拟南芥DNA甲基化及去甲基化研究进展

表观遗传学 (Epigenetics) 的词根最早出现于2000多a前, 亚里士多德提出后生理论 (The Theory of Epigenesis) 。直到1975年, Holiday.R对表观遗传学进行了较为准确的解释, 他认为, 表观遗传学不仅在发育过程, 而且应该在成体阶段研究可遗传的基因表达改变[1]。经典遗传学认为, 核酸是遗传的分子基础, 生命的遗传信息都是由核酸序列决定的。然而随着现代分子遗传学的发展, 人们发现, 不仅DNA序列包含遗传信息, 核苷酸、组蛋白、染色质水平的修饰也会造成基因表达模式的改变, 并可以在后代中稳定表达。

DNA甲基化是最常见的表观遗传现象, 常见的DNA甲基化发生在DNA链上的胞嘧啶第五位碳原子和甲基间的共价结合, 胞嘧啶被修饰为5甲基胞嘧啶 (5m C) 。与之相反, DNA去甲基化则是指5甲基胞嘧啶 (5m C) 被胞嘧啶取代的过程。

1 拟南芥DNA甲基化模式

在拟南芥中, DNA甲基化包括从头开始甲基化及维持性甲基化。从头开始甲基化是指DNA两条链都没有甲基化, 通过甲基转移酶 (DNMTs) 先使其中一条链甲基化, 然后再使另一条链甲基化。维持性甲基化指DNA中已有一条链发生了甲基化, 在DNA复制过程中通过甲基转移酶来维持甲基化状态[2]。DNA甲基化主要发生在对称的CG, CHG序列和不对称CHH序列 (H代表A, G, C, T) 。其中CG甲基化的维持由DNA甲基转移酶MET1 (DNMT1-like enzyme) 调控, CHG由CMT3植物特异甲基转移酶来维持[3,4], 通过与KYP (H3K9me2甲基化转移酶) 形成回路, 维持CHG甲基化[5]。不对称的CHH甲基化在复制过程中不能保持, 由Rd DM (RNA介导的DNA甲基化) 通道的甲基转移酶DRM1和DRM2发挥作用而形成[6]。新的研究发现, 在met1和cmt3缺失突变体中, CHH基因组水平甲基化有更大的影响, 相较于drm1和drm2突变体, 这说明CMT3和MET1对于CHH甲基化可能有一定作用。此外维持CG, CHG甲基化可能也需要DRM1和DRM2作用[7]。拟南芥甲基化位点中, 1/3位点与si RNAs相关[8], 剩下2/3位点独立于si RNAs。甲基转移酶可以靶向依赖si RNA (si RNA-dependent) 通道和不依赖si RNA (si RNA-independent) 通道实现CG或者非CG甲基化。

1.1 MET1介导的CG甲基化

M E T 1具有与哺乳动物D N M Ts相同的结构域, 在DNA复制过程中, 发挥DNA甲基转移酶作用维持植物CG甲基化。此外, met1突变体表现出明显的花期延迟现象[9], 且通过全基因组甲基化分析发现其对于非CG甲基化水平也有一定影响。

1.2 CMT3介导的CHG甲基化

CMT家族含有染色质结合结构域编码植物特异甲基转移酶, 具有3个成员——CMT1、CMT2和CMT3, 主要参与维持CHG甲基化。拟南芥中, 通过对CMT3及KYP组蛋白甲基转移酶进行结构分析, 揭示CMT3与KYP形成协同反馈回路共同维持CHG甲基化及TE转座子沉寂[10]。KYP被招募到CHG甲基化位点通过SET和SRA结构域;同时, CMT3的BAH结构域识别H3K9me2甲基化位点, 招募CMT3形成CHG甲基化[11,12]。

