单克隆抗体大量生产技术及研究进展

单克隆抗体大量生产技术及研究进展（精选14篇）

篇1：单克隆抗体大量生产技术及研究进展

单克隆抗体技术在植物中的研究应用

介绍了单克隆抗体技术及其基本原理,综述了单克隆抗体技术在植物病原菌、植物病毒及植物其他方面的`应用研究.

作 者：李亚璞 LI Ya-pu 作者单位：河北省生物研究所细胞生化研究室,河北,石家庄,050081刊 名：河北农业科学英文刊名：JOURNAL OF HEBEI AGRICULTURAL SCIENCES年，卷(期)：13(4)分类号：Q813.2关键词：植物 单克隆抗体 病原菌 病毒

篇2：单克隆抗体大量生产技术及研究进展

采用重氮化法合成磺胺二甲嘧啶(SM2)-人血清白蛋白(HSA)免疫抗原和SM2-卵清白蛋白(OVA)包被抗原.经紫外光谱扫描法确认SM2与载体蛋白偶联成功;经计算SM2与HSA、OVA的结合比分别为9:1和15:1.利用杂交瘤技术和有限稀释法经过5次亚克隆,得到三株特异性稳定分泌SM2抗体的.杂交瘤细胞,经鉴定该单克隆抗体免疫球蛋白亚类为IgG1,为入链,分子量为162 Ku,染色体数目90条左右,亲和常数为6.1×1012 M-1.与其他四种磺胺药和两种载体蛋白HSA、OVA均无交叉反应.

作 者：丁良君 李继昌 周艳君 付锐 霍贵成 张东玲 DING Liang-jun LI Ji-chang ZHOU Yan-jun FU Rui HUO Gui-cheng ZHANG Dong-ling 作者单位：丁良君,李继昌,霍贵成,张东玲,DING Liang-jun,LI Ji-chang,HUO Gui-cheng,ZHANG Dong-ling(东北农业大学,动物医学院,黑龙江,哈尔滨,150030)

周艳君,ZHOU Yan-jun(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001)

付锐,FU Rui(伊春市金山屯区林业医院,黑龙江,伊春,1500263)

篇3：单克隆抗体纯化技术研究进展

关键词：单克隆抗体,单抗,沉淀法,色谱法

单克隆抗体,简称单抗,主要来源于免疫动物的腹水和杂交瘤细胞培养上清液[1]。单抗主要被应用于疾病的诊断和治疗,不论来源方式是那种,都要经过纯化才能被使用。单克隆抗体的纯化主要有沉淀法和色谱法两类方式。随着单克隆抗体生产的批量化、规模化,单克隆抗体的纯化技术也向大体积、短时间、低成本方向发展。

1沉淀技术

沉淀技术是根据蛋白质疏水性的不同,通过提高盐浓度,改变蛋白质的疏水性,使蛋白质沉淀从而达到蛋白质分离目的的一种纯化技术[2]。目前应用于单克隆抗体纯化方面的沉淀技术主要有辛酸沉淀法、硫酸铵沉淀法、辛酸硫酸铵沉淀法、聚乙二醇沉淀法、优球蛋白沉淀法五种方法。

1.1辛酸沉淀法。辛酸可以使腹水中的白蛋白和β、α球蛋白等杂蛋白沉淀下来。辛酸沉淀法就是利用辛酸这一特点,将保留于上清液中的抗体与杂蛋白分离开来。利用辛酸沉淀法纯化单克隆抗体可以减少抗体聚合,充分保留抗体活性。但是此种纯化方法也有其局限性,通过这种方法获得的抗体需要通过其他途径进行浓缩,回收率底,而且辛酸有使Ig G3和Ig A类抗体产生不可逆沉淀而失活的特点,不可用于此类抗体的纯化。目前,这种纯化技术常被用于Ig G1、Ig G2a、Ig G2b和Ig M亚类的纯化[3]。

1.2硫酸铵沉淀法30%-50%浓度范围内的硫酸铵能与免疫球蛋白形成沉淀。硫酸铵沉淀法就是利用这一特点将免疫球蛋白与其他杂蛋白分离开来的。该方法可稳定抗体,保持抗体活性,可以浓缩样本,并可以去除白蛋白、转铁蛋白等杂蛋白,但是由于通过硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体获得的纯度较低,因此,在实践中通常都会结合其他的方法进一步纯化。通过硫酸铵沉淀法纯化单抗时要注意经过硫酸铵沉淀后某些m Ab的活性会丧失,另外,硫酸铵沉淀法还会引起其他杂蛋白产生共沉淀,降低抗体的纯度。

1.3辛酸硫酸铵法沉淀法。在偏酸条件下,用辛酸硫酸铵沉淀法可以沉淀腹水或血清中除Ig G外的蛋白质,一般此法不用于Ig A和Ig M的纯化。辛酸硫酸铵沉淀法因其具有操作简单,抗体回收率高,产率高以及能够保持良好活性等优点被广泛应用于Ig G1和Ig G2b的纯化。

1.4聚乙二醇沉淀法,聚乙二醇沉淀法是利用聚乙二醇极强的吸水性将抗体分子析出。此方法用于Ig M的纯化时可以达到较高的纯度和回收率。

1.5优球蛋白沉淀法,此法用于Ig G3和Ig M的纯化可以保证良好的活性,同时保证较高的回收率。

2色谱技术

利用混合物各组分理化性质的不同,使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中,由于在流动相中的各组分通过固定相的速度不同。来达到分离各组分的目的,此种方法即为色谱法。

2.1离子交换色谱。通过改变洗脱液PH值或盐离子的浓度将通过带有相反电荷与介质表面结合的抗体蛋白洗脱下来,从而达到抗体蛋白与杂蛋白分离的目的。利用此原理的离子交换色谱法主要有阳离子交换层析法、阴离子交换层析法、阴阳双层交换离子法,都可用于单抗的纯化,但要注意选择合适的PH值才能保证较高的抗体回收率。其中阴离子交换层析法主要用于Ig G的纯化。

2.2蛋白质A亲和色谱法蛋白质A因其与不同种属抗体间的亲和力不同,而被用于Ig G亚类的分离纯化。用蛋白质A亲和色谱法纯化抗体因其具有所得的纯度可以达到99%以上[4,5,6],对于抗体的浓缩浓度可达10g/L,适用范围广等优势,成为目前应用最普遍的单克隆抗体纯化方法之一。但是蛋白质A亲和色谱法作为纯化的一种方式也有它的劣势存在,比如抗体在低PH值下会有高分子聚合物和沉淀形成[7,8,9];会有杂质被一并洗脱,影响抗体的安全使用;蛋白质A使用周期短,价格高昂等等。针对存在的问题,蛋白质A亲和色谱法也在不断改进中。

2.3蛋白质G亲和色谱。使用蛋白质G亲和色谱法纯化抗体,无法将体系中的白蛋白和巨球蛋白除去[10,11],但是采用基因修饰改进后的蛋白质G可以解决这个问题。

2.4免疫亲和色谱。免疫亲和色谱法是利用抗原与抗体可特异性结合成抗原-抗体复合物的特性而形成的一种单克隆抗体纯化法。这是一种非常有效的抗体分开发,但是由于抗原的价格昂贵,对于这种纯化方法的大规模使用形成了限制。

除以上所述的方法外,常用的色谱分离法还有组氨酸亲和色谱法、凝胶过滤色谱法、疏水作用色谱法、亲硫吸附色谱法、疏水电荷诱导色谱法等方法[12],由于篇幅的问题,在这里无法一一阐述。

纯化方法虽多,但是要在使用时根据具体情况,找到最适合的纯化方法才能取得好的分离效果。

篇4：单克隆抗体大量生产技术及研究进展

随着信息与通讯技术的快速发展，微博、微信、微电影等微浪潮悄然兴起。在追求速度与效率的今天，人们的空闲时间越来越零星化、碎片化。一篇简短的博客，一部十来分钟的电影，人们可以在短时间内获取想要的信息，打破了传统长篇大论的模式。微课正逢其时，在这种微环境中应运而生。

然而，微课在国内起步较晚，微课资源尚十分匮乏。结合我校现状，课题组以全国首届高校微课程比赛为契机，提出了以“细胞生物学”课程为载体，通过开发“单克隆抗体技术”微课程，着力提高学生自主学习能力。

