法都被应用于农产品检测中,它们的应用使PCR技术拥有了更高的灵敏度和更短的周期。

1.5 试纸条快速检测技术(即膜载体免疫分析快速检测技术)[12,13]

试纸条与试剂盒相比较具有更加易于携带、检测更加迅速等优势。在实际检测过程中,特别是现场快速检测,并不一定需要对每个样品都获得定量数据而只需要定性地判别出某个样品是否含有某种农兽药,含量是否超过规定标准既可。因此只需要几分钟或十几分钟就可以获得结果的快速检测试纸条是最为合适的检测工具。试纸条技术与试剂盒相类似,其特点是以微孔膜作为固相载体。标记物可用酶或各种有色微粒子,如彩色乳胶、胶体金、胶体硒等,以红色的胶体金最为常用。固相膜的特点在于其类似滤纸的多孔性。液体可穿过固相膜流出,也可以通过毛细管层析作用在膜上向前移行。常用的固相载体膜为硝酸纤维素膜、尼龙膜等。试纸条技术主要包括酶标记免疫检测技术(immunoenzyme labeling technique)和胶体金标记免疫检测技术(immunogold labelling technique)。酶标记免疫检测技术是以酶为示踪标记物,而胶体金标记免疫检测技术是以胶体金作为示踪标记物,应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。酶标记检测技术包括flow-through和dip-stick两种形式,胶体金标记检测技术包括flow-through和lateral-flow两种形式。

1.6 流动注射免疫分析技术[14]

流动注射免疫分析法是将速度快、自动化程度高、重现性好的流动注射分析与特异性强、灵敏度高的免疫分析集为一体。这种分析方法具有分析时间短、需要样品量小和操作简便等特点。利用FIIA对一些样品分析,测定耗时不足1min。FIIA有:均相FIIA和非均相FIIA。流动注射免疫分析主要包括:流动注射脂质体免疫分析技术、流动注射荧光检测、流动注射化学发光检测、流动注射分光光度检测和流动注射电化学检测。利用FIIA是一种灵敏性、专一性、准确性好、快速、节约成本的方法,样品也不需要预处理和富集。

1.7 其他分析技术[15,16,17,18]

免疫亲和(Immunoaffinity)是利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种层析技术。其原理是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物,使目标产物得到分离纯化的液相层析法。亲和层析已经广泛应用于生物分子的分离和纯化,如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素受体、糖蛋白、核酸及多糖类等;也可以用于分离细胞、细胞器、病毒等。

毛细管电泳免疫分析技术是将毛细管电泳技术(CE)与免疫分析技术(IA)相结合起来的一种新型的免疫分析技术。毛细管电泳免疫分析分为竞争性毛细管电泳免疫分析和非竞争性毛细管电泳免疫分析。与毛细管电泳免疫分析的检测器主要有激光诱导荧光和紫外检测器。其中激光诱导荧光检测器因具有较高的检测灵敏度,通过对抗体或是抗原进行荧光标记而被广泛使用。此外还有生物传感器、荧光免疫分析技术、放射免疫分析技术、磁免疫分析技术、蛋白质芯片、等。

2 结语

分子生物学检测方法 篇8

1 生活在活性污泥当中的微生物

活性污泥当中主要含有藻类、细菌、原生动物、微型动物、真菌、放线菌等, 能够分解和吸附存在于废水当中的有机物。活性污泥当中存在较多的菌, 主要有丝状菌和菌胶团以及少量的游离细菌。活性污泥当中还存在较多的原生动物, 时常出现的一些原生动物包括变形虫、漫游虫、盾纤虫、吸管虫和钟虫类等等。除此之外, 活动污泥当中还存在诸多后生动物, 例如:线虫、轮虫等, 所以人们认为活性污泥属于一个极其丰富的微生物世界, 针对那些工艺管理者而言, 一定要具有识别微生物的能力, 并掌握它在处理污水时表现出来的指示作用。

2 应用微生物检测污水中微生物的工艺流程

2.1 对镜检进行介绍

在做污水处理厂这个实验时, 微生物镜检这个项目最近这些被众多相关人士所关注和研究。此检测项目依据直观可靠的检测结果, 同化验室SVI以及MLSS和SV等诸多检测结果进行配合, 能够使工艺掌控人员清楚的掌握系统当中活性污泥的实际变化情况, 这样工艺掌控人员就能够对工艺进行有针对性的调整[1]。