1.3 Rd DM介导的CHH甲基化

在拟南芥中, 24个核苷酸大小的小干扰RNA (24n t s i R N A s) 和长链非编码R N A指导的重新开始D N A甲基化及转录沉寂过程即为RNA指导的DNA甲基化 (Rd DM) 。RNA介导的转录基因沉寂是一个保守的现象, 在真菌、植物、动物中都会发生。对于许多细胞内功能如转座子沉寂, 基因组稳定性, 细胞保持等功能维持具有一定作用[13,14]。Rd DM模型目前认为:RNA聚合酶Pol IV产生单链RNAs作为si RNAs前体, Pol IV与RNA依赖的RNA聚合酶II (RDR2) 紧密联系, RDR2对Pol IV的转录产物加工成双链RNA, 这个过程借助ATP依赖的染色质重塑因子CLSY1作用。ds RNAs被DCL3酶切成24-nt si RNAs小片段, 通过HEN1作用使si RNAs甲基化。单链si RNAs与AGO4或者AGO6[15]形成Rd DM效应因子复合物。AGO4复合物结合于RNA聚合酶Pol V;同时, Pol V转录需要蛋白复合物DDR (包括DRD1、DMS3、RDM1) 。其中, DRD1是ATP依赖的染色质调控因子, DMS3是黏连蛋白类似物, RDM1具有单链DNA结合活性。RDM1是Rd DM效应因子复合物的一部分, 既与AGO4相联系又与重新开始的甲基转移酶DRM2一起催化CG, CHG和CHH甲基化的形成。Pol V转录物的进一步扩增需要一些RNA结合蛋白, 其中SPT5L/KTF1被招募到Pol V转录独立于AGO4因子, 起着稳定效应因子复合物作用[16]。IDN蛋白复合物也结合于Pol V转录物招募SWI/SNF染色质重塑复合物, 一起参与异染色质形成。而最近又发现, DTF1识别组蛋白H3K9甲基化, 与CLSY1相互作用在Rd DM途径上游发挥作用[17]。

2 拟南芥DNA去甲基化模式

DNA去甲基化包括被动去甲基化和主动去甲基化。被动去甲化发生在DNA复制过程中, DNA甲基转移酶不活跃, 导致未被甲基化的位点保留在新合成的链中。而活跃的去甲基化独立于DNA复制, 存在5种可能的机制DNA糖基化酶初始的碱基切除修复机制、脱氨基作用及G/T碱基错配修复机制、核酸切除修复机制、氧化去甲基化机制及水解去甲基化[18]。在拟南芥中研究进展主要集中于DNA糖基化酶初始的碱基切除修复及氧化去甲基化两个机制上。其中, DNA糖基化酶家族中最先发现ROS1基因, 之后DML2和DML3等与ROS1功能类似的基因被发现, 也发挥着去甲基化作用。目前认为ROS1双官能团酶切除甲基, 切割碳链暴露缺口, 产生脱碱基位点, ZDP和APE1L将3'磷酸变成3'羟基, 最后通过DNA聚合酶和DNA连接酶进行缺口修复, 使甲基化位点脱甲基化[18,19,20]。ROS1是该通道中发挥作用的主要功能蛋白[19], 那么ROS1是怎么靶向特异的位点?最近研究表明, 甲基结合蛋白MBD7特异结合于高度甲基化的CG位点, 并通过与IDM2和IDM3的相互作用, 招募组蛋白乙酰转移酶IDM1催化H3K18和H3K23的乙酰化[21,22], 进而招募去甲基化酶ROS1和其他去甲基化酶来限制DNA甲基化的延伸, 防止基因沉默。氧化去甲基化机制揭示Jmj C蛋白对组蛋白H3K9和H3K36甲基化进行氧化去甲基化。在拟南芥中, Jmj C组蛋白去甲基化酶相关蛋白家族的成员IBM1被发现, 使组蛋白H3K9去甲基化, 阻止DNA中BNS (BONSAI——位点高度甲基化[23,24], 研究还发现负责可变剪切的EDM2等蛋白[25]通过调节H3K9去甲基化酶IBM1的表达参与DNA去甲基化。

3 拟南芥DNA去甲基化相关的酶

3.1 ROS1 (Repressor Of Silencing 1)

ROS1基因编码DNA去甲基化酶, 是一个双官能团蛋白, 既糖基化DNA又发挥裂解酶作用裂解DNA, 对于维持转基因及同源内源基因的表达非常重要。ROS1通过抑制启动子甲基化来抑制RD29A-LUC转基因沉寂及内源基因沉寂[19]。在ROS1活性缺失的情况下, Rd DM介导特异位点高度甲基化并使转录沉寂。

