cd级危房鉴定标准（精选3篇）
篇1：cd级危房鉴定标准
蔡家滩小学D级危房隐患报告
东河乡党委、人民政府、区教育局项目办：
蔡家滩小学校园内一年级教室及科学仪器室（即进校门第二排马路西侧教室）为1984年修建的钢屋架结构教室，计108平方米；另学校教职工食堂44平方米，为1995年修建土木结构房。以上房屋共计152平方米，于2009年全国校舍安全工程鉴定中被兰州城市建设设计院鉴定为D级危房，但由于我校学生增多学生教室缺少，教学中对各功能室的需要等因素，我校仍在继续使用上述房屋。
特此向东河乡人民政府及上级部门报告，申请解决学校危房隐患。
东河乡蔡家滩小学
2012年11月29日
篇2：cd级危房鉴定标准
1 材料与方法
1.1 材料
T4 DNA Ligase酶、Bam HI及Eco RII酶、DNA凝胶回收试剂盒:Ta Ka Ra公司, 高纯质粒小量提取试剂盒:Hyclone公司, DH5α大肠杆菌:上海吉凯基因公司;慢病毒包装细胞293T细胞:Invitrogen公司;人喉癌上皮细胞Hep-2购自中国科学院上海生化与细胞研究所;LymphoprepTM分离液:Nyco Prep公司;LipofectamineTMRNAi MAX转染试剂:invitrogen公司;胎牛血清:Hyclone公司;CD47抗体:abcam公司;Goat Anti-Rabbit Ig G:southern biotech公司;定量PCR用的SYBR Green q PCR Super Mix:Invitrogen公司;定量PCR用的SYBR Green q PCR Super Mix:Invitrogen公司;荧光显微镜:Leica公司。
1.2 方法
1.2.1 特异性sh RNA序列的设计、载体构建
检索Genebank, 获取CD47基因核苷酸序列, 得到针对CD47编码区的发夹状寡核苷酸干扰序列。经Blast比对进行同源性分析后, 选出特异性较高的3组分别命名, 以可以被任意替换的茎干发夹结构作为阴性对照。序列分别为NC:UUCUCCGAACGUGUCACGUTT, NC_AS:ACGUGACACGUUCGGAGAATT, SASI_Hs O0:GGCAUUAGCUGAGAGGUGUd Td T, SASI_Hs O0_AS:ACACCUCUCAGCUAAUGCCd Td T, SASI_Hs O1:GGUGAUUACCCAGAGAUAUd Td T, SASI_Hs O1_AS:AUAUCUCUGGGUAAUCACCd Td T;SASI_Hs24:GACUUCUACAGGGAUAUUAd Td T, SASI_Hs24_AS:UAAUAUCCCUGUAGAAGUCd Td T。CD47基因特异性靶序列的选择及质粒、干扰链的合成:由sigma公司完成。
1.2.2 酶切、慢病毒包装
取p LVX-sh RNA载体15μL于EP管, 用Bam HI 1.5μL与Eco RII1.5μL、10×buffer 5μL酶切反应4 h以上;产物回收加入T4 DNA Ligase使CD47sh RNA片段与目的载体连接, 连接产物加入至DH5α感受态细胞中转化;用高纯质粒小量提取试剂盒行质粒提取, 同时挑取阳性克隆行PCR鉴定、DNA测序;PCR鉴定阳性克隆引物序列:CD47sh RNABam HIF1:gatccggtgattacccagagatatctcgagatatctctgggtaatcacctttttg;CD47sh RNAB am HIR1:aattcaaaaaggtgattacccagagatatctcgagatatctctggg taatcaccg。将含目的基因sh RNA-CD47的重组质粒p LVX-sh RNA-CD47及包装质粒导入密度达70%~80%的293T细胞, 产生高滴度含目的基因sh RNA-CD47慢病毒。PCR条件:94℃30 s预变性, 94℃30 s变性、55℃30 s退火、72℃30 s延伸, 共30个循环, 每个循环结束后从第二步开始下一个循环, 循环结束后再72℃延伸6 min。对PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳, 设立自连对照 (空载体自连对照组) 和阴性对照 (dd H2O) , 同时将产物测序。
1.2.3 慢病毒生物学滴度测定 (TU/m L) 及细胞感染
