细胞凋亡研究

细胞凋亡研究（精选十篇）

细胞凋亡研究 篇1

1 线粒体通路

又称内源性凋亡途径。线粒体控制细胞在有氧环境下的生活和死亡, 是细胞生成ATP的主要场所。近年来的研究表明, 线粒体也是细胞发生凋亡的主要调控场所并参与了大多数细胞凋亡的调控过程。内源性凋亡途径可由多种因素诱发, 如细胞脱离了原来的生长环境、失去了赖以生存的生长因子或激素的支持、或者由于DNA损伤等[2]。在线粒体内、外膜之间存在线粒体通透性转变孔 (MPTP) , 线粒体膜通透性转变的发生在细胞凋亡中起着举足轻重的作用。引起MPTP开放的因素分为细胞外源性损伤和细胞自身衰老两方面, 外源性损伤 (如Ca2+超载、氧化应激过度、p H值过高、线粒体膜电位下降、能量衰竭、药物诱导等) 可导致细胞坏死和凋亡, 而细胞自身老化主要导致细胞凋亡[3]。在生理情况下MPTP周期性开放, 使膜间隙的正离子或质子进入基质, 从而防止膜间隙正离子的过度蓄积。

在各种促细胞凋亡信号作用下, MPTP不可逆地过度开放, 线粒体跨膜电位崩解, 呼吸链解偶联, 线粒体基质渗透压升高, 内膜肿胀, 位于线粒体膜间隙的细胞色素C (Cytc) 等促凋亡活性蛋白释放至胞浆内, 在ATP/d ATP存在的情况下, Cytc与凋亡蛋白酶活化因子-1 (Apaf-1) 形成多聚复合体, 活化Caspase-9前体, 导致下游效应者Caspase-3活化, 切割底物使细胞凋亡。其中, 活性Caspase-3是级联反应中关键蛋白酶, 是多种凋亡途径的共同下游效应部分, 作用底物大多是细胞中功能蛋白质, 它们参与DNA修复、m RNA裂解、类固醇合成及细胞骨架重建等过程[4]。在该过程中, 线粒体膜电位下降是凋亡的早期表现, 一旦线粒体膜电位损耗, 细胞就会进入不可逆的凋亡过程。细胞凋亡是一个需要ATP提供能量的过程。研究表明, 线粒体的能量储备在其中起决定性的作用, 细胞内ATP水平耗竭在25%~70%时细胞将以凋亡的形式死亡, 而大于70%时将以坏死的形式死亡[5]。Bcl-2家族控制着线粒体外膜和内膜的通透性, 因此是线粒体凋亡途径的主要调控者, 它们通过激活一系列下游基因发挥调节凋亡作用[6]。Bcl-2家族分为3类:促凋亡蛋白 (如Bak和Bax) 、抗凋亡蛋白 (如Bcl-2和Bcl-x L) 以及Bim、Bid等BH3-only蛋白。BH3-only是一类促凋亡蛋白, 通过抑制Bcl-2抗凋亡成员的活性或激活Bax/Bak样促凋亡成员的活性来调节细胞凋亡。Bcl-2家族中, Bax是线粒体途径的主要介导者[7]。Bax经活化后, 从胞质转入线粒体, 线粒体膜通透性破坏, 致Cytc等释放而介导线粒体途径的细胞凋亡。

2 死亡受体通路

该途径为胞外信号所诱导的细胞凋亡途径, 因此也称外源性凋亡途径。哺乳动物细胞表面至少有8种死亡受体:Fas、TNFR1、TNFR2、DR3、DR4、DR5、Dc R1和Dc R2, 它们都属于肿瘤坏死因子α受体家族成员。在这些死亡受体中最典型的是Fas和TNFRs。

2.1 死亡因子受体 (Fas) /死亡因子Fas配体 (Fas L) 死亡通路

Fas又称APO-1 (即CD95分子) , 属于Ⅰ型膜蛋白。Fas主要以膜受体形式存在, 在细胞凋亡中具有信号转导作用。Fas L属于细胞表面的一种Ⅱ型膜蛋白。Fas L可与Fas结合, 导致Fas胞内的死亡区形成三聚体的活化形式, 随后募集FADD (Fas相关死亡结构域蛋白) , Fas L-Fas-FADD形成了死亡诱导信号复合物 (DISC) , DISC形成后引起胞质内前半胱胺酸天冬酶8 (Procaspase-8) 分子激活.而后激活的Procaspase-8相互连接, 进一步自我激活启动下游的Caspase相关蛋白酶级联反应, 最终导致细胞凋亡[8]。另一方面激活的Caspase-8也可将位于胞浆的Bid切割成截断的Bid (t Bid) , t Bid有很强的促凋亡活性, 再次作用于线粒体释放Cytc, 通过Caspase-9/3发挥促凋亡作用[9]。该通路中, DISC的形成是级联反应的关键步骤[9]。

2.2 TNFR死亡通路

TNF通过TNFR-I和TNFR-Ⅱ介导其生物学活性。TNFR-I包含具有转导细胞死亡信号所必需的一段高度同源性的氨基酸序列 (即DD) , TNFR-Ⅱ缺乏DD, 但这两个受体都可介导凋亡[10]。TNFRs不具有酶解活性, 但可募集其他分子转导信号。当与TNF结合后, TNFR-I三聚体化, 然后募集一个衔接蛋白TRADD (TNFR-associated death domain) 。TRADD可以引起两条信号转导通路的激活: (1) 通过招募FADD诱导细胞凋亡, FADD通过募集和活化Caspases激活凋亡通路; (2) 通过肿瘤坏死因子受体相关蛋白2 (TRAF-2) 和诱导转录因子 (RIP) 活化。TRAF-2和RIP活化NF-κB诱导激酶 (NIK) , NIK使NF-κB抑制蛋白发生磷酸化, 并促进NF-κB的降解和释放, 后者转位至核, 激活一系列基因表达[11], 导致细胞凋亡发生。

3 内质网通路

细胞凋亡除上述两种经典途径外, 还存在内质网通路, 是近些年才发现的一种新的凋亡途径。内质网广泛存在于真核细胞中, 参与蛋白质合成、折叠和寡聚化, 钙的储存、脂类代谢、类固醇代谢的合成等, 是细胞内重要的细胞器。内质网作为信号传导的枢纽平台, 在细胞凋亡过程发挥着重要作用。内质网通路即内质网应激 (ERS) 引起的细胞凋亡, ERS是指很多病理生理刺激, 如氧化应激、缺血缺氧、钙稳态紊乱及病毒感染等, 能够引起内质网腔内未折叠与错误折叠蛋白蓄积以及Ca2+平衡紊乱。ERS是机体对各种病理生理刺激的一种自身保护性防御机制, 这种作用既能修复早期或受损较轻的细胞, 又能清除过度损伤的细胞, 为维持机体的生理平衡和内环境稳态起到重要作用[12]。适度的ERS可通过促进内质网处理未折叠及错误折叠蛋白等降低损伤;而持久或严重的ERS则可引起细胞凋亡[13]。根据诱发原因不同, ERS可分为3种类型:未折叠蛋白反应 (UPR) 、内质网超负荷反应 (EOR) 和固醇调节级联反应。UPR是介导ERS的最重要的信号机制, 其主要是由一个ER分子伴侣葡萄糖调节蛋白/免疫球蛋白重链结合蛋白 (GRP78/BIP) 和3个ER应激感受蛋白, 即RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶 (PERK) 、激活转录因子 (ATF6) 和需肌醇酶-1 (IRE-1) 所介导的保护性应激反应[14]。目前, 已知内质网应激诱导细胞凋亡的途径有3条: (1) CHOP/GADD153基因的激活转录; (2) JNK的激活通路; (3) 内质网特有的半胱氨酸蛋白酶Caspase-12的激活通路[15]。

3.1 CHOP通路

CHOP通路是调节内质网应激诱导凋亡的主要通路。CHOP/GADD153 (生长停滞及DNA损伤基因, growth arrest and DNA-damage-inducible gene 153) 是内质网应激特异的一个转录因子, 在正常情况下, CHOP主要存在于细胞质中, 含量很低。而PERK、ATF6、IRE-1分别与分子伴侣GRP78/BIP结合, 处于无活性状态;在细胞处于应激状态下, IRE-1、PERK和ATF6的活化均对CHOP产生诱导, 促使CHOP的激活, 其表达显著增加, 过量表达的CHOP聚集在细胞核内, 促进细胞凋亡。目前的研究仅对CHOP的上游调节机制有了一定了解, 其下游的调节机制还不明确, 考虑可能与TRB3相关。TRB3是一个激酶类似蛋白, 属于Tribbles假性蛋白激酶家族一员, 它能够直接与丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶AKT结合, 抑制其活性。AKT是重要的抗凋亡信号分子, 因此CHOP可能是通过诱导TRB3的表达进而抑制AKT的活性, 促进细胞凋亡[16]。此外, CHOP诱导细胞凋亡还可能是通过调节Bcl-2蛋白家族的促凋亡和抗凋亡之间的平衡。CHOP可以上调促凋亡基因Bax/Bak, 可以抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达, 减弱其抗凋亡能力, 敏化内质网应激反应, 促进凋亡[17]。比如CHOP与c AMP反应元件结合蛋白 (CREB) 形成二聚体能抑制Bcl-2蛋白的表达, 促进线粒体对促凋亡因素的敏感性[18]。

3.2 JNK通路

JNK (c-Jun氨基末端激酶, c-Jun N-terminal kinase) 也被称为应激活化蛋白激酶, Xia等[19]在大鼠嗜铬细胞瘤PC-12细胞的培养过程中发现, 去除神经生长因子可以使PC-12细胞发生凋亡, 而PC-12细胞中的JNK和p38通路都是激活的, 从而在神经元中首次发现了JNK的促凋亡作用。目前认为JNK通路机制主要有两个[7]: (1) 通过转录依赖的方式调节下游凋亡相关靶基因的转录和凋亡蛋白的表达而介导死亡受体途径及线粒体途径的细胞凋亡。JNK被刺激因素激活后, 可从细胞质转移到细胞核中, 通过磷酸化激活c-jun、c-Fos等转录因子, 而调节下游凋亡相关靶基因的表达。如JNK入核激活转录因子后有诱导Fas L、TNF等配体蛋白的表达, 而启动死亡受体途径的细胞凋亡。 (2) 通过非转录依赖的方式直接调节胞质内靶蛋白的活性而介导线粒体途径的细胞凋亡, 譬如可上调BH3-only蛋白如Bim、Bid、DP5的表达, 活化Bax等促凋亡蛋白介导线粒体途径的细胞凋亡, 此过程不依赖新基因的表达。

3.3 Caspases通路

Caspase-12 (胱天蛋白酶-12) 是Caspase亚家族成员, Caspases-12产生于内质网, 并仅在内质网应激时被活化, 是介导内质网应激凋亡的关键分子。在正常生理情况下, Caspase-12与其他的Caspase一样以无活性的酶原形式存在, 在内质网应激损伤状态下, Caspase-12酶原特异激活, 并协同其他内质网应激分子激活Caspase-9酶原, 再通过Caspase-3途径导致细胞凋亡[20]。

研究表明, 这3种凋亡途径也并非完全独立, 在某些情况下它们存在相互联系。譬如内质网通路和线粒体通路之间, 促凋亡Bcl-2家族成员Bak和Bax可迅速清空内质网Ca2+, 使线粒体对Ca2+内流和Cytc释放敏感, 从而调节Cytc释放的动力学并调节凋亡[21]。另外线粒体途径与死亡受体途径也不能完全分开, 两者除了可在Caspase-3处会合并通过Caspase-3激活下游底物而呈现凋亡细胞的共同特点外, 另一个汇合点是Bcl-2基因产物。最近研究结果显示:Bcl-2可通过干扰死亡受体途径而抑制细胞凋亡, 并提出了一型细胞和二型细胞的概念。Bcl-2对死亡受体凋亡通路不起作用的细胞称为一型细胞, 反之则称为二型细胞。二型细胞可通过死亡受体途径激活的Caspase-8而酶切Bcl-2家族中Bid, 从而进入细胞凋亡的线粒体途径[22,23]。

4 展望

细胞凋亡研究 篇2

【摘要】细胞骨架是细胞重要的组成成分，维持着细胞正常形态和功能。凋亡时多种细胞骨架蛋白(如actin，myosin等)由于受凋亡因素作用，蛋白结构发生改变，进而引起凋亡细胞的形态改变。因而细胞骨架的改变在细胞凋亡发生过程中具有重要作用，提示可通过改变细胞骨架结构来诱导细胞凋亡，以达到治疗肿瘤及其他疾病的目的。【关键词】 细胞骨架