3.2 IDM1 (Increased DNA Methylation 1)

IDM1, 拟南芥DNA去甲基化的调控因子, 对于防止ROS1调控的同源多拷贝基因及重复序列基因的高度甲基化非常重要。通过亚硫酸盐测序发现在idm1突变体中造成拟南芥基因组DNA甲基化升高的位点与ros1突变体产生的甲基化位点有较高的重合度, 推测IDM1参与ROS1介导的去甲基化调控通路。IDM1结合于染色质中缺乏组蛋白H3K4二甲基及三甲基位点, 使组蛋白H3乙酰化创造一个染色质环境为后续ROS1发挥作用。IDM1是一个组蛋白H3乙酰基转移酶, 具有三个结构域。通过DNA甲基化识别MBD结构域识别CG甲基化位点, 植物同源PHD结构域识别未被甲基化的组蛋白H3K4表观遗传特征, 组蛋白乙酰基转移酶HAT结构域使组蛋白H3K18和H3K23乙酰化[26]。由于IDM1与ROS1不能共定位, 推测一个未知的与ROS1相互作用的蛋白可能识别乙酰化的H3K18和H3K23标志, 招募ROS1靶向特异位点进行DNA去甲基化作用。

3.3 IDM2及IDM3 (Increased DNA methylation 2and Increased DNA methylation 3)

IDM2属于高度保守的ACD蛋白家族, ACD蛋白最早在动物中发现, 在各种细胞内进程及抵抗逆境病害等方面有着重要作用[27,28,29], 在植物当中大部分ACD蛋白属于热休克蛋白[30] (s HSPs) .大量研究表明ACD蛋白作为分子伴侣发挥作用[27], IDM2是一个编码α-晶体结构域的核定位点白其转录水平并不受热激影响, 与IDM1具有相互作用证明它可能作为分子伴侣与IDM1一起参与组蛋白H3K18乙酰化, 在DNA活跃去甲基化及阻止转录沉寂中发挥作用[31]。IDM3与IDM2类似, 具有α-晶体结构域且与MBD7具有相互作用[21]。

3.4 MBD7 (Methyl-Cp G-Binding Domain)

之前研究表明, DNA活跃去甲基化主要是由ROS1蛋白发挥主要作用, 但是ROS1蛋白怎么靶向特异的甲基化位点并不清楚, 而研究发现MBD7在特异识别甲基化位点发挥作用。MBD7蛋白的N端为甲基化识别结构域特异性识别CG甲基化位点, C端有很强的染色质识别能力。与IDM2及IDM3具有相互作用, 进一步招募IDM1[26]及其他一些蛋白进行组蛋白H3K18和H3K23乙酰化, 为ROS1发挥作用创造染色质环境 (图1) 。mbd7突变体导致NPTII转基因沉寂但不影响Pro RD29A:LUC转基因沉寂, 全基因组甲基化位点分析mbd7突变体甲基化位点与ros1突变体造成的甲基化位点有部分重合, 推测MBD7可能是ROS1调控通道中的蛋白[22], 且MBD7靶向靠近染色体中心高密度DNA甲基化位点, 同时影响Gypsy类型反转座子活动。

3.5 ZDP (Zinc Finger DNA 3’Phosphoesterase)

ZDP突变体导致DNA高度甲基化及报告基因转录沉寂, 全基因组甲基化分析zdp突变体使上百个内源基因位点高度甲基化, 并且发现DNA磷酸化酶ZDP与ROS1具有相互作用, 是ROS1活跃去甲基化分支的下游蛋白[32]。ROS1作用位点后产生单核苷酸缺口, ZDP将3'磷酸变为3'羟基, 通过单链核苷酸切除和长链DNA合成[33,34], 使后续发生DNA聚合及连接反应修复缺口, 实现去甲基化过程。最近又发现ROS1作用后的位点并不继续β, δ裂解而仍然是β裂解产物, 产生3'不饱和醛基, 不依赖于ZDP活动, 可能通过AP核酸内切酶 (APEs) 发挥作用。

3.6 APE1L (Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease)

APE1L, 拟南芥AP核酸内切酶的一种, 与ROS1蛋白在体内共定位。ROS1蛋白β裂解产生3'不饱和醛基, 随后APE1L将不饱和醛基转换成3'羟基。生化数据表明APE1L有微弱的3'磷酸活性, 证明APE1L属于ROS1调控通道另一分支的DNA活跃去甲基化下游蛋白, 独立于ZDP分支通道 (图2) 。通过对突变体ape1l全基因组高度甲基化检测[20]。推测APE1L是一个多功能酶, 可能与ZDP一起作用于DME糖基化酶调控通道, 控制胚乳中印记基因及种子的生长。

