白血病细胞/药物作用

白血病细胞/药物作用（精选五篇）

白血病细胞/药物作用 篇1

1 材料与方法

1.1 实验材料

Kasumi-1细胞株、K562细胞株、HL60细胞株、Jurkat细胞株、NB4细胞株及U937细胞株购中国科学院上海细胞库, 白杨素含膦 (磷) 衍生物由中山大学化学与化学工程学院彭爱云提供。PRMI-1640培养基购自美国Gibco公司, 新生牛血清从杭州四季青生物工程材料有限公司购买, 甲基亚砜 (DMSO) 购自美国Amresco公司。

1.2 白杨素含膦 (磷) 衍生物的合成

以白杨素为先导化合物, 按步骤1和步骤2所示的合成路线 (图1) , 经膦 (磷) 酰化结构修饰后合成新的系列白杨素含膦 (磷) 衍生物。结构经核磁、红外、质谱等确证, 纯度经高效液相色谱鉴定。化合物合成由中山大学化学与化学工程学院合成。

1.3 细胞培养及原代细胞分离

细胞株用含10%小牛血清的RPMI 1640完全培养基, 加1×105U/L青霉素、1×105U/L链霉素, 在37℃、95%饱和湿度和5%CO2条件下培养, 1~2 d换液1次。

选取根据MIC分型诊断为急性白血病的初诊患者, 抽取骨髓5 m L, 分离单个核细胞 (BMMNCs) 。共分离10例急性白血病患者的BMMNCs。

1.4 MTT实验

取指数生长期细胞或BMMNCs, 实验在96孔培养板中进行, 每孔加入100μL细胞悬液 (2×104个细胞) , 100μL用培养基稀释的药物。白杨素为阳性对照组、设溶媒对照组及调零组, 每组3孔, 培养一定时间后, 实验组及对照组每孔加入20μL MTT液 (5 g/L) , 调零组加入无血清PRMI-1640培养基, 混匀, 继续培养6 h, 离心去清液, 每孔加入100μL DMSO溶液, EX-800型酶标仪以450 nm波长测定OD值, 计算相对细胞活力, 细胞活力 (%) =实验组OD值/对照组OD值×100%, 重复3次实验。

1.5 统计学处理

使用SPSS 11.5软件进行统计学分析, 计量资料数据以 (±s) 表示, 采用t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白杨素含膦 (磷) 衍生物的结构及理化性质

合成了12个白杨素膦酸单酯 (3a–3l) , 6个白杨素膦酸 (4a–4f) , 1个白杨素膦 (磷) 酸6和2个白杨素膦 (磷) 酸单酯7a, 7b, 共21个化合物。结构见图2。该类化合物是未见文献报道的新化合物, 其构效关系显示有更强的抗肿瘤活性、较好的水溶性、更高的生物利用度, 其结构经核磁、红外、质谱等确证, 纯度经高效液相色谱鉴定, 均达到99.5%以上, 溶解度经高效液相色谱法测定为52.3-138.6μm。

2.2 白杨素含膦 (磷) 衍生物对Kasumi-1细胞增殖抑制活性筛选

为了筛选出增殖抑制活性较强的化合物, 参照文献[5]报道先导化合物——白杨素抑制细胞活性的有效浓度, 并以其作为阳性对照, 12个化合物分别以100μm作用细胞48 h, MTT试验检测细胞活性。结果见表1, 衍生物3c、3e、3j、4b、7a、7b对Kasumi-1细胞有一定的增殖抑制活性。其中衍生物3c、7b对细胞的抑制活性远远高于先导化合物白杨素, 比较差异有统计学意义 (P<0.01) 。

以白杨素 (chrysin) 为对照, 100μm的3c、7a分别作用Kasumi-1细胞0、12、24、36、48、60 h, 结果见图3。100μm的3c作用36 h细胞活性最低, 100μm的7a作用48 h细胞活性最低。衍生物3c、7a对Kasumi-1细胞增殖抑制活性呈时间依赖性, 且均强于白杨素, 比较差异有统计学意义 (P<0.01) 。0、25、50、75、100μm的3c、7a分别作用Kasumi-1细胞48 h, 结果见图4。衍生物3c在50μm浓度时, 细胞活性达到最低, 衍生物7a在100μm浓度时, 细胞活性最低。衍生物3c、7a对Kasumi-1细胞增殖抑制活性呈浓度依赖性, 且均强于白杨素, 比较差异有统计学意义 (P<0.01) 。白杨素含膦 (磷) 衍生物3c、7a对Kasumi-1细胞增殖抑制的时效关系及量效关系见图3和图4。