一微课的背景与定义

如何处理好教与学的关系，是教育界探索的永恒课题。陶行知先生认为老师的责任不在教，而在教学，教学生学；老师的教法除了联系自己的学问，必须联系学生的学法。1993年，美国北爱荷华大学的有机化学教授LeRoy A. McGrew[1]提出了“60秒有机化学课程”，让非科学专业人士在非正式的场合中了解了化学知识。英国纳皮尔大学的Terence Kee教授[2]让学生对特定主题进行一分钟演讲（One Minute Lecture，OML），使学生掌握特定领域中的核心概念。2004年，可汗学院创办人孟加拉裔美国人萨尔曼·可汗利用电子画笔给远在新奥尔良市的表妹补习功课，并收到很好的效果。上述结果均揭示，站在学的立场，优化教的方法，才能达到教学的理想效果。正是出于这样的教学理念，美国圣胡安学院的高级教学设计师David Penrose在2008年正式提出了“微课”这一概念。他把微课比作“知识脉冲”（Knowledge Burst），教师把教学内容与教学目标紧密地联系起来，以产生一种更加聚焦的学习体验。

什么是“微课”？国内尚无一个比较系统的定义。我国教育技术界的胡铁生、焦建利、黎加厚、吴秉健和张一春等对微课的概念进行了详细诠释。微课，又名微课程（Microlecture，Microcourse），是指以微型教学视频为载体，时间在10分钟以内，针对某个学科知识点（如重点、难点、疑点、考点等）或教学环节（如学习活动、主题、实验、任务等）而设计开发的小课程[3-5]。微课作为一种新型学习资源，其根本目的是为了突破难点、传授技能、培养兴趣、启迪智慧，是为了更好地服务学生自主学习。微课作为微时代的产物，一问世就受到众人的热捧，其原因如下：

1解析时间较短，符合学习规律

根据学习者的认知特点和学习规律，一节课真正能有效学习的时间一般为5-10分钟。微课的时长正好符合这一特征要求，具备轻负担、高质量、低耗时的特点。因此，相对于传统一节课（45分钟）的教学课例来说，微课是“片段化的课堂”。

2涵盖内容较少，问题高度聚焦

微课目标真实、主题突出、过程简约、结构安排精巧、手段选择精致，更适合学习者的需要。微课集中解决教学中的重点、难点、疑点内容，便于学生吃透主题。因此，相对于传统一节课要完成复杂而众多的教学内容，微课的内容更加精简，是“浓缩的课堂”。

3占用容量较小，学习无处不在

以微型教学视频为载体的微课资源一般以支持网络在线播放的流媒体（flv，wmv，rm等）格式进行发布与传播，容量大小在几十兆左右。学习者可在线观摩课例，查看教案、课件等辅助资源，也可灵活方便地将其下载到终端本地设备（PC、手机、MP4等）上实现移动学习、“泛在学习”。因此，相对于传统的教学模式，微课是“随时随地的课堂”。

二“单克隆抗体技术”微课程的开发

单克隆抗体技术是细胞生物学细胞工程章节中的重要知识点，结合多年的教学经验，我们将该知识点设计并开发了3个微课视频：单克隆抗体的概念、单克隆抗体的制备、单克隆抗体的应用。

1微课主题的确定

根据多年的教学积累，结合课堂教学效果，课题组撰写教学反思，整理归纳细胞生物学教学中的重点、难点、疑点内容；钻研教材，结合教学大纲整理“单克隆抗体技术”章节的知识菜单，并交由教研组讨论，确定“单克隆抗体技术”知识点作为微课程开发的主题。讨论中普遍认为，学生对单克隆抗体概念的认识是该课程的一大重点，如何与已有知识———多克隆抗体进行有效区别是授课中需要重点说明的问题；单克隆抗体制备过程中两步筛选的基本原理是本课程的难点；随着生物技术的高速发展，单克隆抗体的应用越来越普遍，深入了解其应用前景是本课程的重要拓展。

2微课开发的要点

选题宜“小”且“精”。微课以“微”为主要特征。选题要充分考虑这一特点，要在最短的时间内把重难点讲清说透，必要时可以把知识点进行合理解构。

过程紧凑合理。根据教学内容的需要，开发者要科学安排教学过程，既要有简明的知识引入、流畅的过程讲解，还要给学习者留有一定的想象空间。

形式生动唯美。微课作为一种视频学习资源，吸引人是其又一要素。因此，在微课开发设计时要从欣赏者的角度来审阅作品的可看性。

三“单克隆抗体技术”微课程的实践意义

1触角延伸，丰富课堂，为传统教学补充活力

微课源于现实课堂。教师在长期的教学积累中或针对难点突破，或针对课前导入，或针对拓展延伸，设计开发并解构成微课资源，并在课堂教学中承担不同的角色。因此，开发和设计微课是现有课堂教学的一种有益补充和拓展，是对目前课程内容精细化和便捷化处理的一种方式。

2优化资源，满足需求，为学生学习提供素材

微课程的出现是网络技术和移动学习技术发展的必然产物，适应新时代学生便捷学习的需要，它改变了学生原有的学习方式。微课资源的微型化、片段化符合个人学习者的学习习惯，能有效增加学习机会和满足学习需求，是学生课外延伸的个性化学习的最好载体。因此，微课使得学生学习时效性得以增强，学生可以按需选择学习，既可查漏补缺，又能强化巩固知识，集中有效时间解决学习中的难点和疑点问题；另外，学生可以利用移动学习终端设备随时随地开展个性化学习，让教师不再是讲台上的“圣人”，而是身边的导师。endprint

3拓展视野，提高能力，为教师发展搭建平台

微课程研发的主体是一线教师，把教师从教育教学的执行者变成课程的研究者和开发者，在研发的实践中激活教师的创造热情。教师在整个教学过程中，经历着“研究—实践—反思—再研究—再实践—再反思”的循序渐进、螺旋上升的过程。为拓展知识点，教师通过查阅资料去充实内容，在拓展视野的同时，也丰富了教学资源；凝练出简明扼要、逻辑性强、易于理解的教学语言，呈现出流畅紧凑的讲解过程，从而迅速提升教师课堂教学水平，促进教师专业成长。刘静波[6]认为微课程是一种供教师学习的课程，一个借以成长的工具，更是一种教师自发的“草根”的教研方式。

四存在的问题与对策

1处理好微课的“微”与学科体系的“全”的关系

微课以“微”著称，表现为时间短、容量小、内容精。学生能基于知识点进行有针对性、查缺补漏式的学习。由此带来的问题是，一个微课只是一门学科系统知识中的一个点，学生通过微课获得的知识是零散杂乱、不成体系的。我们可以通过加强微课程平台建设，使学生既能快速高效地了解“点”，又能系统连贯地把握“面”。

2检查和反馈学生自主学习情况

在没有监督的情况下，学生能自觉完成学习任务吗？如何跟进他们学习进度？怎样反馈自主学习的效果？这些都是在微课应用和推广的过程中摆在我们面前的关键问题。我们一方面可以借鉴美国可汗学院的监测系统，另一方面通过微课网络课程的建设，人性化地追踪学生自学情况、学习进度及学习效果。

总之，微课作为信息时代的产物，不应只是一段借助网络传播的视频，而应是课程目标、内容、评价、监控的有机统一体；是一种传统教学模式的补充，为学生提供可选择的学习资源。微课实施者要不断更新教育理念，注入新的思考，以保持其长久的吸引力。

参考文献

[1]LeRoy A. McGrew. A 60-Second Course in Organic Chemistry [J]. Journal of Chemical Education. 1993，70（7）： 543-544.

[2]Kee TP. The One Minute Lecture[J]. Education in Chemistry. 1995（32）：100-101.

[3]关中客.微课程[J].中国信息技术教育，2011 （17）：14.

[4]胡铁生.微课：区域教育信息资源发展的新趋势[J].电化教育研究， 2011（10）：63-67.

[5]黎加厚.微课的含义与发展[J].中小学信息技术教育， 2013（4）：10-12.

篇5：单克隆抗体大量生产技术及研究进展

抗鸡γ-干扰素单克隆抗体的研制及初步鉴定

目的: 制备抗鸡γ-干扰素单克隆抗体(mAb).方法: 应用淋巴细胞杂交瘤技术,以重组菌BL21(DE3)(pET-ChIFN-γ)表达产物的包涵体作为抗原免疫BALB/c鼠,以纯化的GST-ChIFN-γ作为检测抗原,制备抗鸡γ-干扰素mAb;采用ELISA、Dot-ELISA和Western blot鉴定mAb的特异性.结果: 获得2株可稳定分泌抗鸡γ-干扰素mAb的`杂交瘤细胞株1G5、5E3,其Ig亚类均为IgG2a,腹水mAb 1G5、5E3的ELISA效价分别为1:1 600 000,1:120 000.在Dot-ELISA试验中,这2株mAb均只与表达His-ChIFN-γ及GST-ChIFN-γ的重组大肠杆菌反应,与未表达这2种IFN-γ的其他8种菌株均不发生反应.在蛋白质印迹试验中,2株mAb均能与融合蛋白GST-ChIFN-γ、His-ChIFN-γ发生反应,出现特异性条带.结果表明,mAb 1G5、5E3是针对鸡γ-干扰素的特异性mAb.结论: 成功地制备抗鸡γ-干扰素的mAb,它们在免疫检测、免疫细胞功能分析和免疫调节研究等方面有应用价值.

