动物心肌梗死管理论文提纲

2022-11-15

论文题目：炎症微环境的免疫调控与血管重构分子机制的研究

摘要：1研究背景急性冠脉综合征（acute coronary syndrome,ACS）是由于冠状动脉粥样硬化斑块糜烂或破裂,从而引起斑块表面血栓形成和/或远端血栓栓塞,造成完全或者不完全的心肌缺血为特征的一组临床疾病。2016年流行病学的报告显示:我国有2.9亿心血管疾病患者,2015年心血管病死亡是城乡居民总死亡首位原因,城市为42.61%,农村为45.01%,其中ACS占比近50%,并且ACS的发病年龄逐步有年轻化的趋势。根据心肌梗死全球通用定义（第三版）,ACS分为ST抬高型心肌梗死（ST segment elevation myocardial infarction STE-ACS）和非ST段抬高型 ACS（non-ST segment elevation ACS,NSTE-ACS）。冠状动脉内血栓形成和/或血栓栓塞是ACS最主要的致病因素,易损斑块的破裂是ACS发作的基础。因此,深入研究易损斑块的分子细胞生物学机制,探讨预测动脉粥样硬化斑块易损性的新生物标志物,对降低急性冠脉综合征的发生,最大程度地减少严重心血管事件的发生具有重要的临床意义。巨噬细胞、单核细胞及其炎症反应在斑块进展中发挥了重要的作用。巨噬细胞和单核细胞能吞噬胆固醇微粒,在泡沫细胞的形成、死亡以及坏死核心的形成中起到了重要的作用,并参与炎症反应和斑块破裂,从而加快了斑块破裂的进展。近期的研究表明,巨噬细胞和单核细胞在斑块中聚集的机制可能是局部细胞增生（而非浸润）。此外,中性粒细胞来源的cathelicidins可诱导循环单核细胞的粘附,从而表明中性粒细胞可能先于单核细胞参与血管炎症反应。与白细胞活化相关的炎症介质分子也可能与动脉粥样硬化性疾病的进展有关。白介素6（interleukin-6,IL-6）能促使血管损伤部位中活化的白细胞和平滑肌细胞分泌C反应蛋白。研究表明,IL-6受体的Asp358Ala等位基因变异是冠心病的危险因素,提示IL-6信号通路在动脉粥样硬化的进程中发挥了重要的作用。白介素等相关炎症因子信号通路与动脉粥样硬化的发生和进展密切相关,但是,目前确切的分子机制仍然不明确。白介素增强子结合因子3（ILF3）是一种双链RNA结合蛋白,参与了 DNA代谢、转录调控,翻译,RNA稳定以及microRNA的加工和定位。最近的研究表明其在ACS中可能的生理作用,包括早期心肌损伤、血栓形成、中风、发炎和血脂异常。但是人们对其在动脉粥样硬化斑块易损性中的作用知之甚少,同时血清中的ILF3作为普通人群预测ACS危险的生物标志物的临床价值和潜在的病理机制仍不清楚。在本研究中,我们在人的血清样品以及冠脉狭窄患者斑块组织中探讨了ILF3对动脉粥样硬化斑块易损性的作用,同时通过血清ILF3预测急性冠脉综合征,为临床早期检测和诊断ACS提供了新的靶点。2目的（1）明确人血清ILF3含量的变化是否与ACS的发生相关（2）明确ILF3在血管及心肌组织的表达变化,探讨血清ILF3含量的变化是否与血管损伤或心肌损伤的发生相关,探讨其可能的分泌部位（3）探讨ILF3能否作为新的AS斑块破裂的预测标志物3方法3.1研究人群该研究包括回顾性研究和前瞻性验证队列。从山东省的四家医院的急诊科选择了因胸痛就诊的526名ACS患者（包括221例AMI和305例UA）。此外,本研究还纳入了 210名健康对照者。其中,在300例ACS患者（包括150例AMI患者和150例UA患者）和85名健康对照者（发现队列）确定了准确的蛋白质定量分析临界值,对226名潜在入选受试者（包括71例AMI患者、155例UA患者）和125例健康对照者的临床表现进行了评估,其中病例组和对照组的年龄,性别和体重指数（body mass index,BMI）分布相似。该研究方案已经通过当地伦理委员会批准,批准号为（KYLL-2018（KS）-233）;所有纳入的参与者均提供了书面知情同意书。所有患者均接受了初步临床评估,包括临床病史,体格检查,12导联心电图,连续心电图监测,脉搏血氧饱和度,标准血液检查和胸部X光检查。只要有临床指征,在就诊时以及1至3小时后都检测hs-cTnI。患者的入选时机和治疗由主治医师决定下进行的。所有最终诊断均基于详实的医疗记录,包括患者病史,体格检查,实验室和放射学检查结果,ECG,超声心动图,心脏运动实验和冠状动脉造影。在监护人的许可下,通过医院急诊科分诊处使用的电子病历系统获得了患者信息和临床检查结果。所有的心肌梗死患者均按最新的指南进行诊断。