2.3 白杨素含膦 (磷) 衍生物3c、7a对多个白血病细胞株的增殖抑制活性

为了探讨衍生物3c、7a对其他白血病细胞株的活性, 选用衍生物3c、7a对Kasumi-1细胞株有效作用时间及浓度, 分别作用于Jurkat细胞株、NB4细胞株、K562细胞株、HL60细胞株及U937细胞株, MTT法检测细胞活性。结果见图5、图6。衍生物3c、7a对以上细胞株的增殖均有明显的抑制作用, 且呈时间及浓度依赖性。与对照组比较, 作用时间48 h时, 25μm衍生物3c即对U937细胞产生明显的增殖抑制作用;50μm浓度时对Jurkat细胞株、NB4细胞株、K562细胞株及HL60细胞株有明显的增殖抑制作用, 差异具有统计学意义 (P<0.01) 。从时效关系方面看, 与对照组比较, 100μm的3c作用24 h后, 对U937细胞株及Jurkat细胞株有明显的增殖抑制作用;作用36 h后对NB4细胞株、K562细胞株及HL60细胞株有明显的增殖抑制作用, 差异具有统计学意义 (P<0.01) 。不同浓度的衍生物7a作用各细胞株48 h, 25μm浓度时对HL60细胞及U937细胞即有明显增殖抑制效果, 比较对照组, 差异有统计学意义 (P<0.01) ;50μm浓度时K562细胞及NB4细胞有显著增殖抑制效果, 比较对照组, 差异有统计学意义 (P<0.01) , 而Jurkat细胞则在75μm时出现明显增殖抑制作用。100μm的7a作用各细胞株时效关系曲线显示, 作用24 h, NB4细胞即出现一定的增殖抑制效果, 比较对照组, 差异有统计学意义 (P<0.01) ;作用36 h, 除U937细胞外, 其余细胞均出现显著增殖抑制作用, 比较对照组, 差异有统计学意义 (P<0.01) ;U937细胞出现一定程度增殖抑制作用, 但与对照组比较, 差异无统计学意义;U937细胞在48 h后出现显著增殖抑制作用, 比较对照组, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。

2.4 白杨素含膦 (磷) 衍生物3c、7a对AML患者BMMNCs的增殖抑制作用

10例初诊的急性白血病, 其中M2a 4例, M5 1例, B-ALL 2例, T-ALL 2例, 慢粒急变1例, 分离骨髓单个核细胞, 用不同浓度的白杨素含膦 (磷) 衍生物3c或7a处理48 h, 取10例患者各浓度的OD值平均数做曲线, 结果见图7。与细胞株结果类似, 衍生物3c及7a对急性白血病患者的骨髓原代细胞均有明显的增殖抑制作用, 且为浓度依赖性。

3 讨论

许多研究者对从植物中筛选出的天然黄酮类化合物 (如葛根总黄酮、姜黄素、金莲花黄酮、染料木黄酮等) 进行了广泛研究, 发现其在体内外对多种白血病细胞均有一定的活性[6,7], 但是天然黄酮存在活性偏低、类药性差等缺点。为了提高其抗肿瘤活性, 适应临床应用, 各种各样的黄酮衍生物被合成[8,9]。文献报道最成熟的为国外研究者合成的Flavopiridol (夫拉平度, 黄酮L86-8275) , Ⅰ期或Ⅱ期临床试验已证实此药单用或与其他化疗药物合用对难治复发性急性或慢性白血病均有肯定疗效[6,10]。

注:A:0、25、50、75、100μm的3c作用各细胞株48 h;B:100μm的3c、作用各细胞株0、12、24、36、48、60 h

注:A:0、25、50、75、100μ的7a作用各细胞株48 h;B:100μm的7a、作用各个细胞株0、12、24、36、48、60 h

近年来许多国内外学者对白杨素衍生物的合成方法和生理活性进行了研究, 对白杨素进行硝化、烷基化、羟甲基化、氟甲基化、膦 (磷) 酰化后合成的部分衍生物具有较强的抗肿瘤活性, 在体外对许多肿瘤细胞都有明显的增殖抑制作用, 如人胃癌SGC-7901细胞、人肺癌A549细胞、人肝癌Hep G2细胞及Hep B3细胞、人宫颈癌He La细胞、人鼻咽癌CNE-2细胞、人结肠癌 (HT-29) 细胞、人类小细胞肺癌NCI2H446细胞、人急性粒细胞性白血病HL-60细胞、人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞、急性白血病 (M5) U937细胞等[5,11,12,13]。白杨素膦 (磷) 酰化结构修饰的报道较少, 陈晓岚等[14]对白杨素进行了含膦 (磷) 改造, 共合成出4种新的化合物, 他们的研究结果表明, 白杨素含膦 (磷) 衍生物与溶菌酶具有更强的亲和力。张婷等[15]合成了白杨素四乙基二膦 (磷) 酸酯, 并发现白杨素和白杨素四乙基二膦 (磷) 酸酯对宫颈癌Hela细胞软琼脂的集落形成有明显抑制作用, 能诱导并促进宫颈癌Hela细胞发生分化, 且白杨素四乙基二膦 (磷) 酸酯在作用效果方面较白杨素明显, 该研究提示膦 (磷) 酸基团的添加增强了抗肿瘤活性。

笔者通过化学法, 将膦酸或膦 (磷) 酸基团引入到白杨素侧链中, 新合成21个未见文献报道的白杨素含膦 (磷) 衍生物。这些白杨素含膦 (磷) 衍生物具备以下优点: (1) 它们较白杨素具有更好的水溶性。预期在体内能较好的被吸收, 可以弥补大多数天然黄酮因水溶性较差而导致生物利用率低的不足。 (2) 含膦 (磷) 基团是一些抗骨质疏松、抗病毒、抗肿瘤等药物分子的药效团, 白杨素又具有广泛生物活性, 所合成的白杨素含膦 (磷) 衍生物应用了药效团拼合原理, 可能具有更好的药理活性。通过体外细胞增殖抑制试验, 从新合成的白杨素含膦 (磷) 衍生物中筛选出对急性白血病 (M2) 细胞株Kasumi-1增殖抑制作用较强的2个衍生物 (3c、7a) , 这两个化合物100μm浓度作用48 h对白血病细胞的增殖抑制率分别为82.64%、79.23%, 白杨素同等条件下对白血病细胞的抑制率为47.39%。此后, 用衍生物3c及7a分别处理多个细胞株及急性白血病患者的骨髓原代细胞, 发现, 白杨素含膦 (磷) 衍生物3c及7a对检测的多个白血病细胞株及患者骨髓原代细胞均有明显的增值抑制作用, 说明该两个衍生物有体外抗白血病活性, 有进一步进行体内抗肿瘤活性研究的价值。