细胞凋亡

细胞骨架蛋白 0、引言

细胞骨架(cytoskeleton)是细胞内不同蛋白质纤维的聚合物和各种调控蛋白交错连接的网络结构，在维持真核细胞的形态、胞内运输、变形运动等方面发挥着重要的作用。细胞骨架主要有3个功能：细胞结构的空间组织作用；建立细胞内外环境中物理联系；协同细胞移动和改变细胞形态的作用。细胞骨架是动态结构，组成它的聚合物和调控蛋白处于连续不断地变化中，将细胞质蛋白和细胞器的活动整合为一个有机体。[1] 细胞凋亡是机体清除衰老、畸变或恶化细胞的一种主动、程序化的生理过程，是多细胞生物维系其结构稳定和内环境功能平衡及生长发育必须的最基本的生物学过程[2]

本文中就凋亡时细胞骨架蛋白的改变的研究进展作一综述。

1、细胞骨架的组成成分

细胞骨架聚合物控制着真核细胞的形态和动力学特征，包括3种主要形式：肌动蛋白丝(actin filament，AF)、微管(microtubule，MT)和中间丝(intermediate filament，IF)，三者被组装成网络结构来抵制细胞变形，但在响应外应力时能够重新组装，在维持细胞完整性方面发挥着重要功能。肌动蛋白丝和微管的聚合与解聚是细胞形态变化的直接因素，与此同时分子马达在细胞各种组分的装配过程中发挥重要功能。1.1微管

微管是由微管蛋白原丝组成的不分支的中空管状结构。直径约25 nm，是细胞骨架成分，与细胞支持和运动有关。纺锤体、真核细胞纤毛、中心粒等均系由微管组成的细胞器。微管有最复杂的聚合和解聚特征，在细胞内的压力下会弯曲，在分裂间期，许多细胞会集合放射状排列的微管以便利用其稳定性，这些微管担当起中心轮毅和细胞内运输功能。有丝分裂过程中，微管骨架会自发地重新排列形成纺锤体，把染色体排列在一条线上[3]。一条微管能在两种状态之问交换：延伸和收缩。其动力学不稳定性使得微管骨架能快速地重组[4] 1.2微丝

微丝(microfilaments，MF)是由肌动蛋自分子螺旋状聚合成的纤丝，又称肌动蛋白丝，是细胞骨架的主要成分之一。微丝对细胞贴附、铺展、运动、内吞、细胞分裂等许多细胞功能具有重要作用。它没有微管稳固，但绑定肌动蛋自丝的交联蛋自具有高度稳定性，装配形成的束状网络结构和树突状网络结构高度稳定。成束的微丝对伸出的丝状伪足起支持作用，丝状伪足使细胞具有趋化性以及参与细胞间的通讯，并能够产生像在吞噬过程中细胞形态的变化。肌动蛋白丝能响应细胞信号系统的作用发生连续的聚合和解聚。如吞噬细胞伸出的伪足是在细胞表面接受趋化性的受体传递下来的信号刺激后，在细胞活跃的边缘带聚合成的。成纤维细胞的收缩作用是在肌动蛋白束的装配过程中，细胞表面的跨膜蛋白与配体结合时触发的。当肌动蛋白纤维和一些解聚因子(比如切割蛋白家族成员)或与一些聚合因子相互作用时，会发生更加复杂的动力学变化[2] 1.3中间丝

中间丝是存在于真核细胞中介于微丝和微管之间，直径约10 nm的纤丝，是最稳定的细胞骨架成分，主要起支撑作用，因组成的蛋白质不同而有不同的命名。它们抵制拉力的能力比抵制压力要强的多，它们能被交联蛋白彼此或与肌动蛋白丝和微管交联在一起，通过和微管或肌动蛋白丝相互作用来形成细胞外应力响应结构，如上皮细胞中的中间丝组装成一个致密的网络抵御外力作用。近年来的研究表明，由核纤层蛋白聚合而成的中间丝，能维持真核细胞胞核结构的完整；核纤层蛋白被细胞周期蛋自依赖的激酶磷酸化从而促进有丝分裂开始时核膜的溶解 [5-6]。不同于微管及肌动蛋白丝，中间丝无极性，不能支持分子马达有方向性的运动。

2、凋亡时细胞骨架蛋白的改变 2.1.细胞凋亡的形态学改变

在细胞发生凋亡的过程中，其形态结构可发生一系列改变，如细胞与周围细胞群脱离，表面原有的微绒毛、细胞间连接消失，核糖体逐渐从粗面内质网上脱离，内质网囊腔扩胀，染色质固缩，核膜孔扩大及细胞出芽，凋亡小体形成。有研究显示，这些形态学改变与细胞骨架的变化关系密切[7]。

2.2 Caspase酶对细胞骨架的作用

细胞凋亡是受细胞内源性基因、酶类和多种信号转导途径控制,激活后呈一个“瀑布式”的信号转导过程。各种凋亡刺激信号如病毒感染、生长因子缺乏、Fas/Apo-1配体、TNF-Ⅱ/TNF-ⅡR等,启动凋亡的发生,由p53、Caspases、Fas相关死亡结构域蛋白(fas-associ-ated death-domain, FADD)及TNF-ⅡR相关死亡结构域蛋白(TNF-Ⅱrassociated death-domain,TRADD)等介导凋亡信号转导,由Bcl-2蛋白家族、细胞色素C及Caspases蛋白酶3个效应器所参与的调控、执行阶段,最后导致内源性核酸激酶激活,核细胞骨架重新组合,细胞骨架结构降解。

Caspase对细胞骨架的影响是通过裂解具有细胞骨架调节功能的蛋白质,如成簇黏附激酶(focaladhesion kinase, FAK), p21活性激酶(p21-activatedkinase,PAK2)等,达到间接地重组细胞骨架结构的作用,由此影响到细胞骨架蛋白发生结构及形态上的变化,导致细胞骨架结构破坏。研究显示,Caspase-3活化后,可使细胞肌动蛋白(actin)、层黏连蛋白(laminin,LN)、胞衬蛋白(fodrin)等多种作为细胞骨架的底物蛋白发生裂解,导致细胞从所黏附的基质或周围细胞群中脱离,同时细胞形态出现染色质浓缩、边集、细胞膜皱缩、凋亡小体形成等凋亡特征性改变。Kothakota等发现,由Fas和肿瘤坏死因子α(TNF-α)介导的人中性粒细胞凋亡过程中,Caspase-3激活后对其底物多聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)的裂解作用晚于对丝的作用,凝溶胶蛋白(gelsolin)蛋白裂解后产生一个352个氨基酸的NH2-末端。该末端可在细胞内以Ca2+非依赖方式对肌纤蛋白细胞骨架产生快速解聚会诱导细胞变圆,从其所黏附平板上脱落,并出现核碎裂等现象。其他研究也显示,表达该末端片段的腺病毒载体可导致黑色素瘤细胞A7、M2和NIH3T3多种细胞的快速死亡。因此,裂解的凝溶胶蛋白可能是细胞凋亡过程中形态变化的重要因素。

近年来,用砷剂(常用As2O3)治疗白血病和某些肿瘤,取得良好的临床效果。其机制就是影响bcl-2蛋白家族表达,通过Fas/FasL依赖的途径激活Caspase-8。研究显示,As2O3能阻滞细胞的增殖,促进细胞凋亡,用As2O3诱导后细胞内Ezrin(一种能与细胞骨架发生相互作用的关键蛋白)、肌动蛋白和细胞骨架均减少,细胞形态发生改变,从而产生凋亡。[2] 2.3 细胞骨架蛋白的改变

2.3.1微丝和肌动蛋白(actin)的改变

F-actin的解聚是凋亡过程中所必须的，其解聚出现在凋亡小体形成之前。actin是Caspases蛋白水解酶的作用底物，当Caspases攻击actin时，可将其切断降解为15kD和31kD两个片段，使之不能重新聚合，并由于15kD片段的形成而引起细胞凋亡形态的改变。Caspases除了可直接切断actin外，还可通过切断微丝系统中的调节蛋白来引起actin的变化。β-catenin是细胞间粘附调节蛋白，凋亡时被Caspase-3切断，去除了其N-末端和C-末端区的蛋白，而残余蛋白产物不能与α-catenin结合，影响actin组建，从而破坏了相邻细胞间actin微丝连接结构。胆固醇氧化物也可干扰actin的重组，表现为F-actin的解聚，应力纤维消失，微丝完全靠近细胞边缘并成块状等凋亡形态。微丝网络的重组也是凋亡小体形成中所必须，在凋亡小体中可见完好的微丝网络。用微丝干扰因子可以阻断凋亡小体的形成。2.3.2 肌球蛋白(myosin)的改变

细胞皱缩和细胞膜发泡是凋亡的重要形态改变。这一形态改变受肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)磷酸化调节。当MLC磷酸化增加时，膜发泡增加。MLC激酶抑制可阻断MLC磷酸化，同时MLC磷酸化受Rho信号途径调节。actin也参与了膜发泡，actin皮质环中的myosin II可使actin环产生向心力，内陷而引起actin和质膜连接较弱处形成突起发泡，因此当actin受破坏时，膜发泡也受到抑制。Lechler等在研究酵母I型myosins功能时，发现myosins直接参与actin聚合过程。actin的聚合依赖myosin动力区的磷酸化，此过程受cdc42调节。myosin I联系质膜与actin微丝，它的运动可使质膜突起并使微丝延长。2.3.3 凝胶素(gelsolin)的改变

gelsolin是凋亡的调节蛋白和效应蛋白。Gelsolin是Caspase-3的底物，在Fas刺激下，Caspase-3可切断gelsolin，形成39kD的N-末端和41kD的C-末端两个片段，其中N-末端片段产物作用于actin丝，引起actin解聚、细胞变圆，粘附力丧失，进而核碎裂等凋亡改变。2.3.4 Gas 2的改变

Gas 2(growth-arrest-specific 2peptide)是gas基因表达的蛋白产物，是微丝系统的组成成分是微丝相关蛋白，也是Caspases的死亡底物。凋亡时，Caspase-3特异地切断Gas 2的C端区，引起微丝的重排，继而细胞发生明显凋亡改变。2.3.5 Fodrin的改变

α-fodrin是膜相关骨架蛋白，在Fas和TNF引起的凋亡中被快速而特异地切断。Fodrin的被切是由Caspases介导的，实验证实α-fodrin的切割必须有Caspase-3参加。细胞色素C可引起Caspase-3活化，进而Caspase-3切断fodrin引起凋亡。Fodrin的切断可能与膜发泡有关。Fodrin蛋白在actin微丝的末端交叉连接，将其连在质膜上，被Caspases降解后，影响actin结构致质膜发泡。2.3.6 PAK2的改变

PAKs(p21-activated kinases)是一类丝氨酸-苏氨酸激酶，其活性受小GTP酶如Rac，cdc42等调节。PAKs分子量为62kD，Jarkat T细胞凋亡时由Caspase-3介导的PAK2蛋白水解。将PAK2切成34kD的C端区片段，该片段的活性作用引起凋亡细胞形态和膜的改变。2.3.7 微管和微管蛋白(tubulin)的改变

许多破坏微管的药物如Dolastatin，可直接引起Bcl-2磷酸化而导致Bcl-2失活，并攻击微管，抑制微管和tubu-lin的装配，抑制有丝分裂的纺锤体形成而引起细胞凋亡。也有些药物可活化一些酶类使bcl-2磷酸化如Taxol可活化CAMP依赖的蛋白激酶(PKA)引起细胞bcl-2磷酸化和凋亡。Taxol也可引起Caspase3的活化，启动凋亡。AS2O3的作用也日益引起重视。AS2O3有微管蛋白增强剂和微管蛋白抑制剂两种特征，在体外实验中，AS2O3能显著抑制GTP引起的聚合作用，并攻击微管蛋白，影响微管形成。资料显示，AS2O3连结tubulin的2个半胱氨酸残基，阻断GTP结合位点，干扰有丝分裂中微管的正常动力学。2.3.8 细胞角蛋白(cytokeratin)和波形蛋白(vimentin)的改变

凋亡早期，中间丝的主要蛋白cytokeratin和vimentin发生解聚和蛋白水解而断裂，其蛋白水解也是由Caspases介导的，中间丝由原来的长丝状解聚成短粗的聚集物，同时伴随膜磷脂酰丝氨酸(PS)的暴露和染色质凝集。胆固醇氧化也可引起vimentin的重排，vimentin丝在细胞边缘形成块状聚集物或在核与胞浆外周之间形成环状网架，这时vimentin丝与核的紧密关系完全或部分消失。[8]