2.2 镜检采样

(1) 采样。我污水厂根据SBR-DAT-IAT这项工艺所具有的特征, 确定在DAT-IAT这个反应池当中中设置相应的采样点, 采样的时间就是反应池当中曝起25分钟后, 也就是泥水全部混合到一起的时候, 从DAT-IAT这个反应池当中取出100毫升的混合液。为了不让水样发生变质, 需要在取样之后便及时将其拿到化验室当中来进行检测工作。通常情况下可以一周采样一次, 还可以一个月采样一次, 实际上我们需要了解工艺的实际调整情况以及接纳污水的情况, 然后适当的增加采样的次数。由于没有相同的工艺, 所以, 应用微生物镜检来对污水当中的微生物进行检测时, 采样点应该是工艺当中代表性极强的位置, 例如:污水处理厂当中二沉池的入口处或者是反应池的末端[2]。同时, 采取的样品一定要是池中最具代表性的一些泥水混合溶液。

(2) 利用微生物镜检对污水中微生物进行检测的方法。把传统的计数法当做定量污水当中微生物的方法, 使用滴管提取一滴 (0.06毫升) 混合均匀的溶液滴到载玻璃片之上, 然后从一侧把盖玻片压好。在制作的时候, 一定要注意不能让气泡出现。制作完样品之后, 应用规格是10*15倍的显微镜来观察全片, 并把对微生物的数量进行计量。然后把观察到的结果记录下来, 这时应该记录微生物的状态活性、数量以及种类等。

3 污水处理厂当中微生物镜检所具有的作用

在污水处理厂实际运行过程中, 利用镜检的方式能够探究出微生物的具体生长状态, 进而掌握活性水泥所具有的活性。在此厂这个大工艺系统当中, 当存在大量钟虫时, 说明此系统在出来工业废水以及生活污水方面有着较好的效果, 能够处理处大量的清水[3]。假如检测出大量的枝虫, 并且轮虫还具有较快的繁殖速度, 通常表明污泥将会发生膨胀的现象。如果检测出盾纤虫的数量逐渐减少, 并且活跃程度大大降低时, 就有可能是进水时受到了污染, 这时所放出的水会非常的浑浊。当活性污泥膨胀的时候, 那么它的絮状结构就会变得十分松散, 诸多草履虫以及变形虫就会出现, 这时出水时经常会带出大量的污泥。

4 针对污水处理工艺提出的指导意见

我们在应用微生物镜检检测污水当中的微生物, 能够够获得非常好的效果。因为指示菌所具有的活力特别高, 并且还能够感知特定物质所表现出来的变化, 所以, 合理的应用微生物镜检能够迅速感知到污水当中各种成分变化状况。而应用微生物镜检能够顺利的完成检测环境的工作。此外还需要明确的一点就是, 利用微生物镜检这项技术时, 一定要注意其自身的几个特征:拥有可以被定量、检测与扩增性;能够准确感知存在于环境当中一些物质的实际变化;在某种环境当中能够体现出较强的活力等[4]。

从整体上来看, 微生物镜检这项技术的灵敏度非常高, 实现了应用非培养的方式对微生物所具有的多样性进行研究的目的, 在基因水平方面使物种的多样性得以扩大, 同时还使活性污泥微生物的探究得到了良好发展。可是任何一种检测方式都具有相应的功能优势以及局限性, 且还一直处在逐渐完善与发展的过程中。所以, 在对微生物的功能与结构进行分析时, 一定要考虑分子技术自身因素会对实验结果造成的影响, 并在探究通过分子技术得到的结果时, 还要探究此方法所具有的稳定性、适用范围以及代表性。如果条件充足的情况下, 应该结合诸多种不相同的分析方法, 合理的对活性污泥当中存在的微生物进行解释与判断, 进而获得一个正确的检验结果。

5 结语

在二十世纪八十年, 微生物镜检这项技术自从诞生之日起, 就被应用在诸多领域当中, 并获得了非常好的检测效果, 例如:考古学、生物学、工程学以及医学等。随着科技的进步, 微生物镜检这种检测手段也不断更新和改变, 并在污水处理方面有了崭新的进展, 可是还有一定的缺陷存在其中, 需要这一领域上的工作人员进行不断努力, 使生物学技术可以更加完善。

