传播分化研究论文提纲

论文题目：埃及伊蚊和白纹伊蚊种群遗传分化及感染寨卡病毒研究

摘要：埃及伊蚊（Aedes aegypti）和白纹伊蚊（Aedes albopictus）是包括寨卡病毒（ZIKV）在内的多种蚊媒病毒的传播媒介,在世界范围内,对人类健康产生巨大的威胁。我国多样化的温度区划为媒介蚊虫的遗传分化和传播效能提供了必要条件,研究我国境内埃及伊蚊和白纹伊蚊种群的遗传分化及对寨卡病毒的传播效能,为媒介蚊虫的科学防控和寨卡病毒流行的监测预警提供科学依据。本研究就种群分化和对寨卡病毒的传播效能两个方面对我国埃及伊蚊和白纹伊蚊种群开展研究,利用重新开发的微卫星位点和线粒体COI、ND4和ND5基因相结合的方法,从种群遗传多样性、结构和扩散的角度对我国不同温度带白纹伊蚊和不同年份的云南埃及伊蚊种群的遗传分化进行评估;基于小RNA测序和PCR扩增技术,筛选出与寨卡病毒感染有关的内源性病毒片段,确定其在白纹伊蚊和埃及伊蚊种群中的分布和多样性,从而探讨内源性病毒片段的分布是否与蚊虫的种群遗传分化有关;通过对白纹伊蚊不同地理株和埃及伊蚊种群对寨卡病毒传播效能差异的研究,探讨地理株和蚊种的差异对蚊虫传播寨卡病毒的影响;通过人工模拟的我国不同温度带气温条件下,白纹伊蚊和埃及伊蚊对寨卡病毒传播效能差异的研究,探讨温度变化对蚊虫传播寨卡病毒的影响。本研究主要成果如下:1.2017～2018年云南埃及伊蚊种群遗传分化研究结果:西双版纳州埃及伊蚊种群平均等位基因数要高于德宏州。2017年基于COI和ND4基因共检测到31个单倍型,且西双版纳州种群的单倍型多样性指数（0.694）要显著高于德宏州（0.377）和临沧市（0.046）,除种群RLWD和MDXL外,各区域种群Ho值均显著低于He,并呈现显著的种群扩张趋势（P＜0.05）;而2018年仅检测到10个单倍型,且西双版纳州种群的单倍型多样性指数（0.404）仍要显著高于德宏州（0.225）和临沧市（0.150）;除种群JGYH和RLHP外,各区域种群Ho值均显著高于He。STRUCTURE检测显示2017年种群共分化成了3个分支,且种群分化主要存在于同区域的个体间和不同区域的种群间,所占变异率分别为19.36%和74.18%;而2018年种群共分化成了2个分支,且种群分化主要存在于不同区域的种群间和同区域的个体间,所占变异率分别为57.42%和36.19%,这两年的地理距离与遗传距离显著相关（P=0.001）。扩散分析表明2017年西双版纳州的勐腊县埃及伊蚊种群和德宏州的RLYB分别向德宏州和西双版纳州扩散,导致两地的种群的遗传相似性;而2018年西双版纳州和德宏州埃及伊蚊种群主要在本区域范围内扩散,导致两区域种群的遗传差异。2.