摘要：目的:探讨新合成的12个白杨素含膦 (磷) 衍生物在体外对白血病细胞的增殖抑制作用。方法:MTT比色法测定12个白杨素含膦 (磷) 衍生物对Kasumi-1细胞的增殖抑制情况, 筛选出比先导化合物白杨素增殖抑制活性强的衍生物, 进一步检测其对Jurkat细胞、NB4细胞、K562细胞、HL60细胞、U937细胞及急性白血病患者骨髓原代细胞的增殖抑制作用。结果:白杨素含膦 (磷) 衍生物3c、7a的对各种白血病细胞均有明显的增殖抑制作用。结论:新和成的白杨素含膦 (磷) 衍生物3c、7a有进一步进行抗白血病效应研究的价值。

白血病细胞/药物作用 篇2

1材料

K562细胞(本室保存);LDM(由中国医学科学院医药生物技术研究所甄永苏院士惠赠);RPM-1640(美国Gibco公司);胎牛血清(美国Biological公司);MTT (噻唑蓝)法检测细胞增殖及细胞毒性试剂盒(南京凯基);苔盼蓝;兔抗人肿瘤坏死因子(TNF-α)抗体(美国Affinity公司);Beta actin (β 肌动蛋白) 抗体 (美国Affinity公司)

2方法

2.1细胞培养K562细胞株从液氮中复苏后,用含10%胎牛血清的RPM-1640培养液在37 ℃,5% CO2恒温培养箱中培养,所有实验均采用对数生长期细胞。

2.2细胞增殖的检测在96孔板加入细胞100 μl/孔 (约1×104),置37 ℃,5% CO2细胞培养箱中培养24 h后,加入不同浓度力达霉素(LDM),再于恒温培养箱孵育48 h,加入50 μl MTT,37 ℃孵育4 h,使MTT还原为甲臜,1 000 g离心,吸出上清,每孔加入150 μl二甲亚砜(DMSO)使甲臜溶解,平板摇床摇匀,于490 nm波长处检测每孔的吸光度(A)值,计算细胞成活率。

2.3细胞的计数离心收集K562细胞,制备单细胞悬液并作适当稀释,细胞悬浮液与台盼蓝溶液以9∶1混合混匀,在3 min内分别计数活细胞和死细胞,计算活细胞率。

2.4细胞凋亡形态的观察将K562细胞2×105个/ml浓度接种于含10%的小牛血清的RPMI 1640培养基中,置24孔板中,每孔2 ml,加入不同浓度的LDM,设对照组,培养48 h,转入离心管,1 000 g离心,弃上清, 取0.2 ml涂片,冷风吹干,瑞氏染色10 min,姬姆萨染液染10 min,冲洗,晾干,在倒置显微镜下观察。

2.5细胞培养上清中TNF-α 表达的检测将K562细胞置37℃,5% CO2细胞培养箱培养48 h后1 000×g离心,收集细胞培养上清。采用ELISA试剂盒进行检测。

2.6凋亡相关蛋白的检测离心收集K562细胞,预冷的PBS洗涤2次,加入裂解缓冲液1 ml(PMSF 10%)震荡混匀,冰浴30 min。 细胞裂解物在4 ℃ 12 000 g离心5min,取上清。使用BCA(Bicinchoninic acid)蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。等量的蛋白样品进行SDS-PAGE,将电泳分离的蛋白转移到PVDF膜 (聚偏二氟乙烯膜) 上。室温下用含5%脱脂奶粉[PBS (磷酸缓冲盐溶液)溶解]封闭1 h。随后加入一抗 (1:500)4 ℃过夜。PBST(PBS溶液加上吐温-20)洗膜3次,加入相应的二抗,37 ℃孵育1 h,PBST洗膜3次。 ECL曝光法显色,通过成像系统捕获图像,并通过图像分析系统对所得区带进行扫描,比较各组的积分A值。

2.7统计学分析实验数据采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析,实验结果采用±s表示。

3结果

3.1 LDM对人白血病K562细胞增殖的影响不同浓度LDM素作用K562细胞48 h后,置于全自动连续光谱酶标仪在490 nm处测定A值。按公式:细胞存活率%=(加药细胞A/对照A)×100,从而得出LDM对K562细胞作用的半数抑制浓度(IC50)为10-10mol/L。见图1。

3.2 LDM对人白血病K562细胞活性的影响苔盼蓝染色显示,正常细胞无色,死细胞呈蓝色。不同浓度LDM素作用于K562细胞48 h后对其生长均有一定的影响。见图2。

注:A:对照;B:10-8mol/L;C:10-9mol/L;D:10-10mol/L;E:10-11mol/L; F:10-12mol/L

分别用10-12、10-11、10-10、10-9、10-8mol/L浓度的LDM素作用K562细胞。按公式:抑制率(IR)%=死细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100,计算出IR值。测得IR值分别为 (21.2±2.5)%、(37.5±0.97)%、(5.21±1.2)%、 (64.5±1.6)%和(71.3±2.0)%。

3.3 LDM对人白血病K562细胞凋亡形态的影响未经药物处理的对照组K562细胞多呈圆形,经不同浓度LDM处理后,均出现明显凋亡形态,包膜皱缩,有泡状突起及不规则凹陷,胞核染色质浓缩,固缩,浓染,断裂成小团块分散在胞膜周边,以至形成凋亡小体。见图3。