3、细胞骨架改变诱导细胞凋亡 3.1 肌动蛋白可能是凋亡早期的调控物之一

肌球蛋白是构成细胞骨架的主要成分，其表达水平的变化与细胞形态变化密切相关。有研究表明，细胞凋亡时，肌动蛋白细丝发生断裂，肌动蛋白网络结构遭到破坏。这是细胞凋亡时形态改变的一个典型特征。那么，通过改变这一典型特征是否就能导致细胞凋亡呢?对此，White等作了深入的研究。他们用细胞松弛剂D抑制气管1HAEo细胞和主支气管上皮细胞肌动蛋白的延伸，或通过Jasp-akinol-ide促进肌动蛋白的聚集，发现改变肌动蛋白的整体性会导致细胞在5 h内出现典型的凋亡形态学改变。细胞松弛剂D会阻碍黏附蛋白的表达，尽管纤维黏连蛋白受体是聚合在一起的，其诱导的细胞凋亡与前述的Caspase-8裂解有关，而Jasplakinolide诱导的细胞凋亡并不破坏细胞的黏连蛋白，与前Caspase-8裂解无关。它们都不受Caspase家族抑制物z-VAD-fmk和Ac-DEVD-cho的抑制，但受死亡受体Fas(CD95)抑制物的抑制，诱导的凋亡与细胞内复杂信号紊乱有关。有研究显示，尽管两种方法诱导的细胞凋亡机制有所不同，但都引起了细胞肌动蛋白网络结构的改变，提示肌动蛋白可能是细胞凋亡早期的调控物之一。用酵母菌所做的实验研究表明，肌动蛋白与细胞凋亡关系密切，破坏肌动蛋白的药物能导致线粒体膜的去极化，诱导酵母菌的衰老。临床上也应用肌动蛋白稳定剂的药物来防止细胞凋亡和预防器官老化。

3.2 任何能使微管结构或功能改变的物质都能导致细胞凋亡

微管与其他细胞器的关系密切，临床常用的一些抗肿瘤药物尽管机制不同，却均可引起微管结构的损伤，导致细胞发生凋亡。它们大致可分为两类：一类是阻滞微管结构聚合，从而抑制肿瘤细胞的增殖。如长春新碱能影响细胞中纺锤体的形成，通过阻滞微管蛋白的聚合，使有丝分裂停止在中期，同时对细胞增殖周期的M期有延滞或阻滞作用。秋水仙碱能与粒细胞的微管蛋白结合，妨碍粒细胞的活动，抑制粒细胞浸润，抑制细胞有丝分裂和结缔组织细胞外基质的合成和分泌，其结构中的C环与微管蛋白结合，阻止其聚合成纺锤体，使细胞分裂停止与中期。另一类是促进微管聚合，并与微管结合，抑制其解聚的抗癌药。其代表药是紫杉醇(Paclitaxel)，它能特异地结合到微管的β位上，导致微管聚合成团块状或束条状，抑制微管网的解聚，而对正常的细胞基本无影响。因此，紫杉醇是第一种作用独特的微管稳定型抗癌药，它可明显减少G1期细胞群，增加G2期和M期细胞数，其作用具有时间和浓度依赖性。临床应用发现，紫杉醇对卵巢癌、乳腺癌、肺癌及恶性黑色素瘤有独特的疗效，倍受临床关注。[9] 3.3 细胞骨架结构与功能相关的蛋白

细胞膜骨架和肌动蛋白骨架的改变在细胞表面的形态改变中起关键作用。细胞骨架蛋白是Caspase和钙结合蛋白酶(Calpain)家族的作用底物，它的破坏对细胞骨架的影响很大，易导致细胞凋亡。肌动蛋白细胞骨架的解体是骨架蛋白经Caspase和Calpain家族蛋白水解作用后的结果。

PIN又称动力蛋白轻链(dyein light chain，DLC)，是动力蛋白复合物和肌球蛋白V的组分，广泛分布于生物体内，藻类的鞭毛，动物成年个体的各组织和整个胚胎均可表达，定位于细胞质和细胞核。PIN作为动力蛋白和肌球蛋白V的组分，参与微管和肌动蛋白为基础的分子驱动器作用，与两种运动蛋白的导向和调节作用有关。动力蛋白是多亚基ATP酶，由多个重、中、轻链组成的分子运动原，作用于细胞鞭毛。实验表明，PIN部分失去功能的果蝇，应起刚毛、翅膀发育等严重的多效性形态缺陷和雌性不育，当功能全部丧失，则引起大量的凋亡和胚胎死亡。胚胎期PIN的缺失导致细胞骨架排列紊乱，说明PIN活性对改变和维持细胞骨架结构和空间分布起到一定作用。PIN的表达可影响细胞发育和分化，与抑制细胞凋亡有关。动力蛋白通过动力激活蛋白连接肌动蛋白相关的细胞骨架，说明PIN可通过肌动蛋白细胞骨架调节细胞反应。

3.4死亡相关蛋白激酶信号通路将细胞骨架和细胞凋亡联系起来 死亡相关蛋白激酶(death-associ-ated protein kinase，DAPK)是受钙调蛋白控制的丝氨酸/苏氨酸激酶。它由多个结构组成，包括1个典型的激酶结构域、1个钙调蛋白连接区、8个锚蛋白的重复序列、1个细胞骨架连接区和1个死亡区。这个前凋亡激酶的作用与肿瘤抑制基因相似，能诱导细胞凋亡。肌浆球蛋白Ⅱ轻链是DAPK在体内作用的第一个底物，通过部分磷酸化作用，DAPK作为有效的肌动蛋白细胞骨架的控制物，能导致细丝和结合点错误连接。另外，DAPK能通过内外机制使整合素活性降低，诱导细胞凋亡。有一些蛋白可通过细胞与细胞之间的相互作用以控制DAPK，如激酶、磷酸酶、编码蛋白等。因此，这些也对细胞骨架和凋亡有一定影响[10-11]。

4、展望及存在问题

综上所述，细胞骨架与细胞凋亡密切相关。利用这一点，我们可通过改变细胞骨架诱导细胞凋亡，提高对抗肿瘤药物的敏感性，达到治疗肿瘤的目的。另一方面也可通过纠正细胞骨架的异常改变，阻滞细胞凋亡，治疗机体组织细胞过度凋亡所致的疾病，延缓衰老。

怎样才能使特定的细胞或细胞群骨架发生改变，怎样才能使发生特定改变的细胞骨架恢复正常，或通过细胞骨架对细胞凋亡进行精确的调控，很值得进行深入的研究。

【参考文献】

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中药抑制细胞凋亡的研究进展 篇3

关键词：凋亡；中药；综述

中图分类号：R2－03文献标识码：A

文章编号：1007－2349(2007)11－0046－03

细胞凋亡(apoptosis)是一种细胞生理性死亡的形式，是多细胞有机体为保持身体组织稳定、调控自身细胞增殖和死亡之间的平衡、由基因控制的细胞自动性死亡过程，在机体的生长发育、衰老、免疫调节、内环境稳定以及肿瘤、感染、自身免疫性疾病等生理病理过程中均有重要意义。机体通过凋亡过程来清除体内不需要或有害细胞，或通过抗凋亡过程维持细胞功能。抑制凋亡在维护生命个体的稳定、抗衰老等过程中有很重要的作用。近年来有关中药抑制细胞凋亡的研究日渐增多，研究涉及缺氧、缺血等因素导致的神经系统、心脑血管、胃肠功能损伤的保护、肿瘤治疗(放、化疗)后骨髓、免疫功能损伤的防治等方面。中医药可对细胞凋亡过程的不同环节进行调节，进而抑制细胞凋亡，维持机体内平衡，阻止组织病理过程的恶化。

1 通过调控细胞凋亡途径抑制凋亡

机体内存在多条细胞凋亡的信号转导途径，其中内源性的线粒体细胞色素C途径和外源性的死亡受体途径所介导细胞凋亡是目前研究较多的途径。

1．1 通过调控线粒体细胞色素C途径抑制凋亡 许多研究结果均表明，线粒体在细胞凋亡过程中起着“主开关”作用，是最重要的途径之一，其通过Cyt－C途径诱导细胞凋亡。在细胞凋亡信号的刺激下，会使caspases激活，胞质Ca²⁺水平升高，产生ceramide，诸如此类的改变会直接或间接地引发线粒体通透性转变孔道(PTP)开放，使能量产生中断，线粒体内膜跨膜电位(△ψm)的下降，并导致外膜破裂，释放出Cyt－C等各种活性蛋白，Cyt－C从线粒体内释放是关键的一步。胞浆内的Cyt－C在dA7P存在下，与凋亡蛋白酶活化因子－1(Apaf－1)结合，诱导caspase－9前体的寡聚化，并形成凋亡体。凋亡体的形成可激活caspase－9，继而活化Caspase－3，启动Caspase的级联反应，引起细胞凋亡。

有研究以缺氧／缺糖再给氧为模型，观察清开灵注射液对神经细胞线粒体膜电位的保护作用。结果发现清开灵注射液能显著降低细胞内Ca²⁺浓度，抑制细胞凋亡，提高线粒体膜电位和活性，认为清开灵注射液可抑制缺氧一缺糖再给氧损伤所致的线粒体膜电位的降低、抑制神经细胞内钙超载与抑制细胞凋亡有关。

1．2 通过调控死亡受体途径抑制凋亡 凋亡还可以通过死亡受体通路介导，现知死亡受体途径主要包括Fas／FasL途径和TNFa／TNFR途径。死亡受体家族成员包括7NFRl、TNFR2、Fas／CD95、TRAlL－Rs等，当死亡受体与其相应的配基(死亡配体)特异性结合后，将凋亡信号由胞外传人胞内，在连接分子的媒介下，激活Caspase，导致细胞凋亡。

1．2．1 通过调控Fas／FasL途径抑制凋亡 中药可以通过调控Fas／FasL的表达，抑制受损细胞的凋亡。参附注射液对培养的乳鼠心肌细胞缺氧及缺氧／复氧时凋亡相关基因Fas／FasL蛋白表达影响研究发现，结果缺氧4.5h及10.5h后，心肌细胞Fas／FasL蛋白的阳性表达指数(positive expressionindex，PEI)参附注射液组明显低于缺氧组；参附注射液可通过下调Fas／FasL蛋白表达，参附注射液组还见到caspase-3活性下降，提示参附注射液抑制乳鼠心肌细胞凋亡是通过Fas／FasL-caspase-3途径实现的。

1．2．2 通过调控TNFa／TNFR途径抑制凋亡 研究还发现中药通过调控7NFa／TNFR途径抑制细胞凋亡。枸杞多糖对老年大鼠T细胞过度凋亡及相关基因表达研究发现，枸杞多糖可以下调促凋亡的TNFRl基因mRNA表达并上调抗凋亡的Bcl-2基因mRNA表达，降低老年大鼠T细胞的过度凋亡，从而改善老年大鼠T细胞过度凋亡的状态。

2 通过影响凋亡信号传导抑制凋亡

细胞抗凋亡的信号转导是在内外生存因子的刺激下，激活多种信号偶联途径的信号转导过程。常见的凋亡信号传导途径有磷脂酰肌醇－3－激酶(P13K)／蛋白激酶B(PKB或称为AKT)途径，RAS－MAPK途径，NF－κB途径，N()途径等。

2．1 P13K／PKB途径 P13K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，PKB是P13K的靶蛋白之一，P13K与PKB是促进凋亡作用的重要调节因子；其过量表达可抑制细胞的凋亡。黄芪多糖(APS)对2型糖尿病大鼠肾组织胰岛素信号分子表达的研究发现，认为黄芪多糖降低2型糖尿病大鼠血糖水平的机制可能与提高糖尿病大鼠肾组织中胰岛素受体(InsR)、胰岛素受体底物－1(IRS－1)、P13K水平，增加组织对胰岛素的敏感性，改善胰岛素信号转导有关。

2．2 RAS－MAPK途径 丝裂原活化蛋白激酶家族(MAPKS)参与细胞凋亡的信号转导过程。MAPKS级联反应包括MAPKKK，MAPKK与MAPK等3个顺序的活化过程。每一种激酶又由不同成分组成。MAPK包括ERK，jNK／SAPK，P38。有研究探讨肝星状细胞丝裂原活化蛋白激酶(HSCs MAPK)通路中ERK、JNK的活化情况，以及丹参药物血清对磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶(P－ERK)、磷酸化氨基末端蛋白激酶(P－JNK)表达，肝纤维化大鼠经丹参药物血清干预后较对照组均显著降低，正常大鼠经丹参药物血清干预后较正常大鼠对照组也均显著减少。表明活化的HSCs中ERK、JNK保持着较高的磷酸化水平，两者介导的信号转导通路是HSCs活化和增殖的重要途径之一；阻断MAPK信号通路可能是丹参治疗肝纤维化的重要作用途径之一。

