PCR实验室规化设计说明

PCR实验室规化设计说明（共7篇）

篇1：PCR实验室规化设计说明

P C R 检 测 实 验 室 建 设

设 计 说 明

DNA检测室是一种特殊实验室，它不仅采用了获得诺贝尔奖的实时荧光定量PCR技术，尤其是对设计建造过程中的室内空气污染控制和操作流程过程中的交叉污染控制有着及其特殊和非常严格的要求；本设计专为刑侦技术DNA检测实验区室内空气污染控制环境建设提出了整体解决方案。此方案在为华北、东北、西北地区十余个地市级公安局设计中多次得到公安部二所数名领导、专家的支持和指导，并在与各局刑侦技术主管领导、法医和我公司专业技术人员等三方共同研究讨论过程中不断达到理念清晰、布局合理、设计规范、设置完善，即符合实际使用需求，又符合公安部系统刑侦技术DNA检测实验室验收及国家实验室认可、卫生部临床检验中心验收的硬件标准；由于各地客观条件有所不同，须在此整体解决方案的基本框架和原则内因地制宜。

参照标准：《法庭科学DNA实验室检验规范》公安部GA/T 383-2002 《法庭科学DNA实验室规范》公安部GA/T 382-2002 《临床基因扩增检验实验室工作规范》卫医发[2002]8号文

《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》卫医发[2002]10号文

《临床基因扩增检验实验室设置标准》卫医发[2002]10号文附件

《基因检验实验室技术要求》国家质监检验总局SN/T 1193-2003 《洁净室及相关受控环境-生物污染控制》国际标准 ISO 14698 《洁净厂房设计规范》国家标准 GB 50073-2001 《洁净室施工及验收规范》建设部 JGJ 71-90 《室内空气质量标准》国家标准GB/T 1883-2002 《实验室 生物安全通用要求》国家标准GB 19489-2004 《生物安全实验室建筑技术规范》国家标准GB 50346-2004 《病原微生物实验室生物安全管理条例》卫生部（2004-11-12）

《低压电气施工及检收规范》国家标准GB 50254-96 《通风与空调工程施工质量验收规范》 国家标准GB50043-2002 设计参数：洁 净 度——CLASS 7（主实验室）CLASS 8.3（辅助间）

换气次数——15h-1～25h-1（7级）8h-1～10h-1（8.3级）

温 度——20℃～22℃（冬季）24℃～26℃（夏季）

湿 度——30%～50%RH（冬季）50%～70%RH（夏季）

照 度——≥250Lux（操作区）≥150Lux（辅助区）

噪 音——≤60dB（A）

压 差——≤-5 Pa（负压间）≥ +5 Pa（正压间）

格局规划：实验室高度为2.6-3米，各功能间将根据其不可逆工艺流程、实际用途、设备摆放及人性化等因素通盘布局划分；

功能区分为：

一、普通实验区——法医物证常规检验室、法医物证存储室、受案室、检材室、骨骼提取实验室、数据比对分析室、紧急淋浴洗眼间、洁具间、洗衣间、测序仪专用UPS机房；

二、特殊实验区 / 污染控制区——更鞋 / 缓冲走廊、更衣 / 缓冲间、现场物证DNA提取间（30-50㎡）、嫌犯血样DNA提取间(15-30㎡）、试剂混配间(15-30㎡）、PCR扩增间(15-30㎡）、扩增产物测序间(15-30㎡）；

三、污染控制区基本格局

方案

1、各功能间相互串通，即用套间方式进行人流/物流，此案应严禁采用，首先从房间格局上避免交叉污染；

方案

2、设置独立缓冲间为最佳（尤其是DNA提取间、PCR扩增间、试剂混配间），且人流/物流分道，流程相临间应设置物流传递窗。

方案

3、设置共用缓冲间/缓冲走廊为亦可，操作流程：

完全双通道流程：

常规物证 → 物证存放

↑ 现场物证DNA提取 → PCR扩增 → 产物测序 ↑ ↗ ↗ ↘ 受案 → 检材 原始试剂混配 数据处理

↘ ↘ ↗ 嫌犯血样DNA提取 → PCR扩增 → 产物测序

简化双通道流程：

常规物证 → 物证存放

↑ ↗ 现场物证DNA提取 ↘

受案 → 检材 → 嫌犯血样DNA提取 → PCR扩增 → 产物测序 → 数据处理

原始试剂混配 ↗

单通道流程：

常规物证 → 物证存放

受案↑→ 检材 → DNA提取 → PCR扩增 → 产物测序 → 数据处理

原始试剂混配 ↗

气流组织：

1、原始试剂混配室应为正压间，在微环境百级超净台内操作，须防止其它程序功能间对本操作间的污染；

2、DNA提取室应为微负压间，须设置排风系统，以防止核酸提取时可能产生的气溶胶对人员的侵害和对其它程序功能间的扩散污染；

3、PCR扩增室应为微负压间，须设置排风系统，以防止大量扩增产物对其它程序功能间的扩散污染；

4、检测室应为微负压间，须设置排风系统，以防止扩增产物在电泳测序过程中的扩散污染；同时因3130分析仪散热量较大，会提高室内温度3-5℃；

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5、试剂混配室、DNA提取室、PCR扩增室、检测室如设置缓冲间，功能间内可均为正压，而在缓冲间内设置负压，气流从其双道门的门缝处分别向缓冲间内流动，用合理的气流组织方式避免各功能间的交叉污染；

6、高效送风口为顶送风，侧下回/排风（竖井、夹道、缓冲间）方式。

通风空调：特殊实验区各主要功能间采用非单向流、三级过滤、各自独立送/回风、集中（或独立）新/排风的净化系统，室内空调全部选用悬挂风管式商用空调，通过新风/送风/回风管道、风阀等连接悬挂式袋式中效净化加压风机箱，避免集中回风后再循环可能造成的空气交叉污染，同时亦可避免如采用全新风全排风方式而造成的室内热量/冷量大量流失、难以控制和洁净度无法保证的技术问题，从而提高制热/制冷效果，降低运行能耗；主要功能间内或其配套的缓冲间均加装排风装置，以防止室内污染空气外漏它屋而造成的交叉污染，达到置换室内空气。

电气照明：室内照明灯具采用了国内优质的防尘净化灯，为双管40瓦，在应急照明方面，采用了优质的应急净化灯，当遭遇临时停电或紧急事故断电时，部分净化灯管可迅速转入蓄电池供电，以保证每间自动开启一盏应急照明灯管，方便人员在15分钟内撤离，而平时，此应急净化灯与其它净化灯同样使用，无任何区别，省去了购买安装应急灯组的麻烦，使整个试验区内浑然一体、专业实用；功能间及缓冲间设UV灯。

室内电路上，均应采用达到国家标准的电气线缆，采用并联方式，主线使用班4～6MM2 线缆，插座及照明使用2.5 MM2 线缆，所有线路均为暗装，并使用PVC阻燃线管，接头在技术夹层中采用线盒安装，杜绝施工及维修中的安全隐患。配电柜及空气开关均使用国内著名厂家的元器件，寿命长、安全可靠，风机动力配电箱与空调、照明、插座等总配电箱将分别设置，各间净化风机箱与空调可依据使用需求即可集中操控，亦可单独使用。装修材料：特殊实验区搭建室内环境污染控制二级屏障——密闭间，其围护、吊顶全部采用厚度为50mm的EPS夹芯净化彩钢复合板（双面钢板厚度0.5mmEPS容重16Kg/m3），平整、无漏缝、易清洁、不发尘；