通过hs-cTnI的上升和/或下降模式诊断出坏死,其中至少一个值高于第99个百分位数,hs-cTnI分析的不精确度为10%。对于hs-cTnI的分析,最低检测下限是0.01g/L。因此,为了表现肌钙蛋白升高的趋势,初始值正常的患者肌钙蛋白水平必须升高到0.04 g/L的才能满足AMI的诊断标准。肌钙蛋白T水平正常且典型的静息性心绞痛,或者先前稳定的心绞痛发作突然加重,或心脏运动试验阳性或心脏导管检查显示冠状动脉狭窄70%的情况下,诊断为UA。既往有过心脏方面的病史,但不包括冠状动脉症状（例如,心包心肌炎,快速性心律失常）和非心脏症状。如果急诊科排除了急性心肌梗死,但没有足够的临床证据来进一步明确诊断,则将此类归类为来源不明的胸痛患者。通过对纳入者问卷调查的方式收集有关健康的信息。对与吸烟有关的问题分类为当前,以前或从不吸烟。肌酐通过Jaffe法测定,每日变异系数为3.5%。在山东大学齐鲁医院的检验科,对所有纳入者进行了非禁食血清的检测,得到了总胆固醇,高密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯的数值。健康队列中的临床检查由训练有素的护士进行,包括血压,体重,身高以及腰围和臀围的标准化测量。健康的参与者（志愿献血者）均来自山东大学齐鲁医院济南院区。3.2血清ILF3和hs-cTnI的测定ELISA法测定人外周静脉血血清中ILF3和hs-cTnI的水平。3.3临床样本收集我们从山东省红十字捐赠的遗体标本中筛选患有动脉粥样硬化疾病和健康对照者的冠状动脉组织标本（每组三个以上样本）进行了评估。从在山东大学齐鲁医院因严重颈动脉狭窄行内膜切除术的患者中获得颈动脉斑块,总计15例患者（男9例,女6例）。在收集样本之前,每位患者均签署书面知情同意书,并获得了山东大学齐鲁医院伦理委员会的伦理学批准。利用颈动脉超声确定颈动脉粥样硬化损伤程度,颈动脉内膜切除术获得动脉粥样硬化病变的人颈动脉节段,固定在中性福尔马林溶液中,通过石蜡包埋后进行免疫组织化学分析。3.4免疫组织化学和免疫荧光染色分别用苏木精＆伊红和Masson三色染色对8微米厚组织切片进行了染色,观察了动脉粥样斑块的形态和胶原蛋白含量。同时还进行了 3,3-二氨基联苯胺染色,(将石蜡包埋的组织切片脱蜡并用抗体染色,然后用生物素偶联的二抗（1:1000）染色,然后用辣根过氧化物酶偶联的链霉亲和素染色（Dianova,Rodeo,CA）。使用抗Mac-3（鼠类巨噬细胞标记物）鉴定巨噬细胞。为行免疫荧光染色,将切片脱蜡并用特异性抗体染色,然后用荧光标记的第二抗体染色。细胞核用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行复染。通过激光扫描共聚焦显微镜（LSM710,卡尔·蔡司,德国）获得特定的荧光成像。3.5统计分析在发现队列中,我们比较了至少一根主要的冠状动脉存在70%狭窄的患者和冠状动脉没有达到70%狭窄患者的基线特征。使用Fisher精确检验比较了 AMI,UA和健康对照组之间的二分变量（性别,糖尿病史等）。使用Wilcoxon秩和检验比较连续变量（BMI,生物标志物等）。确定了 ILF3和hs-cTnI的预测概率的受试者工作特征（ROC）曲线,并使用逻辑回归模型评估疾病风险。为了评估ILF3和hs-cTnI的诊断价值,使用发现队列ROC曲线以至少85%的敏感性选择了临界点。使用验证队列确定相应的敏感性,特异性和准确性。为了消除数据的多重共线性,我们对生物标志物的值进行了对数转换,并删除了具有较大方差膨胀因子的变量。所有实验至少独立进行三次,所有的分析均使用带有pROC 23和ggplot2软件包的R版本3.5.0软件24（R统计学计算基金会,维也纳,奥地利）。所有测试均为双面测试,显著性差异性设置为0.05。4结果4.1研究流程入选的526名ACS病人和210名健康对照人群分为回顾性研究队列和前瞻性研究队列。回顾性研究队列包括150名UA病人,150名AMI病人,和85名健康对照人群。我们将通过回顾性研究队列构建ILF3变化对ACS的诊断系,筛选出最佳诊断阈值后,在前瞻性研究队列人群验证。前瞻性研究队列包括155名UA病人,75名AMI病人和125名健康对照人群。所有的入选招募的患者来自四个不同急诊科,并采集了血液样本。测量了生物标志物,并将其与最终诊断和随后的住院过程相关联。具体流程见相关流程见（图1）4.2 ILF3的水平的变化研究发现,与健康对照人群相比,ACS患者血清中的ILF3清浓度明显高于健康对照组,增加了 23倍以上,存在显著的差异。