2．3 NF－κB途径 在大多数细胞类型中，NF－κB在胞浆中与抑制亚单位lκB结合形成无活性的复合物。在TNF诱导的细胞凋亡过程中，可刺激lκB的磷酸化作用及降解作用。使NF－κB能从复合物中释放并活化，活化的NF-κB迅速转位进入胞核，继而作用于靶基因，诱导基因表达，编码前炎性蛋白，如IFN，细胞因子，生长因子，细胞黏附因子，红细胞生成素与MHC－I类分子等，抑制NOS的生成，并诱导编码凋亡抑制蛋白C－IAPl，C－IAP2基因表达，诱导抗凋亡基因Bcl－2，Bcl－x1的表达。探讨人参皂甙对心血管疾病的保健和防治机制的研究发现，结果显示内毒素脂多糖(LPS)促使HUVEC NF－κB向细胞核内转移，人参皂甙则能阻止

LPS诱导的NF－κB核内转移；能完全阻止LPS致内皮细胞核提取物NF－κB DNA结合活性；IJs能使HUVl3C PAl－1蛋白及mRNA表达显著增强，人参皂甙则使LPS的这种作用明显减弱。认为人参皂甙对心血管疾病的防治机制之一可能是通过NF－κB途径拮抗LPS致HUVEC PAI－1的表达。

2．4 NO途径 NO对细胞的增殖与存活有双重效应。它可以通过多种机制诱导细胞的凋亡，但在一些特定环境中，NO又可在一些细胞类型中作为凋亡的潜在抑制剂。川芎嗪对多巴胺诱导PCI2细胞凋亡的保护作用的研究发现，认为川芎嗪可抑制DA引起的PCI2细胞凋亡，此作用可能与降低NO生成有关。NO的抗凋亡作用还与caspase水平有关。在死亡配体依赖与配体非依赖的凋亡中，NO均能抑制caspase的活性。黄芪、当归注射液可通过促进NO的生成、诱导caspase3表达促进体外培养的血管平滑肌细胞凋亡。同时还可通过上调bcl－2表达而抑制其阻止氧自由基破坏细胞结构，起抗细胞凋亡作用，通过抑制粘着斑激酶的表达，调节其对细胞增殖和凋亡的影响。已发现，NO在某些细胞类型的线粒体中起抗凋亡作用。如在鼠肝线粒体中，生理浓度的NO能可逆性的抑制PTP的开放，机制是通过膜的去极化与Ca²⁺的积聚作用。

2．5 其他 胞浆中游离的Ca²⁺作为第二信使在凋亡信号传递过程中起关键作用；细胞核内钙离子浓度的持续升高是导致细胞凋亡的主要原因。细胞凋亡时最显著的变化是DNA的断裂，钙离子可直接激活核酸内切酶促进DNA断裂，也可通过激活蛋白酶、磷酸酶和磷脂酶，导致染色质结构完整性的丧失。葛根素及由红参和麦冬有效成分制成的参麦注射液对脑缺血／再灌注中神经细胞均有一定的抑制作用。作用机制可能是阻断Ca²⁺内流和／或胞内钙库的释放。从抑制神经细胞内钙超载。

目前发现在某些细胞中，cAMP是引起细胞凋亡的信号。细胞内cAMP浓度的上升可激活cAMP依赖性蛋白激酶，使靶细胞上某些丝氨酸和苏氨酸磷酸化，从而影响这些蛋白的生物学功能，引起细胞凋亡。黄精多糖对正常小鼠血糖水平无明显影响；但可显著降低肾上腺素诱发的高血糖小鼠的血糖值；其机制可能是降低肾上腺素模型小鼠肝脏中cAMP的含量，通过抑制凋亡减轻高血糖肝脏的损害。

3 通过调控凋亡相关基因表达抑制凋亡

Bcl－2基因家族是最重要的细胞凋亡调控基因。抗凋亡基因bcl－2和bcl－xL是Bcl－2家族蛋白成员中主要的抗凋亡分子。bax基因是Bcl－2家族中重要的促凋亡基因。另外，p53、c－myc、Fas、c－fos等基因均是参与调控细胞凋亡的重要基因。有研究用黄芪注射液进行治疗贫血小鼠，提示黄芪注射液可通过上调抗凋亡蛋白Bcl－XL表达减轻骨髓有核细胞的凋亡，并促进红系、巨核系造血。丹参对持续性非卧床式腹膜透析(CAPD)相关性腹膜硬化模型大鼠腹膜间皮细胞凋亡有抑制作用，其机理是下调Fas基因的蛋白表达，上调Bcl－2基因的蛋白表达。c－los是一种转录调节因子，正常情况下在脑内水平极低。c－fos不适当的过度表达可干预细胞核的修复功能，导致细胞凋亡。有实验表明。c－fos可能诱导脑缺血一再灌流时海马CAl区细胞晚期促凋亡基因的表达，共同调控细胞凋亡，而中药有效成分葛根素可通过下调凋亡相关基因c－fos的表达，减少神经细胞的凋亡，从而具有保护神经的作用。

4 通过调控细胞因子抑制凋亡

细胞因子(cytokine，CK)是机体细胞分泌调节细胞增殖、分化与死亡的一大类因子。与凋亡有关的细胞因子有氧自由基、氧化低密度脂蛋白(OX2LDL)及某些细胞因子等。清热解毒方泻心汤可显著降低实验性AS大鼠血清MAD水平，增强SOD活性，降低OX2LDL及N()水平等，从而抑制血管细胞过度凋亡。细胞因子如TNF(Tumomecrotiefactor)具有多种生物学功能，TNF在体外可诱导肿瘤细胞、树突状细胞及大鼠肝细胞出现凋亡，其中TNF-α与凋亡的关系更为密切，能与TNF受体结合，引起细胞内贮存Ca释放，引起细胞内游离Ca²⁺浓度升高，从而激活Ca²⁺依赖性核酸内切酶，引起DNA片段断裂和细胞凋亡。此外，与凋亡有关的细胞因子还有IL-2、IFN-γ、TGFβ1，NK细胞、IL-3、IL-4、IL-6、LAF-1(白细胞黏附因子)、CAM-1(细胞内黏附分子)、GM-CSF(粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子)、NGF(神经生长因子)、SCF(干细胞因子)、IGF-1(胰岛素样生长因子)、核转录因子xu等。黄芪对脂多糖(LPS)致大鼠急性肺损伤(AIJ)后大鼠肺组织细胞有保护作用，其机制是减少促炎因子TNF-α、IL-1β的释放，抑制肺泡上皮细胞凋亡。地黄饮子对阿尔茨海默病动物模型细胞凋亡抑制的机制，与上调核转录因子κB、hsp70mRNA的表达，抑制线粒体释放细胞色素C，控制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的激活有关。

5 结语

细胞凋亡作用机制的研究进展 篇4

1 细胞凋亡的线粒体依赖性途径和死亡受体途径

1.1 细胞凋亡的线粒体途径

长期以来, 人们一直将细胞线粒体视作为提供能量的细胞器, 而忽略其在细胞凋亡中的作用。随着细胞凋亡研究的深入, 发现某些与凋亡相关的基因产物 (蛋白质或酶) 均可定位于细胞线粒体, 从而使线粒体与细胞凋亡之间相关性的研究成为当今生命科学研究的前沿课题。

传统的细胞超微结构分析认为, 凋亡细胞线粒体的形态可维持不变直至到细胞降解的最后阶段, 但近年的实验研究提示, 线粒体在细胞凋亡乃至细胞死亡的过程中均发挥着关键性的作用。线粒体跨膜电位崩解是细胞凋亡特异性早期指标之一, 这是由于PT孔 (Permeabilitytransitionpore, PT) 开放引起线粒体通透性转换 (Permeabilitytransition, PT) 的直接后果。PT孔是跨越线粒体外膜和内膜的通道, 其主要是由位于线粒体内膜的腺核苷酸转位子和位于线体外膜的电压依赖性离子通道所组成[2,4]。目前PT孔开放的机制尚不清楚, 但许多研究表明, PT孔的开放可引起一系列与细胞凋亡相关的事件发生, 如在线粒体跨膜电位崩解时, 线粒体可释放一种50k D的蛋白质[3], 并以此蛋白直接诱导细胞核凋亡而不需要任何辅助因子的参与, 这种蛋白被命名为凋亡诱导因子 (Apoptosinducingfactor, AIF) 。从线粒体中释放的另一种蛋白Smac/DIABLO可通过结合抑制凋亡蛋白 (IAPs Inhibitorofapoptosisproteins) 而发挥促细胞凋亡作用[5]。值得提出的是线粒体释放蛋白中还包括细胞色素C (Cytrochome C, cyt2c) , 其一旦进入细胞浆可在ATP或d ATP的协同作用下与凋亡蛋白酶活化因子1 (Apoptoticprotease2activatingfactor21, Apaf21) 结合以使其分子结构改变来激活Casepase29, 进而活化的Caspase29又可激活其下游Casepase23等酶系以导致细胞凋亡[6,7,8]。Cyt2c参与了Caspase23活化的正反馈调节途径, 即cyt2c的释放同样可促进Caspase2的活化。然而, 某些细胞内cyt2c的释放事件可能早于线粒体跨膜电位崩解, 故表明线粒体所释放的cyt2c还可能依赖于非PT孔开放的其它途径[9]。

最近研究发现某些凋亡因子也可通过破坏的线粒体外膜直接进入细胞浆, 目前对于这一过程发生的机理尚不清楚, 但当细胞凋亡时VDAC的关闭能使线粒体ATP和ADP交换发生障碍[10]。当线粒体内膜高极化时质子大量转运至线粒体膜间隙导致膜间隙渗透压增高, 使胞浆中大量水份渗入致使膜间隙压力增大, 水分冲破表面积较小的外膜而导致膜间隙中的大量凋亡诱导因子重新分布于细胞质以造成细胞凋亡[11]。

1.2 细胞凋亡的死亡受体途径

除了细胞凋亡的线粒体途径外, 细胞内还存在另一种可引起细胞凋亡的死亡受体途径。死亡受体属于肿瘤坏死因子受体基因超家族成员, 可传导由特定的死亡配体引起的凋亡信号, 目前发现至少有5种死亡受体在细胞凋亡信号传导中发挥作用[12]。其中最典型的死亡受体有CD95 (称Fas或Apo1) 和TNFR1 (称p55或CD120a) 。一旦细胞受到某些凋亡信号的刺激, Fas (CD95) 通过与其特异性配体Fas L (CD95L) 结合而在细胞膜表面发生聚合, 形成的复合物通过FADD与Caspase28特异的结构域结合并使Caspase28形成二聚体而自身激活, 进而引起细胞的Caspases酶系级联反应以导致细胞凋亡[13]。

实际上, 细胞凋亡的线粒体途径与死亡受体途径并不能完全分开, 两者可在Caspase23处会合并通过Caspase23激活下游底物而呈现凋亡细胞的共同特点, 但两条途径的另一个会合点是bcl22s基因产物[14]。早期人们认为bcl22和bcl2x L等bcl22s基因家族成员对死亡受体途径不起作用, 但最近研究结果显示bcl22可通过干扰死亡受体途径而抑制细胞凋亡并提出一型细胞和二型细胞的概念。bcl22对死亡受体凋亡通路不起作用的细胞称为一型细胞, 反之则称为二型细胞, 二型细胞可通过死亡受体途径激活的Caspase28而酶切bcl22家族中Bid, 从而进入与细胞凋亡的线粒体依赖性途径[15,16]。另外, 一型细胞和二型细胞可通过特异性基因的表达发生细胞类型间的转换, 如细胞表达XIAP可使一型细胞向二型细胞转化, 而胞浆中Smac/DIABLO的表达可引起二型细胞向一型细胞转化, 因此细胞凋亡的两条通路存在着互相联系及互相转化[17]。

2 酶学机制

2.1 Caspases蛋白酶

胱冬蛋白酶 (Caspases) 是近几年研究的热点之一, 属于ICE/CED3蛋白酶家族成员, 目前发现至少有14种之多, 分别命名为Caspases1-caspases14[18]。与细胞凋亡密切相关, 它是通过级联反应, 最终激活核酸内切酶来实现的。也有人认为凋亡并不总是引起Caspases的释放, 而Caspases的释放也并不总是引起凋亡, 很可能还与细胞的迁移和分化有关[19]。蛋白酶前体可在天冬氨酸位点上被切断成3部分, H2N-端是抑制区域被移去, 另一端COOH-端断裂成一大一小亚单位称为死亡区域, 二大二小亚单位结合成活化酶, 可以作用于下游效应Caspases这种级联反应 (Spases Cascade) [20]的进行有赖于Caspases的调节蛋白、辅助因子、反馈关系和阈限等控制。当凋亡外界信号只作用于Caspases前体 (Procaspases) , 前体可活化蛋白酶激发因子 (Initiator of Caspases) , 激发因子可以活化蛋白酶效应因子, 然后作用于底物蛋白[21], 其作用包括以下3个方面: (1) 凋亡信号传导级联反应过程的一个关键环节; (2) 可直接破坏细胞结构, 如核层蛋白 (Laminine) 和凝胶蛋白 (Gelsolin) 等, 使蛋白分解引起凋亡; (3) 对蛋白酶的调节功能, 如灭活细胞凋亡的抑制剂作用、激活下游的核酸内切酶等。

