常绿大戟乳胶中天然橡胶的提取及其鉴定

许多植物物种都会散发出一种乳状、颜色各异的汁液, 这种汁液称为乳胶。乳胶是一种多元化的组合物, 其包括生物碱、萜类化合物和聚合物物质, 如树脂、树胶、淀粉、油、大量的蛋白质和酶活性1-3。目前, 对乳胶的生物学作用还没有普遍认同的观点。乳胶作为营养或水储备的功能, 或作为植物废弃的代谢产物的功能已多次被提出。乳胶通过抵制食草动物和昆虫、杀死或抑制微生物植物病原菌的生长、密封伤口等方式为植物防御机制做出重要的贡献2, 4。

乳胶是构成乳管的胞质物5。目前已知的大部分关于乳胶和乳管的生物化学知识源于对巴西橡胶树的研究, 它做为天然橡胶的主要来源, 是一种具有经济价值的大戟科植物。根据一些细节的调查显示, H.巴西乳胶蛋白质组含有一系列的蛋白质, 由这些天然橡胶制成并含有蛋白质的产品, 在正常使用中可引起致敏人的过敏反应, 如医护人员所穿的服装和手术手套6, 7。

银胶菊 (灰色) , 俗称银胶菊, 能生产出高分子量的天然橡胶, 作为低过敏性胶乳的一个可行的商业替代品可与H.巴西乳胶相比8–10。其他类似的高品质天然橡胶来源是橡胶植物, 它们原产于哈萨克斯坦和乌兹别克斯坦的山区, 橡胶草, 鸦葱属植物, 以及乌兹别克斯坦鸦葱11, 和容悦庄印度榕树12。高分子量的天然橡胶已被证实存在于两种生菜种类, 即野莴苣和莴苣13。

低分子量橡胶, 作为研究天然橡胶的良好范本, 源于向日葵14, 无花果树 (橡皮树和无花果) 15, 16, 大戟属植物大戟草17和灌木大戟18。据报道, 银胶菊橡胶的低分子量部分可以被修改, 以产生环氧化天然橡胶的低粘度类似物19。环氧化聚合物提高了硫化橡胶组合物的物理性质, 特别是耐磨耗性和耐油性。因此, 即使低分子量橡胶不适合高性能的应用, 它们仍然可以用来作为一种增塑剂或加工助剂, 或可以作为原料用于生产类似于由天然橡胶生产的具有很高价值的特种聚合物的衍生物18。

另一种可生产橡胶的植物是桑科植物 (木菠萝) 的菠萝蜜。从菠萝蜜中提取的橡胶是研究分析天然橡胶的良好范本, 因为可以从它的水果和躯干中同时获取低分子量和高分子量的橡胶17。

乳胶植物已得到广泛的研究, 但相对鲜为人知的是来自大戟属植物的乳胶的生化特性, 尽管一些作者正在努力填补这一空白20-26。

我们选择地中海灌木常绿大戟作为替代品和互补的实验范本来研究植物乳胶生物化学的复杂性。常绿大戟是一种灌木, 少汁大戟科, 通常可广泛生长于地中海盆地的不同环境中 (岩石山坡、公路绿化带、开阔的树林和橄榄园) 。这种大戟科植物包含多种生物活性化合物, 如萜类、生育酚、脂肪酸和甾醇。此外, 一些论文中也提到常绿大戟的胶乳中蛋白质和酶的存在27-30。

我们在这份论文中将阐述常绿大戟的胶乳中的天然橡胶的提取及其结构表征。

1材料与方法

1.1试剂

由西格玛化工 (圣路易斯, 美国) 提供的乙酸, 乙腈, 丙酮, 苯, 乙醇, 环己烷, 甲苯, 三氯乙酸 (TCA) , 和Triton®X-100。

1.2植物材料和橡胶提取

从南撒丁岛 (意大利) 的一些地区中已达到最终高度 (1-1.5米) 的成熟植物中收集而来的常绿大戟乳胶, 顶部切枝。立即将胶乳提取并且不进行存储。运用四种不同的提取方法以试验出最佳的橡胶产量。胶乳 (100毫升) 的萃取:

1.丙酮 (100m L) ,

2.乙酸 (5 m L) ,

3.三氯乙酸 (10 m L) ,

4.Triton®X-100 (1m L) 。

在12, 000rpm下, 将该混合物分别放在玻璃试管中预先称重30分钟。将 (1) 中含有橡胶的沉淀物直接进行纯化处理, 而将 (2) , (3) , (4) 中凝固的橡胶分别用去离子水洗涤并在真空下458C下干燥过夜。

从丙酮提取沉淀残余物, 并从其他提取方法中得到凝聚干燥橡胶, 将它们放置在恒定258℃的环境中摇动过夜, 以使它们分别溶解在环己烷中, 以12, 000rpm离心30分钟, 以除去不溶于环己烷的部分。橡胶是通过乙醇沉淀从可溶环己烷中得到的。重复5次处理环己烷/乙醇, 将沉淀物在真空下干燥, 最后称重以测定橡胶的百分比。

从丙酮中萃取的沉淀残余物选择性地溶解在苯中, 并以12, 000 rpm离心30分钟。将部分苯进行旋转真空蒸发以除去溶剂, 这样橡胶的百分比就可以通过称量从苯提取的残留物进行测定。

不溶于环己烷的残留物和不溶于苯的材料则被认为是污染物。

1.3天然橡胶凝胶含量

为确定天然橡胶中的凝胶含量, 将0.2-0.3克的橡胶片分别浸泡在过量的甲苯中24小时。将该溶液用120μm尼龙网过滤盘 (马赛诸塞州比勒里卡, 密理博公司) 进行过滤。残留在过滤器的上的干燥物的重量, 即凝胶的重量, 以原始橡胶的总重量为基础进行计算。

1.4乳胶树脂含量

为确定树脂的含量, 将1m L的常绿大戟乳胶与2m L的丙酮混合。将该混合物以12, 000 rpm离心30分钟, 然后将丙酮提取物到转移到预先称重的小瓶中, 在658C环境下使用快速真空离心浓缩器 (艾本德公司, 德国) 使其在真空下蒸发。将小瓶称重, 残余的干燥物, 即树脂的重量以总乳胶重量为基础进行计算。树脂含量也通过紫外光吸收来确定。丙酮可溶物提取物的上清液等份与乙腈混合 (比例1:10) 。将丙酮和乙腈置于658C真空下, 使用快速真空使其蒸发至近干。将该过程重复三次, 残留的液体最终为1m L乙腈与涡旋混合物, 然后用分光光度法进行分析, 以确定最大波长和消光系数。

乳胶中的水含量可以用低压冻干后的干重来计算。

橡胶、凝胶、树脂、污染物, 以及乳胶中的水至少被计算为五种不同的测量值。

1.5分子量和分子量分布

分子量通过凝胶渗透色谱法 (GPC) 进行测定。从聚合物标准服务 (PSS) 有限公司 (德国美因茨) 获得高效液相层析 (HPLC) 使用串联三列 (ID 8 mm×300 mm) , 填充苯乙烯二乙烯苯共聚物 (5μm;102, 103, and 105埃) 并用四氢呋喃 (THF) 作为洗脱剂, 并进行分析。色谱图在23℃下用折射率检测器 (RI) 进行记录。将样品 (3g/L) 溶解于四氢呋喃 (THF) 中, 在室温下搅拌过夜。清澈的样品溶液通过1.0μm过滤装置 (Schleicher和Schuell) 进行过滤然后通过一个自动进样器注入50μL的溶液。PSS的聚异戊二烯从1到1000 k Da的标准被用于制备校准曲线。

1.6分光光度法

利用Ultrospec2100分光光度计 (英国剑桥柏楉有限公司) 测量1cm路径长度细胞的吸收光谱。

1.7红外光谱

傅立叶变换红外光谱 (FTIR) , 集中于400 cm-1至4000 cm-1的中间区域, 当位于4cm-1且分辨率超过64使用布鲁克矢量22型分光光度计 (布鲁克公司) 进行平均扫描。将样品溶解于苯, 然后浇铸在溴化钾 (KBr) 压片上, 形成薄膜。

1.8核磁共振光谱

核磁共振光谱可以通过Inova NB瓦里安仪 (加利福尼亚州帕洛阿尔托, 瓦里安科学仪器) 进行收集。将橡胶提取物溶解于0.7 m L的C6D6。1H NMR核磁共振光谱在40℃下以每2秒499.843兆赫的频率进行收集。相对于C6D6中央峰7.17 ppm, 1H NMR核磁共振化学位移为百万分之一 (ppm) 。