摘要：文章针对活性污泥处理, 介绍了存在于活性污泥当中的微生物, 然后又分别探究了微生物镜检这项技术在处理污水中微生物的工艺流程, 最后针对污水处理工艺提出了一些具有指导性的意见, 希望可以达到很好的污水治理效果。

关键词：分子生物学技术,污水处理,微生物检测,应用

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分子生物学检测方法 篇9

摘 要 线虫群落组成可作为评估土壤环境质量的一个重要指标。分子生物学手段为解决传统形态学鉴定进行群落组成分析工作量较大，专业知识需求高，鉴定结果的一致性易受干扰等问题提供了新途径，并具有样品量小，检测速度快，对近缘种区分度高等特点。

关键词 线虫多样性；高通量测序；DGGE；分子生物学；遗传标记

中图分类号：S154 文献标志码：B 文章编号：1673-890X（2016）15--02

线虫在土壤食物网中占据较为重要的地位，常以土壤微生物为食，在土壤有机质分解、养分循环、改善土壤结构以及植物演替中发挥着重要的作用，其群落组成的变化能够反映所在生态系统的健康状况[1]。

传统的线虫群落结构研究基于对土壤中线虫的人工分离和形态学鉴定，往往需要研究者具备专业的分类学知识，同时耗费大量的时间和精力。而且，由于线虫个体较小，物种的分类比较粗糙，往往只到科属水平，使生态分析比较模糊或表面化。此外，由于提取方法和形态学分类依据的限制，科属鉴定只能针对从土壤中获取的很小一部分成年线虫个体，很难反映全部土壤线虫的状态，且易受环境和人为因素的干扰，可能使后续群落结构和区系分析结果在平行试验结果间缺乏一致性。

针对遗传物质的分子生物学方法在分类学上的引入为解决问题提供了新的方法和思路。不同于传统的形态学鉴定对常规物种描述性的评估，采用分子生物学方法能针对少量样品进行分析，降低了劳动强度和对分类学专业知识的要求，提高了效率。此外，分子生物学技术也可以更容易地鉴定亲缘种[2]，提高了研究的精度。本文针对线虫群落结构分析中分子生物学的研究应用现状进行概述，分析了各种方法的利弊，为线虫分子生态学研究提供参考。

1 利用分子生物学方法对线虫群落的分析

1.1 DNA条形码技术

DNA条形码技术能利用相对较短的标准DNA片段，进行种内特异性与种间多样性的生物身份建立，实现了对物种快速、准确进行识别和鉴定[3]，可用于与生物分类相关的生态学、保护生物学等领域。基于DNA条形码技术的线虫分类学研究已经引起人们的关注。许多遗传标记（Genetic Markers）已被用于线虫的鉴定，包括SSU rDNA、LSU rDNA、ITS序列、COI等。

小亚基核糖体DNA（The ribosomal DNA small subunit，SSU rDNA）是最早用于标记的片段，目前应用较广泛。它能有效描述某些线虫但不能完全解释形态学研究观察到的结果。对于线虫目和科水平的鉴定效果较好，但某些线虫种无法用SSU进行区分。后来，人们尝试用大亚基核糖体DNA（The ribosomal DNA large subunit ，LSU rDNA），但它需要多个区域的扩增是有效的。利用核糖体DNA内转录间隔区（The internal transcribed spacer，ITS）建立线虫系统发育分类系统。线粒体细胞色素C氧化酶亚基I（Cyctochromec oxidase subunit I，COI）具有引物通用性高和进化速率快等优点，用于动物分类鉴定较为理想。当然，利用以上遗传标记的条形码技术都一些问题，如缺少同门范围（phylum-wide）内的引物，很难找到适宜用做条形码的单一基因片段以鉴定全球范围内的线虫种类，进而建立高通量测序的方法等。