总的来说, 在蛋白酶级联切割过程中, Caspases-3处于核心位置[22], 不同的蛋白酶分别切割其酶原, 使其激活, 活化的Caspases-3又进一步切割不同的底物, 最终使细胞走向凋亡。

2.2 核酸内切酶

核酸内切酶是凋亡的最终执行者, 各种凋亡刺激因素通过不同的信号途径, 最后激活核酸内切酶, 引起DNA裂解为180-200bp及其整倍数的片段, 在凝胶电泳中显示为“DNA梯形带”。目前所知核酸内切酶至少有4种以上包括核酸内切酶-1、核酸内切酶-2、DUC18和NUC1等。核酸内切酶经Caspases-3激活后, 对核小体进行消化切割并产生特征性的“DNA梯形带”, 有人认为在凋亡过程中只有一种核酸内切酶参与切割, 如核酸切内酶-1家族中的核酸内切酶Gamma[23], 有人根据DNA片段有高分子量和低分子量两种, 提出可能有不同的核酸内切酶参与, 如核酸内切酶-1和核酸内切酶-2[24]。其它参与凋亡过程的蛋白酶还包括丝氨酸蛋白酶、纤溶酶原激活物以及由泛素介导的蛋白酶反应等[25]。

3 展望

细胞凋亡是机体的一种基本生理机制, 贯穿机体整个生命活动过程, 为机体正常细胞的更新和异常细胞的清除提供了手段, 对维持个体正常生理过程和功能表达具重大生物学意义。细胞凋亡近年来已成为细胞生物学与分子生物学的研究热点, 对细胞凋亡机理的深入探讨可对一些疾病包括癌症提供新的治疗方法和途径, 目前药物开发多是从病理过程中的分子机制、正常生理过程起作用的因子来寻找新药。肿瘤、心脑血管病、慢性炎症、免疫系统疾病等都是以细胞损伤和失控为关键环节, 所以细胞保护、调节药物比杀伤药物的前景要广阔得多。如果把细胞凋亡的基础性研究与药物开发的应用性研究结合在一起, 会缩短基础与临床应用的差距。利用细胞凋亡的相关基因研究, 开展基因治疗是一种富有成果的途径。在以细胞凋亡研究为主体的基因治疗研究中, 应突破专一基因的研究, 而应把相关基因结合起来研究, 可能会更加有效。从抑制、调节异常基因表达过程设计新药可进一步提高药物的选择和有效性。另外, 也多利用APO研究中细胞因子或细胞保护因子开发新药, 如肿瘤死亡因子、集落刺激因子等。还可以对参与细胞凋亡的受体进行研究, 开发受体激动性或拮抗性药物, 在受体水平或受体传递环节上切断或干扰细胞凋亡过程, 从而阻断疾病的发生、发展的某一环节, 达到治疗或预防疾病的目的。

摘要：细胞凋亡 (apoptosis, APO) 是新近提出的有关细胞死亡的一种模式, 是生物界重要的生命现象之一, 就近几年来细胞凋亡机制研究进展作一综述, 为相关研究提供参考。

细胞凋亡研究 篇5

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向降解同源靶基因6O09!从而抑制靶基因的蛋白表达%@1AB.9:;信号通路在乳腺癌的发生发展中起着重要作用!@1AB的过表达与乳腺癌的恶性程度有关%@1AB.9:;通路的活化能够抑制)“?[转录因子介导的细胞生长停滞和细胞凋亡%O&*Q*5.+P*C等&AG’研究表明!利用O09D降低乳腺癌细胞中

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Y=期%UO91,是肿瘤坏死因子U0)家

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@1AB.9:;信号通路的激活!却能抑制UO91,诱导的凋亡%使用针对@1ABSM8$调节亚单位和9:;=的+DO09和UO91,联合治疗结肠癌!凋亡细胞的数

量明显多于单独应用UO91,%而且

9:;=+DO09介导的@1AB通路的抑制

导致UO91,死亡受体G和8增加%

O09D在抑制@1AB.9:;的同时诱导UO91,死亡受体表达!使抵抗性结肠癌

细胞对UO91,诱导的细胞死亡更加敏感&A8’%编码@1ABS=HH$催化亚单位的

@1BA9基因在大多数的人类肿瘤中

发生突变%最近!^*5Q等&AI’研究发现

@1BA9基因突变型的结肠癌细胞株

由于@1AB.9:;信号通路的激活!其能抵抗由生长因子缺乏诱导的细胞凋亡!对@1AB的抑制剂,E7FGHH7高度敏感!而且!@1BA9特异的+DO09+能够显著减少J09的合成和_或诱导细胞凋亡%而@1BA9基因野生型的结肠癌细胞株却没有表现出明显的@1AB活性!其虽然对@1AB的抑制剂

,E7FGHH7诱导的生长抑制高度敏感!

但对于@1AB抑制诱导的凋亡却不敏感!如果将突变型的@1BA9基因转染至野生型的结肠癌细胞株后也能获得与@1BA9基因突变型的结肠癌细胞株相同的特性%@1AB特异性的

+DO09除可降低体外结肠癌细胞的活

力!还可抑制体内转移性结肠癌的生长&M’%X‘D=在肠上皮细胞和结肠癌中作为一个生存基因发挥作用!可活化

@1AB.9:;信号通路!对生理性和治疗

性凋亡刺激有不同程度的抵抗性%X‘D=在人结肠癌细胞中过表达!这种过表达与其扩增有关%利用特异的LDO09敲除人结肠癌细胞系aU.7F的X‘D=后!能抑制9:;的磷酸化并增加癌细胞对红杉醇介导的细胞凋亡的敏感性&AN’%由此可见!对于@1AB.9:;相关的肿瘤!@1ABb9:;及其相关基因有望成为基因疗法的靶点!同时也为联合使用+DO09和其他化学药物治疗肿瘤提供新的策略!进一步提高肿瘤的治疗效果%

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体或人工合成的反义寡核苷酸在较早前已经用于干扰@1AB.9:;信号通路%据报道!@1ABSM8$基因相关的反义

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细胞凋亡研究 篇6

方法：采用MTT法考查GEE对HepG2增殖的抑制作用，普通光镜观察、荧光染色法观察细胞形态的改变及细胞凋亡，流式细胞仪（FMC）观察细胞周期变化和凋亡峰的出现。

结果：0.4～1.6mg/ml壁虎提取物对HepG2增殖产生抑制作用，且呈明显的时-效、量-效关系（P<0.05）。光镜观察可见贴壁细胞数量明显减少，细胞碎片和悬浮细胞数目明显增加，荧光染色显示细胞核显著收缩，呈致密浓染。FCM结果表明1.6mg/ml壁虎提取物处理细胞24h后使HepG2出现明显的凋亡峰，并将细胞周期阻滞于S期和G2/M期。

结论：壁虎提取物能诱导HepG2细胞凋亡。

关键词：壁虎细胞凋亡HepG2

【中图分类号】R4【文献标识码】A【文章编号】1008-1879（2012）11-0009-02

壁虎又稱守宫、天龙、蝎虎等，古代“五毒”之一，具有补肺肾、易精血、通络起废、镇痉祛风等功效。壁虎在临床广泛地用于治疗多种疑难杂症，对多种恶性肿瘤，尤其是肝癌、肺癌、食管癌、胃癌、乳腺癌、宫颈癌等常见多发恶性肿瘤有独特的疗效。近年来对该药的研究有不少进展，但目前对壁虎抗肿瘤机制不明了。壁虎作为中药还未载入国家药典，还未得到应有重视，国内外同仁对其有效成分、作用机制研究不多。因此研究壁虎对体外肿瘤细胞增殖的抑制作用有可能发现壁虎的抗癌机制。本文拟对壁虎提取物为研究对象，研究其体外作用人肝癌HepG2细胞后的增殖抑制情况，能否诱导凋亡及相关分子机制，为壁虎的药用开发提供科学理论和临床应用依据。

1实验材料

1.1细胞株。人肝癌细胞株HepG2（ATCC，美国）。

1.2药物。壁虎或为壁虎科动物无蹼壁虎或其他几种壁虎的全体。处理方法：高速组织捣碎机使细胞裂解，离心，抽提，旋转蒸发冷冻干燥，浓缩成干粉。

1.3主要试剂及试剂盒。MTT（Genview），细胞凋亡-Hoechest染色试剂盒（南京凯基生物发展有限公司），RPIM1640（GIBCO），胎牛血清（杭州四季青），碘化丙啶（Sigma），青霉素/链霉素（HyClone公司），其余药品均为国产分析纯。

1.4主要仪器。荧光倒置显微镜（OLYMPUS公司），倒置显微镜XSZ-D2型（重庆光学仪器厂），冷冻干燥仪（MARTIN CHRIST公司），酶标仪（中科院生物物理所），BI-2000生物医学图像分析系统（成都泰盟公司），流式细胞仪（Beckman公司）。

2实验方法

2.1HepG2细胞的培养和处理。HepG2进入对数生长期时可进行以下操作。

2.2细胞毒性试验。采用MTT法：实验设调零组（空白组）、阴性对照组、药物处理组。药物处理组设定7个不同浓度（0.125、0.25、0.5、1、2、4、8mg/ml），计算增殖抑制率。

2.3普通光镜细胞形态观察。细胞接种方法同细胞增殖抑制实验，经一定量梯度浓度的药液处理48h后，和阳性对照组（阿霉素处理）、阴性对照组的HepG2细胞置于倒置光学显微镜下观察细胞形态。

2.4荧光染色观察细胞凋亡。将无菌盖玻片置于六孔板内，于盖玻片上种入细胞培养过夜，待盖玻片上细胞汇合度约为50%-80%时加入一定量的药液，继续培养24h。设对照组。后按照细胞凋亡-Hoechest染色试剂盒的说明操作，用荧光倒置显微镜（激发波长340nm，吸收波长450nm）观察拍照。

2.5FCM检测。收集经一定浓度药物作用24h后1×107个细胞，冷PBS（PH7.2，0.1M）清洗2遍，70%的冷乙醇于4℃固定后送检，每个样品测试约1.2×104个细胞。

3实验结果

3.1壁虎对HepG2增殖的抑制作用。壁虎提取物各剂量组均有一定程度的抑制HepG2细胞增殖，并且随着剂量和时间推移，抑制率增强，具有明显时间依赖性和剂量依赖性。

3.2普通光镜观察结果。阴性对照组HepG2细胞生长密集，细胞呈梭形或多角形，细胞彼此之间紧密接触。壁虎提取物处理后的贴壁细胞面积变小出现圆形或椭圆，间有细胞碎片，细胞数量明显减少，同时细胞形态发生变化，细胞从多边形变成圆形，呈凋亡细胞改变，胞浆出现空泡，体积缩小，细胞间隙增大，随时间推移，细胞数目进一步减少，见较多的凋亡和坏死细胞；阳性对照细胞小而圆，细胞数量剧减，呈凋亡细胞改变，可见凋亡和坏死并存现象。

3.3荧光染色结果。正常HepG2细胞核较大，呈弥散均匀蓝色荧光，但蓝色荧光较浅；实验组的细胞形态不规则，细胞核或细胞质内可见致密浓染的荧光颗粒，新月样荧光，蓝色荧光的强度较大。坏死对照组也可见颗粒状荧光，但呈松散和淡染状。

3.4FCM检测结果。阴性对照组表明HepG2细胞中DNA含量分布较集中；由流式细胞分析结果，表明用药后G0/G1期细胞比例显著减小，且在G0/G1期前出现一个显著的凋亡峰（AP峰）。用药组与阴性对照组相比，细胞周期被阻滞于S期和G2/M期，而G0/G1期的比例显著下降。

