信号通路干扰

2024-05-02

信号通路干扰（精选七篇）

信号通路干扰篇1

1 RNA干扰技术

RNAi是通过沉默目标基因以研究基因和蛋白质功能的研究手段, 被广泛的用于临床疾病研究。作用的起始阶段正义链和反义链混合的双链 (double-stranded RNA, ds RNA) 在细胞内与核酸内切酶Ⅲ结合后, 其被切割成si RNA。效应阶段si RNA则降解成正义链和反义链, 后者与内切核酸酶以及其他蛋白一起形成RNA诱导的沉默复合物 (RNA-induced silengcing complex, RISC) 。RISC的核酸部分与外源性基因所表达m RNA靶向结合后, 在结合部位切割m RNA, 随即RISC的蛋白部分引起m RNA降解。进入扩增阶段, si RNA与m RNA结合, 并将结合体作为引物, 从而再次形成ds RNA。靶向m RNA全部降解致使目的基因沉默。

2 RNAi对致肝星状细胞活化主要信号通路的应用

静止状态的HSC, 细胞质内α-平滑肌肌动蛋白 (smooth muscle actin-α, α-SMA) 较少。当肝脏受损时, HSC增殖活跃, 细胞外基质 (extracellular matrix, ECM) 分泌增多, 胞质内α-SMA产生增多[1], 此即HSC活化。实验证明转化生长因子-β (transforming growth factor-β, TGF-β) 信号通路、Wnt信号通路、结缔组织生长因子 (connective tissue growth factor, CTGF) 信号通路等均参与HSC的活化, 进而参与肝纤维化的形成。而应用RNAi沉默信号通路中的各种信号分子, 抑制HSC的活化, 从而为治疗肝纤维化提供新的途径。

2.1 TGF-β/Smads信号通路

TGF-β是超家族TGF中的一员, 其除了在ECM形成方面起着重要作用外还影响细胞的增殖、分化。不少学者发现参与肝脏损伤修复的细胞如肝细胞, 枯否细胞, 内皮细胞分泌大量TGFβ1, TGFβ1通过其受体 (主要为TβRⅠ及TβRⅡ) 作用于HSC, 分泌大量ECM, 其中TGFβ1被认为是致肝纤维化最强的细胞因子。TGFβ1先与TβRⅡ结合, 再与活化的TβRⅡ激酶结合使TβRⅠ磷酸化, 然后激活Smad2、3, Smad2、3与Smad4结合形成异源寡聚体, 最后转入胞核中发挥调控作用[2]。

有人用Smad3 si RNA转染活化的HSC后胶原Ⅰ, Ⅲ, ⅠⅤm RNA表达受到了明显抑制, 说明阻断TGF-β/Smad3信号传导途径能对抗纤维化进展。郑素军[3]等将Smad3-sh RNA慢病毒感染HSC-T6 3后观察细胞增殖, Smad3-sh RNA组较对照组细胞增殖明显下降 (P=0.00) , 表明Smad3-sh RNA可阻断TGFβ1对HSC-T6细胞的促增殖作用。而其他学者利用si RNA靶向沉默TGF-β1后, HSC激活相关指标均受到不同程度抑制, 延缓肝纤维化进程, 并一定程度上逆转肝纤维化。

2.2 Wnt/β-catenin信号通路

Wnt/β-catenin信号通路即经典β-catenin依赖信号通路, 该通路被证实与某些癌症、纤维化疾病、炎症性肠病有关。β-catenin是该信号通路的核心部分, 因为其游离态水平受肿瘤抑制因子结肠息肉基因产物、支架蛋白Axin、糖原合成酶激酶-3β构成的β-catenin降解复合体控制, 在未活化细胞的细胞质或细胞核内几乎检测不到[4], 当wnt蛋白与Frizzled受体结合后经一系列反应最终导致β-catenin在细胞质积累, 当积累到一定水平可发生核转移, 故β-catenin在细胞核内聚集, 可作为该信号通路激活的标志。

有研究发现β-catenin在活化HSC内的表达水平较静息状态提高了5~7倍[5], 目前越来越多的研究结果证实经典Wnt信号通路通过激活HSC参与了肝纤维化的形成。葛文松等[6,7]将si R-NAβ-Catenin转染HSC-T6细胞后, 发现HSCs增殖明显被抑制, 最大抑制率达到44.8±2.8% (P<0.01) ;HSC细胞凋亡增加达28.6% (P<0.05) , 同时下调了Ⅰ、Ⅲ型胶原m RNAs的表达。有研究证实Wnt/β-catenin信号通路通过下调PPARγ的表达而促进HSCs向肌成纤维细胞的转化[8]。Tsai等[9]利用si RNAβ-Catenin转染HSC-T6细胞, 发现PPARγ表达上调, 从而影响HSC的活化。

2.3 CTGF/整合素/FAK

CTGF (又称CCN2) 为一种富含半胱氨酸的分泌性多肽, 具有调节细胞增殖、分化、凋亡等作用, 还影响着细胞迁移、黏附等功能, 并影响ECM的生成。CTGF在正常肝脏组织的CTGF表达很低, 然而在肝纤维化患者体内其表达显著提高。整合素是跨膜蛋白家族成员之一, 由α和β两个亚基构成, 亚基上的胞外区与ECM相连, 同时还是CTGF的细胞表面受体。Huang等[10]证实CTGF能与HSC表面整合素α5β1受体结合, 在肝纤维化发生发展过程中发挥调节细胞增殖、黏附的功能。粘着斑激酶 (focal adhesion kinase, FAK) 是体内非受体型酪氨酸蛋白激酶之一, 与相应配体结合后经不同的信号转导通路, 调节细胞生长、增殖、周期调控及凋亡等过程。FAK的N端与整合素亚基上的胞质区结合后能传递细胞外来的信号。已有研究证实HSC活化伴随着CTGF/整合素α5β1/FAK信号通路的活化并以此通路促进肝纤维化。郝春秋等[11]发现沉默CTGF后HCT-T6细胞的Ⅰ型胶原蛋白m RNA和蛋白的表达分别下调了74.21%和70.79%, 同时ECM的产生受到抑制[12]。An等[13]利用RNA干扰技术沉默FAK基因能抑制HSC的增殖, 并通过caspase-3和Bcl-2/Bax通路诱导HCS的凋亡。

2.4 Notch信号通路

Notch信号通路包括Notch受体、转录因子、DSL配体和靶基因这4个核心组件, 其中Notch受体包括Notch1、2、3、4, 转录因子分别有CBF-1、Suppressor of hairless和Lag1, 而Jagged1, Jagged2, Delta-like1, Delta-like3, Delta-like4构成DSL配体, HES、Hey为靶基因。该信号通路通过Notch受体与配体结合, 释放出NICD (Notch intracellular domain, NICD) , 其核定位序列能被转运至细胞核内与CSL家族转录因子结合使靶基因表达, 从而调控细胞增殖、分化和凋亡。陈毅雄[14]验证了Notch受体1-3、DSL配体Jagged1以及靶基因HES1在HSC-T6中均有表达, 在用Notch3-si RNA转染HSC-T6细胞后α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白的表达下降, 而用Jagged1-si RNA转染后也有类似的作用, 表明沉默Jagged1能有效抑制HSC的活化和ECM的产生。同时, 研究还发现Notch3在正常肝组织中检测不到, 而在慢性活动性肝炎患者肝纤维化组织中的表达明显上调, 且α-SMA和Ⅰ型胶原表达增加;而沉默Notch3组中未发现上述表现[15]。

3 应用前景

近年来国内外许多研究探讨了肝纤维化的可能机制, 其中HSC的激活在肝纤维化中的作用得到广泛证实。而利用RNAi抑制HSC的活化能有效减缓肝纤维化进程。研究还发现信号传导途径之间有交互作用, 共沉默不同通路的信号分子有扩大抗纤维化的作用, 但目前此类研究尚少且多集中在动物实验。肝纤维化发展成肝硬化后将不可逆转, 若在肝硬化之前逆转肝纤维化将极大程度地减轻患者痛苦。

摘要：肝纤维化是各种致病因子致肝细胞损伤后的修复过度。肝星状细胞 (hepatic stellate cell, HSC) 的激活被认为是肝纤维化的核心环节, 实验证实多条信号传导通路参与HSC的激活。RNA干扰 (RNA interference, RNAi) 能有效沉默目的基因, 以HSC活化信号通路为切入点, 设计小干扰RNA (small interfering RNA, si RNA) 抑制相关信号通路的活化, 从而达到抑制HSC, 激活是目前研究肝纤维化机制的主要手段。该研究综述了RNAi技术在研究HSC活化信号途径中的作用, 以求为治疗肝纤维化提供一种新思路。

舌苔的细胞信号通路研究进展篇2

1 舌苔与细胞凋亡信号通路关系

细胞凋亡是由基因控制的细胞程序性死亡,胞外的死亡信号通过TNFR1、Fas等死亡受体完成跨膜传导,内质网和线粒体等细胞结构在死亡信号的胞内传导中具有重要作用,Caspase家族蛋白、bcl-2家族蛋白等多种分子参与凋亡信号的传导,相互制约组成一个完整、高效的凋亡机制网络系统[1]。目前研究发现,舌苔形成与舌背黏膜上皮细胞的增殖、分化和凋亡密切相关,舌苔的研究也深入到分子水平,特别是凋亡相关基因在舌苔研究中取得了不少有意义的成果[2]。在舌苔形成机制的研究中,吴正治课题组[3,4]运用原位杂交、免疫组化技术对凋亡相关基因bax、fas、TGF-β3在正常及常见病理舌苔上皮细胞中的mRNA转录水平及蛋白产物进行测定,发现与正常及薄苔比较,剥苔bax、fas基因过度表达伴随细胞凋亡增多,而厚苔bax、TGF-β3mRNA低表达伴随细胞凋亡减少,舌苔上皮细胞中促凋亡基因bax、fas、TGF-β3表达水平变化趋势与细胞凋亡水平变化趋势一致,他们从基因分子水平角度阐述常见舌苔的形成机制和影响因素;李明等[5]运用原位杂交、免疫组化技术对Fas在正常及常见病理舌苔上皮细胞中的mRNA转录水平及蛋白产物进行测定,发现Fas引导的细胞凋亡可能是影响舌苔上皮细胞凋亡并导致舌苔厚度变化的重要原因;梁文娜等[6]运用免疫组化技术检测舌苔脱落细胞调控蛋白,研究围绝经期综合征患者舌苔脱落细胞调控蛋白与肝郁病理对的相关性时发现,围绝经期综合征肝郁病理改变与舌苔脱落细胞调控蛋白Fas、Bax的阳性率呈正相关,与Bcl-2的阳性率呈负相关,提示肝郁病理是围绝经期综合征的核心病机之一,与舌苔脱落细胞凋亡调控蛋白相关;李灿东课题组[7]通过对109例慢性浅表性胃炎患者的舌象及舌上皮细胞凋亡基因相关蛋白p53、bcl-2及fas等进行观察,研究细胞凋亡与舌象形成的关系时发现,舌象形成与细胞凋亡具有密切关系,p53、bcl-2和fas参与了细胞凋亡的调控,共同构成了慢性浅表性胃炎舌象形成的细胞学基础。