1.2 PCR-DGGE

变性梯度凝胶电泳（Denaturing gradient gelelectrophoresis，DGGE）利用不同核酸序列或基因片段在变性梯度胶上电泳迁移率的不同将序列分开，可以直接切下凝胶条带测序，进行群落内的系统发育分析。有研究探讨使用PCR-DGGE法分析线虫群落组成。Waite[4]等从草地土壤中直接提取环境DNA，针对SSU 18S rDNA序列，采用PCR-DGGC法研究土壤线虫群落的多样性，并获得了某些属线虫的特异序列。但发现结果与之前进行的基于形态学分类的研究结果不一致。并且，从结果很难获取有关的遗传多样性或任何特定的类群的相对丰度的信息。Wang[5]等采用该法和形态学鉴定相结合的方法对铜污染土壤中线虫多样性进行分析，结果表明，PCR-DGGE法对判别重金属污染土壤中线虫多样性具有可行性。但PCR-DGGE法存在一些缺点，如PCR引物可能存在扩增的局限性；分离的DNA片段较小（最大为1 kb），序列信息有限；在不适宜的实验条件下，序列不同DNA片段不能完全分开；只能检测到环境中的优势种群等。

1.3 PCR-TRLFP

末端限制性片段长度多态性分析（Terminal restriction fragment length polymorphism，TRFLP），在PCR扩增基础上，根据限制性酶切片段长度差异来检测生物群落差异的一种指纹分析方法。该方法可用于不同生境的线虫群落研究。目前，已针对草地、农田、沙丘、森林及沼泽地等生态系统开展了相应研究[6-8]，并获得了较理想的结果。TRFLP最主要的优点是能够在不同序列运行中比较数据，不像DGGE在凝胶之间比较。片段可以被精确地控制在700bp左右；超过这个规定的相关片段可以被控制在1000bp大小，分辨率相对较高。在96或384孔板可以进行TRFLP，加上电子数据输出和自动自如，这意味着它是高通量与快速数据分析结合的方法。但是由于限制性酶对扩增产物酶切得不完全，会存在高估生物群落的多样性。

1.4 高通量测序

高通量测序在微生物生态学研究中已经取得了比较理想的结果。因此，有研究者将该方法引入线虫多样性的研究中。近几年，二代测序技术（The next-generation sequencing，NGS），特别是454测序在线虫多样性研究方面取得了长足进展，定性或定量研究中，高通量测序结果都有比较好的一致性和重现性[9]。但也存在一些问题，例如，虽然线虫的优势种和常见种易被检测，特定种属的信息更加丰富，但还不能完全反映线虫群落组成。现有引物不具有线虫专一性，同时还会扩增出真菌、植物或其他后生动物的信息，易对聚类分析产生干扰。针对SSU rDNA的研究发现，先对土壤样品中线虫进行分离提取再进行测序，可以降低真菌或植物OUTs的干扰，但会使聚类结果偏向某些定的种属或特定生长阶段的线虫；而直接从土壤中获取线虫DNA，又对引物的特异性有较高要求[10]。因此，线虫DNA的提取方法，遗传标价通用引物的选择是下一步研究亟待解决的问题。

2 结语

虽然存在局限性，但分子生物学手段的应用拓宽了线虫学研究的广度和深度。有报道表明，传统分类学与分子方法对于线虫多样性的研究结果的缺乏一致性，因此，建立传统分类方法与分子方法的对应关系是研究的一个关键点，分子技术要能反映特定种或某功能团的相对多度。此外，高通量测序可以实现同时对多个土样样品的土壤线虫进行大规模分析，但目前方法尚不成熟，未来基于遗传标记的高通量基因组研究将线虫生态学的发展方向之一。传统分类学是分子手段的基础，分子方法对大样本的分析更加简便，二者彼此促进，必将推动土壤线虫分类学及群落研究的发展。

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肿瘤靶向治疗及其相应分子靶点检测 篇10

1 肿瘤分子靶点

肿瘤靶向治疗药物是采用基因设计和研制的, 主要以肿瘤发生发展中已经的异常分子为依据, 但是, 在临床治疗中, 并不是所有的肿瘤患者都有药物作用于靶点, 而且, 即便是存在着异常靶点, 但是其所表现出来的情况也是各有不同。因此, 为了强化肿瘤患者靶向治疗效果, 必须加强对患者肿瘤是否存在的靶点进行进一步了解。一般而言, 由于某种原因肿瘤的异常靶点不同, 有受体、激酶、信号传导、生长因子以及基因等[1]。所以, 其检测的方法和判断标准也会有所不同, 具体现在以下几个方面。

首先是相关抗原。一般而言, 某些表现抗原主要存在于恶性细胞上, 在周围的正常细胞上却没有, 在一定的条件下相关抗原就会成为与抗体相结合靶点, 为此, 可以将抗体的特异性进行改造, 如大小、位点、化学物质以及放射性物质等从而来使得抗体的治疗效果提高。