注:A:对照;B:10-8mol/L;C:10-10mol/L;D:10-12mol/L

3.4 LDM诱导人白血病K562细胞TNF-α 在细胞培养上清中的表达结果显示,10-8、10-10、10-12mol/L的LDM处理后,细胞培养血清中TNF-α 的含量分别为16.2 ± 4.0、35.0 ±2.9、51.0 ±3.6、60.5 ±0.5,对照组为 (16.2±4.0)pg/ml,3个浓度组与对照组的差异均有统计学意义(P<0.01)。见图4。

注:A:对照;B:10-8mol/L;C:10-10mol/L;D:10-12mol/L。TNF-α—肿瘤坏-α;β-actin—β 肌动蛋白(内参蛋白)

3 . 5LDM对人白血病K562细胞TNF - α 表达的影响用10-8、10-10、10-12mol/L浓度LDM处理组48 h后,TNF-α 蛋白的表达量依次为0.42±0.01、1.67±0.13 (P<0.01)和2.41±0.08(P<0.01),与对照组0.23±0.02相比,A值升高。见图5。

注:与对照组相比较,aP<0.01

4讨论

目前认为,肿瘤的发生和细胞增殖与细胞凋亡平衡失调有关。细胞凋亡是细胞内源性基因调控下的生理性细胞死亡方式,凋亡过程受阻是肿瘤发生的主要机制之一,同时也是临床上肿瘤治疗研究的热点之一。 诱导凋亡是化疗药物抗白血病的重要机制。

LDM(原名C-1027[5,6],lilamycin)是具有我国自主知识产权的烯二炔类(enediyne)抗生素,以其抗肿瘤的强烈活性及独特的DNA切割方式而颇受重视。LDM由1个辅基蛋白和1个发色团组成,发色团是其活性部分。LDM能引起核苷酸碱基和序列特异性的DNA单链和双链断裂[7]。大量研究表明,力达霉素具有较强的抗肿瘤活性[8,9,10],LDM能够强烈抑制肿瘤生长和肿瘤转移。最近有研究证明,LDM可以诱导肿瘤细胞染色体异常和端粒错排[11]。以往研究显示,不同剂量LDM能诱导多种类型的肿瘤细胞死亡,如典型细胞凋亡,但其究竟确切作用于哪种凋亡通路目前尚不清楚。细胞凋亡是一种在基因控制下的细胞主动死亡过程,以核酸内切酶活化后将DNA分解为180 bp整倍数的片断DNA为特征。形态学上表现为细胞起泡,核固缩。LDM作用非常迅速,活性比一般抗肿瘤药强。要抑制肿瘤细胞的生长,一方面可以通过影响细胞周期,使其不能进行正常的有丝分裂;另一方面可以促进细胞凋亡,以达到治疗目的。本研究采用MTT法观察了LDM对人白血病K562细胞增殖有抑制作用,其IC50值为10-10mol/L,作用均强于丝裂霉素和阿霉素,显示出LDM对K562细胞有极强的杀伤作用。人白血病K562细胞经LDM处理后,细胞均出现明显凋亡形态,胞膜皱缩,胞核固缩, 浓染,断裂成小团块分散在胞膜周边,以致形成凋亡小体。细胞凋亡是内外多因子复杂的相互作用诱导产生凋亡信号,目前普遍认为是一系列高度调控的半胱氨酸蛋白酶(caspase)在凋亡不同阶段发挥作用,分为调控性caspase和效应性caspase形成凋亡信号转导的酶级联反应。TNF-α 是一种具有广泛生物学效应的细胞因子,因其可致肿瘤出血,并能抑制、杀伤体外培养的肿瘤细胞而得名。TNF-α 的生物学活性占TNF总活性的70%~95%,其前体由223个氨基酸组成,相对分子质量为26,成熟的TNF-α 含157个氨基酸,无蛋氨酸残基,即无糖基化位点,TNF-α 通过细胞膜上的受体 (TNFR)发挥生物学活性[11]。TNF的生物效应都是通过细胞表面的2种TNF受体(TNFR)引发,其信号转导通路主要包括caspase家族介导的细胞凋亡、衔接蛋白TRAF介导的转录因子NF-B和JNK蛋白激酶的活化[12]。细胞凋亡的死亡受体途径是指细胞凋亡由死亡受体[主要有Fas(factor associated suicide)、TNFR(tumor necrosis factor receptor) 家族和TGF-βR(transforming growth factor β receptor)等]介导,与各自的配体相互结合后激活下游的信号转导。其中Fas和配体Fas L(Fas ligand) 结合,通过死亡功能区活化接头蛋白FADD (Fas-associated protein with death domain),而FADD又可以通 过N端的死亡 效应域DED (Death effector domain)和Caspase-8相互作用引发细胞凋亡。本实验研究证实,低浓度LDM可能通过上调TNF-α 表达水平诱导K562细胞凋亡抑制其增殖,其作用机制有待进一步深入研究。

