肾结石与饮食研究论文提纲

2022-11-15

论文题目：氢化镁调控PLIN2缓解结晶肾损伤的作用和机制研究

摘要：研究背景肾结石是全球的常见疾病,可以导致慢性肾脏病,甚至肾脏丧失,给许多国家带来了沉重的社会经济和医疗负担。2017年全国关于肾结石的流行病调查显示:肾结石的发生率为6.4%,且10年的复发率为52%。肾结石的发病率在全球范围内都在增加,这些增加在性别、种族和年龄上都可以看到,代谢功能障和饮食习惯的改变可能是一个关键的驱动力,此外,全球变暖可能会影响这些趋势。最近的流行病学研究表明,肾结石与心血管疾病、高血压、肥胖、糖尿病、代谢综合征有关,这些都是公认的慢性肾脏病（Chronic Kidney Disease,CKD）危险因素。因此,深入研究肾结石的发生、发展机制,加强预防和治疗迫在眉睫。大量的研究已经证实80-90%的结石成分为草酸钙（calcium oxalate,Ca Ox）。无论是动物实验还是临床实验均显示,肾小管上皮细胞暴露于高草酸或Ca Ox结晶中,晶体中会产生过量的活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）,导致损伤和炎症。在结石患者和实验诱导的Ca Ox肾结石大鼠的尿液中都可以检测到氧化应激和炎症的主要标志。抗氧化处理可以减少草酸钙结晶肾动物模型的肾脏损伤。由此可见,氧化应激和炎症反应在整个Ca Ox结石形成、进展过程中起着重要作用。氢作为自然界最简单和最丰富的元素,曾经被认为对高等生物没有任何生物学效应,自日本科学家发现氢气可通过选择性抗氧化治疗疾病后,氢气在各个领域得到广泛的关注和研究,且发现氢气在多种疾病模型和人类疾病中显示出预防和治疗效果。近年来,固态氢载体的生物学效应,成为氢医学的热点。纳米氢化镁（MagnesiumHydride,Mg H2）是一种新型高效的镁基储氢材料,具有高储氢、质量轻等优点,能够水解缓慢释放氢气,持续时间长。2016年首次有学者将氢化镁用于生物学研究,研究结果提示氢化镁能够改善喂食高脂饮食的野生型小鼠的血浆甘油三酯水平,并延长了它们的平均寿命,可能的机制是氢化镁在体内产生氢气,氢气刺激过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α（PGC-1α）基因表达促进脂肪酸代谢。因为氢化镁较氢气具有携带方便,使用方便,且体内缓慢释放氢气,具有一定的量效关系,所以推测氢化镁对结晶肾损伤模型应有一定的改善作用。但是氢化镁对结晶肾损伤的保护机制仍不明确,需要进一步研究。Perilipin2（PLIN2）是一种脂肪相关分化蛋白,主要定位于细胞内脂滴表面,促进胞内脂滴形成,保护甘油三酯免受脂解。PLIN2作为特异性性标记物可以推测动脉粥样硬化的脂质积聚情况,而且还可以影响多种代谢相关性疾病如胰岛素抵抗、糖尿病、脂肪肝及肥胖症等都。本研究旨在探讨氢化镁是否具有改善结晶肾模型肾损伤的程度及是否能够通过PLIN2发挥其改善作用。研究目的一、氢化镁改善草酸盐诱导的结晶肾损伤的作用研究二、氢化镁缓解结晶肾损伤的潜在靶点筛选三、氢化镁调控PLIN2缓解结晶肾损伤的机制研究研究方法一、动物模型的建立及分组动物实验一:购买36只雄性野生型C57B/L6小鼠（8周龄）,随机分为6组,分别是盐水组（Con,n=6）、乙醛酸盐组（Gly,n=6）、乙醛酸盐+氢化镁50mg/Kg组（Gly+MH50,n=6）、乙醛酸盐+氢化镁100mg/Kg组（Gly+MH100,n=6）、乙醛酸盐+氢化镁200mg/Kg组（Gly+MH200,n=6）、乙醛酸盐+氢化镁400mg/Kg组（Gly+MH400,n=6）。动物实验二:另40只雄性C57BL/6小鼠（8周龄）,随机分为5个实验组:盐水组（Con,n=8）;乙醛酸诱导的草酸钙结晶组（Gly,n=8）;乙醛酸+氢化镁组（GH,n=8）;乙醛酸+氢氧化镁组（GOH,n=8）;乙醛酸+玉米油组（GV,n=8）。