13C NMR核磁共振光谱在40℃下以每3秒125.681兆赫的频率进行收集。相对于C6D6中央峰, 13C NMR核磁共振化学位移以ppm为单位表达, 与C6C6相关的中央峰值为128ppm。

2研究结果

2.1橡胶、凝胶和树脂

天然橡胶用丙酮、乙酸、三氯乙酸、Triton®X-100经四种不同程序从常绿大戟中提取。用环己烷/乙醇对获取的橡胶原料进行连续纯化处理。用丙酮提取橡胶原料, 或用苯纯化处理。图1比较了提取和纯化过程中得到的橡胶产率。用乙酸提取可得到较高的橡胶产率 (14.3%) , 而其他提取方法得到的橡胶产率约为7-13%。用两种不同的纯化处理方法 (环己烷/乙醇和苯) 从橡胶原料中提取得到的橡胶的产量只有细微的差别。同从巴西橡胶原料中提取的橡胶产率相比, 用乙酸方法获取的橡胶产率较低, 但它的橡胶产率与橡胶含量为6-12%的其它橡胶植物接近, 且与橡胶含量为0.4-0.7%的菠萝蜜相比, 用乙酸方法获取的橡胶产率约为20倍以上。

图通过不同方法从常绿大戟乳胶中获取的橡胶产率。数值以百分比w/v表示, 它显示了含水量为72%的100 m L胶乳在经过环己烷/乙醇处理后, 其乳胶含量的变化。纯化过程中, 乳胶原料可以用苯 (丙酮*) 代替丙酮进行萃取处理。

用乙酸和环己烷/乙醇萃取橡胶样品中的凝胶含量是橡胶重量的2.5%。

重量法测定的树脂含量达到了9.1% (w/v) 。用紫外光谱检测常绿大戟乳胶中回收的树脂量。树脂的乙腈溶液在消光系数为3.9 cm–1 (mg/m L) –1时最大吸光度为261nm。A261和丙酮可溶物质的重量分析测定之间呈线性关系 (数据未标出) 。

表I显示了一定量的常绿大戟乳胶中, 水、树脂、橡胶、凝胶、和污染物的含量。

对用乙酸进行提取, 并用环己烷/乙醇进行纯化处理的橡胶进行结构分析。

2.2分子量

估量常绿大戟乳胶中天然橡胶的分子大小。将用乙酸进行萃取和用环己烷/乙醇进行纯化得到的干燥物质溶解在THF中, 并依据GPC使用RI进行检测。常绿大戟乳胶天然橡胶显示出单峰分子量的分布 (图2) 。在多分散性指数为2.9Mw/Mn情况下, 数均分子量 (Mn) 为31, 500, 而重均分子量 (Mw) 为93, 000。用同样的方式说明了菠萝蜜和常绿大戟17中的橡胶分别以分散性指数为105Mw的分子量进行窄和宽的单峰分布。

w/v值表示为百分比。

a橡胶用乙酸萃取, 然后用环己烷/乙醇纯化处理。

b以橡胶的重量为基准计算出凝胶的重量。

2.3红外光谱分析

常绿大戟胶乳中的橡胶显示了红外波段的顺式1, 4聚异戊二烯特性在1664和835 cm–1, 这是分别由C=C的拉伸和C-H弯曲形成的 (数据未标出) 。

NMR核磁共振分析

图3显示了常绿大戟乳胶中提取的500赫兹1H NMR核磁共振谱橡胶, 并将其溶解在C6D6里。该提取物的1H NMR核磁共振谱表明了5.31, 2.17和1.73 ppm这三个主峰, 它们形成分别是由于烯烃、亚甲基和甲基的质子的顺式1, 4聚异戊二烯, 证实了该提取物的苯可溶部分主要由天然橡胶构成的, 并与红外数据相一致。

图2常绿大戟乳胶中橡胶分子量分布图。X轴代表分子量 (道尔顿) , Y轴表示w× (log M) , 其中w表示质量分数不恒定的摩尔质量增量 (log M) 。

图3常绿大戟胶乳中提取的橡胶在C6D6中的1H NMR核磁共振谱。将7.17 ppm每赫兹共振C6D6作为内化学位移的参考。在纯化过程中使用环己烷的*1H NMR核磁共振残差信号 (1.43 ppm) 。插图显示了 (A) 3.9-4.2和 (B) 1.56-1.66 ppm的扩展范围。