其中急性冠脉综合征患者中有155位不稳定型心绞痛（UA）和71位急性心肌梗塞（AMI）患者,尽管UA患者的ILF3水平略高于AMI患者,但差异无统计学意义。在四个诊断中心中,患者的ILF3水平在诊断组中的相对差异基本一致。没有不确定的结果,也没有限制异常值。4.3 ILF3预测ACS发生的准确性通过ROC曲线下面积（AUC）来量化血清ILF3的预测准确性,对于所有ACS患者、UA患者和AMI患者,ILF3的预测的准确性都很高。ILF3联合hs-cTnI（ILF3+hs-cTnI）预测ACS的准确度为0.99,明显高于单纯hs-cTnI的准确度（P＜0.001）。ILF3+hs-cTnI联合诊断的曲线下面积（AUC）分析显示ILF3+hs-cTnI联合诊断的UA的准确性要显著高于单独应用hs-cTnI预测UA风险的AUC。ILF3、hs-cTnI和ILF3+hs-cTnI预测AMI的准确性相似。根据ROC曲线确定最佳临床决策限值。ACS的ILF3和hs-cTnI 阳性诊断值。然后将这些诊断值应用于对验证队列患者中ACS、UA和AMI的预测,在所有ACS病例中显示出高的敏感性（＞84%）和100%的特异性;除敏感性外,ILF3对ACS的预测性能指标均不低于hs-cTnI。更重要的是,ILF3对ACS的阴性预测值也高于hs-cTnI。4.4 ACS患者血清ILF3水平的升高与心肌损伤无显著相关性。与血清hs-cTnI相比,ACS患者血清ILF3水平的变化没有随着胸痛发作时间的延长而进行性升高,说明ACS患者血清ILF3的升高与心肌细胞坏死的严重程度无关,表明ILF3不是心肌细胞坏死特异性的生物标志物。4.5 ACS患者血清ILF3含量与冠状动脉粥样硬化的严重程度无显著相关性我们评估了 ACS患者的血清ILF3水平升高是否与血管造影冠状动脉病变程度的相关性。在发现队列中,通过对300例ACS患者血管造影资料分析其血管狭窄的程度,及单支病变、双支病变和多支病变的程度发现:血清ILF3水平也与冠状动脉病变狭窄程度（通过Genisi评分）和病变血管支数无显著的相关性。这些数据表明,ACS患者血清ILF3水平的升高不能反映冠状动脉粥样硬化的严重程度,而可能反映冠状动脉粥样硬化斑块的炎症水平。4.6 ILF3含量与炎症因子显著相关为了确定血清ILF3和hs-cTnI升高的临床意义,我们采用logistic多元回归分析方法来评估其与动脉粥样硬化血管的危险因素如:年龄、性别、吸烟、血清总胆固醇和一些炎症细胞因子的相关性。结果显示:ACS患者血清hs-cTnT的升高与与冠心病和IL6密切相关,而ILF3的升高与性别、糖尿病、他汀类药物治疗、IL1β、IL6和TNFα密切相关。这些结果提示ACS患者血清hs-cTnT升高是心肌损伤的标志,而ILF3的升高更可能与AS斑块内的炎症程度相关。4.7 ILF3特异性在动脉粥样硬化斑块的M1巨噬细胞表达升高。人冠状动脉的免疫荧光和免疫组织化学染色显示,与非动脉粥样硬化的血管组织相比,ILF3在人动脉粥样硬化斑块中表达明显升高,并且在坏死核心区域大量表达。此外,我们在人颈动脉斑块中在巨噬细胞中观察到ILF3和iNOS（Ml巨噬细胞生物标志物）的共定位,表明ILF3是在斑块的炎性M1巨噬细胞中表达。5结论ILF3可能作为一种新的预测动脉粥样硬化斑块易破裂的生物标志物,对急性冠脉综合征的患者提供早期的诊断作用。1研究背景冠状动脉内的易损斑块,是指不稳定的、易形成血栓的,而突然导致急性心脏事件发生的斑块。易损斑块导致血栓形成是急性冠脉综合征（acute coronary syndrome,ACS）的重要发病机制。它可以表现为斑块破裂继发血栓形成,或是斑块侵蚀或钙化结节等病变诱发血栓形成等。斑块破裂在病理上为脂质斑块的纤维帽缺损并延伸到脂质核心,常有血小板及纤维蛋白构成的非闭塞性血栓。破裂的脂质斑块常伴有薄纤维帽及较大的脂质核心,纤维帽中有大量的巨噬细胞浸润,而脂质核心中富含胆固醇结晶。目前的研究表明,巨噬细胞是ACS发病的中心环节。巨噬细胞对纤维帽基质降解是斑块易损性的重要因素,测定纤维帽中巨噬细胞的含量,可以评估动脉粥样硬化斑块是否稳定。白介素增强子结合因子3（ILF3）是一种双链RNA结合蛋白,目前研究表明可调节细胞代谢的过程,包括转录调控以及mRNA加工和定位。最近的研究发现其在ACS中可能的生理作用,包括早期心肌损伤、血栓形成、中风、炎症和血脂异常。然而,人们对其在动脉粥样硬化斑块易损性中的作用知之甚少。在前期研究中,我们发现ACS患者的血清ILF3水平明显升高,在动脉粥样硬化斑块中ILF3表达明显升高,并且定位于巨噬细胞中,我们通过巨噬细胞特异性过表达ILF3小鼠和小鼠原代巨噬细胞来阐明ILF3对动脉粥样硬化斑块易损性的潜在影响,进一步探讨动脉粥样斑块易损性的机制。