我国不同温度带白纹伊蚊种群遗传分化研究结果:不同温度带种群的等位基因数很高,且从温带（3.876）到热带（4.144）呈现上升的趋势;基于COI和ND5基因共检测到25个单倍型,且热带的单倍型多样性指数（0.657）要显著高于温带（0.115）和亚热带地区（0.298）;所有种群的Ho值（0.557）都要显著低于He值（0.684）,且呈现显著的种群扩张趋势（P＜0.05）。STRUCTURE和单倍型聚类分析显示种群共分化成了两个类群和3个单倍型分支,种群分化主要存在于种群内和个体间,占比分别为31.4%和63.04%,且仅热带区域的白纹伊蚊种群的地理距离和遗传距离显著相关（R~2=0.6614,P=0.048）。扩散分析表明我国不同温度带之间的白纹伊蚊存在4条主要的扩散路线。3.埃及伊蚊和白纹伊蚊种群内源性病毒插入片段研究结果:内源性插入片段可用于埃及伊蚊和白纹伊蚊的种群结构分析,而仅埃及伊蚊内源性棒状病毒片段可用作其种群分化研究。埃及伊蚊的棒状病毒Aa Rha033片段可用作监测埃及伊蚊种群的入侵和扩散的分子标签,白纹伊蚊的Ab Rha58可能是潜在的检测白纹伊蚊种群遗传结构的分子标签。4.寨卡病毒细胞动力学研究结果:寨卡病毒在BHK-21、Vero、C6/36和Aag2细胞中的扩增基本相似,温度的升高会促进寨卡病毒感染后C6/36细胞的生长和病变,但对寨卡病毒的扩增无显著影响。转录组分析结果表明:感染后第二天共有1358个基因发生显著性差异（P＜0.05）,有707个基因上调、651个基因下调;感染后第四天共有3640个基因发生显著性差异（P＜0.05）,有2218个基因上调、1422个基因下调,这些基因主要参与细胞的催化、结合、代谢和生物学调控等。5.温度会显著影响白纹伊蚊的生命周期（P＜0.0001）,其中白纹伊蚊在21℃下的平均存活时间为34.82±8.65天,在28℃下为29.13±7.57天,而在35℃下仅为8.23±4.13天;温度和寨卡病毒感染会对不同温度带白纹伊蚊的产卵行为产生显著的影响,且寨卡病毒感染仅能促进亚热带株NJDX和热带株HKWN在低温环境下的产卵量。6.不同白纹伊蚊地理株感染寨卡病毒结果:亚热带株NJDX的寨卡病毒感染率要明显高于热带株HKWN和温带株BHBG,且在感染后第二天其各组织的感染率均高于60%。亚热带株NJDX和热带株HKWN的感染从第2天持续到第14天,而温带株BHBG的感染仅从第3天持续到第10天。温度升高会显著提高热带株HKWN和温带株BHBG唾液腺的感染率,且低温会显著降低温带株BHBG的感染率;热带株HKWN中肠的感染率随着温度的升高而增加,温带株BHBG则随温度的升高而降低,而亚热带株NJDX则随温度的升高呈现先增后减的趋势;亚热带株NJDX和热带株HKWN卵巢的感染率随着温度的升高呈下降的趋势,而温带株BHBG则随着温度的升高而升高。7.埃及伊蚊感染寨卡病毒结果:在感染后七天内,埃及伊蚊的感染率随温度的升高而增加;而在感染后第14天,低温条件更有利于埃及伊蚊感染寨卡病毒。在相同的处理条件下,埃及伊蚊对寨卡病毒的传播效能要显著高于白纹伊蚊。