作 者：戴华 焦新安 潘志明 黄金林 胡茂志 唐伟 刘秀梵 DAI Hua JIAO Xin-an PAN Zhi-ming HUANG Jin-lin HU Mao-zhi TANG Wei LIU Xiu-fan 作者单位：扬州大学,农业部畜禽传染病学重点开放实验室,江苏,扬州,225009刊 名：细胞与分子免疫学杂志 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY年，卷(期)：22(4)分类号：Q813.2关键词：鸡γ-干扰素(ChIFN-γ) 单克隆抗体

篇6：单克隆抗体大量生产技术及研究进展

目前，抗肿瘤单

。与多克隆抗体相比，单克隆抗体是单克隆

高化学上纯的同源抗体，而且单克隆抗来源特异性、

体至少在理论上是可以持续的“无限制”的供应，这

样就减少了不同动物个体所获得多克隆抗体始终有

［8］

差别的不利因素。对于具有抗药性的肿瘤细胞，170单克隆抗体药物表现出良好的杀伤力，如抗P-糖蛋白单克隆抗体构成的免疫毒素对于具有多抗药

性的肿瘤细胞可显示选择性杀伤作用。且单克隆抗体药物开发风险小，相比化学药物和微生物类药物，每一次失败都付出极大的代价，而单克隆抗体药物由于针对性强，开发临床研究失败的风险较小。

治疗指征是B细胞性慢性淋巴细源化单克隆抗体，

胞白血病，对T细胞性幼淋巴细胞白血病也有治疗

［13］

作用。（4）抗CD20抗体。最近批准的3个CD20抗体有：利妥昔单克隆抗体，适用于复发或化

学治疗抵抗性B淋巴细胞型的非何杰金淋巴瘤；替伊莫单克隆抗体，是世界上第1个放射性标记的单克隆抗体，用于治疗难治复发B细胞非何杰金淋巴瘤；托西莫单克隆抗体或131I标记托西莫单克隆抗体，具有抗肿瘤和放射免疫治疗功能。（5）抗表皮

有2个抗表皮生生长因子受体单克隆抗体。最近，

长因子受体单克隆抗体被批准用于治疗癌症，西妥

昔单克隆抗体和帕尼单克隆抗体。有25%～80%的结直肠癌出现上皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR）过表达，而EGFR是穿膜受体，具有酪氨酸激酶活性。除了上面介绍的9个单克隆抗体外，还有大量的单克隆抗体仍在研究［14］中。

2

2．1

单克隆抗体抗肿瘤类药物新药研制状况

单克隆抗体来源的抗肿瘤类药物经典品种在单克隆抗体抗肿瘤药物的发展中，出现了一系列

经典品种：（1）利妥昔单克隆抗体是全球第1个上

［9］

市的单克隆抗体药物。利妥昔单克隆抗体是抗体类药物中的主要品种，占据了全球抗体市场份额

该品由Genentech公司与罗氏公司共同开的30%，

“美罗华”，发上市，商品名为年销售额超过33亿美

元，主要用于治疗复发性、顽固性低度或滤泡性非何杰金淋巴瘤，目前该药也被批准用于类风湿性关节［10-11］

。（2）曲妥珠单克隆抗体是单克隆抗体高增炎

长的典型代表。曲妥珠单克隆抗体是信号传导抑制用于治疗乳腺癌。，商品名为“赫赛汀”药，

的曲妥珠单克隆抗体销售额为18．1亿瑞士法郎，比上年同期增长了105%，成为高增长药物的典型代表。（3）贝伐单克隆抗体是疗效较好的人源抗体。贝伐单克隆抗体是首个上市的人源化血管内皮生长

VEGF）单克因子（vascularendothelialgrowthfactor，隆抗体，临床疗效好

［12］

3

单克隆抗体抗肿瘤药物的国内外生产动

篇7：7单克隆抗体制备教案

一、教学目标

知识目标：

1、单克隆抗体的概念

2、单克隆抗体的制备过程，以及过程中涉及的具体筛选过程。

3、单克隆抗体的应用，和普通抗体相比的优点。能力目标：

1、学会从复杂的制备过程中找出简单的流程图

2、注意前后知识点的对比学习。情感态度价值观：从生物导弹的应用了解单克隆抗体目前在抗癌方面的贡献，并努力掌握更多的相关知识。

二、教学的重点难点：

单克隆抗体的制备过程，以及过程中涉及的具体筛选过程。

三、教学课时：1课时

四、教学过程：

【一】锚式问题：从“生物导弹”一个新颖而又陌生的画面入手。引发学生的探究热情。具体结合材料和图片来介绍生物导弹。资料：“生物导弹”是免疫导向药物的形象称呼，它由单克隆抗体与药物或放射性同位素配合而成，因带有单克隆抗体而能自动导向，在生物体内与特定目标细胞或组织结合，并由其携带的药物产生治疗作用。问题：生物导弹中的关键成分是什么？什么是单克隆抗体？ 【二】自主探究（4分钟，学生看课本完成）

1、长期人们怎样获得抗体？这样的抗体有什么缺点？

（给动物反复注射抗原，然后在动物的血清中提取抗体。抗体产量低、纯度低、特异性差）

2、B淋巴细胞在分泌抗体时有什么特点？B淋巴细胞实际指的是什么细胞？（一个或是一种B淋巴细胞只能分泌一种抗体；效应B细胞或是浆细胞）

分析：这两个问题比较简单，而且在课本中能直接找到答案，学生迅速阅读课本就能完成。【三】继续探究（10分钟，学生看课本，查阅资料，讨论合作完成）

1、写出单克隆抗体制备的过程简图（略，见课件）

2、怎么获得免疫小鼠，目的是什么？

（给小鼠注射特定的抗原，使小鼠发生特定的体液免疫，产生相应的B淋巴细胞）

3、为何选择B淋巴细胞和骨髓瘤细胞？

（B淋巴细胞能产生特定的抗体，单不能无限增殖；骨髓瘤细胞能无限增殖）

4、过程中大致需要几次筛选？怎么筛选？目的是什么？（主要是2次。第一次为了筛选出杂交瘤细胞；第二次筛选出能大量产生特定抗体的杂交瘤细胞。）

5、最终获得单克隆抗体的办法有几种？分别是？

（两种。体内在小鼠的腹水中提取；体外在细胞的培养液中提取）

6、单克隆抗体制备过程涉及的技术及其原理有哪些？

（细胞融合：原理是细胞膜具有流动性；动物细胞培养原理：细胞增殖）

分析：上述的6个问题涉及的内容是本节课的重点和难点，也是考点，需要和学生一起系统化的梳理，并强调重点内容作好笔记。【四】继续探究总结

1、单克隆抗体的“单”和“克隆”分别指的是什么？

（单：单个能产生大量抗体的杂交瘤细胞；克隆：无性繁殖即有丝分裂）

2、单克隆抗体的应用主要有哪些？

（主要集中在医学方面，诊断疾病，治疗疾病等）

3、单克隆抗体的主要优点有哪些？

（特异性强、灵敏度高、纯度大、可大量制备）【五】运用质疑

1、科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是(A)A．经过免疫的B淋巴细胞 B．不经过免疫的T淋巴细胞 C．经过免疫的T淋巴细胞 D．不经过免疫的B淋巴细胞

2、将小鼠骨髓瘤细胞与一种B淋巴细胞融合，可使融合的细胞经培养产生单克隆抗体，下列说法中不正确的是(C)A．动物细胞融合和动物细胞培养技术是单克隆抗体技术的基础 B．实验中杂交瘤细胞从培养基中吸收葡萄糖的方式是主动运输

C．B淋巴细胞与骨髓瘤细胞直接放入培养液中就能融合为杂交瘤细胞

D．按照培养基的用途分类，实验中筛选杂交瘤细胞的培养基是选择培养基

6、单克隆抗体是指（C）

A．单个骨髓瘤细胞增殖产生的抗体

B．单个B淋巴细胞增殖产生的抗体 C．单个杂交瘤细胞增殖产生的抗体

D．单个抗体通过克隆化，产生大量抗体 【六】课外延伸

篇8：单克隆抗体大量生产技术及研究进展

然而, 微课在国内起步较晚, 微课资源尚十分匮乏。结合我校现状, 课题组以全国首届高校微课程比赛为契机, 提出了以“细胞生物学”课程为载体, 通过开发“单克隆抗体技术”微课程, 着力提高学生自主学习能力。