3.7 IBM1 (Increase in BONSAI Methylation 1)

IBM1是组蛋白H3K9me2去甲基化酶, 在拟南芥中一方面, 甲基转移酶CMT3与组蛋白甲基化酶KYP产生CHG甲基化及组蛋白H3K9me2;另一方面, 由存在的CG甲基化招募IBM1发挥去除KYP产生的H3K9me2作用 (图3) 。IBM1调控的甲基化位点位于IBM1基因的一段很长且高度保守的内含子上 (BONSAI位点) , 编码两种m RNA变体, 长链变体 (IBM1-L) 和短链变体 (IBM1-S) 。IBM-L编码有功能的IBM1蛋白包含jmj C结构域[24], 有实验证明在met1突变体中由于CG甲基化缺失, 短链变体 (IBM1-S) 表达量不受影响, 长链变体 (IBM1-L) 的表达量下调, 导致H3K9me2的聚集。同时, ROS1去甲基化酶的活性也受到影响[23,24]。因此, 通过控制H3K9去甲基化酶及DNA去甲基化酶活性, 形成自我调控的回路维持CG甲基化及组蛋白修饰。

3.8 EDM2 (Enhanced Downy Mildew 2)

染色质调控因子EDM2在阻止转录沉寂和DNA高度甲基化方面起作用, 包含植物同源结构域识别活跃的或者受抑制的组蛋白甲基化标志。EDM2通过促进m RNA转录产生3'ploy A末端来调控组蛋白H3K9去甲基化酶基因IBM1的表达, 一起控制GHG甲基化和转录基因沉寂。edm2突变体与ibm1及DNA糖基化酶三突变体rdd重合上百个高度甲基化区域, 其中包括与ROS1靶向区域[25]。研究认为类似于IDM1, EDM2和IBM1可能一起创造合适的染色质环境以便后续ROS1发挥作用, 同时还发现EDM2在一些转座子的沉寂方面也有着一定的作用。

4 结语与展望

D N A甲基化、组蛋白修饰、非编码R N A调控、染色质结构重塑、RNA干扰、基因组印迹、基因沉默、X染色体不活跃等都属于表观遗传学范畴。其中, DNA甲基化是表观遗传学重要的标志之一, 发展了各种方法检测DNA甲基化水平。在拟南芥中主要应用了甲基敏感酶进行核酸杂交 (Southern blotting) 及酶切P C R (C H O P P C R) 检测, 单个位点重亚硫酸盐测序 (Bisulfite sequencing) , 染色质免疫共沉淀序列分析 (Ch IP-seq) , 全基因组重亚硫酸盐测序 (Whole genome bisulfite sequencing) 等, 为进行相关研究提供了极大便利。目前, 研究DNA甲基化对于控制转座子活动、植物生长发育、调节转录基因表达、如X染色体不激活、基因印迹等方面起着重要的生物学作用。对于DNA甲基化机制的研究也逐渐趋于完善, 但是对于DNA甲基化与其他表观遗传调控机制如组蛋白修饰, 染色质结构等方面的关系仍然不是很清楚, 这将是今后研究的一个重点。

与DNA甲基化相反, DNA去甲基化在阻止转录基因沉寂, 防止特异位点高度甲基化等方面发挥重要作用。目前, 对于DNA去甲基化的研究上不够完善, 如ROS1糖基化酶的碱基切除修复机制的下游机制如何进行?是否存在其他独立于ROS1的活跃去甲基化机制及其如何发挥作用等方面尚不清楚。

DNA甲基化的水平主要由甲基化和去甲基化这两个途经来协同调控。因此, 有关DNA甲基化及去甲基化研究必将有力地促进表观遗传学的研究进程, 进一步提高人们对于表观遗传学的认识, 为其将来的应用奠定坚实的基础。

摘要：DNA甲基化及去甲基化是表观遗传的重要标志, 广泛存在于细菌、动物、植物中, 在控制转座子转录沉默、调控基因表达 (X染色体失活, 基因印迹, 副突变) 、维持植物发育等方面发挥重要作用。DNA表观修饰不改变基因序列, 仅改变碱基修饰, 并通过有丝分裂或者无丝分裂在后代中遗传。DNA甲基化是在甲基转移酶作用下, 以S腺苷甲硫氨酸为甲基供体, 使DNA胞嘧啶发生甲基化。研究发现, DNA去甲基化普遍存在于生物体内, 在植物中, DNA糖基化酶介导的碱基切除修复机制被发现。基于此, 对模式植物拟南芥中存在的DNA甲基化及去甲基化机制进行综述。

关键词：DNA甲基化,DNA去甲基化,表观遗传学

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