所有墙与顶、地、窗对接角均采用内圆弧（阴角）或外圆弧（阳角）和工艺，室内无死角、不集尘、易清洁；50槽、门框料、窗框料、圆弧角等结构件均选用净化专用铝型材料；

实验区域内地面全部选用纯进口国际知名品牌的优质复合型/通体型PVC地面，多层工艺处理，PVC无缝焊接，防渗漏、防腐蚀、易清洁、美观大方；

室内围护屏障所设固定采光窗/观察窗均采用净化专用铝型材、浮法玻璃制作，不可开启；室内门可通过尺寸为宽850mm、高1900 mm，负压较大的室门向外侧开启，正压室门向内侧开启，走廊或主通道门向外侧开启，门上均设置有长方形观察窗；

作为二级屏障以降低外环境空气或沙尘污染对室内的影响。

配套设备：本实验室内根据需要将可配备具有国家注册商标的“世安” 牌微环境百级生物型超净工作台、拥有国家专利的“世安” 牌补风型排毒通风柜、国内独家生产的“世安” 牌内排式净化捕尘柜、ⅡA型生物安全柜等作为微环境污染控制的一级屏障；超净工作台、净化捕尘柜、生物安全柜均选用世界著名品牌德国EBM风机，噪音低、体积小、风量均匀，及自主研发的程序控制器，选用0.3μm效率≥99.97％的高效过滤器；并与冰箱等其他落地设备、试剂柜/仪器台/操作台/电脑桌等现代实验室家具、PCR仪/测序仪/离心机/工作站/计算机等各种台式仪器及功能间格局等统一设计规划；尤其是美国ABI公司提供的测序仪和PCR仪对室内空气及温湿度的环境控制具有一定的要求；

各实验室间配备不锈钢传递窗作为物流专用单向通道，其具备双门机械联动互锁，双控紫外灭菌灯开关，传送便捷，人 / 物分流，从最大程度上降低交叉污染。

各功能间仪器、设备基本配置(参考)：

一、物证接案室

1、收案实验台

2、万向排气罩

3、立式更衣柜

4、卧式更鞋柜

5、液晶屏台式电脑

6、打印机

7、脚踏式不锈钢垃圾桶

二、检材准备室

1、钢结构实芯理化板台面实验台

2、柜式PP水槽洗涤台

3、双门试剂柜

4、常温冰柜

5、-40℃超低温冰箱

6、电热恒温冰箱

7、压力蒸汽灭菌锅

8、照像仪

9、通风柜（腐败物等）

10、液晶屏台式电脑

11、脚踏式不锈钢垃圾桶

三、核酸提取室（现场物证）

1、钢结构实芯理化板台面实验台

2、柜式PP水槽洗涤台

3、紧急洗眼器

4、手消毒/烘干器

5、ⅡA型生物安全柜/补风型通风柜/内排式净化捕尘柜（骨格粉碎提取等）

6、电冰箱

7、电热恒温水浴锅

8、纯水器

9、加样枪

10、定时恒温磁力搅拌器

11、电子分析天平仪

12、加湿器

13、液晶屏台式电脑

14、DNA扩增仪

15、冷冻离心机

16、高速离心机

17、振荡器

18、脚踏式不锈钢垃圾桶

四、核酸提取室（嫌犯血样）

1、钢结构实芯理化板台面实验台

2、柜式PP水槽洗涤台

3、电冰箱

4、加样枪

5、液晶屏台式电脑

6、ⅡA型生物安全柜/补风型通风柜/无管道净化通风柜

7、冷冻离心机

8、高速离心机

9、定时恒温磁力搅拌器

10、电子分析天平仪

11、电热恒温水浴锅

12、振荡器

13、脚踏式不锈钢垃圾桶

五、试剂混配室

1、钢结构实芯理化板台面实验台

2、柜式PP水槽洗涤台

3、电冰箱

4、加样枪

5、液晶屏台式电脑

6、生物型单面垂直送风百级洁净工作台

7、小离心机

8、不锈钢试剂配送车

9、脚踏式不锈钢垃圾桶

六、PCR扩增室

1、钢结构实芯理化板台面实验台

2、柜式PP水槽洗涤台

3、电冰箱

4、加样枪 5、9700扩增仪

6、液晶屏台式电脑

7、脚踏式不锈钢垃圾桶

七、产物测序室

1、钢结构实芯理化板台面实验台

2、柜式PP水槽洗涤台

3、电冰箱

4、加样枪 5、3130分析仪

及其专用UPS不间断电源（距检测室较近处设可散热UPS机房）

6、液晶屏台式电脑

7、小离心机 8、96孔平板离心机

9、脚踏式不锈钢垃圾桶

八、数据分析室

1、钢结构实芯理化板台面实验台

2、液晶屏台式电脑

3、打印机

4、脚踏式不锈钢垃圾桶

篇2：PCR实验室规化设计说明

PCR实验室分为四个区域，进入各工作区域必须严格按照单一方向进行，不同的工作区域使用不同的工作服（例如不同的颜色）。工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出，四区域分别为： 1.试剂配制区n 2.样品处理区n 3.核酸扩增区n 4.产物分析区n 如使用全自动分析仪，区域可适当合并,三四区可合并为扩增产物分析。

各区的功能是： 1.1.1 试剂准备区：扩增试剂的配制、分装和保存。1.1.2 样品处理区：样品登记、分装；核酸提取、保存和加样。1.1.3 扩增产物分析区：扩增产物的测定、结果分析、登记及报告。1.2 扩增前区与扩增后区应严格分开，须使用不同的房间，两区之间最好有一定的间隔。1.3 使用商品化试剂盒可在样品处理区进行少量试剂配制。1.4 在满足下列操作和清洁处理要求的前提下样品处理区和试剂准备区可设在同一房间内： 1.4.1 在生物安全柜内操作。1.4.2 每个实验人员、实验组分别使用各自的试剂及耗材。1.4.3 盛放污染材料的器皿密封并一次性使用。1.4.4 用有效的方法对操作区域和共享器具在实验前后进行清洁及消毒。设计要求：

PCR实验室可以是分散形式，也可以是组合形式,现要主要是以组合形式为主流。完成一组PCR实验，通常应经过试剂配制、样品处理、核酸扩增及产物分析四个实验过程，若实验工艺需要，还应增加样品粉碎过程。

一、分散形式PCR实验室 所谓分散形式PCR实验室，是指完成上述实验过程的实验用房彼此相距较远，呈分散布置形式。对于这种布置形式的PCR实验室，由于各个实验之间不易相互干扰，因此无需特殊条件要求。

二、组合形式PCR实验室 所谓组合形式PCR实验室, 是指完成PCR四个实验过程的实验用房相邻布置，组成独立实验区域的形式。对于组合形式PCR实验室，由于各个实验间集中布置，容易造成相互干扰，因此，对总体布局以及屏障系统具有一定的要求。各室在入口处设缓冲间，以减少室内外空气交换。

试剂配制室及样品处理室宜呈微正压，以防外界含核酸气溶胶的空气进入，造成污染,可以通过控制进风风量大于排风风量达到正压效果。

核酸扩增室及产物分析室应呈微负压，以防含核酸的气溶胶扩散出去污染试剂与样品，可以通过控制排风风量大于进风风量达到负压效果。

在理想情况下，PCR实验室缓冲间内，可设置正压，使室内空气不流向室外，室外空气不流向室内。

PCR实验室进风由原有中央空调控制，要求将中央空调风口安装到指定定点，且高度为地面铺装好后2600mm处。

如果使用荧光PCR仪，扩增室和产物分析室可以合并。

若房间进深允许，可设PCR内部专用走廊。需要指出的是在减少室内外空气交换方面，缓冲间比专用走廊更有意义。各个区域之间应具备单向的实验工艺流、物流、人流与气流，形成单向流程的保护屏障，避免实验之间的相互干扰，防止核酸气溶胶对实验过程造成污染产生假性结果。实验室的墙体，包括顶棚，应结构牢固、气密性好；所有阴角宜采用圆弧形线条过渡；墙体内壁光洁、不吸附、耐腐蚀、易清洗消毒；地面材料应满足无缝隙、无渗漏、光洁、耐腐蚀的要求。