一微课的背景与定义

如何处理好教与学的关系, 是教育界探索的永恒课题。陶行知先生认为老师的责任不在教, 而在教学, 教学生学;老师的教法除了联系自己的学问, 必须联系学生的学法。1993年, 美国北爱荷华大学的有机化学教授Le Roy A.Mc Grew[1]提出了“60秒有机化学课程”, 让非科学专业人士在非正式的场合中了解了化学知识。英国纳皮尔大学的Terence Kee教授[2]让学生对特定主题进行一分钟演讲 (One Minute Lecture, OML) , 使学生掌握特定领域中的核心概念。2004年, 可汗学院创办人孟加拉裔美国人萨尔曼·可汗利用电子画笔给远在新奥尔良市的表妹补习功课, 并收到很好的效果。上述结果均揭示, 站在学的立场, 优化教的方法, 才能达到教学的理想效果。正是出于这样的教学理念, 美国圣胡安学院的高级教学设计师David Penrose在2008年正式提出了“微课”这一概念。他把微课比作“知识脉冲” (Knowledge Burst) , 教师把教学内容与教学目标紧密地联系起来, 以产生一种更加聚焦的学习体验。

什么是“微课”?国内尚无一个比较系统的定义。我国教育技术界的胡铁生、焦建利、黎加厚、吴秉健和张一春等对微课的概念进行了详细诠释。微课, 又名微课程 (Microlecture, Microcourse) , 是指以微型教学视频为载体, 时间在10分钟以内, 针对某个学科知识点 (如重点、难点、疑点、考点等) 或教学环节 (如学习活动、主题、实验、任务等) 而设计开发的小课程[3,4,5]。微课作为一种新型学习资源, 其根本目的是为了突破难点、传授技能、培养兴趣、启迪智慧, 是为了更好地服务学生自主学习。微课作为微时代的产物, 一问世就受到众人的热捧, 其原因如下:

1解析时间较短, 符合学习规律

根据学习者的认知特点和学习规律, 一节课真正能有效学习的时间一般为5-10分钟。微课的时长正好符合这一特征要求, 具备轻负担、高质量、低耗时的特点。因此, 相对于传统一节课 (45分钟) 的教学课例来说, 微课是“片段化的课堂”。

2涵盖内容较少, 问题高度聚焦

微课目标真实、主题突出、过程简约、结构安排精巧、手段选择精致, 更适合学习者的需要。微课集中解决教学中的重点、难点、疑点内容, 便于学生吃透主题。因此, 相对于传统一节课要完成复杂而众多的教学内容, 微课的内容更加精简, 是“浓缩的课堂”。

3占用容量较小, 学习无处不在

以微型教学视频为载体的微课资源一般以支持网络在线播放的流媒体 (flv, wmv, rm等) 格式进行发布与传播, 容量大小在几十兆左右。学习者可在线观摩课例, 查看教案、课件等辅助资源, 也可灵活方便地将其下载到终端本地设备 (PC、手机、MP4等) 上实现移动学习、“泛在学习”。因此, 相对于传统的教学模式, 微课是“随时随地的课堂”。

二“单克隆抗体技术”微课程的开发

单克隆抗体技术是细胞生物学细胞工程章节中的重要知识点, 结合多年的教学经验, 我们将该知识点设计并开发了3个微课视频:单克隆抗体的概念、单克隆抗体的制备、单克隆抗体的应用。

1微课主题的确定

根据多年的教学积累, 结合课堂教学效果, 课题组撰写教学反思, 整理归纳细胞生物学教学中的重点、难点、疑点内容;钻研教材, 结合教学大纲整理“单克隆抗体技术”章节的知识菜单, 并交由教研组讨论, 确定“单克隆抗体技术”知识点作为微课程开发的主题。讨论中普遍认为, 学生对单克隆抗体概念的认识是该课程的一大重点, 如何与已有知识———多克隆抗体进行有效区别是授课中需要重点说明的问题;单克隆抗体制备过程中两步筛选的基本原理是本课程的难点;随着生物技术的高速发展, 单克隆抗体的应用越来越普遍, 深入了解其应用前景是本课程的重要拓展。

2微课开发的要点

选题宜“小”且“精”。微课以“微”为主要特征。选题要充分考虑这一特点, 要在最短的时间内把重难点讲清说透, 必要时可以把知识点进行合理解构。

过程紧凑合理。根据教学内容的需要, 开发者要科学安排教学过程, 既要有简明的知识引入、流畅的过程讲解, 还要给学习者留有一定的想象空间。

形式生动唯美。微课作为一种视频学习资源, 吸引人是其又一要素。因此, 在微课开发设计时要从欣赏者的角度来审阅作品的可看性。

三“单克隆抗体技术”微课程的实践意义

1触角延伸, 丰富课堂, 为传统教学补充活力

微课源于现实课堂。教师在长期的教学积累中或针对难点突破, 或针对课前导入, 或针对拓展延伸, 设计开发并解构成微课资源, 并在课堂教学中承担不同的角色。因此, 开发和设计微课是现有课堂教学的一种有益补充和拓展, 是对目前课程内容精细化和便捷化处理的一种方式。

2优化资源, 满足需求, 为学生学习提供素材

微课程的出现是网络技术和移动学习技术发展的必然产物, 适应新时代学生便捷学习的需要, 它改变了学生原有的学习方式。微课资源的微型化、片段化符合个人学习者的学习习惯, 能有效增加学习机会和满足学习需求, 是学生课外延伸的个性化学习的最好载体。因此, 微课使得学生学习时效性得以增强, 学生可以按需选择学习, 既可查漏补缺, 又能强化巩固知识, 集中有效时间解决学习中的难点和疑点问题;另外, 学生可以利用移动学习终端设备随时随地开展个性化学习, 让教师不再是讲台上的“圣人”, 而是身边的导师。

3拓展视野, 提高能力, 为教师发展搭建平台

微课程研发的主体是一线教师, 把教师从教育教学的执行者变成课程的研究者和开发者, 在研发的实践中激活教师的创造热情。教师在整个教学过程中, 经历着“研究—实践—反思—再研究—再实践—再反思”的循序渐进、螺旋上升的过程。为拓展知识点, 教师通过查阅资料去充实内容, 在拓展视野的同时, 也丰富了教学资源;凝练出简明扼要、逻辑性强、易于理解的教学语言, 呈现出流畅紧凑的讲解过程, 从而迅速提升教师课堂教学水平, 促进教师专业成长。刘静波[6]认为微课程是一种供教师学习的课程, 一个借以成长的工具, 更是一种教师自发的“草根”的教研方式。

四存在的问题与对策

1处理好微课的“微”与学科体系的“全”的关系

微课以“微”著称, 表现为时间短、容量小、内容精。学生能基于知识点进行有针对性、查缺补漏式的学习。由此带来的问题是, 一个微课只是一门学科系统知识中的一个点, 学生通过微课获得的知识是零散杂乱、不成体系的。我们可以通过加强微课程平台建设, 使学生既能快速高效地了解“点”, 又能系统连贯地把握“面”。

2检查和反馈学生自主学习情况

在没有监督的情况下, 学生能自觉完成学习任务吗?如何跟进他们学习进度?怎样反馈自主学习的效果?这些都是在微课应用和推广的过程中摆在我们面前的关键问题。我们一方面可以借鉴美国可汗学院的监测系统, 另一方面通过微课网络课程的建设, 人性化地追踪学生自学情况、学习进度及学习效果。

总之, 微课作为信息时代的产物, 不应只是一段借助网络传播的视频, 而应是课程目标、内容、评价、监控的有机统一体;是一种传统教学模式的补充, 为学生提供可选择的学习资源。微课实施者要不断更新教育理念, 注入新的思考, 以保持其长久的吸引力。

参考文献

[1]LeRoy A.McGrew.A 60-Second Course in Organic Chemistry[J].JournalofChemicalEducation.1993, 70 (7) :543-544.

[2]Kee TP.The One Minute Lecture[J].EducationinChemistry.1995 (32) :100-101.

[3]关中客.微课程[J].中国信息技术教育, 2011 (17) :14.

[4]胡铁生.微课:区域教育信息资源发展的新趋势[J].电化教育研究, 2011 (10) :63-67.

[5]黎加厚.微课的含义与发展[J].中小学信息技术教育, 2013 (4) :10-12.