从以上研究可见,在舌苔的形成过程中,特别是薄苔和厚苔的形成过程与bax、fas基因凋亡密切相关,一般认为在薄苔、剥苔中bax、fas基因表达增多伴随细胞凋亡增多,而厚苔中bax、fas基因的低表达伴随细胞凋亡减少。

2 舌苔与表皮生长因子信号通路关系

表皮生长因子主要在颌下腺和十二指肠Brunner氏腺产生,也存在于胰腺、空肠、肾脏等处,对于组织增生、分化和器官的发育成熟有重要作用,EGF-R具有促细胞分裂的酪氨酸酶[8]。现代研究发现[9],舌苔的增厚与表皮生长因子(EGF)的增加有关,EGF可以明显促进上皮细胞的角化,如刘家义等[10]通过对慢性胃炎各组患者唾液中表皮生长因子(EGF)含量的测定及舌苔上皮细胞表皮生长因子受体(EGFR)的蛋白检测来研究EGF及其受体表达与中医慢性胃炎舌象形成的关系,结果发现:唾液EGF含量及EGFR表达呈现脾胃湿热证>肝胃不和证>脾胃虚弱证>胃阴不足证的趋势,唾液EGF含量、EGFR表达与慢性胃炎舌象形成有相关性;周坤福等[11]运用EGF-R SABC免疫组化技术,通过皮下注射EGF,观察小鼠舌上皮细胞生长和EGF-R的表达观察表皮生长因子(EGF)影响舌苔形成的分子机制,结果发现EGF可以通过EGF-R机制,影响舌苔形成。任晓岚等[12]研究发现:EGF与EGF-R结合后,激活受体自身的酪氨酸激酶活性,将信号传递,参与有丝分裂,然后将有丝分裂信号从细胞外传递到细胞内,从而有效调节细胞对外界刺激的反应、细胞增生、存活、黏附、迁移和分化等;许冬青等[13]应用基因芯片、荧光定量PCR技术定量检测舌癌患者舌黏膜EGF-R mR-NA的表达水平,结果显示不同舌苔EGF-R mRNA表达水平差异明显,黄厚苔组值最高,其次是白薄苔、黄薄苔组,说明不同舌苔舌上皮细胞EGF-R基因表达水平存在明显差异,EGF-R可能是影响舌苔形成的重要因素之一;佟书娟等[14]采用ELISA法和免疫组化法S-P法检测胃腺癌患者不同舌苔组和正常人群对照组血清中TGF-α的含量及舌鳞癌患者不同舌苔舌背黏膜组织中EGF-R的表达情况,结果发现,胃腺癌组血清TGF-α的含量明显低于正常对照组(P<0.05);从苔色方面分析,胃腺癌白苔组明显低于正常对照组(P<0.05);从苔质方面分析,胃腺癌厚苔组明显高于正常对照组(P<0.05),胃腺癌剥苔组明显低于正常对照组(P<0.05);胃腺癌患者血清TGF-α的含量黄厚苔组明显高于剥苔组(P<0.05)。EGF-R在不同舌苔黏膜组织中的表达趋势为:舌鳞癌白薄苔组>舌鳞癌白厚苔组>舌鳞癌黄薄苔>舌鳞癌黄厚苔>舌鳞癌剥苔和正常对照组,说明TGF-α和EGF-R机制影响舌苔形成;张凌媛等[15]运用免疫组化技术检测围绝经期综合征肝郁型患者舌苔脱落细胞EGFR表达情况,研究舌苔变化与肝郁病理的内在联系,结论提示围绝经期综合征肝郁型患者舌苔脱落细胞EGFR表达阳性率明显高于健康人。综上所述,舌苔的形成与表皮生长因子的关系非常密切,特别是在消化道疾病中,表皮生长因子及受体都发生一定能更的改变,推测可能的机制为EGF可以通过EGF-R机制,影响舌苔形成。EGF与EGF-R结合后,激活受体自身的酪氨酸激酶活性,将信号传递,参与有丝分裂,然后将有丝分裂信号从细胞外传递到细胞内,从而有效调节细胞对外界刺激的反应、细胞增生、存活、黏附、迁移和分化。

3 舌苔与脂多糖信号通路关系

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是细菌的细胞壁主要组成成分,对LPS的识别与信号转导是机体自身防御反应的重要环节。LPS可通过LPS-LBP-s CD14三联复合物作用于TLR4并激活My D88,活化的My D88可聚集并结合IRAK1和IRAK2,然后作用于肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6),进一步激活MAPK和NF-kB信号转导通路165〗。由于唾液中的溶菌酶可以裂解口腔中的细菌而产生LPS,由此可推测口腔中的微生物群、溶菌酶与舌苔形成相关。LPS-MAPK通路作为近年来新兴的研究热点,从舌苔菌群的蛋白表达的研究及舌苔微生态角度阐述了舌苔形成的机制。Han J等[17]发现脂多糖激活LPS-MAPK信号通路在哺乳动物细胞中和酵母菌培养环境下同样是适应生理压力的一种途径。张军峰等[18]采用MTT法分别检测不同浓度脂多糖(LPS)经不同作用时长作用后,体外培养的舌鳞癌TCA-8113细胞增殖活性的影响,又通过免疫组化技术研究p38-MAPK激酶、c-myc、c-fos和NF-KB在TCA-8113细胞中的表达水平,来观察不同剂量脂多糖(LPS)同时长作用下,对舌鳞癌TCA-8113细胞的影响作用,结果发现LPS作用TCA-8113细胞16 h,对细胞增殖活性影响不明显;作用32 h,明显促进细胞增殖活性,高剂量脂多糖(LPS)可以影响TCA-8113的增殖活性,是参与舌苔形成的重要外源性因素,对NF-KB信号通路具有重要作用。

4 小结

舌诊是中医诊断的重要方法,其客观化研究一直是中医现代化的研究热点。上述的舌苔研究为中医舌诊客观化研究的发展开辟了广阔的前景,也取得一定成果。但是仍存在一定的不足:1)在舌象研究中,舌象判读多采用医生直观目测和经验辨析,缺乏客观化的评价;2)舌苔研究多集中在利用细胞化学、分子生物学等方法探讨舌苔与疾病的关系,而系统研究某种舌苔形成机制的较少;3)从舌苔的颜色、厚薄的变化与信号通路的关系研究较少。

mTOR信号通路与代谢性疾病篇3

1 m TOR的结构和调节作用

1.1 m TOR 复合体的结构

m TOR存在两种不同功能形式的蛋白质复合体:m TORC1(m TOR complex 1)和m TORC2 (m TOR complex 2)。m TORC1和m TORC2都含有m TOR、m LST8或称Gβl(mammalian lethal withSEC13 protein 8 or G proteinβ-subunit-like)和deptor(DEPdomain-containing m TOR-interacting protein),但是,raptor(regulatory-associated protein of m TOR)和PRAS40或称AKT1S1(proline-rich Akt substrate of 40 k Da)只存在于m TORC1,m TORC2则包含其独有的rictor(rapamycin-insensitive companionof m TOR)、m SIN1或称MAPKAP1 (mammalian stress-activatedmap kinase-interacting protein 1)和PRR5或称protor(proteinobserved with rictor)。也有文献指出:PRAS40是否作为m TORC1的一个核心组成部分或是一个相互作用的底物仍存在争议。

1.2 m TOR 的调节

m TOR通路包括一系列上游蛋白和下游底物,生长因子和胰岛素等活化磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K),通过PI3K依赖的激酶1(PDK1)磷酸化蛋白激酶B(AKt),活化的AKt磷酸化激活m TOR及下游底物。m TOR以两种复合物形式存在,m TORc1和m TORc2,m TORc1作为PI3K/AKt的下游效应器,在氨基酸充足的环境中,受胰岛素和分裂素刺激活化,而m TORc2通过磷酸化AKt的S473使之活化。活化的m TOR进一步通过磷酸化p70s6k和4E-BP1等调节蛋白的合成。相反,当细胞感觉营养缺乏和其他压力时,细胞内的m TOR活性受到抑制,蛋白合成减慢,以便分配更多的ATP用于应付生存危机,TSC2和Raptor是两个对m TORc1具有相反作用的蛋白,TSC2通过降低RHeb的活性以抑制m TOR1的活性,Raptor结合m TOR1并成为维持酶活性的必须蛋白。

也有学者认为,由于m TOR的活性和ATP的浓度关系密切,所以说m TOR是一种能量传感器,而胰岛素信号就是通过m TOR介导的信号传导而起到调节的作用,胰岛素与受体结合激活相应的酶活性,导致其磷酸化及相应底物的磷酸化,IRS-1的磷酸化激活另一信号传导分子AKt直接或间接活化mtor及p70s6k,4E-BP1和el F4G,从而调节蛋白质的合成,促进细胞增长。

1.3 m TOR 在代谢调节中的作用

m TORC1的底物S6K1(S6 kinase 1)和4E-BP1(e IF4E-binding protein 1)能调控m RNA的翻译起始和进程,进而控制蛋白的合成速率。m TORC1也能促进酵母菌和哺乳动物的核糖体的合成,通过增加核糖体RNAS和蛋白的转录来增加细胞蛋白合成的能力。m TORC1的激活能够抑制细胞自噬,反之则诱导其自噬。有研究表明,生长因子和营养物质等能促进依赖于m TORC1的细胞生长、分化及细胞代谢等,并且,其对细胞大小的调控可影响器官和有机体的大小。m TORC1还能通过增加转录的PPARγ(peroxisomeproliferator-activated receptorγ)和SREBP(sterol regulatoryelement-binding protein)的活性来促进脂肪的生成。也有人指出,m TORC1通过SREBP1c来控制脂肪的代谢和生成。SREBP1c是一种转录因子,涉及到调控脂肪代谢的蛋白的表达,而SREBP1c的激活是受m TORC1控制的,m TORC1还控制SREBP1c的m RNA的表达,但其机制仍不清楚。

目前,对于m TORC2的了解相对m TORC1来说比较少。有研究结果证实:m TORC2能磷酸化Ser473,m TORC2通过作用AKT来调控细胞的增殖以及通过PKCα(protein kinase Cα)等来调控肌动蛋白细胞支架组织。此外,还有实验证实m TORC2通过磷酸化并激活AKT、SGK(serum-and glucocorticoid- regulated kinase)、PKC(protein kinase C)等来调控细胞生长、细胞周期的进程及合成代谢等。有人对剔除rictor的大鼠进行实验,证实:脂肪组织中的m TORC2能够控制脂肪与胰岛或是肝之间的信号传递,进而控制全身的生长及葡萄糖的代谢。

