动物疾病预防畜牧养殖论文提纲

论文题目：紫外消毒对污水处理厂二级出水中抗生素抗性菌和抗性基因去除的影响和机理研究

摘要：几十年来,抗生素被广泛应用于人类和动物疾病预防和治疗,以及畜牧养殖。环境中残留的抗生素促进了抗生素抗性菌（Antibiotic-resistantbacteria,ARB）和抗性基因（Antibiotic resistance genes,ARGs）的产生,进而导致抗生素抗性致病菌的增加。在各种污水处理厂的污水中,ARGs的含量远远高于典型的水环境。河流ARGs水平与上游污水处理厂规模存在显著的相关性。所以研究深度处理技术（如紫外消毒）对ARB和ARGs的去除,对于控制其在环境中的传播扩散具有重要意义。为了阐明紫外消毒对污水处理厂二级出水中抗生素抗性去除的影响和机理,本文研究了紫外处理前后ARB的耐药谱和可培养异养菌的种类的变化;还检测了紫外消毒前后ARB中基因组和质粒上ARGs的分布情况,研究紫外照射对活体ARB中不同位置ARGs的影响。此外还采用实时荧光定量PCR技术对紫外消毒前后二级处理出水中ARGs的丰度进行检测,探究紫外消毒对ARGs的去除效果。本文主要研究结果如下:经过紫外照射后大部分主要种属的多重抗性（Multi-antibiotic resistance,MAR）指数显著升高。例如Aeromonas的MAR指数从0.56增加到0.67;Enterococcus从0.53增加到0.63。对5种以上抗生素具有抗性的Aeromonas在UV5（5 mJ/cm~2紫外照射）中占Aeromonas总数的90%,而在RW（二级处理出水）中却只有76%。经过5 mJ/cm~2紫外照射后,夏季和冬季水样的MAR指数也都显著增加（P＜0.05）。UV5中对9种以上抗生素具有抗性的菌株的占比在夏季和冬季水样中分别变为RW的2倍和4.3倍。紫外照射对ARB起到了明显的选择作用。随着紫外照射剂量的增加,细菌群落结构发生了显著变化。革兰氏阳性菌检出频率逐渐增加,而革兰氏阴性菌丰度逐渐降低。由于不同种属细菌的耐药谱存在较大差异,所以群落结构的改变使得各种抗生素的抗性菌的检出频率发生巨大变化。经过10 mJ/cm~2紫外照射后,夏季和冬季水样MAR指数分别降低到0.45和0.25。这主要是由于MAR指数相对较低的属取代了MAR指数较高的属,成为UV10（10 mJ/cm~2紫外照射）中的优势属。对基因组DNA来说,经过10 mJ/cm~2紫外照射后有5种ARGs（tetA、tetC、tetM、tetW和sul2）的检出频率升高。tet基因的平均检出频率从56%变为59%,并没有显著的变化。而sul基因检出频率则显著降低（P＜0.05）,从42%降低到28%,这主要是由细菌群落结构的变化引起的。对于质粒DNA,7种ARGs中有6种ARGs（tetA、tetC、tetM、tetW、tetX和sul1）的检出频率在紫外照射后降低,范围为8.9%～20.4%。tet基因和sul基因的平均检出频率分别降低了15%（P＜0.05）和6%。紫外照射对幸存ARB中基因组ARGs的影响较小,而却能显著降低其质粒ARGs的检出频率。我国市政污水处理厂规定的最低紫外消毒剂量为20 mJ/cm~2,在此剂量下可以达到较好的灭菌效果（＞99%）,但是仅能去除二级处理出水中42.1%的ARGs。当紫外剂量升高到160 mJ/cm~2时,对大部分ARGs的去除率可达到90%以上,而此剂量下对多重耐药基因mexB的去除率仅为50%,其出水丰度仍在10~7copies/mL以上。在经过160 mJ/cm~2紫外照射后,尽管14个ARGs（总共23个）的相对丰度大幅降低,但是ARGs的总相对丰度却显著升高。这主要是由于多重抗性基因mex B被极大的富集（17.31倍）,显著影响了ARGs的总体相对丰度变化。

关键词：紫外消毒;抗生素抗性;微生物群落;质粒DNA;qPCR

学科专业：环境工程（专业学位）

摘要

Abstract

第一章 绪论

1.1 抗生素抗性菌与抗性基因概述

1.1.1 抗生素抗性菌与抗性基因的危害

1.1.2 抗生素抗性基因的耐药机制

1.1.3 抗生素抗性基因的传播机制

1.2 水环境中抗生素抗性菌和抗性基因研究现状

1.2.1 畜禽养殖厂废水

1.2.2 医院废水

1.2.3 市政污水处理厂

1.2.4 自然水体

1.3 水环境中抗生素抗性菌和抗性基因深度去除研究进展

1.3.1 氯消毒

1.3.2 紫外照射

1.3.3 臭氧氧化

1.3.4 光氧化

1.3.5 其他

1.4 研究目标与内容

1.4.1 研究目标

1.4.2 研究内容

1.4.3 技术路线

第二章 实验材料与试验方法

2.1 实验材料与仪器

2.1.1 实验试剂

2.1.2 常用培养基、溶剂及抗生素的配制

2.1.3 试剂盒

2.1.4 实验仪器

2.2 试验方法

2.2.1 样品的采集

2.2.2 紫外消毒装置及过程

2.2.3 细菌的计数、分离纯化和鉴定

2.2.4 抗生素敏感性实验

2.2.5 DNA的提取

2.2.6 抗生素抗性菌中抗性基因的检测

2.2.7 定量PCR标准曲线的建立

2.2.8 实时荧光定量PCR

第三章 紫外照射对抗生素抗性菌的影响

3.1 引言

3.2 实验材料与方法

3.2.1 细菌分离与培养

3.2.2 抗生素药敏实验

3.2.3 16S rRNA基因扩增

3.2.4 结果分析

3.3 结果与讨论

3.3.1 污水厂二级出水中抗性菌的分布

3.3.2 紫外照射对二级出水抗生素抗性的影响

3.3.3 群落结构变化对二级处理出水中抗生素抗性的影响

3.3.4 紫外照射下二级出水多重抗生素抗性指数的变化

3.4 本章小结

第四章 紫外照射对抗生素抗性菌中抗性基因的影响

4.1 引言

4.2 实验材料与方法

4.2.1 基因组与质粒DNA提取

4.2.2 ARGs检测

4.2.3 结果分析

4.3 结果与讨论

4.3.1 抗性基因在二级处理出水中的分布

4.3.2 基因组DNA上ARGs的变化

4.3.3 质粒DNA上ARGs的变化

4.4 本章小结

第五章 紫外照射对污水处理厂二级出水中抗性基因的去除研究

5.1 引言

5.2 实验材料与方法

5.2.1 实时荧光定量PCR

5.2.2 分析方法

5.3 结果与讨论

5.3.1 ARGs 绝对丰度的变化

5.3.2 ARGs 相对丰度的变化

5.3.3 抗性基因之间的相关性

5.4 本章小结

第六章 结论与建议

6.1 结论

6.2 建议

致谢

参考文献