4讨论

在我国传统中医药学中，壁虎常被组成方剂用于燥湿健脾、祛风散寒，也可活血消肿、治疗炎症、抗癌，但是壁虎的抗癌作用机制还未见报道。本实验的结果表明，0.125～8mg/mL壁虎提取物对HepG2有明显增殖抑制作用，且有较明显的量-效、时-效关系；而2mg/mL壁虎提取物对HepG2发生凋亡产生较典型的凋亡性状，细胞可能处于凋亡初期或中期。流式细胞仪检测结果表明，用药后HepG2出现明显阻滞于S期和G2/M期，减少细胞向G2期和M期转化。以上结果表明，壁虎提取物具有显著诱导HepG2产生凋亡的作用。具有极大临床应用研究潜力。

参考文献

[1]宋萍，王美学，谢爽等.鲜壁虎冻干粉诱导C6角质瘤细胞凋亡的血清药理学研究.中国中西医结合杂志.2004.24（10）：919-921

姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展 篇7

近五十年的研究表明, 姜黄素可以用于预防和治疗肿瘤, 对多种肿瘤细胞的产生、增殖、转移均具有抑制作用, 如结肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、皮肤癌、白血病等。其可能的作用机制有诱导肿瘤细胞凋亡、改变细胞受体连接、阻断细胞内信号反应等[3,4]。细胞凋亡 (cell apoptosis) 是一种由基因调控的细胞主动死亡过程, 是机体生长发育、细胞分化、生理及病理性死亡的重要机制。众多细胞实验和动物实验均已经证明, 姜黄素具有确切的诱导肿瘤细胞凋亡的活性。其抗癌谱较广, 是一种具有广阔开发前景的中药, 亟待进一步对其作用机制深入研究, 以便及早在临床上推广使用。

1 抑制NF-KB活化

NF-KB是一类在动物细胞中广泛表达的转录因子, 其主要生理功能之一是通过诱导凋亡抑制基因的转录, 拮抗细胞凋亡的发生[5,6]。姜黄素可以抑制A2780细胞生长和诱导凋亡, 用不同浓度的姜黄素作用于A2780细胞爬片12 h后, NF-KB蛋白 (P65) 表达均有下调[7,8]。最近发现, 姜黄素抑制NF-kB活化是通过抑制诱导IKBa磷酸化的激酶活性而发挥作用, 影响细胞表面黏附分子、趋化因子、TNF、MMP9、COX2和NOS的表达。由于NF-KB参与细胞的存活和增殖过程, 因此抑制NF-KB活化也可部分解释姜黄素诱导的抗增殖和诱导凋亡的效应[9,10]。

2 抑制转录共激活因子P300活性和表达

P300是一种重要的组蛋白乙酰基转移酶, 它能乙酰化核心组蛋白N末端的赖氨酸残基, 使核小体组蛋白与DNA的结合稳定性下降, 进而使转录机器与染色体的结合成为可能。在细胞中可与多种基因转录活化因子结合而形成辅化因子复合体。除乙酰化作用外, P300还可以在转录起始复合体的形成中起支架或桥梁的作用[13]。目前研究表明, P300作为一种核蛋白, 它们具有调节细胞增殖、分化、细胞周期, DNA的损伤修复和凋亡的作用圈。姜黄素能抑制胃癌SGC-7901细胞P300的mRNA和蛋白质的表达, 并能抑制组蛋白H3、H4乙酰化, c-myc表达也明显抑制, 但野生型P53表达则不受抑制。且P300的抑制与组蛋白H3、H4乙酰化程度及c-myc抑制程度具有明显的相关性。这可能是姜黄素抑制乙酰化酶P300后, 抑制了组蛋白的乙酰化, 使染色体的结构变得紧密, 不便于cmyc的启动子区域与调节蛋白结合, 从而抑制了原癌基因c-myc表达。另有研究发现姜黄素能够抑制转录共激活因子p300活性和表达, 可能是姜黄素对抑制B细胞淋巴瘤细胞系Raji细胞增殖作用, 并促进其凋亡的作用机制之一[14]。

3 上调caspases蛋白酶

胱冬蛋白酶属于ICE/CED3蛋白酶家族成员, 目前发现至少有14种之多, 分别命名为casepases1～casepases14。与细胞凋亡密切相关, 它是通过级联反应, 最终激活核酸内切酶来实现的。姜黄素可呈时间及剂量依赖性抑制Raj细胞增殖, 可显著促进Raji细胞凋亡;Western blot检测表明, 在25μmol/L (IC50) 作用24 h, Raji细胞与对照组相比, 胱冬蛋白酶8和9的表达明显增高, 提示胱冬蛋白酶8和9在Raji细胞增殖和凋亡中起重要的作用。说明姜黄素诱导Raji细胞死亡受体Fas的表达增强, 激活了caspase 8, 从而启动caspase级联发应, 使线粒体下游caspase 9效应酶激活, 最终诱导细胞凋亡[11]。姜黄素能够诱导黑色素瘤A375细胞的凋亡, 并呈时间和剂量依赖性。免疫组化检测Caspase-3蛋白表达, 原位杂交检测Caspase-3 m RNA, 结果发现Caspase-3表达增加, 说明Casepase-3参与了姜黄素诱导A375细胞凋亡的发生和发展同。姜黄素能明显抑制U251细胞的增殖并且诱导其凋亡, FAK蛋白表达减少, caspase-3活性增强, 各种caspase抑制剂 (如z-DEVD-fmk, z-IETD-fmk、z-LEHD-fmk、zVAD-fmk等) 可抑制姜黄素诱导的U251细胞凋亡。姜黄素通过抑制FAK蛋白的表达和激活caspase途径可诱导U251细胞凋亡, 这提示我们caspase-3作用于FAK, 以去除FAK抑制凋亡的作用, 使细胞最终凋亡[12]。

4 抑制Survivin表达率

survivin是IAP家族成员之一, 分布于有丝分裂元件, 具有调控细胞有丝分裂和抑制细胞凋亡的功能。survivin在大多数正常组织中未被检测, 但在肿瘤组织中过量表达。survivin已经成为癌症治疗的一个重要靶点[15]。姜黄素能抑制胃癌细胞SGC-7901和MKN-45的生长并促进其凋亡, 其发生与Survivin表达率下降有关[16]。邱学德也发现姜黄素能够诱导膀胱肿瘤细胞株T24和BIU87凋亡, 姜黄素可使肿瘤细胞株的Survivin m RNA表达量降低[16]。

5 调节Bcl-2家族相关基因蛋白表达

Bc1-2家族蛋白是在细胞凋亡过程中起关键性作用的一类蛋白质。线粒体上, Bcl-2家族蛋白通过与其他凋亡蛋白的协同作用, 调控线粒体结构与功能的稳定性, 发挥着细胞凋亡“主开关”的作用。Bcl-2家族包括两类蛋白质:一类是抗凋亡蛋白, 另一类是促凋亡蛋白。姜黄素在初治AML患者原代细胞时, 可使抗凋亡蛋白Mc1-1下调, 促凋亡蛋白Bax、Bak上调。第一次证明了姜黄素可诱导初治AML患者原代细胞的凋亡, 并发现姜黄素诱导白血病细胞凋亡的机制之一是调节Bcl-2家族成员Mc1-1、Bax、Bak的表达, 进一步证实各成员之间存在复杂的相互关系[16]。采用免疫细胞化学法发现, 姜黄素诱导SKOV3细胞凋亡的作用与下调Bcl-2、MTP53的表达及上调Bax、Fas的表达有关[17]。

6 改变线粒体膜电位

有文献报道说明线粒体跨膜电位的耗散早于核酸酶的激活, 也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面。而一旦线粒体跨膜电位耗散, 细胞就会进入不可逆的凋亡过程[22]。杨甫文等发现姜黄素诱导鼻咽癌细胞凋亡可能与改变线粒体跨膜电位, 释放CytC, 上调Fas基因表达, 激活caspase-3酶有关[18]。这提示线粒体跨膜电位是姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡的新靶点[19]。

7 展望

细胞凋亡研究 篇8

1 细胞凋亡机制

细胞凋亡包括3个时期:第一个时期是定型期, 靶细胞接到死亡指令, 开始程序死亡;第二个时期是实施期, 细胞内出现了一系列的形态和生化变化, 如细胞核凝集、细胞缩小、形成膜泡、微绒毛丧失、染色体DNA降解、形成核小体长度为单位的DNA片段等;第三个时期是吞噬期, 凋亡小体被周围的吞噬细胞消化吞噬, 凋亡完成。在哺乳动物细胞凋亡过程中, 有几种基因和蛋白起十分重要的作用。

1.1 Caspase家族蛋白

Caspase是半胱氨酸基天冬氨酸-特异性蛋白酶 (cysteinyl aspartate specific protease) 即半胱氨酸天冬氨酸酶的缩写, 属于ICE/CED3蛋白酶家族成员。目前发现至少有14种, 分别命名为Caspase1~Caspase14。根据其N-末端长短可分为两个亚群:长N-末端亚群 (Caspases-1、2、4、5、8、9、10、14) 和短N-末端亚群 (Caspase-3、6、7、11、13) 。其中Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9是位于凋亡通路上的三个关键因素。有文献报道, 射线诱导的细胞凋亡与Caspase-3有关, 辐射诱导的凋亡主要与Caspase-9有关。在屈鸣麒等人对高压氧对颅脑损伤后神经细胞凋亡及Caspase-3表达的影响的研究中发现:颅脑损伤大鼠脑组织中Caspase-3的表达明显增高, 与神经细胞凋亡的发生呈正相关, 高压氧可以抑制颅脑损伤后脑组织中Caspase-3基因的表达, 明显降低神经细胞凋亡率, 促进神经功能恢复。Oommen S等研究发现大蒜素能通过激Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的信号的活动诱导人癌细胞凋亡小体形成, 核浓缩和典型的DAN梯形带形成。因此Caspase-3被认为是在多种诱导剂刺激后导致凋亡的关键酶, 它的活化预示着细胞凋亡执行阶段的开始。Caspase-3还能放大Caspase-8和Caspase-9的信号, 引起细胞全面自杀解体, Caspase-8和Caspase-9都可以通过蛋白水解片活化Caspase-3, Caspase-3反过来使细胞内许多重要的蛋白质 (包括其余的Caspases成分) 水解而得以活化。PARP (聚ADP核糖聚合酶) 是细胞凋亡中第一个被鉴定的由Caspase-3水解的DNA修复相关酶。DNA修复功能的丧失, 致使不能维持基因组的稳定, 从而间接促使细胞凋亡。

1.2 Bcl-2基因家族Bcl-2被认为是细胞凋亡蛋白家族中

最重要的调控蛋白, 它与Bax、Bad、Bak等共同组成了Bcl-2蛋白家族, Bcl-2的功能受其蛋白产物Bax和Bcl-xl蛋白调节。Bcl-2家族通常以二聚体的形式发挥作用。其中Bcl-2、Bax和Bcl-xl具有抑制细胞凋亡的功能;Bal-xs、Bad、Bak、Bik和Bid具有促进细胞凋亡的作用。Bax定位于胞质溶胶中, 自身形成同源二聚体或与Bcl-2形成异源二聚体。研究表明Bcl-2/Bax的比值对细胞凋亡的发生具有决定性作用。Bcl-2表达>Bax时Bcl-2与Bax的异源二聚体增多, 细胞趋于存活;Bcl-2表达

1.3 P53蛋白

P53是典型的抑癌基因, 其基因产物属一种转录因子, 分野生型和突变型两种形式。野生型P53诱导细胞凋亡, 而突变型P53则抑制细胞凋亡。野生型P53诱导细胞凋亡的机制有两个方面, 其一, 野生型P53可促Cip1 (cdk-interacting protein 1) 基因码的21KD蛋白的表达, 从而抑制细胞周期素依赖性激酶2 (CDK2) 的活性, 阻止细胞进入DNA合成期, 停滞于G1期, 利于细胞启动自身修复机制, 若DNA受损细胞不能有效修复, P53则介导细胞发生凋亡。另一方面, 通过调控Bcl-2, 已发现Bcl-2的5’端有一个P53的负应答元件, P53与该元件结合后, 可抑制Bcl-2基因的转录, 从而促进细胞凋亡。P53基因的突变与肿瘤的发生密切相关, 在人类全部肿瘤中, 发生P53基因突变者约为60%。P53的激活是对一些恶性相关的刺激信号的反映, 其结果是抑制肿瘤细胞的生长。同时, P53的抑制蛋白的过度表达或其刺激因子的缺乏等也可引起P53抑癌功能的丧失。