在1H NMR光谱中, 峰值4.05 ppm (图3, 插图A) 的出现可能是由亚甲基端基, CH2-OH或CH2-OP17, 32所致。因此, 仅仅利用1H光谱来区分他们几乎是不可能的, 而13C光谱可以解决这个模棱两可的问题 (见下文) 。值得注意的是, 由于酯端基的存在17, 32, 当共振位于4.72 ppm时我们无法观察到光谱的存在。

图3的插图B进一步展示出了在1.65-1.56 ppm范围内几个大信号谐振的存在。这些可以归因于一个二甲基烯丙基在ω-末端的反式构型, 甲基质子的反式异戊二烯单元在1.58、1.62和1.64 ppm分别以ω-反式-反式, 反式-反式-顺式序列的形式存在17, 32。

图4显示了13C NMR光谱。图中显示了观察到的135.2, 125.1, 32.2, 26.4和23.4 ppm五个特征峰。这些峰的出现源自两个烯、二亚甲基和顺式-1, 4-聚异戊二烯的甲基的碳原子, 它们分别与1H NMR光谱保持一致33。光谱也显示了反式异戊二烯的C-1的亚甲基碳原子40.2717和59.41ppm谐振的存在。在后者共振以及上述4.05ppm的1H信号的基础上, 常绿大戟橡胶的一个末端可以被确定为CH2-OH羟基基团。事实上, 在64.54ppm无法观察到CH2-OP谐振。

图4将常绿大戟乳胶中的橡胶13C NMR光谱溶于C6D6中。溶于128.0 ppm C6D6的13C NMR光谱中央峰被用来作为内部化学位移的参考。

3结语

本研究的结果表明, 常绿大戟乳胶中含有天然橡胶。最佳的橡胶提取方法是首先与乙酸反应, 然后用环己烷/乙醇纯化处理。通过1H NMR, 13C NMR和FTIR光谱的研究, 该橡胶的结构可以被确定为顺式-1, 4-聚异戊二烯。

天然橡胶的分子量对橡胶制品的加工性能具有非常重要的作用。巴西橡胶树物种的天然橡胶显示出其分子量和分子量的分布。分子量及其分布取决于克隆和橡胶树, 以及种植园的环境条件和收集后乳胶材料的处理方法34。众所周知, 不同植物物种生产的橡胶分子大小各不相同, 天然橡胶的分子大小是通过酶的作用来决定的。体外生物化学研究表明, 多种因素的组合必须有助于橡胶体内的分子量15。常绿大戟乳胶中呈单峰分子量分布的橡胶具有低分子量。因其他低分子量的天然橡胶则不适用于高性能应用, 则常绿大戟胶乳可以被用作生产类似于由天然橡胶生产的高附加值特种聚合物衍生物的原料18。

我们未来的目标是研究常绿大戟乳胶的合成, 分析橡胶颗粒以及与它们相关的酶, 研究橡胶转移的动力学数据并搜索更多关于橡胶结构的详细信息。我们坚信, 常绿大戟的乳胶成分的研究将在根本上有利于常绿大戟乳胶成分的广泛理解。

摘要：常年生长于地中海的灌木常绿大戟乳胶中的天然橡胶首次得到确认和鉴定。可用四种不同的物质来提取常绿大戟中的天然橡胶, 即:丙酮, 乙酸, 三氯乙酸, 和Triton?X-100, 并用环己烷/乙醇进行连续处理。大戟乳胶中的橡胶含量为14% (w/v) , 低于巴西三叶胶的30-35%的橡胶含量, 但近似其它生产橡胶植物的橡胶含量。大戟乳胶的分子量为93000, 其中Mw/Mn为2.9。1H NMR, 13C NMR和FTIR分析揭示了天然橡胶的顺式1, 4聚异戊二烯的典型特性。这些研究结果为研究乳胶成分提供新的见解, 并最终有利于对大戟乳胶成分的更广泛理解。?2012威利期刊公司。生物聚合物97:589-594, 2012。

关键词：大戟乳胶,乳胶,天然橡胶,1, 4-聚异戊二烯

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