2目的（1）建立巨噬细胞特异性过表达ILF3的ApoE-/-小鼠AS模型,观察ILF3对AS斑块的形成及易损性的作用;（2）阐明过表达ILF3的巨噬细胞在动脉粥样硬化发生及发展中的作用及相关机制。3方法3.1巨噬细胞特异性过表达ILF3小鼠的构建所有动物实验均根据山东大学实验动物使用和管理机构委员会批准的方案进行。载脂蛋白E（ApoE-/-）敲除的小鼠来自北京大学健康科学中心实验动物科学系。LyzMCre转基因小鼠由山东大学张文程教授惠赠。ILF3条件性过表达小鼠（ILF3 Tg）及ILF3条件性敲除小鼠（ILF3KO）由北京唯尚立德公司构建合成。ILF3条件性小鼠与ApoE-/-小鼠交配,经鼠尾基因鉴定得到ApoE-/-ILF3Tg与ApoE-/-ILF3Tg小鼠,ApoE-/-ILF3Tg与ApoE-/-ILF3Tg小鼠继续与 LyzMCre小鼠交配,经鼠尾基因鉴定得到巨噬细胞特异性过表达ILF3小鼠（ApoE-/-ILF3M-Tg）与巨噬细胞特异性敲除ILF3小鼠（ApoE-/-ILF3M-KO）。野生型小鼠为对照小鼠,所有小鼠背景均为C57/B6背景。3.2动脉粥样硬化不稳定斑块模型的诱导与治疗8周龄的雄性ApoE-/-小鼠和ApoE-/-ILF3M-Tg小鼠高脂喂养（WD,Teklad调整卡路里 88137:21%（wt/wt）脂肪;0.15%（wt/wt）胆固醇;19.5%（wt/wt）酪蛋白;无胆酸钠）4周;在右颈动脉周围植入套管,继续高脂喂养12周。在处死前一周向小鼠腹膜内（i.p.）注射脂多糖（LPS;Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,美国）或对照盐水（每只小鼠每天5ugLPS,每组N=15）。3.3巨噬细胞分离和油红O染色腹膜内注射100%石蜡油7天后,从WT和ILF3M-Tg小鼠的腹腔灌洗中收获腹膜巨噬细胞。将细胞在磷酸盐缓冲液（PBS）中洗涤,在Dulbecco改良的Eagle培养基（含10%胎牛血清）中培养过夜,并用氧化低密度脂蛋白（oxLDL;50 g/ml;北京联合生物有限公司）刺激24小时,以评估巨噬细胞上ILF3的表达是否受脂蛋白调节。4%多聚甲醛固定细胞,PBS洗涤,并在37℃下用Oil-red-O染色20分钟。各组间油红O含量通过Image-Pro plus软件进行定量。3.4免疫组织化学和免疫荧光染色分别用苏木精＆伊红和Masson三色染色对8微米厚组织切片进行了染色,观察了动脉粥样斑块的形态和胶原蛋白含量。同时还进行了 3,3-二氨基联苯胺染色,将石蜡包埋的组织切片脱蜡并用抗体染色,然后用生物素偶联的二抗（1:1000）染色,然后用辣根过氧化物酶偶联的链霉亲和素染色（Dianova,Rodeo,CA）。使用抗Mac-3（鼠类巨噬细胞标记物）鉴定巨噬细胞。为行免疫荧光染色,将切片去石蜡并用特异性抗体染色,然后用荧光标记的第二抗体染色。用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行复染。通过激光扫描共聚焦显微镜（LSM710,卡尔·蔡司,德国）获得特定的荧光成像。3.5免疫印迹分析首先用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质,然后将其转移到硝酸纤维素膜上。用含0.1%Tween-20的5%脱脂牛奶封闭1小时,脱脂牛奶用PBS配置,然后一抗孵育1小时,再在室温下与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育1小时。通过化学发光（Milipore,Billerica,MA,美国）检测结合的第一抗体,并通过Image J软件（NIH,Bethesda,MD,美国）定量。所有表达水平标准化于对照。3.6实时定量PCR使用Trizol试剂（Invitrogen）提取总RNA,然后反转录为cDNA。使用序列检测器系统（IQ5实时PCR循环仪,Bio-Rad实验室,加利福尼亚州,美国）进行基于SYBR Green的实时定量PCR。表达水平标准化于β-actin。3.7流式细胞术有研究表明oxLDL触发巨噬细胞的M1极化,从而诱导和促进动脉粥样硬化中的炎症反应。因此用50μg/ml oxLDL处理腹膜巨噬细胞,并通过流式细胞术评估M1和M2亚型的标志物。将腹膜巨噬细胞（2×105/孔）铺板,加入ox-LDL孵育24小时。