篇9：单克隆抗体制备的筛选过程及意义

关键词：单克隆；抗体；筛选

中图分类号：R392 文献标识码： A 文章编号： 1674-0432（2014）-17-20-1

1975年英国剑桥皇家医学委员会分子生物学实验室的Kohler和Milstein成功的用细胞杂交方法把能够产生针对特定抗原的抗体分泌细胞分离出来，在体外长期传代并分泌特异性抗体，这些细胞经过克隆化，可以形成单克隆细胞，能产生针对某一特定抗原决定簇的完全相同的纯净抗体，即单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。

在单克隆抗体制备过程中，一般需要经历三次筛选过程。

1 HAT选择杂交瘤

细胞融合的选择培养液中有三种关键成分：次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、甲氨蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T），取三者的字头成为HAT培养液。细胞DNA合成一般有两条途径：主途径是由氨基酸和糖合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程；另一替代途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸存在的情况下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化作用合成DNA。甲氨蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞正常合成DNA，而融合所用的瘤细胞是经毒性培养液选出的HGPRT-细胞株，所以不能在HAT培养液中存活。因为融合细胞具有亲代双方的遗传性能，所以可在HAT培养液中长期存活与繁殖，从而达到细胞分离和纯化的目的。

在单克隆抗体制备过程中，由于细胞融合是一个随机的物理过程，小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合细胞悬液中，经融合后细胞可能有多种形式，不一定就是需要的杂交瘤细胞，如融合的脾细胞和杂交瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。正常的脾细胞在培养液中存活仅5～7天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去，而未融合的瘤细胞则需要进行进一步特别的筛选取出。

2 抗体的检测与筛选

筛选杂交瘤细胞通过选择培养而获得的杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体，因此需要检测特异性抗体，并筛选出所需要的杂交瘤细胞系。根据抗原的性质、抗体的类型不同，需选择不同的筛选方法。常见的为酶联免疫吸附法（ELISA），根据反应结果即可挑选出所需的阳性杂交瘤细胞系。

3 有限稀释法筛选

在单克隆抗体的生产过程中，由于效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HAT培养液筛选出的杂交细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞群进行再次筛选，选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞。因此采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖，然后检测每个孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附法），上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是单个细胞的，继续进行有限稀释，一般重复3～4次，直至确定每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞为止。

本次筛选也是鉴定的过程。一般杂交瘤细胞需经过2～3次反复克隆后，才能达到100%细胞阳性率，这个方法法也同样适用于一般细胞培养中的细胞纯化、突变细胞株的选择、识别和分离。

4 意义

通过HAT培养液的筛选作用，正常的脾细胞在培养液中存活仅5～7天，细胞的多聚体形式也容易死去，而未融合的瘤细胞则需要进行特别的筛选取出，从而达到筛选出融合的杂交瘤细胞的目的。但此时融合的杂交瘤细胞仅有少数能分泌针对特定免疫原的特异性抗体，因此需进行第二次筛选，即抗体的检测与筛选。但这次筛选出的抗体能力存在差异，仍需进一步筛选，即第三次筛选，选出活力好、抗性强的细胞。

经过三次筛选过程，最终可选出产生特定抗体的稳定的杂交瘤细胞，并保证细胞板的每个孔中增殖的细胞均为单克隆细胞，从而分泌出单一高效的单克隆抗体。

参考文献

[1] Kohler G，Nature C Continuous cultures of fused cells

secreting antibody of predefined specificiyt[J]. Nature，1975.256（4）：495-497.

[2]许保疆等.单克隆抗体在农业和医学上的应用[J]. 中国畜牧兽医， 2010.37，（7）：86-88.

[3]周东坡，生物制品学[M]. 北京：化学工业出版社， 2007.

篇10：单克隆抗体大量生产技术及研究进展

计

一、教材的地位和作用

《动物细胞融合与单克隆抗体》是人教版普通高中程标准实验教科书生物选修3专题二第2节动物细胞工程中第2小节的内容，由于细胞工程是建立在细胞结构、功能、生理等研究基础上的新技术，动物细胞融合又是细胞工程中基本技术之一，所以第2小节教学内容是在高中必修教材基础上的深入和扩展，也是第1小节动物细胞培养教学后的必然及延伸，是安排在学习了免疫、遗传与基因工程的基础上来进行教学的，学生既有一定的知识基础，又能为后面的微生物与发酵工程的教学奠定基础，尤其是为微生物的选种教学打下基础。同时，生物技术中各个分支领域相互渗透、相互促进，细胞融合技术也不例外，它在现代生物技术中具有一定的理论意义和经济意义。

二、学情分析

学生是在学习了《植物细胞工程》和《动物细胞培养和核移植技术》的基础上学习本节的，所以对于动物细胞融合这一部分应该能较轻松的理解，但是单克隆抗体的制备较复杂学生理解起来会有一定的难度，教师应详细介绍。

三、教学目标

根据新标要求和本节的具体内容，结合学生现有的知识水平，拟定下列教学目标。

、知识目标

（1）掌握动物细胞融合与植物体细胞杂交的区别和联系。

（2）简述动物细胞融合和单克隆抗体制备的过程。

（3）了解单克隆抗体在医学实践中的应用，并说其应用实例。

2、能力目标

（1）由植物体细胞杂交技术导出动物细胞融合过程，培养学生的知识迁移能力、思维能力。

（2）让学生尝试设计单克隆抗体的制备过程，指导学生掌握获取知识和探索生物科学的基本方法，使学生了解生物科学认识模式以发展学生的创造性能力。

（3）分析动物细胞融合技术的意义和应用，逐步提高学生独立获取知识、分析问题和解决问题的能力。

3、情感目标

（1）初步培养学生勇于探索，不断创新的精神和合作精神。

（2）通过向学生介绍动物细胞融合与单克隆抗体技术的发展动态及一些新的研究成果，使学生明确人们对生命奥秘的揭示愈加广泛和深入，知识不断更新并向前发展，认识到学无止境，形成终生学习的意识。

（3）关注动物细胞融合与单克隆抗体技术的发展和应用前景。

四、教学重难点

、重点

（1）动物细胞融合技术。

（2）单克隆抗体的制备过程。

2、难点

单克隆抗体的制备过程。

五、教学实施程序

教师组织和引导

学生活动

设计意图

创设情境，导入新、多媒体播放科幻电影中相关桥段，并展示人-鼠细胞杂交的图片，激发学生的学习欲望，导出本节的题。

2、进行学习目标的解读。、观看电影片段和人-鼠细胞杂交的图片，回忆所学知识。

2、熟悉本节所学内容，把握难点内容。

1、回顾人-鼠细胞杂交试验，让学生对动物细胞融合技术有初步的认识。

2、教学做到有的放矢。

自主学习，知识梳理、多媒体展示相关问题，组织学生进行解答。

2、根据学生的回答了解学生的预习情况。、通过前预习并进行知识梳理，组内讨论，形成统一认知。

2、小组进行展示。

培养学生自主学习的能力，并体现学生的主体地位。

合作探究，班内交流、多媒体展现合作探究内容，引导学生进行相互交流，并进行小组展示。

1、并合作交流，并确定学习难点内容。

培养学生合作精神。

点拨精讲，解难释疑

单克隆抗体制备的过程：

通过多媒体展示单克隆抗体的设计思路及制备过程，同时提出问题，学生讨论。

（教师讲解为主）

合作探究以下问题：

、如何获得B淋巴细胞？

2、如果把B淋巴细胞和骨髓瘤细胞放在一起时，会有几种融合方式（类型）？

3、选择杂交瘤细胞的两步筛选的目的各是什么？

4、如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？

本部分知识较难，但学生通过预习能简单的分析出一部分，通过讨论使知识完整培养学生全面思考问题的能力

随堂练习，当堂反馈

多媒体展示相关习题

读题，思考与讨论，并进行解答

、巩固学生对实验分析解读能力。

2、通过对学生练习结果的评价，了解学生对知识的掌握情况，以便确定下一步的补偿性学习的安排。

归纳总结，科评价、多媒体展示“三个重要过程”“三个一”，帮助学生记忆和理解。

2、对学生的堂表现进行评价。

观看多媒体展示内容，对所学内容有一个概括性的总结。

科学评价有利于小组内学生之间的相互团结，培养学生团队合作的意识

七、板书设计

222动物细胞融合与单克隆抗体

一、动物细胞的融合二、单克隆抗体*、概念：、抗体11概念:Ig

2：B细胞

2、方法：

2、概念：杂交瘤细胞、高度单

一、抗体

3、过程

3、制备过程（杂交瘤制备技术）

4、意义：制备单克隆抗体

4、应用：“生物导弹”

篇11：单克隆抗体大量生产技术及研究进展

以重氮反应将盐酸克伦特罗与牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白偶联制备免疫原和检测原,通过杂交瘤技术获得了3株能分泌特异结合CL小分子的抗体杂交瘤细胞株.经竞争法ELISA分析,9E3抗体的IC50质量浓度为19.85μg/L,14C5抗体为1.65μg/L,16F4抗体为0.84μg/L.在与类似物的交叉性反应中,16F4抗体与沙丁胺醇的交叉反应性为0.26%,特布他林为0.04%,与非诺特罗、肾上腺素、去甲肾上腺素的.交叉反应性都小于0.02%.因此,所制备的抗盐酸克伦特罗的抗体的特异性高,可用于与其相关的免疫检测研究和应用.