作者声明本文无实际或潜在的利益冲突

摘要：目的 探讨低浓度力达霉素(LDM)对人白血病细胞K562增殖的抑制作用及其可能的作用机制。方法 以不同浓度LDM处理K562细胞48 h,通过MTT法检测LDM对细胞增殖的抑制作用;利用苔盼蓝染色对细胞活性进行测定;利用瑞氏-姬姆萨染色法观察LDM对细胞形态的影响;Elisa法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在细胞培养上清中的表达;采用Western Blot检测凋亡相关蛋白TNF-α的表达。结果 LDM对K562细胞增殖有一定的抑制作用,用10-12、10-11、10-10、10-9、10-8mol/L浓度的LDM分别作用K562细胞48 h,抑制率分别为(21.2±2.48)%、(37.5±0.88)%、(52.1±1.24)%、(64.5±1.61)%和(71.3±2.00)%。通过瑞氏姬姆萨染色,荧光显微镜下可见胞膜皱缩,有泡状突起及不规则凹陷,胞核染色质浓缩,固缩,浓染,断裂成团块分散在胞膜周边。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清,LDM处理组与对照组相比,TNF-α表达水平升高。Western Blot分析显示,分别用10-8、10-10、10-12 mol/L浓度的LDM处理细胞48 h后,TNF-α蛋白的表达量依次为0.42±0.01、1.67±0.13(P<0.01)和2.41±0.08(P<0.01),与对照组0.23±0.02相比,吸光度值比升高。结论 低浓度LDM可能通过上调TNF-α表达水平诱导K562细胞凋亡抑制其增殖。

白血病细胞/药物作用 篇3

1 资料与方法

1.1 一般资料

所有的病例均来自2001年1月~2008年12月在我院血液科病房住院的ALL患者, 共46例, 均经骨髓细胞学, 组织化学, 部分经免疫学检查确诊, 符合ALL诊断标准[1]。其中, 男31例, 女15例, 年龄6~47岁, 中位年龄为28岁, 均经长春新碱、柔红霉素、左旋门冬酰胺酶、地塞米松、环磷酰胺等多药组合方案 (VDLCP或VDLP) 诱导治疗后完全缓解, 均进行HD-MTX化疗, 共389例次。

1.2 方法

甲氨蝶吟 (MTX) 每次1~3 g/m2, 其中1/6量在最初30 min内快速静脉滴入, 余下的5/6量在24 h内均匀静脉滴入。用药当天及其后3 d充分水化 (补液量每天3 L/m2) 及碱化尿液 (尿p H≥7.5) 。快速静脉用药后0.5~2 h内鞘内注射MTX (10~15 mg) +阿糖胞苷 (30~50 mg) +地塞米松 (5~10 mg) ;静脉用药结束后12 h开始用甲酰四氢叶酸钙解救, 每次15 mg/m2+生理盐水100 ml静脉滴注, 每6小时1次, 共8次。化疗均于普通消毒隔离病房内进行。

1.3 观察项目

主要是观察治疗前后消化道反应、体温变化、心肝肾功能、全身皮肤及口腔黏膜损害、外周血检查, 观察神经系统有无视力改变、头昏、头痛、颈项强直等。

2 结果

2.1 消化道反应

消化道症状最多见, 发生于用药后4 h~3 d, 174例次 (44.73%) 表现为恶心、呕吐、食欲下降, 12例次 (3.08%) 出现腹痛、腹泻。经使用恩丹西酮或胃复安等对症治疗后缓解。

2.2 皮肤及黏膜损害

24例次 (6.17%) 于用药结束后5~7 d出现口腔黏膜充血、糜烂、溃疡, 经加强口腔护理及抗感染治疗, 多数患者于1周内溃疡好转或痊愈, 其中1例口腔溃疡严重, 合并牙龈出血、鼻出血, 后发生消化道出血死亡。7例在使用后出现皮肤损害, 其中3例用药后第4天出现严重皮疹, 面部、颈部、躯干、四肢皮肤呈大片红斑, 无正常皮肤, 剧痒、剧痛, 最后脱屑, 经用激素、抗组胺药物及对症处理1个月左右痊愈。3例表现为全身点状褐色皮疹, 经抗过敏治疗后好转。1例出现全身皮肤严重剥脱性皮炎、消化道出血, 经积极抢救无效死亡。

2.3 体温变化

于用药后1~2 d出现发热29例次 (7.46%) , 其中, 低热21例次, 中等发热8例次, 给予物理降温及吲哚美辛治疗后2~6 h恢复正常。

2.4 心、肝、肾功能损害

107例次 ( (27.51%) 于用药1周后谷丙转氨酶 (ALT) 升高, 达41~396 U/L, 其中95例次ALT<80 U/L, 12例次ALT≥80 U/L, 经用硫普罗宁、还原型谷胱甘肽等药物护肝治疗1~4周ALT恢复正常。8例患者于用药1周后出现BUN、Cr升高, 均未超过正常值高限2倍, 1~2周自行下降至正常范围。所有病例未发生心功能不全表现, 但6例患者心肌酶增高, 经用门冬氨酸钾镁、肌苷、辅酶Q10等治疗后1~2周恢复。

2.5 血液系统改变

152例次 (39.07%) 出现白细胞减少, 用药后1周达最低值 (0.6~3.1) ×109/L。83例次 (21.34%) 出现血小板减少 (3~85) ×109/L。于用药后2周白细胞及血小板即可恢复正常。在骨髓抑制期内28例次 (7.20%) 继发肺部或呼吸道感染, 经加强抗感染及支持治疗后治愈。