如果使用荧光PCR仪，扩增室和产物分析室可以合并。

若房间进深允许，可设PCR内部专用走廊。需要指出的是在减少室内外空气交换方面，缓冲间比专用走廊更有意义。各个区域之间应具备单向的实验工艺流、物流、人流与气流，形成单向流程的保护屏障，避免实验之间的相互干扰，防止核酸气溶胶对实验过程造成污染产生假性结果。实验室的墙体，包括顶棚，应结构牢固、气密性好；所有阴角宜采用圆弧形线条过渡；墙体内壁光洁、不吸附、耐腐蚀、易清洗消毒；地面材料应满足无缝隙、无渗漏、光洁、耐腐蚀的要求。主要设备试剂准备区 仪器设备主要有冰箱、超净台、加样器、混匀器、天平和离心机等，加样器、天平除了要专用外，还应有定期校准。试剂分装应在超净台中进行 扩增反应混合液应使用分子生物学级的，试剂制备好后应有质检：一是否有污染、二是检测试剂的扩增效果。标本制备区 仪器设备主要有生物安全柜、加样器、离心机、温育仪、混匀器等

扩增区 扩增区的主要仪器是核酸扩增仪、超净台、微量加样器、离心机、可移动紫外灯。扩增仪需进行校准。并配备UPS电源，以防止由于电压的波动，停电对扩增效果的影响。分析区 本区所使用的仪器设备有酶标仪、洗板机、加样器和水浴箱等

洁净实验区的缓冲间部分面积不能超过主实验室的八分之一,这是有规定的.1、主体结构： 主体为彩钢板、铝合金型材。室内所有阴角、阳角均采用铝合金50内圆角铝，从而解决容易污染、积尘、不易清扫等问题。结构牢固，线条简明，美观大方，密封性好。

2、标准的四区分隔和气压调节： 将PCR过程分成试剂准备、标本制备和PCR扩增，产物分析四个独立的实验区。整个区域有一个整体缓冲走廊。每个独立实验区设置有缓冲区，同时各区通过气压调节，使整个PCR实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染并降低扩增产物对人员和环境的污染。可打开缓冲区Ⅰ，缓冲区Ⅱ和 PCR 扩增区的排风扇往外排气，在实验区的外墙上和各扇门上都安装有风量可调的回风口，空气通过回风口向室内换气。

3、消毒： 在三个实验区和三个缓冲区顶部以及传送窗内部安装有紫外灯，供消毒用。在试剂准备区和标本制备区 还设置移动紫外线灯，对实验桌进行局部消毒。

4、不锈钢传递窗： 试剂和标本通过机械连锁不锈钢（不建议使用电子连锁方式）传递窗传递，保证试剂和标本在传递过程中不受污染（人物分流）。

5、地面 地面建议使用PVC卷材地面或自流坪地面，整体性好。便于进行清扫，耐腐蚀。

6、照明 灯具要选用净化灯具，能达到便于清洗、不积尘的特点。在建设的过程中应注意： ●规范的安装流程和全面的服务流程。●严格按照规范科学设计的安装流程。●安装前需要确定以下安装条件，如：电源电压，电源进线位置，电话网络线进线位置，进水水压，最小安装空间，地面平整度，通风孔、进水管和下水管的位置等，理想状态的空间尺寸 样本处理区

三、工作区域及设备要求

（一）试剂储存和准备区 1、2-8C和-15C冰箱

2、混匀器

3、微量加样器（覆盖1-1000ul）

4、移动紫外灯（近工作台面）

5、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）

6、专用工作服和工作鞋

7、专用办公用品

（二）标本制备区 1、2-8C冰箱、-20C或-80C冰箱

2、高速台式冷冻离心机

3、混允器

4、水浴箱或加热模块

5、微量加样器（覆盖1-1000ul）

6、可移动紫外灯（近工作台面）

7、生物安全柜

8、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）

9、专用工作服和工作鞋

10、专用办公用品 如需处理大分子DNA，应具有超声波水浴仪。

（三）扩增反应混合物配制和扩增区

1、核酸扩增仪

2、微量加样器（覆盖1-1000ul）

3、可移动紫外灯（近工作台面）

4、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）

5、专用工作服和工作鞋

6、专用办公用品(四)扩增产物分析区 视检验方法不同而定。基本仪器设备如下：

1、微量加样器（覆盖1-1000ul）

2、可移动紫外灯（近工作台面）

3、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、加样器吸头（带滤心）

4、专用工作服和工作鞋

5、专用办公用品 5.人员和样品的安全是由生物安全柜和定向气流共同来保证。PCR实验室设计规程中规定人员和样品必须单向流动。即从 “试剂准备区到样品制备区，再从样品制备走向扩增区和产物分析区”，绝对不能反向流动，以辟免交叉污染。气流方向只规定试剂准备区为微正压或常压，样品制备区为常压或负压，扩增区和产物分析区为负压，压力梯度是从试剂准备到产物分析区，是高到低的。规程并没有规定要做成全新风系统，但是为降低交叉污染的风险，建议做成全新风系统。概述 临床基因扩增实验又称PCR实验，是专门用来检验艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一种检测手段。它可以通过将病毒体内所含的基因进行扩增的方法，测出一些病毒含量不高的感染者体内是否含有特定的病毒。由于该检测方法可以测出普通检验难以检测出的病毒并具有灵敏度高、特异性高、快捷、对样品要求低等优点，因此被临床医生广为认可，已广泛应用于医院的临床诊断和各防疫检测部门的禽疫病诊断。但是，这种实验需要有能保证绝对安全、配置合理的实验室和非常规范的操作为前提。近年来对临床基因扩增检验实验室的建设越来越得到重视，因为它对检测结果的可靠性、准确性和安全性起到至关重要的作用。本文主要从临床基因扩增检验实验室的平面布局，空调通风系统设计、气流控制和污染的防制几个方面对 实验室设计中的主要特点进行了阐述。临床基因扩增检验实验室设计的核心问题是如何避免污染。因此，实验室的平面布局、空调通风系统设计、气流控制等都是围绕这个核心问题进行的。下面就对这几个方面分别进说明。2 PCR实验室平面布局 临床基因扩增检验实验室原则上分为四个单独的工作区域：试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区、扩增产物分析区。为避免交叉污染，进入各个工作区域必须严格遵循单一方向进行，即只能从试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增反应混合物配制和扩增区→扩增产物分析区。各实验区之间的试剂及样品传递应通过传递窗进行。PCR实验室平面布置示意图如图1所示。图1 PCR实验室平面布置示意图 3 实验室空调通风系统设计及压力控制 PCR实验室并没有严格的净化要求，但是为避免各个实验区域间交叉污染的可能性，宜采用全送全排的气流组织形式。同时，要严格控制送、排风的比例以保证各实验区的压力要求。3.1 试剂贮存和准备区 该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。试剂和用于标本制作的材料应直接运送至该区，不得经过其他区域。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。对与气流压力的控制，本区并没有严格的要求。3.2 标本制备区 该区域主要进行的操作为临床标本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为正压，以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。另外，由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染，所以应避免在本区内不必要的走动。3.3 扩增反应混合物配制和扩增区 该区域主要进行的操作为DNA或cDNA扩增。此外，已制备的DNA模板和合成的cDNA(来自样本制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。在巢式PCR测定中，通常在第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式扩增有较高的污染危险性，第二次加样必须在本区内进行。本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为负压，以避免气溶胶从本区漏出。为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的不必要的走动。个别操作如加样等应在超净台内进行。3.4 扩增产物分析区 该区域主要进行的操作为扩增片段的测定。如使用全自动封闭分析仪器检测，此区域可不设。本区是最主要的扩增产物污染来源，因此对本区的压力梯度的要求为：相对于邻近区域为负压，以避免扩增产物从本区扩散至其它区域。4 污染的预防与控制 PCR实验室设计的核心问题是如何避免污染。在实际工作中，常见的有以下几种污染类型：扩增产物的污染；天然基因组DNA的污染；试剂的污染以及标本间的污染。由于一旦发生污染，实验就必须停止，直到找到污染源为止，而且实验结果必须作废，需重新进行实验。所以发生污染后再围绕实验室来寻找污染源不但耗时而且繁琐，浪费人力物力。因此要避免污染，首先应是预防，而不是排除。4.1 工作区域的严格划分（1）各个实验区域设置合理；（2）各个实验区域要有明显的标记（如醒目的门牌或不同的地面颜色等），以避免各个不同实验区域设备物品、试剂等发生混淆。4.2 合理的系统设置（1）合理的空调通风系统设置，尽量采用全送全排的空调系统；（2）严格的气流压力控制，保证不同的实验区内不同的压力要求。4.3 规范的操作（1）临床基因扩增检验实验室的技术人员必须进行上岗培训，经培训合格后才能从事临床基因扩增检验的工作；（2）在实验操作过程中，操作者必须戴手套，并经常更换。此外，操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施；（3）清洁工作及时、正确。实验工作结束后，必须立即对本区进行清洁。除常规的消毒液体对表面进行擦拭消毒或紫外线灯的照射消毒外，对一些实验设备还应进行高压消毒处理。4.4 严格的管理（1）严格控制进出实验室的人员。与实验无关的人员不得随意进出实验室，有条件的情况下要设置独立的通道和进出整个实验区的门；（2）在各个实验区域使用带有明显区别标志的工作服（如不同颜色），当工作人员离开时不得将本区的工作服带至其它区域；（3）尽量减少在实验区内不必要的走动以减少交叉污染的可能性。（4）扩增产物分析区是最主要的扩增产物污染来源，废液不能在实验室中倾倒，必须经消毒液浸泡消毒后在远离实验室的地方弃掉，用过的吸头等一次性材料也应经消毒液浸泡消毒后统一处理，如焚烧等；（5）扩增产物分析区可能会用到某些可致基因突变和有毒物质，应特别注意实验人员的安全防护。4.5 完备的实验室配套设施 完备的实验室配套设施是保证实验工作的必要条件，应根据各个实验室实验内容的不同配备相应的设备和仪器，如超净工作台、离心机、加样器等。