1.4 Apaf-1

凋亡蛋白激活因子1基因 (apoptotic protease activating factor 1, Apaf-1) 是诱导细胞凋亡的肿瘤抑制基因。目前已得到3种纯化的Apaf (Apaf-1, Apaf-2, Apaf-3) 。Apaf-1即ced-4在哺乳动物中的同源蛋白, 有d ATP存在的条件下, 能激活Caspase-3。Apaf-2是Apaf-1的共因子, 其实就是细胞色素C, 它们结合在一起能激活Caspase-9。Apaf-3就是Caspase-9, 它和ced-3具有类似的结构。Apaf-l和Caspase-9是C-myc诱导肿瘤细胞凋亡中P53的下游成分, 它参与线粒体介导的凋亡途径。李红梅等的研究结果初步证实了Apaf-1基因是启动化疗药物诱导的细胞凋亡过程的重要调控因子。也有研究发现, 一系列肿瘤因该基因缺失而获得抗细胞色素C依赖的细胞凋亡作用;陈剑琳研究了Apaf-1的调节及Apaf-1在发育凋亡中的作用, Apaf-1是参与激活凋亡过程中Caspase系统的关键因子。

1.5 C-myc基因

C-myc原癌基因位于第8号染色体, 是一种控制细胞增殖和分化、调控细胞周期的主要基因, 它具有诱导增殖和凋亡的双重作用。C-myc的持续表达可以促进细胞凋亡, 而且细胞凋亡程度与细胞内C-myc蛋白的活性及其表达有关。黄辉等研究了C-myc与细胞的关系得到C-myc到底是促进凋亡还是促进细胞增殖, 关键是能否获得关键性的生长因子。

2 细胞凋亡的检测方法

2.1 形态学检测方法

细胞发生凋亡时具有固有的形态特征, 如细胞核表现缩小、染色质边缘化、凝集, 凋亡晚期还会出现由核碎片与胞质内的部分细胞器混合在一起, 且被细胞膜包裹形成的凋亡小体。利用光学显微镜可以观察到核固缩、质浓缩和凋亡小体;通过透射电子显微镜还能够清晰的观察到细胞微绒毛的消失、内质网、高尔基复合体及核被膜的膨大, 染色体的边集化及凋亡小体。通过荧光显微镜或激光共聚焦显微镜可以观察细胞染色质的形态学变化、膜结构及通透性的改变, 从而鉴别凋亡细胞、正常细胞及坏死细胞。其中, 透射电镜检查细胞凋亡认为是最经典、可靠的判定细胞凋亡的方法, 被认为是鉴定细胞凋亡的金标准。但观察凋亡细胞的形态特征耗时费力, 不适于大量凋亡样本的检测。2.2细胞凋亡的DNA片段化检测细胞发生凋亡时, DNA降解的发生早于细胞形态学的变化, 所以建立DNA分子水平的检测对早期疾病的诊断有很重要的作用。常见的检测方法有凝胶电泳和原位切口末端标记法。

2.2.1 凝胶电泳检测

琼脂糖凝胶电泳是最早用于研究凋亡生化改变特性的方法。正常活细胞的凝胶电泳为一条正常活细胞DNA凝胶电泳为一条离加样孔很近的区带, 细胞凋亡时核酸内切酶被激活, 将DNA切成50~300kb的大分子质量DNA, 然后进一步分解成180~200bp整数倍的DNA片段, 在凝胶电泳中形成梯形条带, 这是凋亡的特异结果, 但并非必然结果。凋亡过程中, 裂解是标志细胞最终走向死亡的不可逆的重要过程, 因此, 凝胶电泳也曾被认为是细胞凋亡判定的金标准之一。但是, 此法特异性和敏感性差, 只能进行半定量, 且缺乏定位性特征, 在病理形态学中价值不大, 比较适用于体外培养的非增殖性细胞的检测。

2.2.2 原位末端缺口标记法

原位末端缺口标记法 (Transferase biotin-d UTP nick end labeling, TUNEL) 法是一种将分子生物学和免疫组织化学相结合的原位检测凋亡细胞DNA片段的方法。其基本原理为:细胞发生凋亡时核酸内切酶被激活, 染色质或DNA被核酸内切酶切割后产生180bp~200bp的含3-OH末端的片断, 脱氧核苷酸末端转移酶将结合有荧光素的核苷酸 (d UTP) 标记到缺口3-OH的末端, 依次加入HRP抗荧光素抗体和HRP显色底物DAB, 凋亡细胞显色明显, 而正常细胞没有DNA断裂或者只有少量的DNA发生断裂, 故不被显色。TUNEL法因其灵敏高而被广泛用于各种凋亡细胞的检测, 由于在坏死细胞内也可能存在DNA片段化, 所以只有DNA链普遍断裂才能证明细胞发生凋亡。该法过程若处理不当易造成假阳性, 且结果主观性强。TUNEL试验须设阴、阳性对照。

2.2.3 ELISA检测法细胞凋亡时, DNA降解形成的核小体

DNA可与核心组蛋白H2A、H2B、H3、H4等紧密结合, 形成复合体, 抗组蛋白和抗DNA的单克隆抗体双抗夹心法 (ELISA) 即可特异地定量测定细胞凋亡时裂解物胞浆部分的单核小体或寡核小体, 作为凋亡尤其是早期凋亡的指标。通过ELISA检测凋亡细胞释放到细胞质中的核小体从而确定细胞凋亡程度。此方法既可定性又可以定量, 而且适合检测大批量样本, 不需要特殊的仪器。试验过程中如果裂解细胞的时间过长可能导致细胞核中的DNA片段也被计算在内, 进而导致结果偏高, 因此不同的细胞系需要经过数次摸索才能确定最佳检测条件。

2.3 流式细胞仪分析

细胞在通过流式细胞仪 (flow cytometry assay, FCA) 激光焦点时可以发生光的散射, 可以通过对不同角度反射光的分析, 可以得到细胞大小、形状和结构的变化。凋亡的细胞经碘二乙氧磷酰硫胆 (phospholine iodide, PI) 、烟酸己可碱 (hoechst) 等亲DNA染料可染出相应颜色, 并且结合的染料与DNA含量成正比, 即细胞激发后发射荧光强度与结合的染料的量成正比, 因此可以定量检测。用流式细胞仪检测细胞凋亡既可以定性又可以定量, 具有操作简单、快速和敏感等许多优点, 但检验样品前需要获得单细胞悬液才能更好的检测。

2.4 凋亡相关因子Caspase活性的检测

Caspase家族是细胞凋亡过程中的关键元件, 它与多数蛋白酶一样在细胞内以无活性的酶原形式存在, 其激活与超常表达均引起细胞凋亡, 因此又称死亡蛋白酶, 可通过与众多蛋白因子的相互作用调控细胞凋亡。在已发现的14个家族成员中, Caspase-3处于凋亡有序级联反应的下游, 是最重要的效应型Caspase, 是Caspase家族中的最重要的凋亡执行者之一, 是细胞凋亡的关键执行者, 是细胞凋亡过程中的主要效应因子, 是多种凋亡刺激信号传递的汇聚点, 它的活化是凋亡进入不可逆阶段的标志。至今在细胞坏死中未发现有Caspase的活化, Caspase的失活可能使细胞从凋亡转入坏死, 因此检测细胞中Caspase的活力可以作为区分凋亡和坏死的一个标准。检测Caspase活力可用免疫杂交技术分析酶原的加工和底物水解的产物, 或用人工底物 (DIE2V3D4-X) 检测酶活力, 也可对活化的Caspase做亲和标记。这些检测技术结合荧光显微镜和流式细胞仪分析, 将会对凋亡细胞作较为准确的定性和定量检测, 灵敏度高、特异性强。

3 结语

综上所述, 很多基因有明显的诱导细胞凋亡的作用, 如前面介绍的Caspase、P53、Bcl-2和C-myc等。当然还有其它很多种类的基因对细胞的凋亡有重要的影响, 但对其详细的分子机制目前尚不十分清楚, 深入开展在这些基因整体动物和人体的生物学作用, 深入研究它们的分子机制, 具有十分重要的理论意义和广泛的应用前景。

细胞凋亡研究 篇9

1 对细胞凋亡信号传导通路的影响

细胞凋亡的信号转导机制十分复杂, 目前认为至少有三条通路参与, 即线粒体通路、死亡受体通路和内质网通路。

1.1 线粒体通路

又称内源性凋亡途径, 线粒体通路可由多种因素诱发, 如细胞脱离了原来的生长环境、失去了赖以生存的生长因子、DNA损伤等[2]。在生理情况下, 线粒体通透性转变孔 (MPTP) 周期性开放, 防止膜间隙正离子的过度蓄积。在各种促细胞凋亡信号作用下, MPTP不可逆过度开放, 线粒体跨膜电位崩解, 细胞色素c (Cytc) 等促凋亡活性蛋白释放至胞浆内, Cytc与凋亡蛋白酶活化因子-1 (Apaf-1) 形成多聚复合体, 活化Caspase-9前体, 导致下游效应者Caspase-3活化, 切割底物使细胞凋亡[3]。这一途径中, 活性Caspase-3是级联反应中关键蛋白酶[4], Bcl-2家族是线粒体凋亡途径的主要调控者, 他们通过激活一系列下游基因发挥调节凋亡作用。红花黄色素B[5]、茶多酚[6]、麝香酮[7]均能有效抑制细胞线粒体膜电位损伤后细胞内钙超载, 维护线粒体功能, 提高线粒体膜电位 (MMP) , 抑制刺激对细胞线粒体的损伤作用导致的细胞凋亡。高培国等[8]研究发现, 氧化应激可诱导细胞凋亡, 葛根素可通过拮抗过氧化氢对线粒体膜的脂质过氧化反应, 保持线粒体膜的完整性, 维持线粒体膜电位, 减少线粒体损伤率, 降低Caspase-3阳性表达率, 阻断细胞凋亡的信号传导通路, 达到保护细胞的目的。李响等[9]研究表明, 注射用血栓通可以防止线粒体损伤, 提高Bcl-2表达水平, 减少Cytc的释放, 减低Caspase-3活性来拮抗血管内皮细胞凋亡。蒙果等[10]研究发现金钠多中所含银杏黄酮可以阻止MMP的下降和保持膜的完整性, 从而抑制线粒体Cytc释放和细胞凋亡发生。

1.2 死亡受体通路

该途径也称外源性凋亡途径, 死亡受体中最典型的是Fas和TNFRs。 (1) Fas/FasL死亡通路:FasL可与Fas结合, 募集FADD (Fas相关死亡结构域蛋白) 后形成了死亡诱导信号复合物 (DISC) , 激活Procaspase-8, 进一步自我激活启动下游的Caspase相关蛋白酶级联反应, 最终导致细胞凋亡。该通路中, DISC的形成是级联反应的关键步骤[11]。 (2) TNFR死亡通路:TNFRs当与TNF结合后, TNFR-I三聚体化, 然后募集一个衔接蛋白TRADD (TNFR-associated death domain) 。TRADD可以引起两条信号转导通路的激活, (1) 通过招募FADD诱导细胞凋亡; (2) 通过肿瘤坏死因子受体相关蛋白2 (TRAF-2) 和诱导转录因子 (RIP) 活化。TRAF-2和RIP活化NF-κB诱导激酶 (NIK) , NIK使IκB发生磷酸化, 并促进NF-κB的降解和释放, 后者转位至核, 激活一系列基因表达[12], 导致细胞凋亡发生。甄艳军等[13]实验显示, 木贼提取物能致血管平滑肌 (SMC) 膜表面Fas大量表达, 增加死亡受体与配体结合的细胞毒作用介导SMC的凋亡, 而且凋亡率与Fas、FasL表达量成正相关, 两者结合触发的凋亡效应可清除增生的SMC, 减轻内膜增生, 使AS早期SMC增殖与凋亡趋于平衡, 减轻AS早期病变。尚秀玲[14]予白藜芦醇干预动脉粥样硬化家兔, 结果显示白藜芦醇能明显降低家兔主动脉FasmRNA、FasLmRNA、Caspase-3mRNA表达, 且Caspase-3mRNA表达与FasmRNA表达水平呈显著正相关, 通过抑制Fas/FasL途径来抗AS斑块内细胞凋亡。林蓉等[15]研究槲皮素对TNF-α损伤的内皮细胞发现, TNF-α使ECV核内NF-κB表达增加, 而槲皮素能降低内皮细胞NF-κB的表达, 抑制其活化, 减少其降解和释放。