在多细胞生物中,能源物质的贮存和动员机制对m TOR有很大的影响:当营养充足时,m TOR被激活并驱动合成代谢;而在饥饿状态下,m TOR则被抑制以避免代谢信号的紊乱。m TOR涉及到调控蛋白合成、脂肪代谢、细胞生长和增殖等。这些作用对于肝脏、骨骼肌、大脑、脂肪、胰岛β等的功能有决定性的影响。人类代谢性疾病的产生往往是由于这些器官或组织出现代谢紊乱、功能失调所造成的,所以,研究m TOR对这些器官或组织的调节作用有助于更好的研究代谢性疾病的治疗方法。

1.4 m TOR 在骨骼肌中的调节作用

骨骼肌是一种主要的负责胰岛素调控的营养代谢和能量消耗的外围组织,占超过30%的静止代谢率和全身80%的葡萄糖摄入。

研究表明,m TOR的激活或失活对骨骼肌的代谢有很大的影响。m TOR通过调控胰岛素脱敏和线粒体基质的竞争来影响肌肉葡萄糖代谢。肌肉中m TOR的缺乏会导致PKB/AKT的超激活,进而会改变线粒体的调节和氧化能力及增加葡萄糖的摄入和糖原积累。另有研究表明,肌肉中m TOR的缺乏还会导致肌纤维数目的减少。短期的饥饿能够抑制骨骼肌蛋白的合成,但在进食后又能快速刺激蛋白的合成。目前研究表明,雷帕霉素对骨骼肌与肝脏蛋白合成抑制的刺激不同,骨骼肌中雷帕霉素只会减弱而不会完全抑制这种刺激。通过m TOR的信号传递对于骨骼肌的生长是必需的,m TOR作用于PKB/AKT以及通过m TOR的激活来增加S6K1的活性来调控核糖体蛋白m RNA的翻译可以控制肌肉的生长和肌肉质量的维持。AMPK被认为是骨骼肌中的一个能量感应器,AMPK的激活通过磷酸化TSC2(tuberous sclerosis complex 2)抑制了m TOR与其下游多种效应器之间的信号传递,进而影响骨骼肌中翻译的开始和蛋白的合成以及葡萄糖和脂肪酸的代谢、m RNA翻译的合成代谢功能等。

1.5 m TOR 在脂肪中的调节作用

脂肪组织有助于维持体温、贮存和释放能量、分泌激素和细胞因子等。临床学观点认为:长期的m TORC1的激活通过调节WAT(white adipose tissue)中过多脂肪的存贮而促进肥胖的发生。m TORC1对脂肪的贮存形式有关键的作用,它不仅调节甘油三酯的合成,还驱动前成脂肪细胞分化进入WAT。m TORC1还能间接调节PPARγ来影响前成脂肪细胞的分化和脂肪的积累。最近的研究证实m TORC2也涉及到脂肪的生物合成,m TORC2通过激活AKT诱导PPARγ来激活m TORC1。SREBP1c(Sterol response element-binding protein 1c)是一种调控涉及到脂代谢的蛋白表达的转录因子,有研究表明SREBP1c的激活是由m TORC1通过促进SREBP1c的分裂和核积累以及它调节的基因的表达来控制的,m TORC1也能控制SREBP1c的m RNA的表达。m TORC1的激活抑制脂解酶的水平和脂类分解,而激活脂肪生存和脂肪的贮存。有研究指出,m TORC1是通过AKT调控TSC2的磷酸化来控制脂肪生成的,长期抑制m TORC1/S6K1通路会造成葡萄糖的耐受性降低。m TORC2也能磷酸化和激活AKT,通过修饰PKA激素敏感脂肪酶的活性来调节脂类分解。

2 m TOR在代谢性疾病中的作用

作为多种物质代谢的调节枢纽,m TOR不仅能促进生长,也能加速癌症、代谢性疾病等的发生。m TOR/S6K1有助于改善肝和肌肉组织中的胰岛素抵抗。有氧运动和抗阻运动都能通过调节m TOR来改善2型糖尿病的中对血糖的控制,且混合运动效果更好。力量运动能提高骨骼肌m TOR/S6K1的活性,耐力运动一般降低或不改变骨骼肌m TOR/S6K1活性,这些改变都能改善胰岛素抵抗,且混合运动能使饱和脂肪酸的摄入减少,进而减少胰岛素抵抗的发生率,改善肥胖人群的胰岛素敏感性。运动能够改变一些转氨酶的活性从而改善氨基酸的氧化能力,而氨基酸能激活m TORC1和m TORC2,进而改善细胞的代谢、增殖等,成为治疗癌症的可能机制。同时抑制m TORC1和m TORC2可能会更好的防治肿瘤的发生。但是,长期抑制m TOR会增加胰岛素抵抗、β细胞功能失调和死亡,从而加重2型糖尿病病情。有研究表明,在癌症病人和癌细胞中可发现PLD(Phospholipase D)的活性升高,PLD的活性与癌细胞的生存信号有关,而PLD的代谢物PA又与m TOR的活性有关。所以,m TOR能够通过调控癌细胞的生长信号来起到控制癌细胞和治疗癌症的作用。比如 ,肝细胞液中的m TOR能够调控许多由PI3K/AKT调节的信号并感受来自生长激素的信号,抑制m TOR则能够抑制肝脏肿瘤的发生。m TOR的失活也会导致一些肌病的产生,如AKT的超激活会导致肌肉氧化代谢、线粒体调节、糖原积累等受到损害。此外,m TOR通过调节各种细胞的生长、增殖、分化等影响机体的各种代谢,进而影响各种代谢性疾病的发生。

摘要：m TOR(mamalin target of rapamycin)是胰岛素/胰岛素样生长因子下游信号中的一个丝苏氨酸蛋白激酶,它不仅是细胞内营养素、能量状态传感分子,而且能整合来自生长因子、激素、应激、机械刺激等传递的信号。也还可以参与胰岛素/胰岛素样生长因子调节细胞质量(大小)的一关键信号分子,m TOR在人体中的分布广泛,在人体肝脏,骨骼肌,脂肪,大脑中均有分布,并起到十分重要的调节作用,近年来发现其与代谢性疾病的关系也十分的密切,所以该文拟综述m TOR在代谢性疾病中的调节及在身体中各组织器官的作用。

Notch信号通路与消化系统疾病篇4

关键词：Notch信号通路,消化系统疾病

Notch基因最早发现于1919年, 其某种基因突变可造成果蝇的残翅。1983年, 科研人员首次克隆了该基因, 并命名为Notch。随后又研究发现, Notch在脊椎动物和无脊椎动物的多个物种中均有表达, 它对于细胞的生长发育具有广泛影响, 主要是通过调控细胞的增殖、分化和凋亡来影响正常生长。Notch功能失常与一些发育紊乱、消化系统疾病和恶性肿瘤有关。Notch及其配体的突变可导致造血、神经和消化等多种系统的发育缺陷。

1 Notch信号通路

一个完整的Notch信号通路由Notch受体、配体和CSL蛋白等组成。

1.1 Notch受体

Notch受体是一个分子量约为300 kD的单链跨膜蛋白。人体共有4种Notch受体, 即Notch1、Notch 2、Notch 3、Notch 4。它们广泛分布于淋巴细胞, 造血细胞及血管内皮细胞等多种细胞的表面。其基本结构由胞外区、跨膜区及胞内区三部分组成。胞外区 (NEC) :包含29～36个串联的表皮生长因子样重复序列 (epidermal growth factor, EGF) 及3个富含半胱氨酸的Lin/Notch重复序列 (Lin/Notch repeats, LNR) 。它的功能是和配体结合并激活Notch信号途径[1,2]。跨膜区 (TM) :在Notch跨膜区第1743位甘氨酸和1744位缬氨酸之间存在S3裂解位点。胞内区 (NICD) :由RAM结构域、6个锚蛋白 (cdc10/ankyrin, ANK) 重复序列、2个核定位信号 (NLS) 和PEST结构域组成。RAM结构域是与核内转录因子CSL有较高亲和力的位点, 而PEST结构域则是与Notch的降解有关。

1.2 Notch配体

在果蝇中配体称为Delta和Serrate, 在线虫中为Lag–2, 取它们首写字母, Notch的配体又被称为DSL (Delta-Serrate–Lag-2) 蛋白。在哺乳动物中有好多种Notch的配体, 一般与Delta相似的配体被称为Delta或Delta–like, 有Delta1、Delta3和Delta4。与Serrate相似的称为Jagged, 有Jagged1和Jagged2。所以目前发现的人DSL蛋白就有Jagged1、Jagged2、Delta1、Delta3和Delta4。这些配体同受体相似, 都是单链跨膜蛋白, 其胞外区含有数量不等的EGF样重复序列和Notch受体所必需的DSL结构域。

1.3 CSL蛋白

CSL蛋白是在Notch信号通路中起转录调节作用的一种DNA结合蛋白。在哺乳动物中CSL称CBF1, 在果蝇中称su, 在线虫中称Lag-1, 因此CSL是这3个转录因子的缩写。作为Notch信号通路的初级效应分子, CSL通过其Rel同源区N端的β折叠结构域 (RHR-n) 与Notch的活化形式NICD结合形成NICD-CSL复合体, 此复合体再通过CSL分子的Rel同源区 (RHR) 及其N端的31～435位氨基酸残基与GTGGGAA序列结合, 进而激活靶基因的表达。研究表明, Notch信号的靶基因多为bHLH (basic helix-loop-helix, 碱式螺旋-环-螺旋) 家族转录因子, 如哺乳动物中的HES (hairy/enhancer of split) 、果蝇中的E (sp1) (enhancer of sp lit) 等[3]。近年来研究者又发现另一类不同的bHLH家族分子HERP (HES-related repressor protein, Hey/Hesr/HRT/CHF/gridlock) , HERP分子既可以形成同型二聚体, 亦可以与HES形成异二聚体进而激活下游基因的表达[4]。

2 Notch信号通路的途径和功能

2.1 Notch信号的传导途径

Notch信号的传导不需要第二信使的参与, 可以直接接收相邻细胞的信号并传到细胞核内, 与相关转录因子结合而激活靶基因。研究表明, 经典的Notch信号通路的激活需要经过三步裂解法[5]。合成的Notch在S1位点被furin样转化酶切割成2个片段:胞外区和跨膜区。它们通过二硫键相接而形成异二聚体形式的Notch受体。当相邻细胞的受体和配体结合后, 在金属蛋白酶作用下, Notch在S2位点被裂解成2个片段。C端裂解产物进一步在跨膜区S3位点被γ-分泌酶水解, 并释放出ICN (Notch胞内区部分) 进入核内, RAM区结合CSL蛋白。在没有ICN的情况下, CSL蛋白起转录抑制作用, 但当ICN与CSL蛋白结合后, 其RAM区与CSL蛋白和MAML蛋白结合形成三聚体, 此三聚体的直接靶基因HES和HRT都是有碱性螺旋环螺旋 (bHLH) 结构的转录抑制因子[4]。MAML募集组蛋白乙酰转移酶、P300/CBP等乙酰化组蛋白的因子, 最后使三聚体成为转录激活因子而激活基因转录[6]。