PCR实验室并没有严格的净化要求，但是为避免各个实验区域间交叉污染的可能性，宜采用全送全排的气流组织形式。同时，要严格控制送、排风的比例以保证各实验区的压力要求。3.1 试剂贮存和准备区 该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。试剂和用于标本制作的材料应直接运送至该区，不得经过其他区域。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。对与气流压力的控制，本区并没有严格的要求。3.2 标本制备区 该区域主要进行的操作为临床标本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为正压，以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。另外，由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染，所以应避免在本区内不必要的走动。3.3 扩增反应混合物配制和扩增区 该区域主要进行的操作为DNA或cDNA扩增。此外，已制备的DNA模板和合成的cDNA(来自样本制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。在巢式PCR测定中，通常在第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式扩增有较高的污染危险性，第二次加样必须在本区内进行。本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为负压，以避免气溶胶从本区漏出。为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的不必要的走动。个别操作如加样等应在超净台内进行。3.4 扩增产物分析区 该区域主要进行的操作为扩增片段的测定。如使用全自动封闭分析仪器检测，此区域可不设。本区是最主要的扩增产物污染来源，因此对本区的压力梯度的要求为：相对于邻近区域为负压，以避免扩增产物从本区扩散至其它区域。4.0传递窗口的尺寸：

篇3：谈PCR实验室的设计与施工

目前, 国内二级以上的医院都广泛开展了临床基因扩增检验项目, 使PCR (Polymerase Chain Reaction) 实验室即基因扩增实验室的设计与建造也越来越受到重视。

要完成一组PCR实验, 通常需要经过试剂配制、样品处理、核酸扩增和产物分析4个实验过程。这4个实验过程的实验用房应相邻布置, 组成一个独立的PCR实验区。标准的PCR实验区包括:试剂准备区、标本制备区、扩增区、产物分析区、各区配套的缓冲区及公共走廊。

二、平面布局

某医院PCR实验室平面布局如图1所示, 整个区域有一个公用走廊, 每个独立实验区设有专门的缓冲区。通过压差控制, 使整个PCR实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染, 并且降低扩增产物对人员和环境的污染。

1.某医院PCR实验室平面布局图

三、压力梯度控制

试剂准备区和标本制备区呈相对正压状态, 以防止外界含核酸气溶胶的空气进入, 造成污染。

核酸扩增室及产物分析区应呈相对负压状态, 以防止含核酸的气溶胶扩散出去污染试剂与样品。建议采用5~10Pa压差, 在控制上比较容易实现。

四、正负压区域缓冲室的设置

根据压力梯度的要求, 试剂配制室和样品处理室为相对正压, 扩增室和产物分析室为相对负压, 要求正压的区域和要求负压的区域的缓冲室内的压力设计大不相同。

正压缓冲室符合一般正压洁净室的缓冲原则, 主要是防止室外环境空气中的气溶胶进入室内。正压缓冲室的布置如图2所示。

负压缓冲室则是要求缓冲室对核酸扩增室及产物分析区保持正压, 对缓冲室外也保持正压 (主要是满足室内净化需要, 如室内无洁净要求, 此处可以为0压) 。负压缓冲室的布置如图3所示。

五、PCR实验室内主要设备及房间面积要求

在PCR实验室内有大量的实验仪器, 其中一些仪器和实验室建造有很大关系。

(一) 试剂准备区

试剂准备区配备有2~8℃冰箱和-80℃冰箱, 计算冷负荷时, 需要将它们计算在内。房间的面积宜控制在15m2~20m2。

(二) 标本制备区

标本制备区配备有2~8℃冰箱和-20℃冰箱, 计算冷负荷时, 需要将它们计算在内。在标本制备区, 还需要配备生物安全柜, 用于进行提取核酸的操作。为避免提取的核酸在柜内反复循环, 造成标本之间的交叉污染, 出现假阳性结果, 该区域配备的生物安全柜必须是B2型的。生物安全柜工作区垂直气流全部来自实验室, 排风经过高效过滤器过滤后直接排至室外, 不允许回到安全柜和实验室中。

根据我们的经验, 如果实验室内配备生物安全柜, 每配备一台, 实验室的面积增加10m2;标本制备区的面积宜在25m2~30m2之间。

(三) 扩增室

扩增室主要配备PCR实验室的核心仪器PCR仪, 本文实例中使用了ABI7500和ABI9700两种PCR仪。在实验室建造过程中, 需要给PCR仪配备专门的UPS电源, 以保证其正常工作。该区面积控制在15m2~20m2。

(四) 产物分析区

在室内配备通风橱, 保证房间内的相对负压, 空气从室外流向室内。该区面积控制在15㎡~20㎡。

六、PCR实验室对空调系统的要求

首先, 要求4个区域的空调系统完全独立, 前两个区域相对正压, 后两个区域相对负压。标本制备区配备有B2型生物安全柜, 需要在安全柜进行操作时, 要有相应数量的新风补充。产物分析区配有排风橱, 也需要有一定数量的新风补充。

其次, 实验室内的温度、湿度都有一定的要求。尤其是湿度, PCR实验室内一般要求相对湿度在65%以下。南方地区空气湿度大, 而标本制备区和产物分析区需要大量的新风补充, 这些新风如果处理不好, 会造成实验室内湿度过高。