动物实验一:提前2天分别使用50、100、200、400 mg/kg剂量的Mg H2灌胃治疗。第3天给予乙醛酸盐腹腔注射造模,1天一次,连续注射5天,第8天处死小鼠。动物实验二:提前2天分别予氢化镁（200mg/kg）、氢氧化镁（450mg/kg）、玉米油0.1ml灌胃,第3天给予乙醛酸盐腹腔注射造模,1天一次,连续注射5天,第8天处死小鼠。二、肾组织病理染色肾组织取材固定后,进行常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、烘片,按照实验步骤,进行H＆E、Masson、Vonkossa、免疫组化、免疫荧光等染色,使用光学显微镜和荧光显微镜进行拍照。三、小鼠肾功能及氧化应激指标的检测小鼠麻醉后,眼球取血、静置、离心、取上清,备用。采取竞争法酶联免疫吸附检测技术（ELISA）,购买相应检测指标的Kit,根据实验步骤检测。四、细胞培养、分组和干预使用小鼠肾小管上皮细胞（TCMK-1）作为体外实验细胞,配制DMEM培养基,在DMEM培养基中加入10%胎牛血清和1%双抗（青霉素-链霉素-两性霉素B溶液）。细胞实验分组:Con组:TCMK-1细胞,每天定时观察细胞状态、更换新鲜培养基未添加任何刺激;Na Ox组:加入草酸钠浓度（0.5m M）共孵育,在培养箱中培养24小时;Na Ox+H2组:加入草酸钠浓度（0.5m M）后放入含氢细胞培养箱12小时,12小时后取出放培养箱中继续培养。Con+H2组:TCMK-1细胞同样放入含氢细胞培养箱12小时,12小时后取出放培养箱中继续培养。五、细胞活力检测使用CCK-8检测试剂盒检测,根据实验步骤,在96孔培养板中加入不同浓度的草酸钠,在培养箱中孵育不同的时间,另一个96孔板增加含氢培养,最后加入CCK-8溶液,利用酶标仪测定其在450nm处OD值。六、细胞内ROS检测配制DCFH-DA至10umol/l,将收集好的细胞置于DCFH-DA中,放入细胞培养箱内20分钟取出,流式细胞仪检测DCF水平。七、细胞线粒体膜电位的检测根据试剂盒的说明将CCCP（10m M）1:1000加入到细胞培养液中,配成终浓度10μM,孵育细胞20分钟,装载JC-1,通过流式细胞仪检测线粒体的膜电位。八、组织与细胞蛋白检测利用总蛋白提取试剂提取组织或细胞蛋白,研磨、离心、取上清液,BCA法检测样品蛋白的浓度,加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X）,100℃金属浴,5-10min。-20℃冰箱保存,通过蛋白免疫印迹法检测进目的蛋白水平。九、组织和细胞RNA检测使用Trizol试剂提取组织或细胞总RNA,检测RNA浓度,利用商品化kit使m RNA转变为c DNA,SYBR Green染料法检测实时荧光定量PCR。十、代谢组学、高通量转录组检测和生物信息学预测利用超高压液相色谱-四级杆-时间飞行串联质谱（UPLC/Q-TOF-MS）方法检测肾组织代谢组学。高通量转录组检测步骤:肾组织总RNA提取、总RNA纯度和完整性检测、文库构建、上机测序、测序数据质控、序列比对分析、表达量分析、表达量差异分析、RNA-SEQ筛选差异基因、GO分析及KEGG分析、差异基因筛选及验证。使用NCBI GEO Data Sets验证PLIN2在肾脏的表达水平。预测PLIN2上游转录因子步骤:首先利用NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索PLIN2上游启动子序列;接着利用UCSC数据库（http://genome.ucsc.edu/）预测与PLIN2启动子结合的转录因子;然后利用JASPAR数据库（http://jaspar.genereg.net/）分析预测的转录因子与PLIN2上游启动子序列的结合位点。