2.6 神经系统

3 例出现轻度头昏、头痛, 可自行缓解。

3 讨论

实验证明, 采用HD-MTX治疗, 药物可通过被动扩散的方式直接进入细胞内, 且可抑制游离MTX从细胞内向细胞外流动, 从而保持细胞内足够的药物浓度, 竞争性抑制二氢叶酸还原酶, 导致四氢叶酸生成减少, 以致DNA合成障碍, 对快速增殖的肿瘤细胞有杀伤效应, 可能改变白血病细胞癌基因的表达, 起到基因治疗作用[2], 化疗剂量越大, 杀死的白血病细胞越多, 化疗剂量每增加1倍, 其杀灭能力增强10倍;1次充分有效的化疗, 1个疗程可杀灭白血病细胞2~5个对数级[3]。近10多来, HD-MTX已被公认是预防和治疗ALL髓外白血病的主要手段之一。但由于MTX对增殖更新较快的正常组织细胞 (如骨髓及消化道粘膜上皮细胞等) 也有较高的亲和力, 所以在化疗过程中容易出现一系列的毒副作用, 此外还可通过免疫介导引起特异性炎症、严重过敏反应等[4]。本组资料显示HD-MTX化疗后副作用以胃肠道反应多见, 其次是骨髓抑制, 再次是肝功损害、皮肤及黏膜损害、发热, 神经系统及肾功能损害相对较少, 且均可逆转, 只有2例患者死于相关毒副作用, 大多数患者对HD-MTX有良好的耐受性, 均能坚持完成治疗。由此可见, HD-MTX作为防治髓外白血病和全身巩固治疗方案, 只要设计合理, 治疗前肝、肾功能正常, 治疗时保证充分水化、碱化, 保肝、护心、利尿, 利用正常细胞与肿瘤细胞复苏时间差, 正确使用甲酰四氢叶酸钙解救, 将较少出现严重的副作用[5,6]。

摘要：目的:探讨大剂量甲氨蝶呤 (HD-MTX) 治疗急性淋巴细胞白血病 (ALL) 的毒副作用。方法:回顾性分析2001年1月～2008年12月在我院血液科病房住院的ALL患者的临床资料。结果:临床特点显示HD-MTX化疗后副作用以胃肠道反应多见, 其次是骨髓抑制, 再次是肝功损害、皮肤及黏膜损害、发热、神经系统及肾功能损害相对较少, 且均可逆转, 只有2例患者死于相关毒副作用, 大多数患者对HD-MTX有良好的耐受性, 均能坚持完成治疗。结论:HD-MTX作为防治髓外白血病和全身巩固治疗方案, 只要设计合理, 治疗前肝、肾功能正常, 治疗时保证充分水化、碱化, 保肝、护心、利尿, 利用正常细胞与肿瘤细胞复苏时间差, 正确使用甲酰四氢叶酸钙解救, 可减少严重的副作用。

关键词：甲氨蝶呤,大剂量,副作用

参考文献

[1]张之南.血液病诊断及疗效标准[M].北京:科学出版社, 1998:184-194.

[2]Neth R.Modern trends in human leukemiaⅦ[M].Herdelburg:Springer, 1989:27.

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[4]刘峥, 陈静, 王天有, 等.大剂量甲氨蝶呤治疗小儿急性淋巴细胞性白血病致过敏反应4例[J].中国小儿血液, 2000, 3 (1) :38.

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白血病细胞/药物作用 篇4

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂和设备 K562/S (敏感株) 和K562/ADM (耐药株) 购于中国医学科学院血液病研究所。双氢青蒿素 (Dihydroartemisinin, DHA) (标准品) 购自上海融禾医药科技发展有限公司, 临用前用二甲亚砜 (DMSO) 溶解, 所有实验中DMSO终浓度<0.1%, 阿霉素 (ADM, 杭州赛洛菲民生制药有限公司) , 四氮唑蓝 (MTT, Gibco公司) , 藻红蛋白 (PE) 标记P2糖蛋白 (P-glycoprotein, P-gp) 单克隆抗体 (BD公司产品) , 破膜剂 (美国Caltag公司) 。恒温CO2细胞培养箱 (美国HERAEUS HERA cell240) , 流式细胞仪 (FACS Calibur SE, 美国BD公司) 。

1.2 DHA细胞耐药的逆转实验 实验分为4组, 对照组:K562/ADM (不加任何药物) ;10μmol/L DHA实验组:K562/ADM细胞+DHA (终末浓度为10μmol/L) , 20μmol/L DHA实验组:K562/ADM细胞+DHA (终末浓度为20μmol/L) , 40μmol/L DHA实验组:K562/ADM细胞+DHA (终末浓度为40μmol/L) 。取对数生长期K562/ADM细胞接种于96孔培养板, 调整细胞密度为1×104/ml。按上述分组加入不同浓度DHA, 培养24h后加入ADM, 使ADM终末浓度分别为0、0.1、0.5、2.0、5.0μg/ml, 再培养48h后, 每孔加入四甲基偶氮唑盐 (MTT) 20μL, 继续培养4h, 弃上清, 加入二甲亚砜 (DMSO) 150μL, 平板振荡器震荡5min后, 置酶联免疫检测仪上测定波长490nm下各孔吸光度 (A) 值, 设既不加药也不加MTT的空白对照组, 计算细胞存活率。细胞存活率 (LCS, %) = (A实-A空) / (A对-A空) ×100%;细胞增殖抑制率=1-LCS。每组均设3个复孔, 实验重复5次, 取其均值。采用综合计算法, 计算出半数抑制率的ADM浓度 (IC50) 。细胞耐药逆转倍数=对照组细胞IC50/对照组细胞IC50。

1.3 P-gp表达的检测 采用免疫组化方法, 将经DHA处理48h及未经DHA处理的K562/ADM细胞分别收集, 离心, 0.1mol/L PBS冲洗, 再分别调成1×106/ml单细胞悬液, 涂片, 体积分数为4%多聚甲醛固定后用SP染色法染色。采用的一抗为人抗P-gp的单克隆抗体, 然后用生物素标记的第二抗体与链霉素抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞中的抗原。具体步骤按照S-P免疫组化染色试剂盒进行, 将包膜着色者定为阳性细胞, 实验的同时以K562/S细胞为阴性对照。