为了分析ILF3过表达后激活的CD86和CD209阳性细胞,将小鼠单克隆的抗CD86抗体和抗CD209抗体（1:1000）（Abcam,剑桥,英国）在4℃避光情况下孵育30分钟。用PBS洗涤3次后,在4℃用二抗抗小鼠PerCP-Cy5-5-A和APC-A（Abcam,剑桥,英国）孵育30分钟。洗涤并收集标记的细胞,并使用FACS流式细胞仪系统进行分析。3.8精氨酸酶1启动子荧光报告表达载体的构建通过ensemble网站进行查询Arg-1启动子序列,选取-560 bp至-210 bp这一部分启动子序列进行分析,采用逐段删除法将Arg-1启动子片段合成后构建入报告基因载体 PGL3-basic 中,顺序分别为:-260 bp,-310 bp,-360 bp,-410 bp,-460 bp,-510 bp,-560 bp。3.9双荧光报告基因检测技术首先制备细胞裂解液,在冰上加入裂解液进行裂解细胞,然后离心,转移细胞裂解产物于新的离心管备用。然后按照荧光素酶试剂盒说明书进行处理细胞裂解液,并及时用光度计进行检测。结果分析:计算firely luciferase活性值与内参β-gal活性值的比值,利用T检验进行数据分析,P＜0.05为具有统计学意义。3.10 染色质免疫共沉淀技术（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）（1）细胞准备根据试剂盒要求准备一定量的细胞用于CHIP实验（2）CHIP实验,按照MilliporeCHIP试剂盒的说明书逐步完成实验。3.11 ILF3干扰慢病毒载体的构建由博尚生物公司负责合成构建,干扰序列为GCCAATGGACTGAAGTCATGT,loop 采用 TTCAAGAGA。3.12统计分析所有数据均使用SPSS19.0软件包进行统计分析,所有的实验至少重复3次。计量资料用均数±标准差表示,计数资料用数值和百分比表示。两组之间比较采用采用独立样本的t检验。P＜0.05被认为差异具有统计学意义。4结果4.1巨噬细胞特异性过表达ILF3小鼠建立如图所示,将公司合成的ILF3全身loxp小鼠与巨噬细胞cre（Lyz2-cre）小鼠经过杂交而得到ILF3M-Tg小鼠,将该小鼠与ApoE-/-小鼠杂交而得到ApoE-/ILF3M-Tg 小鼠。4.2巨噬细胞特异性过表达ILF3小鼠鉴定经鉴定成功构建ApoE-/-ILF3M-Tg小鼠,基因鉴定结果。4.3 ILF3促进泡沫细胞形成在野生型腹膜巨噬细胞中,ILF3的蛋白水平随oxLDL的剂量和处理时间的升高而升高。油红O染色显示ApoE-/-ILF3M-Tg小鼠的巨噬细胞较ApoE-/-对照小鼠的巨噬细胞对oxLDL的摄取能力明显增强。与野生型小鼠相比,ApoE-/-ILF3 M--Tg小鼠的巨噬细胞脂质吞噬相关基因HMGCR,CD36及ABCA1的表达明显升高。4.4巨噬细胞特异性过表达ILF3加剧小鼠动脉粥样硬化的形成与喂养12周的ApoE-/-小鼠相比,ApoE-/-ILF3 M-Tg小鼠在主动脉窦和主动脉部位的动脉粥样硬化明显加重。4.5巨噬细胞特异性过表达ILF3加剧动脉粥样硬化斑块的易损性斑块的形态分析结果表明:ApoE-/-ILF3M-Tg小鼠的动脉粥样硬化斑块包含较大的坏死核心,胶原蛋白含量和平滑肌细胞数量明显降低,在ApoE-/-ILF3 M-Tg小鼠的斑块中有更多的巨噬细胞浸润。4.6巨噬细胞特异性过表达ILF3加剧动脉粥样硬化斑块中的血管生成与ApoE-/-小鼠泡沫细胞区域相比,ILF3过表达区域显示出VEGF的大量表达。然而,在ILF3高表达的区域内,每单位面积的微血管数量明显增加。4.7 ILF3上调增强了 oxLDL诱导的促炎性M1巨噬细胞极化流式结果表明,ILF3M-Tg巨噬细胞中CD86阳性细胞（M1）的百分比显著增加。oxLDL处理后未检测到CD209阳性细胞（M2）发生明显变化。4.8 ILF3过表达加剧动脉粥样硬化斑块中的炎症表达。免疫组化染色显示,与ApoE-/-小鼠相比,ILF3M-Tg动脉粥样硬化斑块的iNOS表达增加,但Argl表达下降,表明ILF3过表达的巨噬细胞,oxLDL促进其向促炎性M1巨噬细胞极化。4.9 ILF3过表达加剧巨噬细胞中炎症因子的表达。利用oxLDL刺激腹膜巨噬细胞24小时,随后对RNA进行实时定量PCR分析,结果表明,抗炎相关基因、促炎基因的转录均增加。与野生型对照相比,ILF3过表达的巨噬细胞中Argl和IL-10的mRNA水平显著降低（P＜0.001或0.01）,而IL-6、TNF-α、iNOS和IL-1β表达显著增加。