1.3 内质网通路

内质网应激 (ERS) 是指很多病理生理刺激, 如氧化应激、缺血缺氧、钙稳态紊乱及病毒感染等, 能够引起内质网腔内未折叠与错误折叠蛋白蓄积以及Ca2+平衡紊乱。适度的ERS可通过促进内质网处理未折叠及错误折叠蛋白等降低损伤;而持久或严重的ERS则可引起细胞凋亡[16]。目前, 已知内质网应激诱导细胞凋亡的途径有3条: (1) CHOP/GADD153基因的激活转录; (2) JNK的激活通路; (3) 内质网特有的半胱氨酸蛋白酶Caspase-12的激活通路[17]。其中, CHOP通路是调节内质网应激诱导凋亡的主要通路。葡萄糖调节蛋白 (GRP78) 作为一种分子伴侣在蛋白质的折叠和转运过程中发挥重要作用, 通过“异常折叠蛋白质反应”途径激活ERS[18], 魏晏等[19]研究发现, 经淫羊霍苷 (ICA) 预处理的同型半胱氨酸 (HCY) 诱导的内皮细胞内GRP78mRNA表达明显减少, 且未见明显凋亡形态学改变, 考虑减缓血管内皮细胞内质网应激可能是ICA抗细胞凋亡作用的机制之一。高雪等[20]以体外培养HUVECs, 通过Ang-Ⅱ诱导细胞凋亡的发生, 观察盐酸川芎嗪 (TMP·HCl) 对凋亡细胞的作用, 发现Ang-Ⅱ诱导细胞很快激活细胞内ERK1/2、JNK, 引起细胞损伤。予盐酸川芎嗪预保护的细胞ERK和JNK磷酸化程度随药物浓度增高而降低, 其激活程度与TMP·HCl浓度成反比。表明TMP·HCl能抑制ERK、JNK的信号通路来保护内皮细胞。

2 对细胞凋亡调控蛋白的作用

Caspase家族和Bcl-2家族在凋亡的发生发展过程中起着举足轻重的作用。Caspases家族是凋亡活化因子, 是引起细胞凋亡的关键酶, 是凋亡通路的核心执行者。Bcl-2家族蛋白是调节细胞凋亡的关键元件, 分为3类:促凋亡蛋白, 如Bak和Bax;抗凋亡蛋白, 如Bcl-2和Bcl-xL以及Bim、Bid等BH3-only蛋白, BH3-only是一类促凋亡蛋白, 通过抑制Bcl-2抗凋亡成员的活性或激活Bax/Bak样促凋亡成员的活性来调节细胞凋亡。王燕[21]研究发现, 用含硒29.403 mg/kg的富硒大蒜油能够降低Bax和Caspase-3蛋白表达量, 使Bcl-2蛋白表达量显著升高, 通过作用于基因转录水平逆转Bax、Bcl-2和Caspase-3的蛋白表达, 从而抑制内皮细胞凋亡。郭峰等[22]实验发现迷迭香酸预处理可以增加凋亡细胞中Bcl-2蛋白的表达, 减少Bax蛋白的表达, 升高Bcl-2/Bax的蛋白比值, 降低Fas、FasL的蛋白表达。潘露茜等[23]实验发现, 软脉煎可以从蛋白水平调节血管平滑肌细胞凋亡, 软脉煎干预后细胞Caspase-8蛋白表达显著降低, 提示软脉煎能通过干预细胞凋亡信号途径中的多信号途径介质Caspase-8来抑制凋亡。严玉平等[24]应用乌鸡白凤丸治疗动脉粥样硬化大鼠研究发现, Caspase-3蛋白表达下调, 血管内皮细胞凋亡率降低, 增殖指数增加。何煜舟[25]体外实验发现, 木犀草素抑制H2O2诱导内皮细胞凋亡途径涉及Caspase-3通路。该药可显著抑制Caspase-3阳性表达, 减少内皮细胞凋亡数量。

3 结语

从细胞凋亡角度探讨中药干预心血管疾病的发生、发展机制是目前研究的热点, 无论是对凋亡的诱发因素, 还是信号传导通路及调控蛋白的研究都取得一定的成就, 涉及的药物包括中药提取出的单体、有效成分以及单味药和复方制剂。但是中药抗细胞凋亡的分子学机制十分复杂, 其药理学基础涉及多个环节, 因而目前仍存在着不足。 (1) 细胞凋亡系统本身分子机制未能阐明的十分透彻, 因而中药对各凋亡传导通路作用的研究大多只停留在表面, 更深层次的研究很少。 (2) 中药本身成分的复杂, 使得其作用多靶点、多层次, 大部分研究只显示中药对细胞凋亡的有效性, 而有效成分及凋亡作用机制有待进一步研究。 (3) 目前大部分实验研究为单因素诱导的细胞凋亡体外实验, 且处于初步试验阶段, 不能真正地模拟相应体内病变及中药干预的全面情况, 人体是一个复杂的系统, 因而在体内多因素参与下中药对细胞凋亡的网络式调控机制是需要研究和完善的重点。 (4) 从目前对凋亡研究的中药来看, 以活血药物居多, 呈现了药物研究的局限性。

摘要：细胞凋亡是由基因控制的细胞自主有序的主动死亡过程, 其与动脉粥样硬化关系密切, 直接影响血管内血栓形成、粥样硬化动脉的形态和结构以及斑块的稳定性。本文就近年来中药对动脉粥样硬化细胞凋亡信号传导通路及调控蛋白的干预研究做一综述。

骨细胞凋亡与股骨头坏死的相关研究 篇10

1 骨坏死细胞凋亡的研究

细胞凋亡又称作细胞程序性死亡, 即细胞在一定生理或病理条件下, 遵循自身程序结束生命的过程, 最后细胞脱落、离体或裂解为若干凋亡小体, 被其他细胞吞噬。该过程主要包括以下几个阶段:凋亡的激发、细胞内凋亡信号传导及调控、凋亡效应分子激活、蛋白及DNA分子断裂、细胞死亡。当前有许多学者认为激素诱导骨细胞凋亡是股骨头坏死的发病机制, 并做了相关研究。

1.1 骨坏死细胞凋亡的发现 Kothapalli等[2]研究发现, 当破坏股骨头部血运使其缺血2 d后, 在骨陷窝内出现凋亡的骨细胞, 这表明缺血性损伤后凋亡也是细胞死亡的一个机制。Eberhardt等[3]研究发现, 兔子应用激素后股骨头软骨下骨骨小梁变细, 伴有骨细胞死亡, 且发现有大量的成骨细胞和骨细胞凋亡。Eberhardt等[3]指出大剂量激素引起细胞活性改变, 凋亡是激素性骨坏死的首要变化。当骨细胞凋亡广泛发生时, 尽管供应股骨头的血管尚无明显变化, 但是骨坏死已经发生了。Rojas[4]对器官移植的患者在应用激素治疗前后分别进行骨活检, 发现用激素前无成骨细胞的凋亡, 而在用激素后有大量成骨细胞凋亡。用激素后正常成骨细胞明显减少, 而且未凋亡的骨细胞大多数由有活性状态转入无活性状态, 血磷水平也相应下降, 并随着激素剂量增加变化更加明显。O′Brien等[5]在鼠的基因中插入能使激素失活的基因来研究激素对骨细胞凋亡的潜在作用时发现, 激素能够直接作用于成骨细胞和骨细胞, 并刺激其凋亡, 但是破骨细胞未受影响, 从而使骨量减少。Silvestrini等[6]研究指出, 细胞内激素受体浓度受多个因素影响, 特别是增生阶段细胞比其他时相的细胞对激素更敏感。Okada等[7]发现, 高剂量的皮质激素可使股骨头内血管内皮细胞循环停止, 并其细胞凋亡, 认为血管的损伤是低氧和高剂量激素共同作用的结果, 但激素引起骨细胞凋亡的的具体机理仍无一个统一的结论。Weinstein等[8]对5 例激素、3 例酒精中毒、1 例外伤、5 例镰状细胞病所致的股骨头坏死患者行手术切除股骨头, 采用TUNEL技术行凋亡细胞检测, 发现激素引起的股骨头坏死切片有大量骨细胞凋亡, 酒精所致股骨头坏死切片中凋亡细胞较少, 其他因素所致股骨头坏死切片中未发现凋亡细胞。Cooper等[9]在研究激素对骨细胞作用时发现激素可引起成骨细胞和骨细胞凋亡, 但并不引起破骨细胞凋亡。

1.2 骨坏死细胞凋亡存在争议 也有一些未发现凋亡细胞的报道, Yang等[10]在地塞米松治疗3 d后的股骨头内未发现凋亡细胞;Pereira等[11]发现可的松 (1 μmol/L) 可以在矿化的条件下阻止成骨细胞凋亡。也有一些研究[12,13]认为, 地塞米松有使骨细胞抗凋亡的作用, 这可能与凋亡检测方法不同有关。

2 骨坏死细胞凋亡相关基因的研究

2.1 骨细胞凋亡与bcl-2基因 越来越多的学者发现, 激素与bcl-2基因有关, bcl-2蛋白通过阻断细胞凋亡信号传递系统的最后共同通道而抑制细胞凋亡, 从而促进细胞成活, 成为重要的细胞生成基因。Hockenbery等[14]研究发现, bcl-2蛋白能阻断内源性核酸内切酶的DNA切割活性, 从而阻断细胞凋亡。李卫哲等[15]研究表明大剂量激素抑制bcl-2表达, 促进骨细胞凋亡。Tsuji[16]研究了导致凋亡过程中的基因

表达, 发现在低氧状态下细胞更容易凋亡。他还发现在低氧并伴有高剂量激素状态下诱导细胞凋亡的P53、Bax基因和抑制凋亡的Bcl-2和MDM2基因均下调, 而在氧正常情况下, 高剂量的激素可使Bcl-2基因上调。他认为在低氧状态下高剂量激素更易引起凋亡。Zalavras等[17]也认为股骨头等特殊部位的细胞凋亡是激素和缺氧共同作用的结果。

2.2 骨细胞凋亡与P53基因 P53也是目前比较公认的与细胞凋亡相关的蛋白质分子。正常P53基因为细胞周期G1期DNA损伤点, 具有阻断细胞增殖和引起细胞凋亡的作用, 而且P53基因可通过上调C-myc、ICE、Fas抗原、Bax基因, 下调Bcl-2基因, 升高细胞内Ca2+浓度, 诱发细胞凋亡。黄永镇等[18]研究发现酒精性股骨头坏死时, P53蛋白上调, 而Bcl-2下调, 认为这是引起骨细胞凋亡的主要原因。

3 骨坏死细胞凋亡的调节

3.1 Caspase调节 赵建宁等[19]通过MTT绘制的生存曲线以及流式细胞仪分析细胞内DNA含量的方法, 证实了地塞米松能够诱导原代分离培养的成骨样细胞发生凋亡, 而且这种效应呈药物浓度和时间依赖性。Liu等[20]发现, Caspase家族是细胞凋亡的重要执行者, Caspase-3的活性在细胞凋亡过程中显著升高, 这说明地塞米松诱导成骨样细胞凋亡是依赖Caspase-3的, 这一结果与糖皮质激素诱导胸腺细胞等免疫细胞凋亡过程中的Caspase-9依赖性不同, 表明糖皮质激素可通过对Caspase家族不同成员的调节, 从而对不同种类的细胞进行调节。

3.2 Fas/FasL途径 Kogianni等[21]研究发现, 地塞米松诱导的骨细胞凋亡与Fas/Fasl凋亡途径有关。地塞米松可上调Fas蛋白在骨细胞膜上的定位, 从而调节骨细胞的凋亡。因为Fas的配体FasL与Fas结合后, Fas三聚化使胞内的死亡结构域构象改变, 然后与接头蛋白Fas相关死亡结构域结合, 其N端死亡效应结构域就能与半胱天冬酶Caspase-8前体蛋白结合, 形成死亡诱导信号复合体, 使得Caspase-8激活而启动Caspase级联反应, 从而激活Caspase-3、6、7, 这几种Caspase均可降解胞内结构蛋白和功能蛋白, 最终导致细胞凋亡。

3.3 NF-κβ途径 NF-κβ是重要的核内信号传导因子, 对细胞的生存起着关键的作用[22]。赵建宁认为, 地塞米松可能是通过抑制NF-κβ的活性而诱导成骨样细胞的凋亡。Emsa的实验结果也发现, 地塞米松明显抑制了NF-κβ活性, 从而诱导成骨样细胞的凋亡。而且研究发现, 糖皮质激素不但能直接抑制NF-κβ的活性, 还能够通过诱导NF-κβ抑制物IkB的生成来阻断NF-κβ与DNA位点的结合。

3.4 其他 Calder等[23]对非创伤性骨坏死患者骨标本采用免疫组织化学研究后发现, 一氧化氮合成酶含量增加。认为激素或酒精对骨细胞有直接的细胞毒作用, 导致一氧化氮增加。这对骨的修复和重建造成有害影响, 并介导凋亡发生, 并指出骨细胞的凋亡在股骨头坏死发病机制中发挥着重要作用。有学者认为激素性股骨头坏死还属缺血性坏死, 缺血缺氧情况下P38促分裂原活化蛋白激酶 (p38MAPK) 途径激活, 可促进低氧诱导的成骨细胞凋亡。