1.4 P-gp功能的检测 采用罗丹明123 (Rhodamine123) 蓄积和外排实验, 参照文献方法进行。蓄积实验:对照组加入终浓度为2mg/L Rh123, DHA组在对照组基础上再加入DHA, 37℃、体积分数5%CO2中孵育45min后, DHA在对照组基础上再加入DHA, 37℃、体积分数5%CO2中孵育45min。用流式细胞仪检测细胞内Rh123激光的荧光强度, 来代表其在细胞内的浓度。

1.5 统计学处理 数据采用均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示, 两样本间均数比较采用t检验。所有数据均用SPSS统计软件处理。以P<0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DHA对K562/ADM细胞的耐药逆转

不同浓度的DHA对K562/ADM细胞都有不同程度的耐药逆转作用, 并且在10～40μmol/L浓度范围内, 逆转作用随着DHA浓度升高而明显增加, 见表1。10、20、40μmol/LDHA实验组细胞耐药逆转倍数分别为1.46、1.90和3.62倍, 呈浓度依赖性 (P<0.01) , 见表1。

2.2 DHA对耐药细胞膜上P-gp表达的影响

免疫组化SP染色结果显示, K562/S细胞其胞膜未着色, 所以其P-gp表达阴性。K562/ADM细胞90%以上细胞膜着棕色, 其P-gp表达强阳性。DHA应用后K562/ADM细胞P-gp表达仍呈强阳性 (着色细胞数<10%为-, 10%～30%为+, 30%～50%为++, 50%～80%为+++, 80%～100%为++++) 。说明DHA不能明显抑制耐药肿瘤细胞膜上P-gp的表达, 见表2。

注:与对照组比较, ▲P<0.01。

2.3 DHA对耐药细胞膜上P-gp功能的影响

流式细胞仪检测结果显示:在蓄积实验中, K562/S细胞内Rh123浓度为98.12%, K562/ADM细胞内Rh123浓度为25.43%, 而加入DHA后, K562/ADM细胞内Rh123浓度升高为81.13%;在外排试验中, K562/S细胞内Rh123浓度为97.89%, K562/ADM细胞内Rh123浓度为23.11%, 加入DHA后, K562/ADM细胞内Rh123浓度升高为61.18%。这些结果表明DHA能使K562/ADM细胞内药物蓄积增加、外排减少, 增加耐药细胞内药物浓度, 抑制P-gp的药物外排泵功能。见表3。

注:▲P<0.01。

3 讨论

青蒿素作为一线的抗疟药已广为大家所熟知, 随着对其研究的深入, 目前青蒿素类药物的抗癌活性逐渐成为学者们关注的热点, 其衍生物双氢青蒿素 (Dihydroartemisinin, DHA) 是青蒿素类药物在体内的主要活性代谢产物, 与其他青蒿素类药物相比显示出更强的抗肿瘤活性[1,2,3,4]。其作用机制可能与肿瘤细胞内自由基的产生及氧化应激、延迟细胞周期、诱导细胞凋亡和抗肿瘤血管生成及多药耐药抗性等相关。本研究主要从DHA对白血病耐药细胞株逆转耐药方面进行探讨。

P-gp 是人类MDR1基因的表达产物, 为一种分子量为170kD的P-糖蛋白 (P-glycoprotein, P-gp) , 又称P-170, 研究表明, 细胞膜上的P-gp是一种ATP依赖的“药物泵”, 可以将细胞内的带阳性电荷的疏水性药物从细胞内逆浓度梯度泵到细胞外, 减少细胞内抗肿瘤药物浓度而使化疗失败[5], 其可以由化疗药物诱导表达, 且P-gp的表达量与细胞耐药性呈正相关。肿瘤细胞耐药的产生与P-gp“药物泵”的功能及表达量密切相关。已知多种MDR逆转剂均是通过抑制P-gp功能增加肿瘤细胞内抗癌药物的累积从而逆转MDR, 如维拉帕米、酚噻嗪、利血平、环孢素A等。而最近在青蒿素逆转实体瘤如乳腺癌MDR的研究表明其机制之一可能为降低细胞膜上P-gp的表达水平, 提高药物在细胞内的聚集, 增强药物对肿瘤细胞的敏感性, 从而发挥杀死肿瘤细胞的作用。为了探讨DHA逆转MDR的机制, 笔者采用罗丹明蓄积和外排实验研究了DHA对P-gp功能的影响。实验的结果显示DHA增加了K562/ADM细胞内罗丹明的蓄积量, 减少了其外排量, 使耐药细胞内罗丹明浓度增加, 因此可以推测DHA通过抑制P-gp的功能提高细胞内罗丹明水平。本试验同时对P-gp的表达水平进行了检测。免疫组化结果显示, DHA应用前、后K562/ADM细胞膜P-gp表达水平均无明显差异, 表明DHA不是通过抑制P-gp表达来逆转MDR。体外试验结果显示, DHA 能有效逆转K562/ADM细胞的多药耐药性, 显著抑制肿瘤细胞膜上P-gp的“药泵”功能, 增加耐药细胞内药物浓度, 因其低毒、广谱高效有望成为肿瘤多药耐药逆转剂的候选药物。