2.2 Notch信号通路的功能

大量实验研究表明, Notch信号通路通过调控细胞的增殖、分化和凋亡来影响细胞的发育和生长。它在胚胎发育、淋巴细胞的分化、造血干细胞的自我更新以及调节血管生成中均起着重要作用

2.2.1 参与胚胎发育

研究表明, Notch信号在各种外胚层来源的组织发育中起到的作用与在果蝇中类似。Notch信号可上调细胞膜表面的Notch分子, 同时下调其配体Delta的表达;反之, Delta的表达对细胞自身Notch分子的表达则有下调作用。这种正反馈机制使发育早期细胞Notch及其配体表达的细微差别在发育过程中被逐渐放大, 从而决定了细胞的不同分化方向[7]。

2.2.2 调节淋巴细胞的分化成熟

在各种免疫细胞的表面, 均有Notch受体和配体的表达。Notch1在胸腺细胞表面表达较高, 它决定早期淋巴细胞向T或B细胞定向分化。当Notch 1信号传到胸腺的淋巴样前体细胞 (CLPs) 后可分化成T细胞;反之, 缺乏Notch 1信号的CLPs则分化为B淋巴细胞。可见, Notch1与T细胞的发育关系密切。研究发现, Notch信号参与T淋巴细胞的阳性选择, 它作用于TCR与MHC分子结合之间。它使其中表达识别MHC-Ⅰ类分子的TCR分化成CD4-CD8+T细胞;使表达识别MHC-Ⅱ类分子的TCR者分化为CD4+CD8-T细胞。

2.2.3 参与造血干细胞的增值与分化

因为细胞的分化方向受到细胞间相互作用的调节, 而Notch信号通路作为细胞间相互作用机制之一, 所以它在造血干细胞自我更新的调控中起到重要的作用[8]。Notch信号通路在细胞发育的不同阶段, 受体和配体的表达不同。骨髓基质细胞中可以检测到Jagged 1、Delta 1和Delta 4, 胸腺上皮细胞表面则主要表达Jagged 1、Jagged 2和Delta1。体外研究证实, Notch配体Delta 1能够提高淋巴系和髓系细胞的自我更新能力并使细胞向淋巴系分化, 然后进一步分化为T/NK细胞。Delta 1还能抑制单核细胞向巨噬细胞转变, 使其转化为树突状细胞。

2.2.4 调节血管生成

血管内皮细胞生长因子 (V E G F) 和成纤维细胞生长因子 (FGF) 调控着血管内皮细胞的增殖和分化。研究发现, Notch信号可能通过与FGF等信号相互作用, 在血管生成中起调控作用[7]。

3 Notch信号通路研究进展

越来越多的研究表明, 许多疾病都与Notch信号通路有关, 本文仅列举Notch信号通路在消化系统中所发挥的作用。

3.1 Notch信号通路在正常消化系统中的表达

3.1.1 胃

胃黏膜分为上皮、固有层、黏膜肌层和黏膜下层。其中固有层含有大量的胃腺, 可分泌胃液, 胃液中含有盐酸和蛋白酶, 可初步消化蛋白质。胃底腺主要位于胃底和胃体的固有层内, 是产生胃液的主要腺体。它由多种腺细胞组成, 主要是主细胞和壁细胞。Nakakura与Sekine等发现, Notch1、Notch2、Notch3和下游靶基因Hes1、Hath1在人类胃黏膜中均有表达, 而Hes2、Hes3在人正常胃黏膜中不表达[9]。另外Sander等研究发现Notch1、Notch2、Jagged1和Jagged2在贲门窦上都有表达, 且在基底层的表达最高, 特别是Notch1和Jagged2[10]。

3.1.2 肝

多种研究发现:Notch信号通路在肝内血管生成、胆管的形成与维持以及肝细胞发育与再生中起到至关重要的作用。Croquelois等用Notch1基因敲除小鼠模型实验来研究Notch信号通路在肝细胞增殖分化中的作用, 发现Notch1缺失会导致肝细胞持续增殖, 且发展为结节性再生性增生, 但不会引起肝内胆管的缺失, 也不影响肝脏内血管的形成[11]。因此可得到的结论是Notch信号通路抑制肝细胞再生和增殖。同时, 研究Jag1/Notch2双杂合子Alagille综合征模型、肝特异性Notch2缺失模型以及用Alb Cre转基因小鼠实验均研究发现Notch2缺失会引起肝胆管板结构异常、肝内胆管结构混乱且伴有肝门区炎性纤维化和肝细胞羽毛状变性;其缺失程度与与肝内胆管异常情况呈正相关[12]。

3.2 Notch信号通路与消化系统疾病

消化系统是体内易于发生疾病的部位, 最严重的十大恶性肿瘤中消化系统就占据四种:食管癌、胃癌、肝癌和大肠癌。而Notch信号通路对它们均有不同的作用。本文就列举其中两种:胃癌和肝癌。

3.2.1 胃癌

吴晴、李大卫等研究发现Notch1和HIF-1α蛋白在胃癌组织中阳性表达率高于正常胃黏膜, Notch1与HIF-1α间存在正相关关系, 并与胃癌侵袭、转移密切相关, 对于判断胃癌的预后可能具有重要意义。另外还发现HIF-1α的过度表达可能参与了Notch1信号通路失调介导的胃癌发生发展机制[13]。吕伟等研究发现DLL4 (Delta-like 4) 在胃癌中的表达明显高于正常胃黏膜, DLL4表达与胃癌胃壁浸润深度呈正相关, 提示DLL4的过表达与胃癌的侵袭和转移能力密切相关。研究表明DLL4的表达在胃癌的血管生成过程中起着重要作用, 与胃癌的转移、浸润密切相关, 其表达可作为判断胃癌预后的一个指标, 以DLL4为靶目标的抗血管治疗技术将为胃癌的综合治疗提供新的方法[14]。

3.2.2 肝癌

范任华等用MTT法及克隆形成实验检测细胞增殖能力时发现, 外源性Notch1-ICD能促进肝细胞的增殖, 与癌基因ras共转染能显著增加肝细胞的增殖;克隆形成实验和体内致瘤实验都显示:Ras与Notch1胞内结构域NICD共同作用能促进肝细胞转化。由此可知:失调的Notch信号与癌基因ras共同作用促使正常肝细胞转化和增殖, 从而导致肝细胞恶性转变[15]。也有相关报道说, Notch受体的配体Jagged1在肝癌中表达明显升高, 表达量与HBx相似, 它们之间的相互作用可能是肝癌发生的原因之一;Delta-like 1在肝癌组织中表达比正常组织中要高, Delta-like 1表达升高时肝癌的增殖能力也升高, 下降时肝癌细胞的增殖能力也降低[6,16]。

4 结语和展望

神经再生相关信号通路的研究进展篇5

1 Rho-ROCK信号通路

1.1 组成和功能

Rho是分子质量大约为20~25 KD的三磷酸鸟苷 (GTP) 结合蛋白, 具有GTP酶活性, 习惯被称为Rho GTP酶, 可被包括血管紧张素Ⅱ、白介素-1、血小板源性生长因子等多种炎症介质和细胞因子活化, 并发生膜转位, 激活下游靶分子, 从而形成蛋白激酶Rock, Rock可使肌动蛋白、肌球蛋白等许多靶蛋白磷酸化, 这些活动如果发生在神经再生活动中, 可调节神经细胞骨架的重排, 继而引起生长锥塌陷、回缩, 轴突生长停止。Rho-ROCK信号途径是中枢神经系统中普遍存在的一条通路, 是介导抑制性信号阻断中枢神经细胞再生的重要途径。

1.2 相关研究

Fujimura等[1]通过抑制Rho/Rock信号通路, 发现能明显防止神经轴突变性, 模型大鼠脊髓背根神经节神经元的空泡样变性坏死率显著降低, 有效促进了脊髓神经元损伤后的修复再生。最近的一些研究也表明, 在阿尔茨海默氏病、脊髓和脑外伤中选择特定的抑制剂阻断Rho/Rock信号通路, 对中枢神经系统轴突再生均具有促进作用[2,3,4]。

可见, 就潜在的治疗靶点而言, 如何抑制Rho-Rock信号通路, 并发现有哪些抑制剂能准确、高效、安全地干扰或阻断该通路, 已成为神经再生研究的重要方向之一。

2 Notch信号通路

2.1 组成和功能

Notch信号通路由受体、配体、DNA结合蛋白、其他的效应物和Notch的调节分子等组成。当细胞接触时, Notch配体与受体相互作用, Notch蛋白经三次剪切, 由胞内段释放入胞质, 并进入细胞核与转录因子CSL结合, 形成转录激活复合体, 从而激活转录抑制因子家族的靶基因, 产生Notch信号, 调节扩大并固化细胞间的分子差异, 最终决定细胞命运。由于Notch信号通路在物种进化中具有高度的保守性, 其对神经干细胞发育成一系列的神经元和胶质细胞也具有允许和决定作用。

2.2 相关研究

Tatsumi等[5]研究发现, 在冷冻受伤的大脑皮质细胞时, 瞬时表达Notch1阳性细胞;由于激活的Notch信号能调节神经系统发育, 故类似的现象可能在成人大脑受伤时存在;后继的研究表明, Notch信号通路的激活可调控脑损伤时干细胞的增殖和分化。Marklund等[6]研究发现, 激活Notch信号通路后, 表达的Jagged-1会抑制中枢神经系统中少突胶质细胞祖细胞 (OPC) 的分化和髓鞘再生。Kamei等[7]也发现, 通过Jagged-1依赖的Notch信号通路, 内皮干细胞能促进脊髓损伤后星形胶质细胞增生。Dias等[8]发现, 在斑马鱼受损的脊髓中, Notch信号通路可控制运动神经元的再生。Li等[9]发现, 通过Notch信号通路, 可溶性Nogo受体融合蛋白能调节反应活性, 从而诱导神经干细胞的增殖。

由于Notch信号通路在神经损伤后修复与再生中的作用复杂多变, 且又高度保守, 故要弄清其机制, 需要进一步研究该通路的各个环节。

3 MAPK信号通路

3.1 组成和功能

MAPK信号通路是有关信号刺激传递的交汇点和共同通路, 它主要包括细胞外信号调节激酶 (ERK) 、p38和c-Jun氨基末端激酶 (JNK) 三条途径, 通过激活使ERK、p38和JNK的酪氨酸、苏氨酸残基去磷酸化, 从而形成一个调节环路, 参与调控细胞的生长、增殖、分化、炎性反应、凋亡等生理和病理过程。

在中枢神经系统中, ERK可被各种生长因子、过氧化氢等磷酸化而激活, 进入细胞核后作用于转录因子, 促进某些基因的转录和表达, 主要与小胶质细胞的增殖和分化密切相关, 可促进炎性反应, 清除坏死组织。此外, 中枢神经损伤时, p38和JNK在损伤处均大量表达, p38表现为促进损伤的修复, 而JNK则通过磷酸化促进神经细胞凋亡, 加重了神经损伤。