第三, 很多PCR实验室都要求室内达到ISO7级洁净标准。

综上所述, 我们可以总结出PCR实验室在空调系统方面的主要要求:四区必须完全独立、大量的新风补充、不同区域的不同压力梯度、较严格的湿度控制要求、较高的洁净度要求。对于这些要求, 简单的、经济的空调系统方案很难满足。

2.正压缓冲室的布置图

3.负压缓冲室的布置图

七、常用的PCR实验室空调系统方案

(一) 壁挂式或吊顶嵌入式空调 (独立制冷机) +新风过滤系统+排风系统

这是目前一些中小医院的PCR实验室经常使用的空调方式, 在每个区域内安装独立的壁挂式空调, 新风系统集中过滤处理 (初效+中效+高中效) , 然后根据需求将新风送入每一个区域内, 配套的排风系统和新风系统联锁控制。如图4所示。

这样的空调系统控制简单、成本低廉, 4个区域的空调系统独立, 房间内的压差也可控。缺点是室内达不到净化要求, 房间内的湿度不可控。我们曾接触过一个项目, 夏季开启生物安全柜后, 整个房间内充满雾气, 房间内的湿度非常高, 致使实验室内的很多仪器出现锈蚀, 仪器的寿命和精度都有所降低, 造成很大的损失。

(二) 自带冷热源 (直膨式) 全新风空调机组+排风系统

该方案主要用于有洁净度要求的PCR实验室, 由自带冷热源 (直膨式) 全新风空调机组进行空气处理, 然后将新风送入4个不同区域, 4个区域采用独立的排风系统来控制房间内的压力平衡。如图5所示。

4.壁挂式或吊顶嵌入式空调 (独立制冷机) +新风过滤系统+排风系统图

5.自带冷热源 (直膨式) 全新风空调机组+排风系统图

6.独立热泵机组+全新风空调机组+排风系统图

该方案的优点是控制简单, 能够满足净化、压力梯度、四区隔离的基本要求, 房间内的温度也可控。

方案的不足之处主要在于房间的湿度控制。主流的空调设备厂家一般都不生产直膨式全新风恒温恒湿机组, 主要原因是机组的控制繁琐、故障率高, 尤其在夏季, 室外高温高湿, 新风通过机组后要达到温度湿度要求, 对直膨式机组来说有很大的难度。因此, 只能通过一些小厂家来进行定制, 设备质量无法得到保障。

(三) 独立热泵机组+全新风空调机组+排风系统

该方案使用独立的风冷热泵机组, 冬季提供热源, 其他季节提供冷源。空气处理则采用组合式新风处理机组, 通过表冷段和再热段来控制新风湿度, 保证房间内的温度、湿度都达到要求。如图6所示。

该方案的优点在于可以满足PCR实验室对空调系统的全部要求 (温度、湿度、压差、洁净度等) 。

方案的缺点是系统控制相对前两个方案更复杂, 初期投资较大, 设备占用空间也比较大。

八、结束语

我们发现, 实验室4区隔离、达到一定洁净度都不难实现, 高湿季节房间内的湿度控制是个大问题, 在这方面需要花费较多的资源。

PCR实验室建设的决策者一般都是科研人员, 他们对洁净度、正负压比较了解, 但对于房间内的新风处理、湿度控制的重要性估计不足。施工单位出于成本考虑, 常常忽略这些问题。

对于PCR实验室的建设, 只有从方案初期、设计的源头开始对上述要点进行控制, 才有可能做出优质的、全面满足医疗实验要求的项目。

参考文献

[1]中华人民共和国住房和城乡建设部, 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB50591-2010, 洁净室施工及验收规范[S].北京:光明日报出版社, 2010.

篇4：细胞呼吸相关实验设计说明

关键词：细胞呼吸测定装置相关实验设计

中图分类号：G633．91文献标识码：B

细胞的呼吸作用作为新陈代谢的主要内容，平时教学的重点内容。它不但可与细胞的光合作用、能量代谢、生态系统等知识建立学科联系，而且又可以与物理化学等学科间知识找到诸多关联点，是理化生小综合或各学科大综合的较理想的设题切入点。而呼吸作用的相关试验设计在平时教学中容易混淆，下面进行简要分析。

1测定装置设置

测定细胞呼吸作用或呼吸类型常采用U型管，液面升降或玻璃管液滴移动观察法，即在广口瓶或锥形瓶内放入被测生物(活种子或植物或动物)通过生物呼吸过程中释放CO₂或吸入O₂的气压变化而推测或计算生物的呼吸状况，如图1装置所示。

由于生物呼吸既产生CO₂，又消耗O₂，前者可引起装置内气压升高，而后者则引起装置内气压下降，为便于测定呼吸情况，应只测其中一种气体变化情况，为此，测定过程中，往往采取用NaOH或KOH吸收掉呼吸所产生的CO₂，这样整个装置中的气压变化，只能因吸收O₂所引起，从而清除CO₂升高对气压的干扰。

2对照实验设计

2．1物理误差校正

由于装置的气压变化，也可能会因温度等物理因素所引起，为使测定结果更趋准确，应设置对照实验，以校正物理膨胀等因素对实验结果造成的误差，此时对照实验与呼吸装置相比，应将所测生物灭活。如将种子煮熟而其他各项处理与实验组完全一致(NaOH溶液，所用种子数量，装置瓶及玻璃管的规格等)。

2．2呼吸类型的确认

欲测定与确认某生物的呼吸类型，应设置两类呼吸装置，两类呼吸装置中单一变量为NaOH或清水，即用等量清水取代实验组的NaOH，其他各项所有项目均应一致。当然此时仍有必要设置另一组作误差校正之用。2套装置可如图2所示。

结果与分析：

(1)若装置1液滴左移，装置2液滴不动，则表明所测生物只进行有氧呼吸，(因有氧呼吸产生CO₂与耗氧量相等)

(2)装置1液滴不动，装置2液滴右移则说明：所测生物只进行无氧呼吸(因无氧呼吸吸只产生CO₂不消耗O₂)

(3)装置1液滴左移，装置2液滴右移，则表明该生物既进行有氧呼吸，又进行无氧呼吸。(因两种呼吸作用共存时呼吸放出的CO₂应高于O₂消耗量)

3注意事项

(1)校正物理误差时应将生物处死，但测呼吸类型时应均用活生物(如两组装置均用活种子)只是将单一变量改为是否用NaOH吸收掉CO₂。

(2)用植物进行呼吸类型测定时，应避免光合作用吸收CO₂与释放O₂对装置气压的干扰，因而有必要对整个装置进行遮光处理，以防光合作用。

(3)若用乳酸菌进行呼吸，既不耗O₂，也不产生CO₂。

(4)若采用含脂肪高的种子如油菜种子做测定实验，则液滴移动更明显(因其耗氧量更大)。

(5)为防止微生物呼吸对实验结果的干扰，将应装置及所测种子进行消毒处理。

[例1]给未萌发的小麦种子、广口瓶、橡皮塞、凡士林、烧杯、小试管、氢氧化钠、细玻璃管等实验材料和药品，试设计一个试验，达到验证“生活着的种子不萌发时也进行细胞呼吸”的目的。

(1)实验原理：_________。

(2)实验装置示意图如图3表示：

①A、B实验装置中，使用NaOH的目的是______

②C烧杯中放入活的干种子，D烧杯中放入_______。这样起对照作用的为________实验装置。

(3)实验结果：________。

解析：本题考查学生的实验设计能力，设计实验要设置对照实验，设置对照实验必须设置单一变量。本题要证明不萌发种子也能进行细胞呼吸，细胞呼吸过程中吸收氧气，放出二氧化碳，因此设置单一变量就是活种子与烘烤致死种子对照；还要考虑对照实验过程中，实验现象要易于观察，根据图中提供的示意图，可以看出广口瓶中放置氢氧化钠溶液，可以吸收瓶中二氧化碳，导致溶液玻璃管中的有色液滴向左移动。根据两瓶中有色液滴移动距离，可以判断未萌发的种子也能进行细胞呼吸。