在滴度测定前一天取48孔板, 加入3×104cell/孔293T细胞。用DMEM完全培养基10倍梯度稀释病毒。如下:取96孔板, 每孔含有90μL培养基, 第一横排孔每孔加入10μL待测病毒原液, 混匀后吸取10μL混合液至第二横排孔 (混匀时尽量不要产生气泡) , 如此稀释至第八横排孔。 (如表1, 注意:每次移液都必须换用新的枪头, 否则就会将枪头外面的病毒带入到下一孔, 导致过高估计滴度的终点) , 吸10μL病毒混合液加入到相对应的48孔板中。经48 h感染, 借用荧光显微镜计数荧光细胞情况。在最高稀梯度m的孔数出N (N<10) 个带荧光的细胞, 则病毒滴度为N×10m/m L (m为稀释梯度) , 若N>10, 则需继续稀释。滴度用TU/m L (感染单位/m L) 标示。换算公式为:TU/m L-[F×C/v]x D。F:GFP表达阳性细胞率 (%) , C:每孔中细胞总数, V:接种体积, D:稀释倍数。细胞感染中, 对6孔板细胞融合度达80%的Hep-2细胞加入不含双抗的完全培养基1.5 m L和病毒上清液0.5 m L, 摇匀后置入37℃、5%二氧化碳培养箱培养24 h后更换培养基, 48 h后观察慢病毒上报告基因绿色荧光蛋白的表达情况。
1.2.4 RT-PCR
按照LipofectamineTMRNAi MAX转染试剂盒说明书的要求转染, 转染后提取Total RNA1, 以 (Oligo) d T为引物逆转录合成c RNA第一链后, 取5μL c RNA为模板, 加入上下游引物各0.5μL, 2×SYBR Green q PCR Super Mix 10μL, d H2O 4.0μL加至共20μL后在实时荧光定量PCR仪上扩增, 产物行数据分析, 试验设定浓度梯度。反应条件:50℃2 min, 95℃2 min, 95℃15 s, 60℃32 s读板, 40cycles。引物序列:CD47-F:5'-CT TTGAAGAGATGAGCAGTG-3', CD47-R:5'-CGATG TGGGATCTAATTCTC-3', β-actin为内参照;β-actin-F:5'-TGGATCAGCAAGCAGGAGTA-3', β-actin-R:5'-TCGGCCACATTGTGAACTTT-3', 扩增片段大小:β-actin为275 bp, 目的片段:CD47为265 bp。
1.2.5 Western blotting
据细胞量加入相应RIPA裂解液, 常规提取细胞蛋白进行蛋白初步定量;取样品50μg, 与上样缓冲液按2∶1混合, 沸水浴5 min, 经SDS-PAGE电泳 (80 V恒压50 min, 120 V恒压出现溴酚蓝刚出胶底部止) 、转膜至PVDF膜, 5%的脱脂奶粉TBST溶液封闭1h, 一抗 (Rabbit Anti-Mouse CD47稀释倍数:1∶4 000) 4℃过夜、二抗 (peroxidase-Rabbit Anti-Rat Ig G稀释倍数:1:2000) 37℃孵育1 h, TBST液洗涤5 min×3次, 湿润的杂交膜表面上均匀加入IMMOBILON WESTERN CHEMILUM HRP SUBSTRATE, 反应5 min, 滤纸吸净多余底物溶液后暗盒曝光、显影、定影。
2 结果
2.1 阳性克隆行PCR鉴定、测序结果 (红色标记为所测目的片段序列)
CD47SRNA-1-U6 (载体上游引物所测) , 见图1。测序结果进行Blast比对, 见图2:CD47sh RNA:NCBI/BLAST/blastn suite-2sequences/Formatting Results-GEZA5X7H113。
测序结果BLAST分析:基因CD47SRNA已成功克隆入至真核表达载体p LVX-sh RNA中, 原始序列与已知序列进行BLAST完全一致。阳性克隆的PCR产物经双酶切后没有插入片段的p GCSIL-GFP空载体PCR产物为对照, 见图3, 鉴定结果与预期相符。
1:阴性对照dd H2O 2:NC·LV;3:Marker;4~6:CD47sh RNA-LV
2.2 慢病毒载体的滴度测定、细胞病毒感染
将慢病毒包装系统中质粒共转染293T细胞, 在倒置显微镜下观察各孔中绿色荧光蛋白的表达情况, 荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少, 病毒滴度为表达绿色荧光蛋白的细胞数除以病毒原液量, 用本文所述方法测得慢病毒sh RNA-CD47滴度为:3×106TU/m L。病毒感染Hep-2细胞48 h后观察荧光, 病毒感染效率均在80%以上。如图4。