作 者：吕琦 张爱玲 王泽华 马岚 LV Qi ZHANG Ai-ling WANG Ze-hua MA Lan 作者单位：吕琦,王泽华,马岚,LV Qi,WANG Ze-hua,MA Lan(云南大学,单克隆抗体工程技术中心,云南,昆明,650091)

张爱玲,ZHANG Ai-ling(云南中医学院,云南,昆明,650032)

篇12：单克隆抗体大量生产技术及研究进展

人胎盘层粘连蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的 获得能特异性识别人层粘连蛋白(hLN)的单克隆抗体(McAb).方法 用纯化的人层粘连蛋白(hLN)作抗原免疫Balb/C小鼠,以细胞融合、酶联免疫吸附实验(ELISA)筛选和克隆化技术获得抗hLN的杂交瘤细胞株;用生物学方法鉴定杂交瘤细胞,用免疫学方法鉴定McAb的特异性.结果 获得4株稳定分泌抗人LN的杂交瘤细胞株(2A1、3B5、2C4、4D1),培养上清的ELISA效价分别为:1:512、1:1 024、1:512、1:256;腹水效价分别为:1×106、1×107、1×106、1×105;采用ELISA相加法表明2A1、4D1与3B5、2C4识别的hLN上的抗原决定簇和识别的不同,4株单抗均属实IgG.结论 成功建立了4株稳定分泌抗人LN McAb的`杂交瘤细胞株,它们分别识别hLN上2个不同的抗原位点,有望作为hLN定量检测的特异性抗体.

作 者：曾宪威 蒋艺勤 肖静 杨元好 ZENG Xian-wei JIANG Yi-qing XIAO Jing YANG Yuan-hao 作者单位：广东省深圳市宝安区松岗人民医院检验科,深圳,518105刊 名：热带医学杂志 ISTIC英文刊名：JOURNAL OF TROPICAL MEDICINE年，卷(期)：7(7)分类号：Q513.2关键词：层粘连蛋白 单克隆抗体 酶联免疫吸附试验 制备

篇13：单克隆抗体研究进展

1 鼠源单克隆抗体技术 (杂交瘤技术)

1.1 杂交瘤技术的基本原理

小鼠骨髓瘤细胞能在体内外无限增殖和分泌无抗体活性的免疫球蛋白, 而免疫小鼠脾细胞具有产生抗体的能力, 但不能无限增殖。采用融合剂聚乙二醇 (PEG) 等将这两种细胞融合成杂交瘤细胞。这种杂交瘤细胞具有亲代细胞的主要特征。既能在人工培养下无限增殖, 又能产生特异性的抗体。由于每一个被免疫的淋巴细胞只能对某个单一的抗原决定簇产生特异性抗体, 因而在将其克隆化后产生的单克隆细胞系, 就能产生大量单一的高纯度抗体, 即“单克隆抗体”。

细胞融合培养时加入HAT (H-次黄嘌呤、A-氨基喋呤、T-胸腺嘧啶) 选择系统, 目的是保证只有杂交瘤细胞的生长。融合细胞能在HAT选择性培养基上生长的原理是:在HAT系统中, A阻断了核酸合成的主要途径, 这时正常细胞可以通过“补救途径”, 由胸腺嘧啶激酶 (TK) 和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (HGPRT) 利用T和H合成核酸。骨髓瘤细胞, 因缺乏HGPRT不能利用“补救途径”, 所以在HAT系统中不能存活。而骨髓瘤细胞和脾细胞的杂交细胞, 从正常的脾细胞获得了HGPRT, 能够存活。正常脾细胞没有在体外长期生长的能力。

1.2 杂交瘤技术的的优、缺点由于单克隆抗体是单细胞

繁殖的细胞所产生的抗体, 具有特异性强, 纯度高, 可以大规模工厂化生产等优点, 从而使免疫分析技术准确性高, 重复性好, 方法简便。

但Mc Ab技术所需仪器设备昂贵, 加之实验程序较为复杂, 又因单克隆抗体针对某一抗原决定簇, 抗原化合价常常不能与抗原形成网络沉淀, 不能用于沉淀衍生出来的免疫技术。

1.3 杂交瘤技术的拓展

随着杂交瘤技术在生命学科各个领域中应用的不断深入, 杂交瘤技术生产单克隆抗体的方法得到了很多改进, 人们不断发现单克隆抗体的新用途。

1.3.1 其它动物的杂交瘤技术

由于人或动物不同类间抗体有排斥反应, 80年代以来, 人们在鼠杂交瘤技术的基础上, 发展了人源杂交瘤技术, 鼠与其他动物包括兔、牛、猪和绵羊的种间杂交瘤。其它动物源的杂交瘤分泌的单克隆抗体特别适合于兽医和食品检验领域中使用。如80年代中期用EB病毒转化体外培养的人B淋巴细胞建立分泌单克隆抗体的细胞系获得成功, 为人源单克隆抗体的生产开辟了新的途径。

1.3.2 抗体酶技术

1986年, Schultz等和Tramontano等发现某些单克隆抗体具有酶的催化作用, 从而为人工设计和生产具有特定催化活性的抗体酶开辟了道路。目前已制备出具有变位酶活性的抗体酶和水解羟基酯、羧基酯、碳酸酯和香豆素酯的酯酶活性的多种抗体酶。

1.3.3 抗独特型抗体的单克隆抗体

独特型是指存在于抗体分子可变区及淋巴细胞受体上的抗原决定簇, 由独特型抗体 (第一抗体) 刺激机体产生的抗体 (第二抗体) 能识别抗原位点的独特型抗体的抗原决定簇, 由抗独特型抗体的抗体 (第二抗体) 刺激机体产生的抗体 (第三抗体) 能与抗原结合, 即与独特型抗体 (第一抗体) 具有类似性。抗独特型抗体作为一种探针已广泛应用于受体结构和功能的研究, 还可用于鉴别和比较特异性抗体分子上的独特型抗体决定簇。

1.3.4 杂交—杂交瘤技术

杂交—杂交瘤技术是分泌不同特异性抗体的细胞进行融合而产生既分别分泌两个亲代细胞的抗体分子, 又分泌同时表现两个亲代细胞抗体结合特异性的杂交分子的杂交瘤技术。其分泌的分子嵌合体就是双特异性单克隆抗体。杂交-杂交瘤的产生可以是杂交瘤和脾细胞间的融合, 也可以是已建立的分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞间的融合, 即四交瘤技术。这种双特异性单克隆抗体适用于抗原的定位观察和定量测定。

2 人源单克隆抗体的研制

2.1 噬菌体抗体库技术

噬菌体抗体库技术是将噬菌体展示技术应用于抗体库技术所取得的一大进展, 是把人淋巴细胞谱中的VH和VL基因片段, 通过RT-PCR技术进行克隆和扩增, 并随机组合到表达载体上, 构建出大容量的人源性抗体库。同时, 利用噬菌体展示技术能将特定分子的基因型和表型相统一的特点, 即噬菌体表面表达了特定的蛋白质, 则噬菌体的DNA中必然含有该蛋白质相应的结构基因, 通过多次的“吸附-洗脱-扩增”的筛选富集过程, 就可以有效地筛选出特异性的人源性抗体的可变区基因, 从而制备出人源性单克隆抗体。初次用噬菌体抗体库技术所获得的人源性单抗其亲和力往往比较低, 难以达到实用要求, 随着近几年体外亲和力成熟技术的进步, 可筛选出亲和力提高103倍的抗体, 接近甚至超过杂交瘤技术所能达到的亲和力水平。

2.2 核糖体展示技术

1997年, Hanes和Plukthun建立了核糖体展示技术: (1) 先构建一个sc Fv文库, 并采用一定的方法, 即同时引入T7启动子、核糖体结合位点和茎环结构, 使文库中的基因片断能与核糖体相结合, 然后转录成m R-NA; (2) 纯化后, 在大肠杆菌S30系统中进行体外翻译, 形成“m RNA-核糖体-sc Fv”复合物; (3) 用固相化抗原从中筛选出相应的展示天然sc Fv的核糖体复合物; (4) 以EDTA解离结合的核糖体复合物 (4b) , 或以抗原特异性洗脱整个复合物 (4a) ; (5) 从复合物中分离获得相应的m RNA; (6) 再反转录成c DNA并以PCR加以扩增, 所得的DNA进入下一轮富集筛选。它是第一个完全在体外进行进化和筛选折叠蛋白质的系统, 其中的每一步包括所有的复制、扩增、转录、筛选的全过程均在体外完成。此种方法可以很容易地构建超大容量的抗体库, 库容可达1014~1015;另外又可以非常方便地联合使用一些特殊的PCR技术, 使抗体获得更大、更广的遗传多样性, 且抗体亲和力也很高, 其亲和常数可达10~11mol/L。