答案：(1)细胞呼吸分解有机物过程中，吸收O₂放出CO₂，NaOH溶液能吸收CO₂，瓶内气压下降。

(2)①吸收二氧化碳②放烘烤致死的种子B

篇5：深圳某PCR实验室装修设计方案

深圳市创美实业有限公司是一家专业从事现代实验室整体技术咨询、规划设计、生产安装及服务一体化的股份制公司。创美公司推崇中西文化相互融合的的管理模式，引进欧美先进的生产技术及设备，结合21世纪实验室的需求，开发出一系列与全球同步的高科技实验室基础装备。标准的PCR实验室装修设计主要包括以下几个方面：

1、实验室主体结构：

实验室设计主体为彩钢板、铝合金型材。室内所有阴角、阳角均采用铝合金50内圆角铝，从而解决容易污染、积尘、不易清扫等问题。结构牢固，线条简明，美观大方密封性好。

2、标准的三区分隔和气压调节：

将PCR过程分成试剂准备、标本制备和PCR扩增检测三个独立的实验区。整个区域有一个整体缓冲走廊。每个独立实验区设置有缓冲区，同时各区通过气压调节，使整个PCR实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染并降低扩增产物对人员和环境的污染。

可打开缓冲区Ⅰ，缓冲区Ⅱ和 PCR 扩增区的排风扇往外排气，在实验区的外墙上和各扇门上都安装有风量可调的回风口，空气通过回风口向室内换气。

3、消毒：

在三个实验区和三个缓冲区顶部以及传送窗内部安装有紫外灯，供消毒用。在试剂准备区和标本制备区 还设置移动紫外线灯，对实验桌进行局部消毒。

4、机械连锁不锈钢传递窗：

试剂和标本通过机械连锁不锈钢（不建议使用电子连锁方式）传递窗传递，保证试剂和标本在传递过程中不受污染（人物分流）。

5、地面：

地面建议使用PVC卷材地面或自流坪地面，整体性好。便于进行清扫，耐腐蚀。没有条件的也可采用水磨石地面，或大块的瓷砖（至少800mm×800mm）接缝需要小于2mm。

6、照明：

灯具要选用净化灯具，能达到便于清洗、不积尘的特点。在建设的过程中应注意：

●规范的安装流程和全面的服务流程。●严格按照规范科学设计的安装流程。

●安装前需要确定以下安装条件，如：电源电压，电源进线位置，电话网络线进线位置，进水水压，最小安装空间，地面平整度，通风孔、进水管和下水管的位置等，理想状态的空间尺寸和通风口尺寸。

创美实业主要产品包括全木、铝木、钢木、全钢等结构的实验台（仪器台）、通风柜、器皿柜、天平台、超净工作台，以及与实验室相关配套的基础装备。产品设计风格彰显人性化、功能化。可满足实验室不同环境的要求，公司向客户提供全程一站式服务即实验室装修工程、净化工程、通风工程等各个领域。为客户营造一个功能齐全、安全舒适、绿色环保、全新的实验室立体空间。

从创业伊始，创美公司凝聚了一批优秀的管理团队和专业人才，积累了丰富的项目管理经验。曾成功服务于以下大型企业、知名科研机构、大专院校：可口可乐、EPSON实验室、台湾旺旺集团、中国海洋石油、中国兵工集团、华中电力、太原钢铁、农业部深圳农产品检测中心、第一军医大学……

我们秉承“科技创新、追求完美”的经营理念，“以质量求发展、以服务创品牌”，公司愿与广大客户携手共进，大步迈向集团化、国际化，为人类社会的科技进步创造美好的明天。

文章来源：VOLAB中国

文章关键词：实验室设计公司

实验室建设规划

篇6：PCR实验室规化设计说明

关键词：荧光定量PCR技术,原理,主要类型,定量方法,优化

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且具有灵敏度高、特异性和可靠性强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点[1]。目前,该技术已广泛应用于分子生物学、医学等学科和基础研究领域,特别是在现代农业转基因作物的定性检测、品系鉴定、转基因成分含量的检测中发挥着重要作用[2]。

1 荧光定量PCR技术的原理

荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[3]。由于常规PCR无法对扩增反应进行实时检测,需借助凝胶电泳等手段对扩增终产物进行定性和半定量分析,不仅费时、费事、易污染,且无法对起始模板准确定量。荧光定量PCR技术是在反应体系中加入荧光基团,荧光基团发出的荧光信号随着反应进程而变化,每经过一个PCR循环反应,定量PCR仪收集1个荧光强度信号,通过荧光强度变化检测产物量的变化,从而得到1条荧光扩增曲线,荧光扩增曲线一般由基线、指数扩增期和平台期组成[4]。只有在荧光信号指数扩增阶段,PCR产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系,才可以在这个阶段进行定量分析。为了便于对所检测样本进行比较,在荧光定量PCR反应的指数期,需要设定1个荧光信号的阈值(threshold)。荧光阈值是荧光扩增曲线上人为设定的一个值,荧光阈值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,用它可以定义样本的循环阈值(Cycle Threshold,Ct)。Ct值是PCR扩增过程中,反应管的荧光信号达到设定阈值时的循环次数。可见,Ct值取决于阈值。经数学证明[5],每个模板起始拷贝数的对数与Ct值存在线性关系。起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数[6]。

2 荧光定量PCR技术的主要类型

荧光定量PCR所使用的荧光化学材料可分为两大类,即荧光染料和荧光探针。荧光染料以SYBR GreenⅠ为主要代表,是非特异性荧光化学材料。荧光探针包括Taq Man、分子信标、荧光标记引物、杂交探针等,属于特异性荧光材料。

2.1 SYBR GreenⅠ

SYBR GreenⅠ是一种能够与双链DNA小沟结合的染料。在游离状态下,SYBR GreenⅠ发出微弱的荧光,但是一旦与双链DNA结合,其荧光强度大大增强。因此,一个反应发出的全部荧光信号与出现的双链DNA量成正比,可以根据荧光信号检测出PCR体系中的双链DNA的数量[7]。其优点是检测方法简单,通用性好,价格相对较低,是许多实验室开展荧光定量实验的首选。SYBR GreenⅠ的缺点在于它能够和所有的双链DNA相结合,因此由引物二聚体、单链二级结构、非特异性扩增产物引起的荧光信号会影响定量的准确性。但可以通过优化PCR的反应条件、选择设计良好的引物,来减少或去除引物二聚体和非特异性产物的产生;另外,也可以通过对扩增产物的溶解曲线进行分析来判断荧光信号的真实性。

2.2 Taq Man探针

Taq Man探针技术是有美国Perkin Elmer(PE)公司研制的一种实时PCR定量技术,在PCR扩增加入一对引物的同时加入1个特异性的荧光探针,此荧光探针为一个30~45 bp的寡核苷酸,它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对,其5′端标记荧光发射基团,3′端标记荧光淬灭基团。当探针保持完整时,3′端淬灭基团抑制了5′端发射基团的荧光发射。但在PCR扩增中,模板变性后低温退火,引物与探针同时与模板结合,在引物的介导下,沿模板向前延伸至探针结合处,发生链的置换,Taq DNA聚合酶的5′→3′外切酶活性将探针5′端连接的荧光发射基团从探针上切割下来,游离于反应体系中,从而脱离3'端荧光淬灭基团的屏蔽,接受光刺激发出荧光信号。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是相对应关系,且荧光强度同被释放的荧光基团的数目也是正比关系,因此该技术可对模板进行准确定量[8]。Taq Man探针技术特异性好、准确性高、假阳性低、重复性比较好。但是需要设计特异性的探针,因此成本较高[9]。