3.2 相关研究

Gwak等[10]在损伤大鼠脊髓尾段后, 用机械式刺激诱发神经兴奋来维持p38 MAPK信号通路的活跃, 结果发现p38 MAPK信号通路的激活能明显促进中枢神经元和小胶质细胞的再生及功能恢复。不过, Vaz和Tu等[11,12]的研究却发现, JNK MAPK信号通路的激活会导致中枢神经元和小胶质细胞凋亡增加, 影响神经功能恢复。另有Alsina和Yu等[13,14]研究发现, 激活ERK MAPK信号通路会导致中枢神经的退行性变, 不利于功能恢复。

由此看来, MAPK信号通路所包含的各条途径对中枢神经再生作用迥异, 它们之间的关系和作用机制尚有待深入探讨。

4 Wnt/β-catenin信号通路

4.1 组成和功能

Wnt信号通路分为经典的Wnt信号通路和非经典Wnt信号通路, 其中经典Wnt信号通路即Wnt/β-catenin通路。经典的Wnt信号通路亦具有高度保守性。Wnt蛋白与细胞表面受体Frizzled家族结合后启动一系列反应, 包括Dishevelled (DSH) 受体家族蛋白质的激活以及最终细胞核内β-catenin水平的变化。DSH是细胞膜相关Wnt受体复合物的关键成分, 它与Wnt结合后被激活, 并抑制下游GSK-3、axin等蛋白质复合物和APC蛋白, 促进细胞内信号分子β-catenin的降解。当胞浆内的β-catenin得以稳定存在后, 部分β-catenin进入细胞核与转录因子作用并促进特定基因的表达, 从而调节细胞的增殖分化。近些年的研究发现, Wnt/β-catenin信号通路不仅在胚胎发育及肿瘤发生中起作用, 而且在神经干细胞的增殖调控中也扮演着重要角色。

4.2 相关研究

David等[15]研究证实, Wnt/β-catenin信号通路可调节脊髓神经干细胞和前体细胞的增殖分化, 可能在治疗神经退行性疾病和神经损伤方面发挥作用;Liu等[16]研究证实, Wnt/β-catenin通路的激活可以调节一种特殊的视网膜神经胶质细胞muller细胞的增殖、分化;此外, Suh等[17]研究提示, 脊髓损伤后, 移植分泌Wnt蛋白的成纤维细胞能明显促进轴突再生和功能恢复。

需要指出的是, 弄清Wnt/β-catenin信号通路在神经再生中的细胞内机制对治疗脊髓损伤将有着极为广阔的前景。

5 m TOR信号通路

5.1 组成和功能

m TOR信号通路主要在蛋白合成中发挥重要作用, 其可调控大量促进细胞周期进行的蛋白质的翻译。很多研究都表明异常的m TOR活性与肿瘤细胞发生关系密切, 大致过程是:激酶蛋白m TOR通过调控m RNA翻译成为具有多种细胞功能的蛋白质, 进而激活信号转导、转录, 再依赖P13K-Akt-m TOR途径或非依赖途径, 以实现对细胞增生或凋亡的控制。目前, 随着神经再生的深入研究, m TOR信号通路在其中的作用机制也逐渐被揭示。

5.2 相关研究

Sun等[18]研究发现, 三磷酸腺苷介导的m TOR通路, 可增加内源性神经干细胞数量, 诱导神经轴突生长, 促进脊髓损伤大鼠的运动功能恢复。Kanno等[19]使用雷帕霉素抑制脊髓损伤小鼠的m TOR通路, 结果表明, 神经组织自噬活性明显增加, 同时神经细胞缺失和凋亡明显减少。Codeluppi等[20]也发现, 在缺血性脊髓损伤模型大鼠体内使用m TOR信号通路抑制剂雷帕霉素后, 受损脊髓中星形胶质细胞数量减少, 促进了神经细胞的轴突再生和神经功能恢复, 原因是星形胶质细胞在神经组织损伤时反应性增生肥大, 形成胶质瘢痕, 抑制轴突再生, 而阻断m TOR信号通路恰恰阻碍了这一过程的发生。

对于m TOR信号通路而言, 进一步解析其引导的复杂蛋白翻译网络, 意味着可能显著增进大家对神经系统基础病变的理解。

6 Eph-Ephrin信号通路

6.1 组成和功能

Eph是目前所知最大的生长因子受体家族——受体酪氨酸激酶家族, Ephrin是其配体, 它们之间建立的信号通路可为细胞传递位置信息, 调控增殖细胞的迁移分化和正确定位, 这些功能主要通过细胞接触而实现。当相邻细胞接触时, 它们表面的Eph受体和Ephrin配体相互作用而产生信号传递, 这种传递因是正反双向的, 可使细胞相互排斥, 从而介导细胞迁移, 规范组织结构, 并帮助形成组织边界, 在成熟期还参与控制组织的动态平衡, 保持成熟组织的生理功能。

Eph受体与Ephrin配体间存在的复杂的双向信号传递途径在很大程度上是通过肌动蛋白细胞骨架的重排来调节细胞的黏附和排斥的[21]。当神经系统损伤后, Eph-Ephrin信号通路可通过控制肌动蛋白来促使细胞快速移动的细胞动力学原理已广为人知, 但对于其能否借助调控基因表达来彻底改变细胞行为还知之甚少。

6.2 相关研究

在中枢神经, Rosas等[22]的实验发现, Eph蛋白明显表达在脊髓挫伤模型大鼠的神经元、轴突、小胶质细胞、巨噬细胞以及反应性星形胶质细胞等处, 并认为Eph受体可能参与脊髓损伤后神经细胞的级联反应。Scicolone等[23]指出, Ephs和Ephrins的受体和配体系统会根据它们所处的中枢神经微环境而产生排斥或黏附反应, 在轴突引导以及突触的形成和改造中发挥核心作用。Eph-ephrin信号通路在中枢神经中的复杂作用尚有待深入研究。

在周围神经, Eph-Ephrin信号通路也发挥了重要作用。Parrinello等[24]将大鼠坐骨神经纤维切断后, 利用荧光显微镜技术观察了修复过程。他们发现损伤处的雪旺细胞与成纤维细胞通过Eph-Ephrin信号通路引发了细胞分化并调控雪旺细胞发生集体定向迁移, 形成细索, 从而引导再生的神经纤维穿过伤口;进一步的整体实验还表明, 若阻断Eph信号或使用敲除Eph基因的动物, 神经损伤后的再生纤维则表现为杂乱无章。

7 结语

综上所述, 随着细胞分子生物学中众多信号通路机制的不断揭示, 近些年来研究神经再生中相关信号通路作用机制的文献也逐渐增多, 但目前主要集中在实验研究方面, 且主要表现为单一信号通路的研究, 而信号通路之间有无相互影响, 以及联合多种信号通路治疗神经损伤有无更佳效果, 尚待深入探讨。

由于与神经再生相关的信号通路众多, 神经系统损伤后往往会产生多种应激信号, 究竟哪些或哪种信号会对神经再生起到更为深刻的影响尚未可知, 故深入认识神经细胞对损伤的应答机制, 可为探索现有的治疗方法在神经再生中的作用机制提供理论支持, 也可为神经损伤的治疗提供更为广泛的途径。

摘要：神经再生作为医学难题之一, 其相关机制的研究不断深入, 目前已达细胞分子水平。本文将近些年来与神经再生相关的信号通路研究作一综述, 以期深入认识神经细胞对损伤的应答机制, 为不同神经损伤的治疗提供积极的理论指导, 并为发展新的治疗方法提供更多思路。

NF-κB信号通路研究进展篇6

NF-κB (nuclear factor-κB) 是一种细胞核转录因子, 因其能够与B细胞免疫球蛋白的κ轻链基因的增强子κB序列GGGRNWYYCC (N-任意碱基;R-嘌呤;W-腺嘌呤或胸腺嘧啶;Y-嘧啶) 特异结合而得名[1,2,3]。NF-κB调控一大类基因的表达, 它调控的靶基因包括免疫相关受体、细胞因子 (如IL-1、IL-2、IL-6、IL-12和TNF2α、LTα、LTβ、GM-CSF) 、炎症因子 (IL-8、MIP-1α、MCP1) 、黏附分子 (ICAM、VCAM和E-selectin) 、急性期蛋白 (如SAA) 等, 在调控免疫细胞的激活、T、B淋巴细胞的发育、细胞凋亡、肿瘤形成、病毒复制、炎症反应及多种自身免疫性疾病方面发挥重要作用[4,5]。

NF-κB信号转导通路属于受调蛋白水解酶依赖的受体信号转导通路。在未受刺激的细胞中, NF-κB转录因子与抑制性I?B (Inhibitorofkappa B) 蛋白结合在一起, 因而被滞留在细胞质中。上游信号的刺激导致IκB蛋白在IKK (IκB kinase) 的作用下被磷酸化修饰, 继而被泛素连接酶复合体识别, 促使IκB蛋白以蛋白酶体依赖的方式被降解, NF-κB从而被释放出来, 进入细胞核并启动靶基因的表达。

2 NF-κB信号通路的主要成员

2.1 NF-κB家族蛋白

NF-κB家族成员主要包括Rel A (p65) , c-Rel, Rel B, NF-κB1 (p50蛋白及其前体p105) 和NF-κB2 (p52蛋白及其前体p100) , 各成员可形成同源或异源二聚体而行使功能。在哺乳动物细胞中最常见的是NF-κBp65与p50结合形成p65/p50二聚体。NF-κB家族蛋白的共同点是均含有一个高度保守的由大约300个氨基酸组成的结构域—Rel同源结构域 (Relhomologydomain, 简称RHD) , 该结构域与DNA结合、蛋白二聚化以及与IκB蛋白结合等功能有关。RHD同时还含有核定位信号序列 (nuclear localization signal, 简称NLS) , 是活化的NF-κB进入细胞核所必需的, 在细胞质中NF-κB与IκB蛋白结合, IκB掩蔽了NF-κB的NLS, 使NF-κB滞留在胞质内, 当IκB被降解后, NF-κB的NLS暴露, 使NF-κB进入核内并与靶基因结合。不同的是Rel A (p65) , c-Rel, Rel B的C端含有一个转录激活结构域 (transactivationdomain, 简称TAD) , 可以通过募集转录共激活物和移除转录阻碍物而促进转录;而NF-κB1和NF-κB2的C端则为多拷贝的锚蛋白重复序列 (ankyrin repeats) , 该重复序列可以与RHD结构域结合, 从而通过掩蔽核定位序列 (NLS) 抑制蛋白的入核, 此外, NF-κB1和NF-κB2的前体蛋白可以通过有限剪切等方式转变成短的、有活性的蛋白形式。p52和p50的同源二聚体缺少TAD, 因此没有真正的能力去驱使转录, 事实上, 在静息细胞中, p52和p50的同源二聚体抑制基因转录, 但p52和p50可以通过与含TAD的NF-κB蛋白形成异源二聚体而起始转录。