摘要：目的:探讨双氢青蒿素 (Dihydroartemisinin, DHA) 在白血病多药耐药中的应用。方法:采用MTT检测DHA联合阿霉素 (adriamycin, ADM) 对白血病多药耐药细胞 (K562/ADM) 生长增殖的影响;应用流式细胞技术分析细胞内罗丹明123 (Rhodamine 123) 浓度, 以检测DHA对白血病细胞膜P糖蛋白 (P-glycoprotein, P-gp) 泵功能的影响;免疫组化方法检测DHA对白血病细胞P-gp表达水平的影响。结果:10、20、40μmol/L DHA实验组的细胞耐药逆转倍数分别为1.46、2.16和3.52倍。DHA使用前、后K562/ADM细胞膜P-gp表达水平无明显差异;Rh123蓄积试验中DHA应用后使K562/ADM细胞内Rh123浓度由用前的22.16%升至89.18%, Rh123外排试验中DHA应用后使K562/ADM细胞内Rh123浓度由用前的27.15%升至60.51%。结论:DHA:能有效逆转白血病细胞的MDR机制为通过抑制肿瘤细胞膜上P-gp的药泵功能, 增加耐药细胞内化疗药物浓度逆转耐药性, 而不是抑制和P-gp表达。

关键词：DHA,白血病,MDR,逆转

参考文献

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白血病细胞/药物作用 篇5

1对象与方法

1.1对象:选择配制中心建成前工作1年以上护士共46名。药物配制中心建成后均一直在配制中心配制细胞毒药物, 并参加科室日常静脉输液及常规护理工作。药物配制中心使用前1年肿瘤科接触细胞毒药物护士定义为暴露组;配制中心使用后1年肿瘤科护士定义为防护组。配制中心由洗手间、更衣间、缓冲间、工作间及药品传递窗组成。通风系统使室内及工作台空气由内向外有序流动。护士配药时穿防护服、面具及手套, 并严格按无菌原则、有害有毒物质防护原则操作。在细胞毒药物配制中心使用前, 细胞毒药物在病房普通无防护条件的治疗室配制。工作时护士仅只戴口罩, 房间内通风为开窗空气自然流动。

1.2方法:配制中心刚投入使用前及使用后1年肿瘤科护士体检时血常规检查数据。护士在工作过程中出现的不适症状由自行设计的调查问卷来统计。具体内容包括:脱发、腹胀、皮疹、咽喉痛、眼睑充血、皮肤瘙痒。凡是在药物配制中心使用前后各1年内上述各个症状发生时间累计超过10 d视为与职业暴露有关。

2结果

2.1护士外周血分类计数:细胞毒药物配制中心使用前后暴露组、防护组护士外周血分类计数相比差异均具有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。

2.2护士主观不适感觉发生率:细胞毒药物配制中心使用前后暴露组、防护组护士脱发、皮疹、眼睑充血、皮肤瘙痒发生率相比差异均具有统计学意义 (P<0.05) ;而腹胀、咽喉痛的发生率均无统计学意义 (P>0.05) , 见表2。

3讨论

目前肿瘤科广泛应用的细胞毒药物多通过对分裂、增殖快的细胞产生一定的杀伤作用, 对正常人体增殖较快的细胞、组织器官也会产生一定的毒性作用。肿瘤科护士在配制细胞毒药物及对患者进行护理过程中可能会通过呼吸道、消化道等多种途径进入体内产生职业暴露[1]。

本研究显示:静脉配制中心投入使用1年后防护组与暴露组相比, 白细胞、淋巴细胞及血小板均有不同程度的上升;脱发、皮疹、眼睑充血、皮肤瘙痒等不适症状发生率下降。提示细胞毒药物配制中心可能通过减少或阻断护士通过呼吸道、消化道、皮肤接触等途径对细胞毒药物的摄入, 从而起到对护士职业暴露所引起的骨髓抑制的防护作用。另外, 研究发现二组患者腹胀、咽喉痛症状差别虽然不具有统计学意义, 但两组发生率绝对值均超过15个百分点以上, 推迟这可能与本研究样本量相对较少有关。

目前我国多数医院, 配制细胞毒药物时护士不穿防护服, 不戴目镜, 多数只戴口罩、手套等现象比较突出[2]。而且肿瘤科护士对化疗药物的危害性认识不足, 自我防护意识薄弱[3]。本研究表明细胞毒药物配制中心的使用缓解肿瘤科护士骨髓抑制, 另外脱发、皮疹、眼睑充血、皮肤瘙痒等不适症状发生率也明显下降。本研究样本量较小, 仅研究了配制中心对护士骨髓抑制、脱发、皮疹等不适的影响, 对其肝肾功能、生育、机体免疫等还需要大样本深入研究。

总之, 本研究表明细胞毒药物配制中心对肿瘤科护士职业暴露所产生的骨髓抑制、脱发、皮疹、眼睑充血及皮肤瘙痒有一定的防护作用。鉴于基层医院肿瘤科实际情况, 建议尽早建立细胞毒药物配制中心。

摘要：目的 探讨细胞毒药物配制中心对护士职业暴露的防护作用。方法 观察细胞毒药物配制中心刚投入使用前及1年后, 护士外周血计数及脱发、腹胀、皮疹、咽喉痛、眼睑充血、皮肤瘙痒发生率。结果 细胞毒药物配制中心使用前后暴露组、防护组护士外周血分类计数、护士脱发、皮疹、眼睑充血、皮肤瘙痒发生率相比差异均具有统计学意义 (P<0.05) ;而腹胀、咽喉痛的发生率均无统计学意义 (P>0.05) 。结论 细胞毒药物配制中心对肿瘤科护士职业暴露所产生的骨髓抑制、脱发、皮疹、眼睑充血及皮肤瘙痒有一定的防护作用。

关键词：细胞毒药物,配制中心,职业暴露,防护

参考文献

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