4.10 ILF3调控精氨酸酶1的转录表达结果显示,ILF3过表达成功,siILF3干扰效果明显,ILF3过表达或ILF3干扰时影响p65及statl活性的影响并影响ARG1的表达;ILF3过表达及ILF3干扰后对ARGI在mRNA水平的影响与蛋白水平一致;双荧光报告基因显示,ILF3调控ARG-1启动子-460～-410区域的活性;染色质免疫共沉淀（ChIP）结果显示,ILF-3可以直接与精氨酸酶1启动子结合。5结论（1）巨噬细胞特异性过表达ILF3促进了对oxLDL的摄取能力,并促进了泡沫细胞的形成与动脉粥样硬化。（2）巨噬细胞特异性过表达ILF3上调促炎细胞因子的表达,同时抑制抗炎细胞因子的表达,从而促进动脉粥样硬化的发生发展。（3）巨噬细胞中ILF3过表达的通过促进其自身滞留,而促进了动脉粥样硬化斑块的形成和斑块的易损性。（4）巨噬细胞中ILF3可以直接与精氨酸酶1的启动子区域结合,从而抑制ARG1的转录表达,而调控巨噬细胞Ml型的极化,促进AS斑块的易损性。1研究背景腹主动脉瘤（abdominal aortic aneurysm,AAA）作为一种慢性退行性血管疾病,其主要特征是血管壁进行性扩张和重塑,导致主动脉破裂引起致死,尤其是在老年人中[1-2]。然而,AAA的发病机制至今尚无定论。尽管AAA和动脉粥样硬化之间有一些共同的特征,但是治疗冠状动脉疾病的方法并不能降低人的AAA形成或扩张,目前的主要治疗手段仍然是外科手术干预[3]。最近的证据表明,慢性炎症在AAA发病过程中起到了关键作用,抑制炎症反应可能成为预防AAA的一种有效的治疗方法[4]。环氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）是前列腺素（prostaglandin synthetase,PGs）合成的关键调节酶,可催化花生四烯酸向PGs的转化。COX-2调节促炎性趋化因子的表达,从而影响细胞的增殖和功能[5-7]。在大多数人体组织中通常无法检测到COX-2,但炎症刺激后可迅速诱导产生(例如脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）或血管紧张素 Ⅱ（Angiotensin Ⅱ,AngⅡ）[8-9]。在慢性炎性疾病（如动脉粥样硬化）中,COX-2表达明显升高[10]。基因敲除COX-2可显著减轻急性炎症,并降低前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）水平[11]。目前的研究证明免疫系统参与了许多心血管疾病的发病过程[12]。CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cells,Tregs）作为免疫系统的重要组成部分,在免疫稳态和耐受性中具有重要的保护作用,防止过度的免疫反应[13]。Tregs的功能受损或缺乏会导致免疫失调和自身免疫性疾病[13]。据报道,Tregs在许多心血管疾病中具有保护作用,包括动脉粥样硬化、高血压、心肌炎和扩张型心肌病等[14]。最近,Tregs被证明能够抑制Ang Ⅱ诱导的小鼠AAA的发生发展[15-16]。然而目前,关于AAA中Treg和COX-2之间的相关性报道甚少。因此,利用AAA模型,我们尝试探索AAA潜在的机制,并寻找其可能的免疫治疗方法。2目的（1）研究Tregs能否抑制AAA的发病;（2）在体内体外实验中,阐明Tregs对COX-2表达的影响,以期明确Tregs发挥保护作用的具体机制;3方法3.1动物模型与干预所有动物实验经山东大学伦理委员会批准,并符合中国卫生部《动物管理规定》的指导原则。从北京大学动物研究中心（中国北京）购买10只C57BL/6J野生型小鼠（雄性,8周龄）,用作Tregs细胞的供体。根据试剂说明书要求,使用CD4+CD25+调节性T细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec,德国）从C57BL/6J小鼠的脾细胞中获得Treg细胞。将纯化的Treg细胞悬浮在磷酸盐缓冲液（PBS,200ul）中以进一步注射。在无菌条件下饲养30只C57BL/6J背景的雄性ApoE-/-小鼠（3个月大）,并保持12小时光照/12小时黑暗的昼夜节律。在整个实验期间,ApoE-/-小鼠均给予高脂饮食（0.25%的胆固醇和15%的可可脂）,并保证足够的食物和水。实验小鼠随机分为三组（每组10只）:对照组（未干预）,PBS组（尾静脉注射PBS）和Tregs组（尾静脉注射106 Treg）。