A:感染后48 h绿色荧光图×40;B:感染后48 h白光图×40
2.3 RT-PCR
感染样品经琼脂糖凝胶电泳, 5 s r RNA、18 s r RNA、28 s r RNA 3条带, 完整性检测Total RNA抽提完整, 纯度检测无蛋白污染。空白对照组, 阴性对照组、转染组25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L的浓度梯度m RNA表达。如图5。结果表明:CD47-si RNA慢病毒转染对Hep-2细胞m RNA表达有抑制作用。RT-PCR结果显示, 喉癌Hep-2细胞中相对于NC组、空白组, 感染组对CD47基因有明显的knock down效应, 同时优选SASI_Hs O1_25nm为最佳效应组。见图6。
1:HEP2-00-25;2:HEP2-00-50;3:HEP2-00-100;4:HEP2-01-25;5:HEP2-01-50;6:HEP2-01-100;7:HEP2-24-25;8:HEP2-24-50;9:HEP2-24-100;10:HEP2-NC-25;11:HEP2-NC-50;12:HEP2-NC-100
A:00-25;B:00-50;C:00-100;D:01-25;E:01-50;F:01-100;G:24-25;H:24-50;I:24-100;J:NC-25;K:NC-50;L:NC-100
2.4 Western blotting
Hep-2细胞转染CD47sh RNA慢病毒48 h后, 分别将未处理组、NC组 (非特异性sh RNA序列的阴性对照) 、优选sh RNA-CD47组提取细胞蛋白并检测细胞CD47蛋白表达水平, 结果显示与对照组相比较, CD47sh RNA慢病毒对目的基因CD47在喉癌细胞Hep-2中有显著的knockdown效应 (图7) ;分析不同浓度sh RNA慢病毒试验组, CD47蛋白表达抑制率与对照组比较差异均有显著性 (均P<0.05) 。
3 讨论
CD47是细胞表面重要的标记物, 功能可能与整合素相关, 其与互为受体配体的抑制性受体信号调节蛋白α可形成CD47-SIRPα信号复合体, 共同作用着效应细胞的功能和其所分泌的细胞因子, 在诱导T细胞免疫耐受、活化、细胞凋亡、巨噬细胞吞噬和肿瘤免疫治疗等方面发挥着多种调节作用。此靶点国内研究较少, 国外现已取得了一定研究成果, 尤其近年来, 斯坦福大学的研究者通过单克隆抗体封闭CD47, 结果导致肿瘤细胞凋亡被清除, 为探究基因靶向治疗恶性瘤奠定了基础, 展示了CD47在疾病治疗方面的前景[6,7,8]。但单克隆抗体具有HAMA免疫效应、无法根源性治疗及不能很好的对具体发病机制展开研究[9];且现临床很多疾病尤其是肿瘤性疾病具体发病机制多数未明确, 为解决这一难题, 基于RNA干扰 (RNAi) 的基因沉默或敲除技术成为领域内的研究热点[10]。RNAi的发现开创了真核生物遗传学新纪元, 它利用了由小干扰RNA引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默现象, 其本质si RNA与对应的m RNA特异结合、降解, 从而阻止m RNA的翻译使同源基因的表达沉默, 通过敲除沉默或过表达研究基因, 再研究其下游基因蛋白表达和生物学作用变化, 为研究目的基因是否在关联疾病中起重要作用及相关机制提供新的思路, 所以, 这一技术已经迅速而广泛地应用到基因功能、表达调控机制及基因治疗研究等热门领域[11]。而同样在这个过程中作为RNAi的重要载体, 慢病毒解决了质粒介导RNAi的局限性[12], 作为一有效工具得以运用, 与其他载体相比, 慢病毒更具优势[13,14]:首先, 既可转染有丝分裂期的细胞, 又可以转染分裂缓慢及处于分裂终末期的细胞;其次, 载体稳定、持久、高效, 发生突变和畸形机率小, 可使转基因细胞保持一个持久、稳定的表达, 更适合长期诱导转移目的基因序列的需要, 且被拆分为三或四质粒系统大大提高了生物安全性;再次, 慢病毒具有能够容纳相对大的转移基因序列以及免疫反应小等优点, 因此应用范围越来越广泛。
篇3：cd级危房鉴定标准