十一、统计学方法计量数据采用（均数±标准误）表示,应用Grapha Pad软件绘制统计图表绘制及分析数据,采用两独立样本t检验和单因素方差分析one-way ANOVA进行各组之间的统计分析,各组间两两比较采用Tukey post-hoc检验,p＜0.05表示组间有统计学差异。结果一、氢化镁改善结晶肾损伤的病理评价（一）氢化镁治疗结晶肾损伤的具有剂量效应关系通过给予不同剂量的氢化镁干预乙醛酸盐诱导结晶肾损伤小鼠,肾组织行H＆E、Masson、Vonkossa染色等,发现随着氢化镁剂量的增加,肾损伤程度逐渐减轻,而且结晶/结石沉积有所减少,氢化镁200mg/kg和400mg/kg改善作用无明显差异,为后续动物实验奠定了基础。（二）氢化镁改善结晶肾损伤模型肾功能及肾小管损伤小鼠肾组织病理结果显示,乙醛酸盐诱导的小鼠肾小管急性损伤明显,伴有大量草酸钙结晶沉积,且纤维化相关指标FN、TGF-β显著高表达,TUNEL染色,凋亡细胞明显,氢化镁治疗组,不仅小管急性损伤有所改善,草酸钙结晶也明显减少及FN、TGF-β、凋亡细胞均显著减少。同时氢化镁治疗组小鼠肾功能有所改善。氢氧化镁组和玉米油组均无上述作用。二、氢气对草酸钠处理后的TCMK-1细胞活力及氧化应激的影响细胞CCK8结果提示氢气可以改善草酸钠诱导的TCMK-1细胞活力的下降。草酸钠诱导TCMK-1细胞内ROS水平升高,并使线粒体膜电位下降,氢气能够降低草酸钠诱导产生的ROS,并通过上调线粒体膜电位改善线粒体的功能。三、小鼠肾组织代谢组学分析用UPLC-Q-TOF/MS分析5组小鼠肾组织匀浆（Con,Gly,GH,GOH,GV）样品,结果显示草酸钙晶体肾损伤模型出现代谢紊乱,主要包括能量代谢、磷脂代谢和氨基酸代谢途径的变化,而氢化镁治疗在一定程度回调上述代谢紊乱,其中以磷脂代谢回调最显著。磷脂作为生物膜的主要成分,在氢化镁治疗后显著逆转,表明氢化镁的治疗可能是通过细胞膜保护实现的。四、小鼠肾组织高通量转录组测序与分析利用RNA-SEQ对氢化镁治疗的结晶肾小鼠进行差异基因筛选,得到差异基因总数2539,其中上调基因总数1543个,下调基因996个,并对差异基因进行GO分析及KEGG分析。选择部分差异基因进行q RT-PCR验证,与测序结果相一致。结合肾组织代谢组学结果,选择与脂质代谢高度相关的PLIN2基因作为下一步研究对象。五、PLIN2相关转录因子生物信息学预测和体内外验证利用生物信息学筛选出4个重要的PLIN2上游转录因子,分别是STAT4、C-JUN、PPARγ和PPARα,选择强相关的C-JUN和STAT4进行下一步验证发现p-C-JUN在结晶肾小鼠肾组织中高表达,且定位于肾小管上皮细胞胞核内,体内外实验WB检测也证实p-C-JUN在模型组升高,氢化镁治疗后可回调,与PLIN2趋势一致,p-STAT4在小鼠模型中没有高表达,且没有定位在上皮细胞核内。六、氢化镁改善结晶肾损伤小鼠氧化应激、炎症和脂质过氧化水平体内实验:利用ELISA方法,检测结晶肾小鼠血清炎症指标（TNF-α,IL-1β）,氧化应激指标（GSH,NO）,脂质过氧化指标（MDA,4HNE）,结果提示,氢化镁可以有效的改善结晶肾损伤的炎症反应、氧化应激和脂质过氧化水平。体外实验:流式细胞仪记录草酸钠处理后TCMK-1细胞内ROS的水平和线粒体膜电位,结果提示,Na Ox组细胞内ROS水平升高,线粒体膜电位下降,氢气处理后,上述指标均可回调。结论一、氢化镁能够有效的缓解结晶肾肾小管损伤,改善肾功能,改善机体炎症、氧化应激和凋亡水平。二、氢化镁可能是通过清除ROS,抑制C-JUN活化,下调PLIN2,改善脂质过氧化来实现的。

关键词：氢化镁;结晶肾;活性氧;脂质过氧化;脂肪分化相关蛋白Perilipin2;C-JUN氨基末端激酶

学科专业：内科学（肾病）（专业学位）

摘要

abstract

缩略词表

第一部分氢化镁在结晶肾损伤中的作用研究

一、前言

二、材料与方法

三、实验结果

四、分析与讨论

五、小结

参考文献