2.3 转基因/转染色体小鼠技术

利用转基因小鼠技术制备人源性单抗就是通过转基因技术, 包括Ig基因小位点法、PI噬菌体载体法及酵母人工染色体法, 将人的抗体基因座转入小鼠体内, 并使人的抗体可变区基因在小鼠淋巴细胞进行重排和表达, 具有表达人抗体的B淋巴细胞在抗原的驱动下进行不断的克隆和分化, 最后形成具有携带高度亲人抗体的浆细胞, 再利用传统的鼠杂交瘤的方法制备人源性单抗。其本质就是将鼠部分人源化, 是对杂交瘤技术的一种改进。

3 基因工程单克隆抗体的发展

随着DNA重组技术的成熟和抗体基因结构及抗体多样性产生机理的阐明, 多种基因工程抗体已经问世。

3.1 嵌合抗体

从杂交瘤细胞中获得抗体V区c DNA, 克隆到重组了人抗体C区的载体中, 转化哺乳动物细胞表达出人鼠嵌合抗体。改造后的抗体保留了原单抗特异结合抗原的V区, 去除了非人源序列 (C区) ;但由于其整个V区都是异源的, 所以嵌合抗体的异源性还很明显。嵌合抗体完整地保留了异源单抗的V区, 最大限度地保持了其亲和活性, 可作进一步改造的亲和力参照体, 也是进一步提高补体活化及细胞毒作用等的基础对照。

3.2 重构抗体

重构抗体是在嵌合抗体基础上进一步发展而成, 也是通过DNA重组方法将人源抗体的互补决定区, 用特异性异源抗体CDR替换所得到的抗体;即由异源抗体中与抗原结合相关的残基与人抗体重新拼接构建的。包括抗原结合位点的重构和框架区 (FR) 重构。

3.3 小分子抗体

抗体分子的抗原结合部位局限在可变区组成的Fv段, 从而可以构建分子量较小的具有抗原结合功能的分子片段, 称为小分子抗体。常见的小分子抗体包括:Fab、Fv及单链抗体, 单区抗体和最小识别单位。

3.3.1 Fab

Fab由重链Fd段和完整的轻链组成, 两者通过一个链间二硫键连接, 形成异二聚体, 是完整抗体分子的三分之一, 仅有一个抗原结合位点。Fab段由于有二硫键连接轻链和Fd段, 分子结构比较稳定, 且较好地保持了天然抗体分子的Fv段结构, 主要用作实验室研究工具。

3.3.2 FV

Fv是抗体分子中保留抗原结合部位的最小功能片断, 它由轻链可变区和重链可变区组成, 两者以非共价键结合在一起。

3.3.3 单链抗体

单链抗体是目前报道最多的基因工程抗体, 是一种新型重组蛋白, 它是把抗体可变区重链 (VH) 与轻链 (VL) 通过一段约15~25个氨基酸残基构成的弹性短肽 (Linker) 相连而成, 通过正确折叠, 两个可变区由非共价键形成具有抗原结合功能的Fv段, 此单一肽链的结构既有利于在大肠杆菌的表达和进行基因重组操作, 也增加了Fv的稳定性。

3.3.4 单区抗体

Ward等 (1989) 发现有些抗体分子的单独VH具有与抗原结合的亲和力, 并保持完整抗体的特异性。将单独VH基因导入表达载体所得到的表达抗体即所谓单区抗体 (single domain antibody) , 仅为完整Ig G分子的1/12, 很易穿透细胞膜。

3.4 抗体融合蛋白

抗体分子片断与其它蛋白融合, 可得到具有多种生物学功能的融合蛋白, 这种抗体融合蛋白有多种不同的构建方式, 可将其分为两大类。一类是将含Fv段的抗体片断与其它生物活性蛋白融合, 利用抗体的特异性识别功能将某些生物学活性引导于特定部位, 靶向治疗是其主要应用领域。另一类是含Fc段的抗体融合蛋白, 利用Fc段所特有的生物学功能与某些具有粘附或结合功能的蛋白融合, 又称为免疫粘附素。

3.5 噬菌体抗体

噬菌体抗体的主要特点是它即可以识别相应抗原并与其结合, 又能够在感染宿主菌中扩增。将B淋巴细胞全套可变区基因克隆出来, 组装成噬菌体抗体群体, 即成为噬菌体库。构建抗体库过程中采用较多的噬菌体载体是Barbas和Clackson构建的载体———p Comb3。

(参考文献从略)

摘要：抗体分子是生物及医学领域中用途最为广泛的蛋白质分子。本世纪30～60年代对抗体的理化性质以及对免疫球蛋白分子结构与功能的研究取得了突破性进展。1976年德国学者Kohler和英国学者Milstein创建杂交瘤技术, 首次成功地制备了小鼠单克隆抗体 (McAb) 即第二代抗体。80年代早期开始了基因工程抗体即第三代抗体的研究。基因工程抗体指通过基因工程方法改造和制备抗体, 它兴起于对鼠单抗的人源化改造, 至90年代初产生的抗体库技术将基因工程抗体的发展推向了高潮, 使抗体制备技术进入了一个全新的时代。

篇14：单克隆抗体大量生产技术及研究进展

关键词：甘蔗；ShSAP1；锌指蛋白；原核表达；多克隆抗体

中图分类号： Q331 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）03-0043-03

逆境相关蛋白（stress assiated protein，SAP）是植物中一类含有A20与AN1锌指结构的蛋白，该蛋白家族与植物的非生物胁迫应答密切相关。SAP基因的表达能够被1种或多种非生物胁迫诱导，转基因研究发现SAP家族基因可以增强转基因植物的对1种或多种胁迫的抗逆性[1]。目前关于SAP的作用机制还不是很清楚，研究发现SAP可能通过泛素蛋白酶途径、蛋白相互作用或作为氧化还原感受器参与植物的逆境应答过程[2-4]。ShSAP1（GenBank登录号HM991960.1）是由甘蔗（Saccharum officinarum L.）中克隆到的SAP家族基因，研究发现该基因的表达具有逆境应答特性[5]，目前正在开展ShSAP1的转基因功能分析。本研究构建了ShSAP1的原核表达载体，通过大肠杆菌原核表达系统进行ShSAP1的蛋白表达与纯化，并通过免疫家兔获得了抗血清，为ShSAP1蛋白功能研究及的后续的转基因检测打下了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

原核表达载体pET32a（+）由中国热带农业科学院热带生物技术研究所刘志昕实验室惠赠，大肠杆菌菌株DH5α和BL21（DE3）感受态细胞感受态购自天根生化科技有限公司。rTaq酶购自大连宝生物工程有限公司，限制性内切酶，T4连接酶购自Fermantas公司，PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自Axygen公司，蛋白Marker、蛋白纯化试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，Goat Anti-Rabbit IgG-AP与BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，其他试剂为国产分析纯。本试验所用的引物序列如下，由上海生工生物工程技术有限公司合成。

1.2 ShSAP1原核表达载体的构建

由甘蔗cDNA扩增ShSAP1基因阅读框，所用引物为PETZP1和PTEZP2，PCR反应条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。纯化PCR产物，用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ对纯化后PCR产物和pET32a（+）质粒进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收PCR产物酶切片段和pET32a（+）大片段，用T4连接酶连接转化DH5α，重组质粒进行酶切验证后送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序，获得原核表达载体pET-ShSAP1。

1.3 融合蛋白的小量表达

将pET32a（+）与测序验证后的原核表达载体pET-ShSAP1转化BL21（DE3），挑取阳性单菌落接种于10 mL含有Amp的LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min培养。培养至D=0.6～0.8，各取1 mL分装于灭菌的1.5 mL EP管中，加等体积35%甘油，混匀，-70 ℃保存。试管中剩余菌液用加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导，37 ℃、200 r/min培养 3～4 h。超声波破碎菌体，取1.5 mL的EP管，分别取1 mL破碎后的菌液，12 000 r/min离心1 min。沉淀用100 μL的无菌水吹散。分别取10 μL上清和10 μL沉淀悬浮液进行 SDS-PAGE 分析，考馬斯亮蓝R-250染色30 min后进行脱色，鉴定表达产物的存在形式及表达量。

1.4 融合蛋白的大量表达与纯化

将小量表达验证过的pET32a（+）和pET-ShSAP1菌液进行划线培养，挑取阳性单菌落接种于10 mL含有Amp的LB液体培养基中，于37 ℃活化培养8 h后，以1 ∶100稀释到400 mL含有Amp的LB液体培养基中，振荡培养至D600 nm值达到0.6～0.8，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，继续于 37 ℃ 培养8 h诱导蛋白表达。8 000 r/min离心10 min，收集菌体，弃上清，加入30 mL Binding Buffer（500 mmol/L NaCl、20 mmol/L imidazole、10 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0）重悬，使用超声波破碎法在冰浴中对菌体进行破碎，8 000 r/min离心10 min，分离裂解液上清保存，取10 μL上清液进行SDS-PAGE分析。