通过遗传学实验的研究, 我们对NF-κB家族蛋白的功能有了更精确的了解, 这些主要是通过基因敲除实验得到的, 现在几乎所有的NF-κB家族成员的基因敲除小鼠都已经被报道, 下面分别介绍NF-κB家族蛋白各个成员的功能。

遗传学研究显示p65在TNFα引起的细胞凋亡中起到关键性的保护作用。P65-/-小鼠在胚胎发生期E14-E15时, 由于TNFα诱导大量发育中的肝细胞发生凋亡而死亡。P65-/-TNFα-/-或p65-/-TNFR-/-双敲除的小鼠在TNFα诱导下没有出现大范围的肝细胞凋亡, 仍然可以正常发育, 可以研究在其它组织中p65敲除的影响。但p65-/-TNFR-/-双敲除的小鼠对细菌感染的易感性增强, 所以出生后死亡率很高, 这也提醒我们注意p65在固有免疫应答中的作用和由非造血系统细胞起始的固有免疫应答。除了抑制TNFα介导的肝细胞的凋亡之外, p65还能保护很多其他类型的细胞免受TNFα的毒性影响, 包括巨噬细胞、B细胞、和T细胞。同时, p65的抗凋亡的功能也不仅局限于对TNFα刺激的应答, 有研究表明p65也可以保护双链RNA (ds RNA) 引起的细胞死亡[6]。P65的抗凋亡功能与它能够诱导许多抑制凋亡的靶基因表达有关, 包括c-FLIP、c IAP1、c IAP2、A20、GADD45β和Mn SOD等[7]。此外在嵌合鼠模型中, p65的敲除实验还显示出其在各种刺激下的B细胞和淋巴细胞增殖时的类别转换中发挥重要作用。

p50蛋白是由NFKB1基因编码的, 并通过p105前体蛋白剪切而成。p105蛋白转变成p50蛋白的过程似乎是细胞中持续发生的, 从而可以提供充足且成熟的p50亚基, 并与其它NF-κB家族蛋白形成二聚体[8]。p105蛋白通过限制性的蛋白酶水解产生p50的过程, 依赖于一个在氨基酸376~404之间的甘氨酸富集区 (GRR) , 它是一个蛋白水解的终止信号。与p65敲除小鼠不同, p50缺失小鼠没有任何发育缺陷。p50-/-小鼠表现出免疫球蛋白产量下降并存在体液免疫应答缺陷。

p52/p100蛋白是由NFKB2基因编码的, p52蛋白来自于p100蛋白诱导后剪切的N端部分, 它是与Rel B形成异源二聚体的主要亚基。p100蛋白被剪切成p52蛋白是受上游信号严格调控的, 只有在某些特定的刺激下 (如某些TNFR家族蛋白的激活) 才会发生, 在未受刺激的细胞中仅有极少的p100的组成型加工处理。p100的加工处理过程首先是由NIK (NF-κB-inducing kinase) 活化IKK (IκB kinase) α, 激活的IKKα促使p100的磷酸化, 从而募集SCFβTr CP, 导致p100的Lys855的多聚泛素化, 再经过蛋白酶体的剪切产生成熟的p52蛋白。有研究显示在此过程中, NIK不仅是IKKα的激酶而且是一个连接IKKα和p100的对接蛋白。此外, p100的C端死亡区 (DD) 可能是一个加工处理过程的抑制区, 缺失此区的p100表现出增加的组成型加工处理。同p105, p100的GRR区对于部分处理产生p52和释放活化的p52:NF-κB复合体也是必需的。p52-/-小鼠不能正常发育出B细胞囊泡、生发中心并且脾的结构和派伊尔结 (Peyer’spatches) 的发育有缺陷[9,10,11], 此外还表现出不正常的T细胞功能。类似的免疫系统缺陷也发生在缺失淋巴毒素β (lymphotoxinβ, 简称LTβ) 、淋巴毒素β受体 (lymphotoxinβreceptor, 简称LTβR) 、NF-κB诱导激酶 (NF-κB-inducing kinase, 简称NIK) 或Rel B的小鼠中[12]。上述结果表明, 这些基因的表达产物可能共同参与LTβR诱导的信号途径。总之, p52敲除小鼠的表型与p52在LTβR诱导的信号途径中的作用一致, 尤其是与次级淋巴器官的发育有关。

Rel B的独特之处在于不能形成同源二聚体, 也不与c-Rel或p65形成异源二聚体, 它仅与p100, p52, p50形成异源二聚体, 且除了与p100相互作用外不与其它I-κB蛋白作用。只有胸腺、淋巴结和派伊尔结 (Peyer’s patches) 的特定区域才能检测到Rel B的大量表达。与它的表达分布一致的是, Rel B的主要功能是促进次级淋巴结构的形成和调节免疫应答中某些类型细胞的发育和功能。研究表明, Rel B:p52二聚体表现出组成型的核定位, 而且Rel B参与多种组织中NF-κB的组成型激活。Rel B-/-小鼠的胸腺和脾脏细胞中表现出NF-κB活性的下降, 并且使多种器官中的炎性浸润增强, 适应性免疫应答也有严重缺陷, 如果p50也敲除, 这种表型会更加明显, 这表明p50和Rel B共同调节限制炎症的基因的表达。各种研究显示, Rel B对于淋巴器官的发生很重要, 尤其是派伊尔结的发育, 这些发现使人们开始关注Rel B:P52在淋巴器官发生中的作用 (很可能是通过LTβR信号通路) 。

c-Rel可以形成同源二聚体, 也可以与p65或p50形成异源二聚体。c-Rel-/-小鼠不能产生有价值的体液免疫应答, 并且外周的T、B细胞对典型的抗原刺激不应答。缺少c-Rel的TAD区, 但有完整的RHD区的小鼠表现出更严重的表型, 如次级淋巴器官显著增生和骨髓增生。表明c-Rel对机体的免疫调节可能具有重要的作用。

以上主要通过基因敲除的研究结果讨论了NF-κB各亚基蛋白的功能, 但是由于NF-κB各亚基之间可能具有功能上的重叠性以及相关性, 所以单独敲除一个亚基的基因可能不能完全表现出该基因的功能。多亚基敲除的实验可以帮助我们更深入地研究NF-κB转录因子的功能, 并且已有研究表明, 多亚基缺失的小鼠确实表现出新的表型或者更加严重的病理症状[12]。

2.2 IκB家族蛋白

NF-κB抑制因子 (Inhibitorofkappa B, I-κBs) 是一类NF-κB抑制蛋白, 其中包括IκBα、IκBβ、IκBλ、IκBε、IκBNS、Bcl-3、IκBζ以及果蝇的Cactus蛋白等亚基, 它们的分子中都含有五到七个在进化上很保守的锚蛋白重复序列, 该重复序列可以通过与NF-κB的RHD结构域结合, 掩蔽NF-κB的核定位序列, 从而使NF-κB滞留在胞质中。另外, IκB家族中还包括一些不具有抑制NF-κB活化功能的蛋白, 如Bcl-3和IκBζ等。下面分别介绍一下各亚基的功能。

静息状态下IκBα通过与NF-κB转录因子的结合掩蔽了NF-κB二聚体的核定位信号, 同时也干扰了NF-κB与DNA的结合, 从而阻抑了NF-κB的转录功能。NF-κB信号通路可被多种外来信号如TNFα、生长因子、细胞因子、淋巴因子、紫外线、药物、压力等激活。在外来信号的作用下, IκBα蛋白N端的两个保守的丝氨酸Ser32和Ser36被IKKβ磷酸化, 继而被SCFβ-Tr CPE3泛素连接酶复合体识别, 从而促使IκBα分子中的Lys21及Lys22位点被泛素化修饰, 并被26S蛋白酶体识别和快速降解。NF-κB被释放出来并进入细胞核, 与特定基因的启动子区域结合, 从而启动靶基因的转录。IκBα-/-小鼠表现出增强的NF-αB的DNA结合活性, 但并不是组成性的, 说明p65:p50二聚体可能还受到其它机制的调控。新合成的IκBα参与反馈调节从而阻止NF-κB的进一步激活, 与此一致, IκBα-/-小鼠在TNF-α刺激下的NF-κB信号通路的结束显著推迟。

IκBβ和IκBε的功能与IκBα相似, 只是与不同的NF-κB二聚体的亲和力不同, 而且它们也受蛋白N端位点的磷酸化调控, 如IκBβ的丝氨酸Ser19和Ser23被IKKβ磷酸化, 但是磷酸化和降解的动力学反应比IκBα要慢得多, 可能是由于上游IKK激酶复合物与底物IκB的亲和力差异等原因造成的。研究显示, IκBε含有一个非经典的NES, 是c-Rel和IκBε返回胞质所必需的, 而且由于IκBε是在NF-κB激活后诱导的, 因此它可能在调节NF-κB晚期基因的激活方面起一定作用。

Bcl-3和IκBζ与经典的IκBs蛋白不同, 而且与其他IκBs的同源性很差。Bcl-3可能作为共激活因子与p50 (或p52) 同源二聚体特异性结合, 形成转录激活复合体, 促进转录, 解除p50 (或p52) 同源二聚体的抑制作用。Bcl-3-/-小鼠可存活, 但对于各种病原体无法产生合适的体液免疫应答, 它们缺少脾生发中心, 但血清抗体水平正常, 并且无抗原特异性应答, 表型部分与p52-/-相似, 也支持了Bcl-3与p52同源二聚体结合形成转录激活复合体, IκBζ可能促进一系列NF-κB靶基因 (如IL-6等) 的活化[13], 但没有其它直接证据证明它是IκB家族的有功能的成员, 并且未显示其与Rel家族成员相互作用。

2.3 IKK蛋白

IKK (IκBkinase) , 它可以使NF-κB的抑制者IκB磷酸化, 随后引起IκB的泛素化和蛋白酶的降解, 释放和活化NF-κB。IKK主要以IKK复合体的形式发挥作用, IKK复合体主要包括IKKα (IKK1) 、IKKβ (IKK2) 和NEMO (NF-κBessential modulator, 也叫IKKγ、IKKAP1、Fip-3) , 其中IKKα和IKKβ是催化亚基, NEMO是调节亚基。IKKα、IKKβ是一类丝/苏氨酸激酶, N端含一个蛋白激酶结构域, C端是螺旋-环-螺旋结构域 (HLH) 和亮氨酸拉链结构域 (LZ) , NEMO是一个分子量约为48KDa的蛋白, 与IKKα、IKKβ不同, 它的N端和C端含有大量的卷曲螺旋结构 (CC) , C端还有一个锌指样结构域 (ZF) 和一个亮氨酸拉链结构域 (LZ) 。IKKα、IKKβ的二聚化依赖于LZ结构域, 而且此结构域对于其的激酶活性也有贡献。HLH结构域对于IKK的激活是必须的, 而且它和IKK激酶活性的负调控有关。IKKα、IKKβ与NEMO的作用是通过C端的六肽序列 (Leu-Asp-Trp-Ser-Trp-Leu) , 即NBD (NEMO binding domain) 实现的。NEMO也能通过其CC和LZ结构域形成多聚体, 主要是三聚体或四聚体。由于IKK复合体中存在两个IKKα/IKKβ二聚体, NEMO很可能是以四聚体的形式存在的。组装IKK复合体时, NEMO通过其N端的CC结构域与IKKβ的C端的NBD结构域结合, 而且有研究显示, 移除HLH结构域, IKK与NEMO无法结合, 这说明HLH结构域可能促进IKK与NEMO的装配。IKKα和IKKβ的序列具有很高的同源性, 其全部序列有52%的同源性, 催化区有65%的同源性。IKKα、IKKβ和IKKγ的蛋白分子量总和约为220k Da, 但IKK复合体的分子量约为700~900KDa, 这说明IKK复合体中还有其他组分, 或IKK复合体中的亚基以聚合体的形式存在。下面分别介绍一下IKK复合物各亚基的功能。