注射一天后,通过皮下置入微量泵连续泵入Ang Ⅱ（1000ng/kg/min）28天,在实验开始2周时再次给予尾注射PBS和Treg[15.17]。实验结束后,对所有小鼠进行安乐死并收集其主动脉组织,储存于-80℃冰箱或用4%多聚甲醛固定以备用。3.2组织学分析小鼠安乐死后,用生理盐水经心脏灌注以清除血管腔中的血液,留取主动脉,用4%多聚甲醛固定。首先,通过测量腹主动脉的最大外径来评估AAA的形成,AAA定义为比正常值扩张至少50%[2]。然后,将腹主动脉包埋在OCT化合物中制作冰冻切片,每张5μm厚,通过苏木精和伊红（H＆E）染色及免疫组化染色以评估COX-2的表达（1:500,Abcam,MA,USA）。最后,利用计算机自动辅助图像分析系统（Image Pro Plus 6.0,Media Cybernetics,美国）计算COX-2的表达量。3.3免疫荧光首先将冰冻切片用BSA封闭30分钟,然后将AAA切片与兔抗COX-2（1:100,abcam,MA,USA）,小鼠抗CD68（1:100,abcam,MA,美国）或小鼠抗α-SM-actin（1:100,Sigma-Aldrich,MO,USA）在4℃孵育过夜。随后在室温条件下将切片与二抗孵育,最后使用含DAPI的抗淬灭封片剂（Vector Laboratories,CA,美国）封片。通过激光扫描共聚焦显微镜（LSM 710,Zeiss,德国）获得图像。3.4细胞共培养和处理在体外研究的第一部分中,在37℃下,用DMEM培养基（含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 g/ml链霉素）培养RAW264.7小鼠巨噬细胞（美国弗吉尼亚州马纳萨斯）。巨噬细胞分别与以下三组共培养:对照组,CD25-组（CD4+CD25-T 细胞,5×105）和 Tregs 组（CD4+CD25+T 细胞,5×105）,先用抗CD3抗体刺激细胞48小时（50ng/ml）,然后用AngⅡ（1μM）刺激24h。最后丢弃漂浮的T细胞,并收集巨噬细胞以进一步分析。在体外研究的第二部分中,培养的小鼠主动脉平滑肌细胞（SMC,ATCC,美国）,分别与以下三组共培养:对照组,CD25-组（CD4+CD25-T细胞,5×105）,和Tregs组（5×105）。首先用抗CD3抗体（50ng/ml）刺激48小时,然后再用AngⅡ（1μM）刺激24h。最后丢弃漂浮的T细胞,并收获SMC用于进一步分析。3.5 ELISA收集细胞培养基的上清液,并按照ELISA试剂盒（BlueGene Biotech,上海,中国）的说明书测定PGE2的浓度。3.6 MTT通过MTT测定法（Beyotime,北京,中国）确定SMC的活力。操作步骤如下,首先将SMC以5000个细胞/孔的密度接种到96孔板中,给予相应刺激后每孔加入10 μl MTT（5mg/ml）,并在37℃下孵育4小时。小心弃去上清液,再每孔加入75μl的二甲基亚砜（DMSO）。最后使用Varioskan Flash多功能酶标仪（Thermo Scientific,Waltham,MO,美国）在 570 nm 处分析样品。3.7实时定量PCR根据试剂的说明书,首先使用Trizol试剂（Invitrogen,Carlsbad,CA）从腹主动脉和收获的细胞中提取总RNA,然后使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad,Hercules,美国）用1μgRNA作为模板,逆转录合成cDNA,最后进行实时荧光定量PCR以确定CD68,诱导型一氧化氮合酶（iNOS）,精氨酸酶-1（Arg-1）,趋化因子配体9（CCL-9）,COX-2和β-actin mRNA的表达。其中,β-actin用作内参。该研究中使用的引物序列见表1。3.8蛋白质印迹分析首先从腹部主动脉或细胞中提取总蛋白。将各组等量的蛋白质加样,在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳,然后将目的蛋白电转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。在5%脱脂牛奶中室温下孵育2小时后,将膜与COX-2（1:500,Abcam,MA,USA）和β-actin（1:1000,CST,美国）的一抗在4℃下孵育过夜。随后,用TBST洗涤3次,将膜与辣根过氧化物酶偶联的二抗室温下孵育2小时。最后,使用增强的化学发光检测系统（美国皮尔斯）拍摄图像。