2.3 分子信标

分子信标技术是一种呈发夹结构的茎环状双标记寡核苷酸探针,环部与靶DNA序列互补,为15~35 bp;茎部是由互相配对的碱基组成,但与靶DNA无序列同源性,约8 bp。在探针的5′端和3′端分别标记荧光发射基团和荧光淬灭基团。当溶液中的模板与分子信标结合配对时,分子信标的构象改变成链状使得荧光发射基团与淬灭基团分开,当荧光基团被激发时,就发出荧光信号。与探针互补的靶分子数量越多,荧光信号也就越强,从而实现了对目的基因的定量检测。分子信标的方法优点是特异性强,荧光背景低。其缺点是设计困难,杂交探针不能完全与模板结合,稳定性较差,价格高[10]。

3 荧光定量PCR技术的定量方法

实时荧光定量PCR技术是DNA定量技术的一次飞跃。运用该技术,可以对DNA、RNA样品进行定量和定性分析。定量方法包括绝对定量和相对定量。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度;后者可以对不同方式处理的2个样本中的基因表达水平进行比较。

3.1 标准曲线法的绝对定量法

用一系列已知浓度的标准品,作为模板进行PCR反应,以标准品浓度的对数值为横坐标,以测得的Ct值为纵坐标,绘制标准曲线,在相同条件下检测未知样品的Ct值,从而根据标准曲线计算出未知样品的浓度(拷贝数)。制作1个好的标准曲线对定量结果至关重要,在制作标准曲线时,应至少选择5个稀释度的标准品,涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围,最好与目的基因有较高的同源性;绝对定量标准品通常可以是纯化的质粒ds DNA,体外转录的RNA,或者是体外合成的ss DNA、标准品的量可根据260 nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量转换成其拷贝数来确定。

3.2 双标准曲线法的相对定量法

在某些不需要对基因进行绝对定量、只需要确定基因相对表达差异的情况下,如某基因在经过某种处理后表达量是增加了还是减少了,用相对定量的方法就可以得到结果。双标准曲线法是指在测定目的基因的同时测定某一内源性管家基因,并用目的基因和管家基因的标准品分别作出标准曲线,处理与未处理样品同时扩增目的基因和管家基因,获得Ct值,然后从各自的标准曲线上求出初始模板量,经管家基因均一化处理后,求出目的基因的相对含量。定量的表达是相对于某个参照物的量而言的,因此相对定量的标准曲线就比较容易制备,对所用的标准品不需要知道绝对拷贝数,只要知道其相对稀释度即可。通常选用的管家基因有GAPDH、β-actin、β2-微球蛋白和r RNA。此方法在扩增效率较低、目标基因与管家基因扩增效率有差异时适用,且需要很精确的结果计算。

3.3 比较Ct法的相对定量法

如果反应条件控制较好,扩增效率较高,目的基因和管家基因的扩增效率基本一致,这时就不需要作标准曲线,而是通过与管家基因Ct值之间的相差来计算目的基因的表达差异。比较Ct法运用了数学公式来计算相对量,前提是假设每个循环增加1倍的产物量,根据数学推导得出:

目的基因的量=2-ΔΔCt

在该公式中,ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照组。因此,2-ΔΔC t表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数,使用这一方法可以直接得到的目的基因相对于管家基因的定量,而不必制作标准曲线[11]。

4 荧光定量PCR技术实验条件的优化

定量PCR技术已经在生物学研究中得到了广泛的应用,技术也日臻完善,并且敏感度极高,特异性强;正因为敏感度高,很容易受其他因素的影响,因此要得到准确可靠的反应结果,必须根据不同的反应类型优化实验条件,如特异性探针及引物的设计、选择合适的Mg2+浓度、引物和探针浓度、循环数等,规范操作步骤,并仔细配制PCR反应体系。

4.1 引物及探针

一是设计要求。引物设计是实时定量PCR中最重要的一步,扩增片段长度根据技术的不同有所区别:SYBR green I技术要求扩增片段不大于500 bp,Taq Man探针技术要求扩增片段长度在50~150 bp。引物序列选取应在基因的保守区段并具有特异性,长度一般为18~24 bp,避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对,引物自身不能形成环状发卡结构,熔解温度Tm值在55~65℃,GC含量在40%~60%,上、下游引物之间的Tm值相差不要超过4℃。在Taqman探针的设计上要求绝对保守,长度为30~45 bp,Tm值在68~70℃,探针的5’端不能为G和避免多个碱基同时出现,探针应尽可能靠近上游引物。二是浓度。引物和探针的浓度也会影响反应的特异性,引物浓度太低会致使反应不完全,引物浓度太高会导致非特异性产物扩增。最佳的引物浓度一般在0.1~0.6μmo L/L,探针的浓度在0.05~0.30μmo L/L,可以在这个基础上再进一步优化,以达到引物探针整体的最佳浓度。三是稳定性。一般从生物技术公司定制引物是以干粉形式运输的,使用时最好用TE溶液溶解,使其最终浓度为100μmo L/L,-20℃保存。纯度高、标记效率高的探针不仅荧光值高,且保存时间可以长达1年以上。由于反复冻融易导致探针降解,在确认探针质量好的情况下,最好稀释成2μmo L/L(10×),作为工作浓度分装多支,避光保存。四是退火温度。退火温度一般设定比引物的Tm值低5℃。在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火;同时还要足够高,以减少非特异性结合。合理的退火温度一般为55~70℃。

4.2 模板质量与浓度

模板的质量会影响PCR扩增的效率。模板应在-20℃保存,避免反复冻融。用TE溶液溶解和稀释模板,这能大大延长保质期。模板浓度应根据Ct值选择,使Ct值位于15~30个循环比较合适,若Ct值大于30,则应提高的模板浓度;如果小于15,则应降低的模板浓度。

4.3 镁离子浓度

Mg2+是影响Taq酶活性的关键因素。Mg2+的浓度过高,会增加非特异性扩增,降低忠实性;Mg2+的浓度过低影响Taq酶发挥最佳活性。一般来说,对以DNA或c DNA为模板的PCR反应,应选择2~5 mmo L/L浓度的Mg2+。

4.4 循环数

一般的实时定量PCR反应只需25~30个循环便可获得满意的结果,但是对于那些极微量的待测样本而言,适当增加循环数可以提高反应的检出底限,建议循环数为40个,但是并非循环数增加的越多,其敏感性就会越高。实际上,当循环数增加到某一值时,敏感性便不再升高。

4.5 重复实验和阴性、阳性对照

定量实验,误差是不可避免的,设立重复实验,对数据进行统计处理,可以将误差降低到最小,因此定量实验的每个样本至少要重复3次以上。为了增加PCR扩增反应的可信度,在扩增的同时,需进行阴性、阳性对照反应。阴性反应中不加模板DNA,而以水或缓冲液代替,用于检验是否存在PCR污染。阳性对照则用于检验PCR试剂和实验操作上可能出现的问题。相对来说,仪器、PCR试剂、SYBR GreenⅠ染料是很稳定的,而操作和模板是薄弱环节,模板的加入量一定要准确,为确保实验数据的有效性,每个样品至少平行做3次重复。使用微量移液器时,如果不仔细,就会产生较大的用量误差甚至错误。在实验过程中应当避免室温下混合各种试剂,应在冰上进行,避免所配体系产生气泡,并且在一经混合后立即开始进行扩增。

5 结语

通过设计针对目的基因的特异性引物和探针,并优化反应体系和控制反应条件,可以成功地建立快速、灵敏、特异的荧光定量PCR检测方法,实现大样本同时检测,节省大量的时间和反应成本。随着基因科学技术的发展,荧光定量PCR技术将会深入和拓展,在现代农业中得到更广泛的应用。

参考文献

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[10]朱捷,杨成君,王军.荧光定量PCR技术及其在科研中的应用[J].生物技术通报,2009(2):73-76.