IKKβ亚基主要在TNF、IL-1和LPS等诱导的促炎反应信号通路中行使磷酸化IκB蛋白的功能, 是IKK复合物的主要的催化亚基, 而且是快速激活NF-κB所必需的。IKKβ能特异地磷酸化IκBα、IκBβ和IκBε分子中特定的Ser残基。以IκBα为例, IKKβ活化后将IκBα的Ser32和Ser36两个位点磷酸化, IκBα随即被E3泛素连接酶识别并导致26S蛋白酶体依赖的降解, 从而使NF-κB二聚体被释放并活化, 这条信号转导途径叫做NF-κB激活的经典信号途径。IKKβ-/-小鼠由于肝细胞发生凋亡, 在胚胎发育的E12.5-E14.5天时死亡, 这与p65-/-及p65-/-p50-/-基因敲除小鼠的表型一致。IKKβ-/-细胞比野生型细胞对TNFα诱导的凋亡更加敏感, 而且TNFα、IL-1和ds RNA等刺激不能诱导IKKβ-/-细胞中NF-κB的活化。IKKβ+/-细胞中IKKβ的表达量降低了一半, 导致IKK的激酶活性降低了~50%, NF-κB的活性则降低了~70%~80%。IKKβ-/-TNFR-/-双敲除小鼠在细菌感染的固有免疫应答中存在明显缺陷, 出生后仅存活几天, 但p65-/-TNFR-/-双敲除小鼠可存活数月, 这说明IKKβ的作用不能被IKKα或其它激酶补偿。以上结果都表明IKKβ是固有免疫和炎症反应等过程中激活NF-κB所必需的蛋白激酶, 主要在NF-κB的经典途径中发挥作用。

虽然IKKα和IKKβ的的序列有很高的相似性, 但是它们在功能上却有很大的不同。IKKα-/-小鼠在出生后4小时就由于多种形态缺陷而死亡, 尤其是表皮和骨骼的发育存在明显缺陷。与IKKβ-/-小鼠不同, IKKα-/-小鼠中没有发现肝细胞的凋亡, 而且在IKKα-/-小鼠的胚胎成纤维细胞、原初上皮细胞和肝细胞中, TNFα、IL-1和LPS的刺激均能诱导正常的IKK复合物的活化和IκB的降解, 表明IKKα不是固有免疫和炎症反应中NF-κB活化所必需的, 而可能在发育过程中有重要作用, 因为新生的IK-Kα-/-小鼠表现出缺乏四肢、尾巴和耳朵, 颅面部发育失常, 皮肤光滑紧绷, 上皮的形成和构造明显异常等表型。研究发现, IKKα的激酶失活突变体IK-Kα (AA) (IKKα的激酶区的两个丝氨酸突变为丙氨酸) 能够阻断NIK诱导的p100的剪切作用;反之, 过量表达持续激活的IKKα (EE) (IKKα的激酶区的两个丝氨酸突变为模拟磷酸化的谷氨酸) 突变体则能促进p100的剪切。同时, IKKα-/-小鼠与p100-/-小鼠表型相似, 并且在IKKα-/-细胞中, p100不能被正常剪切, 而p100的剪切在IKKβ和IKKλ缺失的情况下没有明显异常。以上突变体和基因敲除实验表明, IKKα可能通过被上游蛋白激酶NIK激活的方式诱导p100蛋白的磷酸化和剪切, 最终生成特定的NF-κB二聚体形式———p52:Rel B, 这条信号转导途径叫做NF-κB激活的非经典途径, 因此IKKα主要参与NF-κB激活的非经典途径。研究发现, IKKα的上述活化方式是在某些TNF家族成员的刺激下发生的, 包括B细胞激活因子 (Bcell-activating factor, 简称BAFF) , 淋巴毒素β (LTβ) 以及CD40的配体等。但在某些情况下IKKα也会参与经典的NF-αB激活途径。此外, IKKα还与角质细胞的分化有关, 但此功能是不依赖其激酶活性的, 而且与NF-κB激活无关, 但有研究表示可能与其NLS有关。

IKKα-/-IKKβ-/双敲除小鼠在NF-κB信号通路中有更多的缺陷, 发育过程中无法形成神经胚, IK-Kα-/-IKKβ-小鼠的胚胎成纤维细胞对于TNFα、IL-1和LPS的刺激不应答, 但神经胚的缺失在IKKλ-/-小鼠中没有出现。

同IKKβ一样, NF-κB活化的经典信号途径也需要IKKλ。IKKλ负责将IKK复合物的催化亚基与上游信号通路联系起来, 它通过C端与上游的接头蛋白作用激活IKK, 而N端与IKKα、IKKλ结合。但在IKKα依赖的非经典信号途径中不需要IKKλ。IKKλ的功能失活 (loss-of-function) 和基因敲除实验都表明, IKKλ是NF-κB激活的经典信号途径中IKK激酶复合物活化所必需的。IKKλ-/-小鼠在E12.5-E13天由于大量的肝细胞凋亡而死, 用TN-Fα、IL-1和LPS等处理IKKλ-/-小鼠的胚胎成纤维细胞, IKK激酶复合物和NF-κB均不能被活化, NF-κB的激活完全阻断。IKKλ可能将两个IKKα/β二聚体在空间距离上拉近, 从而使它们通过transautophosphorylation作用互相活化来介导信号通路。

3 NF-κB活化的信号途径

如前所述, NF-κB激活的信号途径主要分为经典信号途径 (classicalpathway或canonicalpathway) 和非经典信号途径 (alternativepathway或noncanonicalpathway) (Senftlebenetal., 2001) 。除此之外, 研究表明还存在其它的NF-κB活化信号途径。

3.1 NF-κB激活的经典信号途径

在病原微生物感染或其诱导的炎症因子的刺激下, NF-κB通常依赖经典信号途径被活化。简言之就是NF-κB二聚体, 如p50:Rel A, 通过与抑制性IκB蛋白 (通常是IκBα) 结合而被滞留在细胞质中;某些配体与细胞表面受体 (如TNF受体或Toll样受体等) 的结合招募下游接头蛋白 (如TRAF家族蛋白或RIP等) , 继而招募IKK复合物 (包括IKKα、IKKβ催化亚基和IKKλ调节亚基) , 并导致IKK复合物的活化;IKK复合物, 尤其是IKKβ亚基磷酸化IκB蛋白的两个丝氨酸残基, 导致IκB蛋白的泛素化和蛋白酶体依赖的降解, 并释放NF-κB进入细胞核, 激活下游基因转录。经典途径被认为是大多数NF-κB激活的主要模式, 但不是唯一模式。经典途径激活主要诱导产生黏附分子VCAM-1、ICAM-1、E-selectin, 炎症趋化因子IL-8、RANTES、MCP-1, 细胞因子IL-6、TNFα、IL-1β等, 因此对于炎症反应和固有免疫应答很重要。TNF信号通路的特征是它既可以诱导细胞的凋亡又可以促使细胞存活, 这两条通路的平衡导致细胞的活化。如果激活NF-κB的信号通路活化, 结果就是使细胞存活, 但如果NF-κB的活化被阻遏, TNF就变成一个有力的细胞凋亡诱导因子。TNF信号通路的两个靶转录因子, NF-κB和AP-1, 也直接参与凋亡或存活的选择, 长时间的JNK/AP-1的激活导致凋亡, 而NF-κB可诱导合成一些效应物来阻断JNK/AP-1信号通路, 因此限制JNK/AP-1的激活, 如GADD45β, 通过阻断上游的激酶MKK7抑制JNK/AP-1信号通路。但JNK和NF-κB的作用也不是完全对立的, 如抗凋亡蛋白c IAP1就是JNK和NF-κB共同调节的。

研究表明, 很多NF-κB信号途径的负调节分子通过抑制TIR受体家族诱导的信号通路来发挥作用, 如SIGIRR (singleimmunoglobulin IL-1Rrelatedmolecule) 、ST2、IRAK-M、My D88s (splicing variantof My D88) 等。SIGIRR是TIR受体家族的一种孤受体 (orphanreceptor) , 可能通过与受体、IRAK和TRAF6等蛋白形成复合体从而竞争性地抑制TIR信号通路;ST2也属于TIR受体家族中的孤受体, ST2缺失小鼠的巨噬细胞在IL-1或LPS刺激时均比野生型细胞产生了更多的促炎细胞因子, 有实验证明ST2可以在LPS等刺激下诱导产生, 并抑制My D88依赖的TLR/IL-1R激活NF-κB的信号通路;IRAK-M是IRAK家族成员之一, 它只在单核细胞和巨噬细胞中表达, 并且在细胞受到TLR/IL-1R的配体刺激时表达量有所增加, 它可能通过干扰I-RAK1的功能, 阻碍IRAK1与TRAF6之间的相互作用来行使负调控功能的。My D88s是My D88的一种剪切形式, 缺失了DD和TIR结构域之间很短的一段序列。My D88s在单核细胞中受LPS的诱导时表达量上调, 但是它不能与IRAK4结合, 因此它通过竞争性地阻止IRAK4被招募到受体复合物上, 从而成为TIR受体家族介导的NF-κB活化信号途径的负反馈调节因子。

NF-κB激活的非经典信号途径。B细胞和T细胞器官发育过程中, 某些胞外信号 (如LTβ、BAFF或CD40L等) 的刺激会诱导NF-κB非经典信号途径的激活。该途径主要通过激活信号分子NIK激酶, 继而磷酸化含有两个IKKα亚基的复合体;IK-Kα复合体通过磷酸化p100导致其被剪切, 从而促成p52:Rel B二聚体的形成, 激活特定基因转录。p52:Rel B是细胞中存在的一种NF-αB异源二聚体形式, 当p52的前体分子p100与Rel B结合时, 二聚体处于非活性状态, 当p100被剪切产生p52时形成有活性的p52:Rel B。NF-κB激活的非经典途径是不依赖IKKβ和IKKλ的, 它是由TNFR家族的部分成员, 如B细胞上的BAFF-R和CD40以及脾基质细胞上的LTβR等介导的 (Bonizzi et al., 2004) 。非经典信号途径的激活对于次级淋巴器官的发育和维持及适应性免疫应答很重要。