蛋白纯化：用6 mL灭菌水洗涤琼脂糖树脂2次后，以 6 mL Binding Buffer平衡亲和柱。取6 mL裂解液上清上柱，用6 mL Wash Buffer（500 mmol/L NaCl、20 mmol/L imidazole、20 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0）洗脱杂蛋白，再分别以由低至高的咪唑浓度的6 mL Elute Buffer（500 mmol/L NaCl，50、100、200、500 mmol/L imidazole，20 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0）洗脱融合蛋白，取10 μL洗脱液进行SDS-PAGE分析。同时，将纯化蛋白送往北京华大基因测序中心进行质谱测序分析。选取浓度与纯度较好的洗脱液进行1×PBS透析，透析3次后进行蛋白浓度测定既可用于免疫兔子，蛋白浓度（mg/mL）=1.45D280 nm-0.74D260 nm[6]。

nlc202309041020

1.5 抗血清的制备和效价测定

将纯化并透析过的融合蛋白作为免疫原对普通成年大白兔进行免疫（注射总量为1 800 μg/只），每次免疫加等体积弗氏完全佐剂乳化后皮下多点注射。每隔8 d 进行1次免疫，第4次免疫后第5天耳静脉采血，分离血清，以ShSAP1纯化融合蛋白（2 μg/mL）为抗原进行ID-ELISA 测定，以免疫前家兔血清作为阴性对照，PBS作为空白对照。效价检测合格后进行颈动脉采全血50 mL，血液处理如下：37 ℃静置1 h，4 ℃ 静置过夜，5 000 r/min离心15 min，吸取上清于50 mL离心管，再次5 000 r/min离心，15 min，吸取上清，留出近期使用量2～8 ℃存放，其余分装后置于-70 ℃。

2 结果与分析

2.1 ShSAP1的原核表达的构建

用引物PETZP1与PETZP2从甘蔗cDNA扩增得到带有BamHⅠ/HindⅢ酶切位点的530 bp目标产物（图1泳道1），将PCR产物纯化后和载体pET32a（+）分别进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切，回收PCR酶切产物和pET32a（+）大片段进行连接转化DH5a，对重组质粒进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切验证，可以切下530 bp左右的目的条带（图1泳道3）载体经测序鉴定后，结果正确，构建成ShSAP1的原核表达载体pET-ShSAP1。

2.2 ShSAP1的小量表达与表达模式的确定

将pET32a（+）与pET-ShSAP1重组子质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选出阳性克隆，小量培养至D值为0.7左右，加IPTG诱导3 h，收集菌体进行超声波破碎细胞后，离心分出上清与沉淀，分别取10 μl上清和10 μl沉淀悬浮液进行SDS-PAGE电泳（图2），pET-ShSAP1菌体裂解液上清在约35 ku处出现1条蛋白带，而对照pET32a（+）上清无此带。ShSAP1基因编码171个氨基酸，预测蛋白分子量约为18.3 ku，融合蛋白的氨基酸总数为332个左右，表达出的融合蛋白ShSAP1-His大小约为35 ku，大小与SDS-PAGE所测大小相符，初步表明ShSAP1在大肠杆菌中表达成功。ShSAP1在（http：//www.expasy.ch/tools）疏水性分析结果表明，ShSAP1编码的氨基酸序列中，具有多个明显的亲水区域，大部分的氨基酸属于亲水性氨基酸，推测ShSAP1属于亲水性蛋白；由pET-ShSAP1的菌体裂解液沉淀悬浮液的电泳结果可以说明，ShSAP1-His融合蛋白主要存在于上清中，确定ShSAP1为可溶性蛋白。

2.3 ShSAP1的大量表达及纯化

经过大量诱导，PET-ShSAP1菌表達出了丰度较高的目标融合蛋白（图3泳道2）。将ShSAP1的粗蛋白上清用 Ni2+-NTA 琼脂糖亲和层析柱进行纯化，其中Elute Buffer的imidazole浓度为100 mmol/L时洗脱纯度和浓度较好，以该浓度下的洗脱产物进行电泳（图3泳道3），测定纯化后的表达产物浓度为0.805 mg/mL。将纯化蛋白条带切下送往华大基因测序，质谱所得部分氨基酸序列经比对后发现与甘蔗ShSAP1推导蛋白氨基酸序列具有一致性，说明ShSAP1在大肠杆菌中得到了正确的表达。

2.4 ShSAP1抗血清的效价测定

将纯化后并经过透析的融合蛋白（0.673 mg/mL）作为免疫原，采用肌肉与皮下注射相结合免疫家兔，4次注射后进行抗血清的效价测定。以蛋白溶液（2 μg/mL）为抗原进行 ID-ELISA 测定（图4），以表达的ShSAP1融合蛋白作抗原，抗血清稀释125 000倍后仍明显地呈阳性反应。效价判断标准为大于最大D405 nm的一半的最小D405 nm所对应的稀释度，即为1 ∶25 000。

3 讨论

植物对逆境的适应主要依靠激活抗逆相关调控因子如DREB、MYB/MYC、NAC、AREB等转录因子[7]，激活下游的抗逆效应基因，这些基因可能是抗逆代谢途径中的关键酶如SOD、POD[8]，也可能是直接起作用的抗逆效应蛋白如热激蛋白等[9]。有研究表明一些抗逆基因能够提高原核表达重组菌的抗胁迫能力[10-12]。ShSAP1的表达能被高盐诱导，在进行ShSAP1融合蛋白抗血清制备的同时，我们通过在培养基和培养平板中添加不同浓度的NaCl对pET-ShSAP1重组菌进行了抗盐性鉴定，结果未发现该重组菌表现出抗盐特征，说明ShSAP1在BL21原核系统中无增强宿主菌抗盐胁迫的能力，可能是由BL21中没有与ShSAP1相互作用的抗逆应答因子所致。本研究对甘蔗ShSAP1进行了原核表达与蛋白纯化，得到了与预期蛋白大小一致的融合蛋白，并制备了ShSAP1的抗血清，为今后转基因植株检测和蛋白质功能研究奠定了基础.

参考文献：

[1]Giri J，Dansana P K，Kothari K S，et al. SAPs as novel regulators of abiotic stress response in plants[J]. Bioessays，2013，35（7）：639-648.

[2]Giri J，Vij S，Dansana P K，et al. Rice a20/AN1 zinc-finger containing stress-associated proteins （SAP1/11）and a receptor-like cytoplasmic kinase （OsRLCK253）interact via a20 zinc-finger and confer abiotic stress tolerance in transgenic arabidopsis plants[J]. New Phytologist，2011，191（3）：721-732.

nlc202309041020

[3]Kang M，Fokar M，Abdelmageed H，et al. Arabidopsis SAP5 functions as a positive regulator of stress responses and exhibits E3 ubiquitin ligase activity[J]. Plant Molecular Biology，2011，75（4/5）：451-466.

[4]Strher E，Wang X J，Roloff N，et al. Redox-dependent regulation of the stress-induced zinc-finger protein SAP12 in Arabidopsis thaliana[J]. Molecular plant，2009，2（2）：357-367.

[5]李晓君，蔡文伟，张树珍，等. 甘蔗锌指蛋白基因ShSAP1的克隆与表达模式[J]. 生物工程学报，2011，27（6）：868-875.

[6]吴育鹏，王健华，冯团诚，等. 辣椒脉斑驳病毒CP基因的原核表达及其抗血清的制备[J]. 园艺学报，2010，37（10）：1598-1604.

[7]Nakashima K，Ito Y，Yamaguchi-Shinozaki K. Transcriptional regulatory networks in response to abiotic stresses in arabidopsis and grasses[J]. Plant Physiology，2009，149（1）：88-95.

[8]Apel K，Hirt H. Reactive oxygen species：metabolism，oxidative stress，and signal transduction[J]. Annual Review of Plant Biology，2004，55：373-399.

[9]Wang W，Vinocur B，Shoseyov O，et al. Role of plant heatshock proteins and molecular chaperones in the abiotic stress response[J]. Trends in Plant Science，2004，9：244-252.

[10]臧 潔，余 梅，王先磊，等. 盐角草Cu/Zn-SOD基因的克隆及耐盐性分析[J]. 农业生物技术学报，2013，21（7）：847-854.

[11]蔡 丹，郑易之，兰 英. 大豆LEA蛋白Em的表达可提高大肠杆菌和烟草耐盐性[J]. 深圳大学学报，2006，23（3）：230-236.

[12]郝梦雨，郎明林，杨学举. 印度芥菜BjJ10-2基因原核表达载体构建及抗盐功能的鉴定[J]. 核农学报，2011，25（2）：247-252.