其次是酪氨酸激酶。该种物质与肿瘤的多向发展有关在细胞生长中, 会参与其生长过程, 包括细胞内恶性转化的蛋白质, 从而将异常信号传递出去, 所以, 从这个角度上讲在临床肿瘤治疗中, 酪氨酸激酶发挥着抑制性作用。经过大量的医学研究实验证明, 从人类的恶性肿瘤中发现了很多种酪氨酸激酶的高表达, 其对肿瘤患者的治疗有着不可忽视的抑制作用。

第三是血管生长因子。一般而言, 血管的生成与肿瘤的转移、生长密切相关。在肿瘤血管中, 细胞生长因子处于关键的核心地位, 诱导着血管的生长, 是由肿瘤细胞分泌而成的。因此, 将血管内VEGF阻断, 就会将异常信号传导阻断, 最终控制肿瘤血管的生长, 进而促进抗肿瘤药物的得到充分发挥, 达到良好的治疗目的。

第四是其他分子靶点。一般而言, 所指的其他分子靶点, 主要是指癌基因及产物、信号传导通路、抑癌基因及产物、端粒、法尼蛋白酶等, 在肿瘤药物治疗中, 这些都可以成为主要的利用靶点, 从而来提高肿瘤治疗效果。

2 肿瘤分子靶点检测方法

在现代临床医学中, 随着科学技术的发展, 临床医学现代化技术也在不断提升, 为此, 肿瘤分子靶点检测方法也在不断的完善, 主要有以下几点方法。

首先是DNA检测技术。该方法首要工作就是要将组织中的DNA提取出来, 采用PCR进行扩增处理, 分析其中是否存在突变形式、突变基因、突变位点, 这种方法主要用到的仪器是测序分析仪。目前, 该技术和方法主要用于检测生长因子受体的突变, 结合临床分析结果, 进而为临床诊断提出主要的依据。一般情况下, 最为常见的突变点是11号外显子和9号外显子, 偶尔也会有17号与13号外显子, 根据大量的研究显示, 传统的化疗治疗方法, 其有效率最高达10%, 但是这种检测方法的应用, 将突变基因检测出来, 采用药物甲磺酸伊马替尼, 其临床治疗有效率高达90%以上[2]。

其次是CISH技术。该技术主要利用碱性磷酸酶标记的探针进行检测, 先在组织切片进行杂交, 再用过氧化酶和抗体进行免疫结合, 利用光学显微镜观察是否存在异常信号, 从而确定有无基因扩增现象。而且这种方法操作简单, 不需要昂贵的仪器, 所用的试剂也比较便宜, 更为重要的是可以进行切片的长期保存, 是一种既比较又有效的检测方法, 具有较高的临床应用价值。经过大量文献资及研究显示, 基于这种技术上的检测率, 符合率高达95%以上, 甚至于可达100%。但是该技术也存在着一定的缺陷性, 如缺乏颜色信号、缺乏对照、基因扩增拷贝数无法计算, 因此, 这就提出FISH技术。

第三是FISH技术。这种技术主要是利用荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA进行杂交。目前这种技术主要是用于检测HER-2基因, 从而确定是否选用何种抗体来为晚期胃癌患者进行治疗, 因为这种方法在荧光显微镜下, 可以将细胞核内的杂交信号等显示出来。

3 总结

总而言之, 肿瘤的形成过程比较复杂, 起初是由于单一基因发生突变而引起的, 但是随着其不断生长, 引发新的突变, 并对药物产生抵抗作用, 从而影响肿瘤患者的治疗。而肿瘤靶向治疗及其相应分子靶点检测, 提高肿瘤治疗疗效, 体现出了肿瘤治疗的个性化, 具有重要的临床意义。

摘要：在20世纪70年代, 肿瘤生物学的研究与发展已经深入到分子水平, 同时, 发现了基因突变与扩增, 这在很大程度上促进了肿瘤的治疗。

关键词：肿瘤靶向治疗,相应分子,靶点检测

参考文献

[1]刘晓蕾, 胡成进.肺癌相关分子靶点检测方法及临床应用研究进展.分子诊断与治疗杂志, 2011, 3 (1505) :330-333.