篇7：浅谈居住区绿化规化与设计

风景园林；居住区绿化建设；管理体制；养护。

1.居住区绿化美化现状

A.发展状况

普通人是城市的主人，在景观设计和城市建设中应该得到关怀，而在城市美化思想指导下的绿化建设，强调的是纪念性、机械性和形式性、展示性。事实上，城市绿化的真正意义在于为城市居民提供一种休闲、生活及工作环境，而不是主题游乐。特别是在新建居住区中，真正为居民的生活和栖居而美化的社区并不多见。而大量出现的是，样板示范区导向的美化，目的是展示政绩，供人参观；商利导向的美化，试图通过美化招徕住户。这两种导向都把居住者和居住环境作为展示品，忽略了环境美化对居住者的日常生活和居住意义，导致了居住区美化走入了歧途。但是，随着城市的建设和发展，建成区不断地迅速扩大，新建居住区如雨后春笋般拔地而起。居住区的绿化与城市建设、交通、卫生、教育、商业服务及其他物业管理等，共同构成现代化城市居住区的总体形象。居住区绿化地是城市园林绿化系统的重要组成部分，是伴随现代化城市建设而产生的一种新型绿地。它最贴近生活、贴近居民，也最能体现“以人为本”的现代理念。在城市的大园林中占有相当的比重。据统计，居住区占地绿化面积已远远超过其他公共绿地增长速度，也创造了一定的生态效益，得到各级领导和有识之士的高度重视，更深受小区居民的关心和瞩目。

B.存在问题

a.自觉执行绿化法规的意识不够，尚未形成规范化管理

由于缺乏有效的保护管理措施，一些建设单位在经济利益的驱动下，改变了部分规划绿地使用性质。如：摆摊设亭，建存车棚、停车场等。绿地成了无视法规的挤占对象。

宣传执法力度不够，管理办法落实不够。对随意折枝、摘花、伐树和车辆碾压绿地等行为，查处工作薄弱，无形中助长了侵占、蚕食、破坏绿地的行为，致使一些人和个别单位的领导绿化意识淡薄，法制观念极差。

存在各行其是的现象，设计与施工未经园林部门审核，影响了居住区绿化美化水平的提搞。

b.绿化规划与快速发展的城市建设不相适应

一些开发商在报规划时，各项指标均符合要求，但具体到施工时，一些配套设施就发生了“计划赶不上变化”的现象。待到投入使用时，问题接踵而至。例如停车场问题、商业配套设施问题等。为了缓解矛盾，开发商不得不考虑补扩建，而补扩建的唯一办法就是挤占绿地。

c.管理体制不顺，经费明显不足

建成区的居住区绿化，有时因为产权和管理范围交接不明晰，责任不清而造成管理不到位。依照法规规定，小区绿化建设和养护经费应由房屋产权单位负责。但由于目前实行房改，房屋产权多样化，至今养护经费不能落实。如果此类问题得不到解决，包袱越背越重，势必会造成将来承受不了而被迫弃管。另外，有一些市政工程，在居住区或重点大街施工，毁坏树木、占用绿地不缴纳绿化损失费，无形中为绿化养护雪上加霜，影响了整体绿化水平的提高。

2.营造最佳人居环境的措施

A.规划设计是关键

a.严格执行规划设计要求

要想提高新建居住区绿化美化水平，就必须做到规划设计合理，使规划到位，建设过程中严格执行规划设计要求。如执行居住区绿化面积占小区面积的30%，还要按照设计人口居住小区集中绿地面积人均1m2、居住区人均2m2的要求，必须具有一定数量的游憩康体设施，供居民游憩赏景及进行各类活动的公共绿地。

b.配置设施完善，综合功能齐全

居住区的基础设施除了绿地外，还应包括教育设施、商业网点、卫生保健、娱乐场所、行政管理、市政公用设施等。

c.规划要有超前意识，留出一定比例的待建用地

d.居住区绿化规划设计要注重创新，注重经济实用，注重管理，注重绿化设计手法

儿童活动区内要树种树型丰富，色彩明快，比例恰当。一般采用生长健壮，少病虫害，树姿优美，无刺、无毒、无飞絮的树种。配置的方式要适合儿童的心理，色彩丰富，体态活泼，便于儿童记忆和辨认。老人活动区应选择高大乔木为老人休息处遮荫，为晨练、散步创造意境。对于大多数长年户外活动的人群要通过用自然流畅的林缘线，与丰富的大色块相结合的方式，取得良好的感官环境效果。居住区是居民一年四季生活、憩息的环境。在植物的配置上应考虑季节变化，营造春则繁花吐艳、夏则绿萌清香、秋则霜叶似火、冬则绿翠常延的景观，使之同居民春夏秋冬的生活规律同步。建议选择一些具有强烈季相变化的植物。如：雪松、玉兰、法桐、元宝枫、紫薇、女贞、大叶黄杨、柿树和应时花卉等，萌芽、抽叶、开花、结果的时间相互交错，达到季相变化。还应乔灌与花草相结合，常绿与落叶相结合、速生与慢长相结合。同时考虑住宅的通风、采光。最后达到功能优先、注重景观、以绿为主、方便居民的目的。

B.增加投资是提高绿化水平的重要保障

绿化经费投入一定终身或一次性使用的办法，都可能造成绿化水平的参差不齐和管理水平的逐年滑坡。建立稳定的、多元化的小区绿化建设和养护管理资金渠道，是提高新建居住区绿化美化水平的重要保障。所以，小区开发商应加大绿化投资力度，同时也要建立多渠道的资金筹集机制，鼓励和引导社会资金用于小区的绿化建设和管理，也是提高新建居住区绿化水平的有效途径。具体可采取如下措施。

单位自管房屋，可按有关条例规定，由该单位按年度制定支出预算，物业公司或房管站管理的房屋，则由物业公司或房管站支出预算。无论由谁管理，都要确保绿化养护经费足够到位。

本着谁受益，谁投资的原则，在居民中筹集一定数量的绿化养护经费，按物业有关管理规定中的0.155元／m2的标准收取绿化费。使居民既尽了义务，又对绿地增加了一份责任和情感。

分清职责，加强对居住区绿化的保护和管理。园林绿化部门要认真履行政府管理职能，对居住区的绿化管理制度切实可行的具体办法，依法加强管理。并制定养管标准，开展检查评比活动，奖优罚劣。街道办事处和居委会要把监督管理绿化作为己任，纳入工作日程。房屋产权单位或物业公司是居住区绿化的责任单位，一方面要安排好绿化养护经费，组织好专业力量进行规范有效的养护管理；另一方面要接受园林绿化管理部门或街道办事处的监督检查和指导，使工作不断改进和加强。

对于尚未实行物业管理的小区，居民委员会要采取新的有效措施，积极鼓励认建认养绿地的活动，增强居民爱绿、护绿意识。

实行养护招投标，走有特色的市场化道路。实行养护招投标是真正实现养管分离，节约养护成本，确保绿地养护质量的有效途径。

C.完善绿地养护管理制度，是提高新建居住区绿化水平的重要保证

过去由于管理体制不顺，养管主体单位不明确，责任不清，出现了一年绿、二年荒、三年光的现象。为了避免此现象发生，在房屋产权单位多样化的今天，对新建居住区的综合管理，应由开发商组织物业公司进行管理。物业公司可自管，也可委托具有一定实力、资质的专业部门管理，但绿化行政管理单位一定严把质量关，实行养管责任制，明确责任。并执行绿化养护考核标准，加强各项养护措施并进行现场指导和监督。

D.多管齐下，确保绿地安全，是提高绿化水平的有效措施