其中,β-actin表达量作为内参。3.9统计分析使用SPSS15.0（SPSS Inc,美国伊利诺伊州芝加哥）软件进行统计分析。数值以平均值±标准差表示,并采用LSD事后分析的单向ANOVA检验进行多次比较。P＜0.05被认为具有统计学意义。4结果4.1体内注射Tregs降低了 Ang Ⅱ诱导小鼠AAA的发病率利用AngⅡ持续微量泵入ApoE-/-小鼠以诱导AAA的实验动物模型[17-18],目前已被广泛应用。与既往的研究结果一致,我们的实验发现,在ApoE-/-小鼠中持续泵入AngⅡ可以成功诱导AAA。如图1所示,对照组和PBS组的AAA发生率分别为80%（8/10）和80%（8/10）,而体内注射Tregs（106个细胞）后AAA的发生率只有30%（3/10）,提示Tregs可以明显降低AAA的发生率（P＜0.05,图1A和1C）。此外,H＆E染色显示,持续泵入Ang Ⅱ显著增加了腹主动脉直径并引起内出血,而注射Treg改善了此现象（P＜0.05,图1B和1D）。这些结果证实了以往的研究,即Tregs可以防止AAA的发生和发展。4.2体内注射Tregs降低了小鼠的COX-2表达现有的研究发现,与正常对照小鼠相比,AAA小鼠中COX-2mRNA的表达显著增加[19]。在体内实验中,为了阐明Treg对腹主动脉组织中COX-2表达的潜在影响,我们进行了免疫组织化学染色。与对照组和PBS组相比,Tregs组的COX-2表达明显减弱（P＜0.05,图2A和2B）。此外,RT-PCR和蛋白印迹分析还显示,Tregs可显著降低腹主动脉组织中COX-2的mRNA和蛋白质表达（P＜0.05,图2C至2E）。4.3 Tregs治疗可降低小鼠SMC和巨噬细胞中COX-2的表达为了观察COX-2在SMC或巨噬细胞中的表达,我们进行了免疫荧光染色。如图3A所示,SMC与COX-2表达共定位,而在AngⅡ+Treg组中,SMC中COX-2的表达明显减少（图3A）。同时,图3B显示在AngⅡ组和AngⅡ+PBS组的巨噬细胞中有COX-2表达,而Treg能够显著降低巨噬细胞中COX-2的表达（图3B）。4.4 Tregs刺激巨噬细胞和SMC后,减少了细胞中COX-2和PGE2的表达已有研究显示在炎性刺激（例如AngⅡ）诱导下COX-2表达明显升高[9]。在内皮细胞中,Ang Ⅱ刺激后,COX-2表达显著增加[20-21]。由巨噬细胞和SMC合成的前列腺素E2（PGE2）可以增加基质金属蛋白酶（MMP）的产生并导致血管壁的降解[22]。先前的研究表明巨噬细胞和SMCs可能是Tregs靶向治疗AAA的主要细胞[15]。因此,在我们的实验中,相继用Tregs和AngⅡ处理巨噬细胞和SMCs,结果发现与对照组相比,Tregs处理可显著降低巨噬细胞中COX-2和PGE2的表达,而CD4+CD25-T细胞对COX-2和PGE2的表达影响不大（P＜0.05,图4A至4C）。此外,与对照组相比,Tregs治疗还显著降低了 SMCs中COX-2和PGE2的表达（P＜0.05,图4D至4F）。以上结果表明,Tregs治疗可降低Ang Ⅱ诱导的巨噬细胞和SMC中COX-2和PGE2的表达。4.5 Tregs治疗增加SMCs的活力并诱导巨噬细胞表型的转变随后我们研究了 Treg对SMCs活力和巨噬细胞表型的影响。如图5AMTT结果所示,与AngⅡ组相比,Treg治疗增加了 SMC的活性,而CD4+CD25-T细胞没有改变SMC的活性。此外,RT-PCR显示,Tregs刺激后诱导了巨噬细胞表型的转变,表现为M1相关基因（CD86和iNOS）表达下调和M2相关基因（Arg-1和CCL-9）表达上调（P＜0.05,图5B至5E）。这些结果表明,Tregs增加了 SMCs的活性并诱导巨噬细胞表型从M1型转变为M2型。5结论在AAA的体内和体外实验中,Tregs治疗均可显著降低AngⅡ诱导的COX-2的表达,这表明Tregs可能通过抑制COX-2的表达对AAA发挥保护作用,该研究可能为AAA的免疫治疗提供启示。

关键词：动脉粥样硬化;ILF3;炎性因子;易损斑块;巨噬细胞;炎症因子;调节性T细胞;环氧合酶-2;腹主动脉瘤;免疫治疗

学科专业：内科学

论文Ⅰ :血清白介素增强结合因子3对动脉粥样硬化斑块破裂预测价值的研究

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英文摘要Ⅰ

符号说明

1 前言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

5 结论

附图