丘北县是少数民族人口占63%的国家级扶贫开发重点县。2004年实施教育综合改革以来,丘北县教育管理体制、办学模式等方面的改革均取得显著成绩。但由于农村人口比重大,丘北县农村教育发展水平与广大人民群众的期望还有很大差距,农村教育仍然很薄弱,教育公平难以体现。主要表现在:一是小学校点分布过散,校均学生少,办学效益低。在全县627所小学,61 638人在校生中,仅有完小190所,在校生42 478人;而校点有437所,在校生19 160人,占小学在校生总数的31?郾08%。校点中一师一校点299所,占校点总数的68?郾42%。二是投入分散,校点基本教育教学设施设备难以配齐,危房多,安全隐患大。全县小学D级危房学校250所,危房面积69 114平方米,占中小学D级危房总面积的61?郾47%。三是师资力量分散,一师一校点过多,且都是两级或三级复式教学,课程开设不齐,课时不足,学生德、智、体等得不到全面发展。四是由于缺校舍和资金等原因,全县还未实现普及实验教学,农村远程教育资源也不能满足教学需求。五是随着城镇化步伐加快,进城务工农民逐渐增多,农村小学校点生源严重不足。
二、排危的基本做法
(一)强化领导,精心组织。省、州整体排除中小学D级危房会议召开后,丘北县委、县政府高度重视,抢抓“整体排危”契机,结合全县教育实际,通过深入调研,反复论证,决定将进一步深化农村教育综合改革与整体排除中小学D级危房有机结合,稳步推进全县教育事业又好又快发展。一是成立由县委书记任组长,县长任副组长,分管教育工作的副县长任常务副组长,县财政、建设、教育、发改等17个部门主要领导和各乡(镇)党委书记为成员的丘北县进一步深化农村教育综合改革工作领导小组;召开全县进一步深化农村教育综合改革暨整体排除中小学D级危房启动会,精心安排各项工作;县教育局与试点乡(镇)实行领导挂钩工作责任制,明确工作职责,成立工作组进驻改革试点乡镇(村)挂钩指导,做到各项工作有人管、有人抓。二是先后制定出台了《中共丘北县委?摇丘北县人民政府关于进一步深化农村教育综合改革的实施意见》和《丘北县整体排除中小学D级危房实施意见》等文件,从政策上、制度上为深化农村教育综合改革工作保驾护航。
(二)科学规划,统筹实施。丘北县深化农村教育综合改革本着“突出重点、优化结构、完善配套、适度超前”的思想,将校点布局调整与整体排除中小学D级危房、寄宿制学校建设、新农村卫生新校园等项目工程有机结合,统筹实施。县教育局会同有关部门和当地党委、政府,在听取各方面意见和建议的基础上,对校点布局、项目建设、投资规模等进行反复分析研究和修正,并报县政府常务会、县委常委会讨论研究审定,确保规划的科学性。
(三)多方筹措,加大投入。为保证各项工作顺利实施,丘北县在项目建设资金缺口大、教育底子薄的情况下,多出主意、多想办法、多方筹措,加大投入。一是抓住国家扩大内需机遇,积极争取国家和省的支持;进一步调整县级财政支出结构,县财政每年预算安排500万元排危专项资金(不含教育费附加),并对贫困家庭寄宿生除国家给予的补助外再给予适当补助。二是通过开展“爱心献教育”活动等方式,充分调动社会各界捐资助学的积极性,广泛吸纳社会资金。三是建设、发改、财政、税务、国土等部门认真落实关于农村中小学基础设施建设有关税费的减免规定,其他相关部门也制定相关优惠政策,对调整校点布局,集中办学给予大力支持。四是在项目建设资金未到位的情况下,积极采取邀请招标的办法,邀请有资质、实力强的建筑商承担学校项目建设工程,具体操作方法是:由发包方先拨付20%的工程启动资金,其余80%的资金由施工企业全额垫付至竣工;从竣工之日起,所欠资金由政府付给每年9%的资金占用费,所欠资金在3~5年内还清,具体事项以签订合同约定为准。五是教育综合改革领导小组成员单位及试点乡党委、政府积极投入人力、物力和财力,为学校项目建设工程的实施提供保障。树皮乡党委、政府积极整合资金25?郾2万元,征地62?郾6亩用于校园改扩建工程。腻脚乡党委、政府先后整合资金20余万元,积极完善各项配套设施建设,确保项目建设工程顺利实施。
(四)加强配合,形成合力。丘北县在排危攻坚战中,各级各部门加强配合,团结协作,形成合力。县教育局负责制定全县农村小学校点布局调整、学校建设规划及其他各项改革的实施方案,并具体指导实施;财政、国土、建设、发改、税务、人事、卫生、民政等有关部门结合自身职责,积极支持配合;各乡(镇)人民政府和农村自治组织通过“特事特办”、“一事一议”等做法,充分发挥在排危工作中的作用,积极提供建设用地等;县人民政府教育督导室加强督促指导,确保校舍排危改造工程按质、按量、按时完成。目前,树皮、腻脚两个试点乡18所项目学校已由10位老板垫资建设,工程进展顺利,建设项目有望在今年8月底前竣工投入使用;其余10个试点村10所项目学校已邀请4位老板垫资施工,工程已全面开工建设。