关键词：白纹伊蚊;埃及伊蚊;遗传分化;寨卡病毒;传播效能

学科专业：病原生物学

缩略语表

摘要

Abstract

前言

1.材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验蚊虫的采集

1.1.1.1 2017~2018年埃及伊蚊的野外调查和采集

1.1.1.2 我国不同温度带白纹伊蚊的野外调查和采集

1.1.2 主要仪器和试剂

1.1.2.1 主要仪器

1.1.2.2 主要试剂耗材

1.2 实验方法和步骤

1.2.1 蚊虫的饲养和温度对蚊虫生命周期的影响

1.2.1.1 白纹伊蚊和埃及伊蚊的实验室养殖

1.2.1.2 温度对白纹伊蚊生命周期和产卵的影响

1.2.2 埃及伊蚊和白纹伊蚊的微卫星引物开发和验证

1.2.2.1 蚊虫基因组的提取和检测

1.2.2.2 蚊虫基因组的消化和载体连接

1.2.2.4 富集DNA片段的再扩增、克隆和测序

1.2.2.5 微卫星位点的多态性验证

1.2.3 埃及伊蚊和白纹伊蚊种群分化研究

1.2.3.1 微卫星位点和线粒体COI、ND4和ND5基因的扩增

1.2.3.2 种群结构、单倍型多样性和扩散分析

1.2.4 寨卡病毒感染细胞和蚊虫

1.2.4.1 寨卡病毒的扩繁和空斑检测

1.2.4.2 细胞感染寨卡病毒的研究

1.2.4.3 温度对白纹伊蚊和埃及伊蚊传播寨卡病毒影响

1.3 实验流程图

2.结果

2.1 基于微卫星标记和线粒体基因的媒介伊蚊的遗传分化研究

2.1.1 基于磁珠富集法的媒介伊蚊微卫星标记的重开发和验证

2.1.1.1 埃及伊蚊和白纹伊蚊基因组检测

2.1.1.2 微卫星位点的筛选和多态性验证

2.1.2 基于微卫星标记和线粒体基因的埃及伊蚊遗传分化研究

2.1.2.1 基于微卫星标记的埃及伊蚊遗传分化研究

2.1.2.2 基于线粒体COI和ND4基因的埃及伊蚊遗传分化研究

2.1.3 基于微卫星标记和线粒体基因的白纹伊蚊遗传分化研究

2.1.3.1 基于微卫星标记的白纹伊蚊遗传分化研究

2.1.3.2 基于线粒体COI和ND5基因的白纹伊蚊遗传分化研究

2.2 基于内源性病毒插入片段的媒介伊蚊的遗传分化研究

2.2.1 埃及伊蚊和白纹伊蚊内源性病毒插入片段筛选、验证和检测

2.2.1.1 埃及伊蚊内源性病毒插入片段的筛选、验证和检测

2.2.1.2 白纹伊蚊内源性病毒插入片段的筛选、验证和检测

2.2.2 基于内源性病毒插入片段的埃及伊蚊种群的遗传分化研究

2.2.2.1 基于内源性病毒片段多态性的埃及伊蚊种群结构分析

2.2.2.2 基于内源性病毒片段位点突变的埃及伊蚊种群遗传多样性分析

2.2.2.3 基于内源性黄病毒片段AaFlavi31位点多样性的埃及伊蚊种群分化分析

2.2.3 基于内源性病毒插入片段的白纹伊蚊种群的遗传分化研究

2.2.3.1 基于内源性病毒片段多态性的白纹伊蚊种群遗传结构分析

2.2.3.2 基于内源性病毒片段位点突变的白纹伊蚊种群遗传多样性分析

2.2.3.3 基于内源性棒状病毒片段AbRha12位点多样性的白纹伊蚊种群分化分析

2.3 白纹伊蚊C6/36细胞感染寨卡病毒的研究

2.3.1 寨卡病毒的扩增、标准曲线和细胞动力学

2.3.1.1 寨卡病毒的扩增和标准曲线制作

2.3.1.2 寨卡病毒的哺乳动物细胞和昆虫细胞动力学

2.3.2 温度对白纹伊蚊C6/36细胞感染寨卡病毒的影响

2.3.2.1 温度对感染寨卡病毒的C6/36细胞形态的影响

2.3.2.2 温度对C6/36细胞感染寨卡病毒的影响

2.3.3 白纹伊蚊C6/36细胞感染寨卡病毒的转录组分析

2.3.3.1 C6/36细胞在28℃和37℃下感染寨卡病毒前后基因表达量差异分析

2.3.3.2 差异表达基因的功能分析

2.4 白纹伊蚊和埃及伊蚊感染寨卡病毒的研究

2.4.1 温度对白纹伊蚊生存周期的影响

2.4.2 温度和寨卡病毒感染对不同温度带白纹伊蚊产卵量的影响

2.4.3 地理株和温度差异对白纹伊蚊和埃及伊蚊感染ZIKV的影响

2.4.3.1 地理株和温度差异对白纹伊蚊感染ZIKV的影响

2.4.3.2 温度对埃及伊蚊感染ZIKV的影响

3.讨论

3.1 分子标签的筛选和确定

3.2 我国不同温度带白纹伊蚊种群分化和扩散

3.3 2017~2018年云南埃及伊蚊种群分化和扩散

3.4 埃及伊蚊和白纹伊蚊内源性病毒插入片段的多样性和特异性

3.5 温度和地理株差异对白纹伊蚊感染寨卡病毒的影响

4.结论和展望

参考文献

主要简历

致谢

附件