3.2 NF-κB激活的其他信号途径

除了上述经典途径和非经典途径之外, NF-κB的激活也可以由IKK非依赖性的信号途径介导。比如, 紫外线 (UV) 辐射等刺激诱导的NF-κB的活化似乎就不需要IKK复合物的参与, 而是p50 (或p52) 同源二聚体与共激活因子Bcl-3等相互作用, 从而具有转录激活活性。

4 NF-κB信号通路的调节机制

细胞内NF-κB的活性是受到严格的调控的, 因为一旦NF-κB活化失控, 就会破坏机体的平衡, 导致包括各种癌症、神经退行性疾病、毛细血管扩张失调症、慢性炎症及各种自身免疫疾病等多种疾病的发生。因此, 研究NF-κB的活性调节机制不仅对研究细胞信号转导的基础理论有重要意义, 而且也为相关疾病的治疗及药物研发提供了新的途径和靶标。

许多激活NF-κB的信号通路在IKK水平上交汇, 因此它是NF-κB调节机制的关键。IKK活化的模式可能是:在静息状态时, IKKα和IKKβ与NEMO结合, 掩蔽了IKK的激酶区, 因此阻碍了IKK的活化。NEMO与接头蛋白RIP等的结合或NEMO的泛素化修饰导致NEMO的寡聚化, 从而使IKK复合体的构象发生改变, 使IKK的激酶区暴露出来, 接着激酶区内的活化环结构中两个保守的Ser残基通过transautophosphorylation或IKK激酶如TAK1等被磷酸化修饰, 导致IKK的活化。活化的IKK接着使下游的底物磷酸化, 包括IκB、IKK的NBD的Ser740和IKK的C端HLH结构域中的多个Ser位点和NEMO的Ser68等。NEMO的磷酸化使NEMO从IKK复合体上解离下来, 接着分子伴侣Hsp-90/Cdc37和蛋白磷酸化酶PP2A (protein phosphatase2A) 或PP2Cβ使IKK复合体重新装备成无活性的形式。

IKK复合物的活化是依赖于磷酸化修饰的, IKK复合物在用蛋白磷酸化酶PP2A或PP2Cβ处理时失去激酶活性, 而用PP2A的抑制剂okadaic acid处理时又能恢复IKK的活性。像其它蛋白激酶一样, IKKα和IKKβ的激酶结构域中都包含一个活化环 (activation loop) 结构, IKK激酶复合物受到上游信号刺激后, 活化环结构中两个保守的Ser残基被磷酸化修饰, 导致IKK的激活。IKKα主要依赖活化环结构中的Ser177和Ser181两个位点被磷酸化而获得激酶活性, 活化的IKKβ还可以通过自身磷酸化使C端HLH结构域中的多个Ser位点进一步磷酸化。如果将IKKβ中的Ser177和Ser181都替换成丙氨酸, 即将IKKβ (SS) 替换成IKKβ (AA) , 就会阻断IKKβ的活化;反之, 如果将它们替换成模拟磷酸化的谷氨酸, 即IKKβ (EE) , 则会导致IKKβ的持续活化。同样的, IKKα蛋白的活化环结构中相应位置的Ser176和Ser180在细胞受到刺激时也有类似的修饰和功能。IKKβ的C端Ser富集区的缺失突变体在TNFα刺激下正常激活, 但活化的持续时间增长, 说明IKKβ的C端HLH结构域中Ser富集区的自身的磷酸化是一个负调节机制。

活化IKK复合物的激酶叫做IKK-K, 很多上游的激酶被认为是IKK-K, 但在基因敲除实验中大多数都缺乏证据, 这更说明IKK可能主要是通过自身的磷酸化来调节的, 而更多的IKK-K可能是接头蛋白而非激酶。IKK的自身的磷酸化可能是由于受到上游信号刺激后使得IKKα-IKKβ之间的空间距离接近或构象改变从而导致互相活化, 这可以由IKK的多聚化或多种接头蛋白如RIP、TRAF募集IKK来介导。研究表明参与NF-κB活化经典信号途径的IKK-K可能主要是TAK1, 而参与非经典信号通路的是NIK。TAK1在TNFα或IL-1等刺激下可以被激活, 并且活化的TAK1存在于IKK激酶复合物中。NIK则是通过直接磷酸化并活化IKKα的方式, 激活由LTβR和BAFF-R等诱导的NF-κB活化的非经典信号途径[14]。

因为IKK的激活与很多接头蛋白有关, 如RIP、TRAF等, 所以也可以通过这些接头蛋白间接的调节IKK的激活。如前所述, 泛素化的修饰在此类调节中发挥了很重要的作用, 研究表明, 通过泛素分子第48位赖氨酸 (K48) 连接的多聚泛素链的修饰通常与蛋白降解有关, 而K63位连接的泛素化修饰通常与蛋白功能的调节有关。TRAF家族蛋白可以作为E3泛素连接酶将自身和IKKλ以K63位连接的方式泛素化, 并通过共价连接的多聚泛素链与TAB2-TAB3-TAK1复合体相互作用, 从而使TAK1活化激活IKK复合物。而去泛素化酶DUB通过去除RIP、TRAF以及IKKλ等蛋白的K63位泛素化而起到负调节的作用, 如A20和CYLD。A20依赖其N端去泛素化酶结构域OTU去除RIP蛋白的K63位连接的多聚泛素链, 从而抑制RIP的功能;再借助其C端锌指结构域的泛素连接酶功能使RIP被K48位连接的泛素化修饰, 从而使RIP被蛋白酶体降解。因此A20是通过去除RIP蛋白的K63位功能调节型泛素化和诱导K48位降解型泛素化修饰的双重作用来进行负调控的。CYLD依赖其C端的一个在Dubs家族中广泛存在的UBP结构域发挥去泛素化作用, 它通过与TRAF2和IKKα分别相互作用, 特异地去除它们的K63位连接的泛素链, 从而阻断IKK复合物的活化。

另外, 还有一些蛋白通过与IKK结合来调节IKK的激活, 如Hsp-90/Cdc37和ELKS。Hsp90可能在IKK激酶复合物中充当分子伴侣的作用, 促进激酶蛋白的正确折叠, Hsp-90/Cdc37的抑制者GA, 抑制了TNFα刺激下的IKK的激活, 它也可以和NF-κB信号通路中的多种激酶作用, 如RIP、NIK、TBK1等, 有研究表明, Hsp-90/Cdc37可能和IKKα结合从而调节IKKα的寡聚状态。ELKS是通过免疫亲和纯化的方法筛选出来的与IKKα相互作用的蛋白, 它的结构与IKKα相似也含有CC结构域和LZ结构域。在未受刺激的细胞中, ELKS是IKK复合物的化学组分之一。RNAi介导的ELKS表达量的降低抑制了IKK的激活以及TNFα和IL-1诱导的前期NF-κB的激活, 但是对NF-κB后期激活没有显著影响。另外, 在免疫共沉淀实验中ELKS与IκBα能够相互结合, 而降低ELKS的表达量则破坏了IKK复合物与IκBα的结合, 表明ELKS可能招募IκBα到IκBα复合物中IKK。

NF-κB的活化还可以通过IκB蛋白来调节, 主要涉及IκBα。我们都知道IκB蛋白的降解释放了NF-κB二聚体, 使其可以入核激活相应基因的转录。IκBα也是NF-κB转录激活的靶基因之一, NF-κB的活化导致IκBα的表达, 产生的IκBα蛋白进入细胞核内与活化的NF-κB结合, 由于NF-κB与IκBα的亲和力大于其与DNA结合的亲和力, 于是NF-κB和IκBα复合体从DNA上解离下来, 并通过IκBα分子上的核输出信号 (nuclearexportsignal, 简称NES) 将NF-κB带回细胞质中, 从而中止NF-κB的活化。因此, NF-κB的活化一方面启动很多效应基因的转录, 另一方面生成IκBα蛋白负反馈调节NF-κB的活性, 中止NF-κB活化信号, 从而控制NF-κB的应答的强度和持续时间[16]。除了诱导产生IκBα对NF-κB的转录激活进行调节外, 还有很多方式影响NF-IκB的转录激活活性, 如NF-κB家族蛋白的翻译后的修饰、与一些转录共因子作用等。NF-κB家族蛋白的翻译后的修饰涉及磷酸化修饰及乙酰化修饰, 以p65为例, 蛋白激酶A (PKA) 可以使p65的Ser276磷酸化, 此磷酸化有两个作用, 一是可以增强p65与DNA的结合能力;一是为转录共激活因子CBP/p300提供一个作用位点, 未磷酸化的p65, C端与Rel区相互作用, 因此阻碍了p65与DNA及CBP/p300的结合, Ser276位的磷酸化阻止了这种分子内的C端与N端的作用, 因此增强了NF-κB的转录激活活性;此外IKK也可以通过对p65的Ser536位磷酸化来增强NF-κB的转录激活活性。研究表明p65共有4个磷酸化位点, 2个在Rel同源区 (Ser276、Ser311) , 2个在TAD区, 转录的激活可能需要每组中至少一个位点磷酸化。而p65的乙酰化涉及多个位点, 其中K218、K221的乙酰化增强转录激活活性, 可能是通过减弱与核内IκBα的结合的方式来作用, 而K122、K123的乙酰化则抑制转录激活活性, 可能是降低了与DNA的亲和力。NF-κB还可以与一些转录共因子作用, 如C/EBP, AP-1, Sp-1, SRF, STAT6等, 来调节其转录激活[17]。

5 小结与展望

总之, NF-κB信号通路对于机体的固有免疫和炎症反应以及适应性免疫等生理病理过程是非常关键的, 因此NF-κB信号通路的失控会导致许多人类疾病, 尤其是与慢性炎症、免疫缺陷以及癌症相关的疾病, 如哮喘、动脉粥样硬化、炎性肠炎, AIDS、类风湿性关节炎、癌症等。研究表明, 许多类型的癌症中都存在NF-κB的组成型激活。因此, 对转录因子NF-κB活化机制的研究, 不仅对于探讨细胞信号转导的基础理论有重要的意义, 而且也为某些疾病的治疗及药物开发奠定了理论基础, 提供了新的途径和靶标。近年来的研究已极大的完善和补充了NF-κB信号通路, 但仍有许多问题等待解决, 如对于不同的NF-κB二聚体的调节、泛素化修饰的确切的调节功能、以及细胞应激引起的NF-κB的活化的具体机制等等, 都需要更深入的研究。

摘要：转录因子NF-κB作为一个标准的可诱导的转录因子已经超过20年了。众多的可激活NF-κB的刺激, 以及大量的受NF-κB调节的基因, 确保了这一转录因子仍然是研究热点。在这里, 我试图总结一下从这些NF-κB的研究中所浮现出的一些基本规律, 并希望能找出一个较统一的关于NF-κB调节的观点。