PCR优化

PCR优化（精选十篇）

PCR优化 篇1

简单序列重复区间 (inter simple sequence repeats, ISSR) DNA标记技术是由Zietkiewicz E等[2]于1994年创建的, 是在简单重复序列 (SSR ) 标记基础上发展起来的一种新技术, 已用于植物品种鉴定、遗传作图、遗传多样性和居群遗传学等研究中[3]。

由于ISSR是基于PCR的一种分子标记技术, 因此其扩增结果容易受Mg2+、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶、模板DNA等因素的影响。本研究通过5因素4水平的正交试验, 建立适合于栝楼的ISSR反应体系, 为栝楼品种的分子鉴定和遗传关系的分析等研究提供了一个标准反应体系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

供试栝楼 (Trichosanthes kirilowii Maxim) 材料种植于浙江林学院遗传学科苗圊地, 采取幼嫩叶片, 液氮速冻后置于-70℃冰箱保存备用。

1.1.2 试剂

用于ISSR-PCR扩增反应的ISSR引物 (10μmol·L-1) 均由上海生工公司合成, 引物序列参照加拿大哥伦比亚大学 (UBC) 公布的第九套 ISSR 引物序列。Taq DNA聚合酶 (5U/μl) 、MgCl2 (25mmol·L-1) 、dNTPs (10mmol·L-1) 以及DNA Marker等均购自上海生工公司。

1.1.3 仪器

ISSR扩增反应在Hybaid公司生产的Gene Amp PCR System 9700扩增仪上进行;电泳仪、电泳槽以及凝胶成像系统由Bio-Rad公司生产。

1.2 方法

1.2.1 栝楼基因组DNA的提取

取栝楼顶端2～3片嫩叶片, 洗净后, 用滤纸吸取表面的水分, 剪碎后放入研钵, 加液氮研成粉末, DNA的提取参照李彦农[4]的改良后的CTAB法, DNA的质量和浓度利用琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白仪U-OO8OD测定OD260/OD280进行检测, 保存于-20℃冰箱备用。

1.2.2 ISSR-PCR扩增反应体系的建立

以UBC810为引物。针对Taq酶量、Mg2+、模板DNA、dNTPs和引物5个因素各设计4个水平 (见表1) , 用L16 (45) 正交表[5], 设计聚合酶链式反应 (PCR) 扩增体系各成分的因素-水平正交设计试验表 (见表2) 。共有16个处理, 每个处理2次重复, 在Gene Amp PCR System 9700扩增仪上进行扩增。反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s, 52℃退火1min, 72℃延伸2min, 35个循环;72℃延伸7min。4℃保存。PCR扩增反应产物用1%的琼脂糖凝胶 (含EB 0.5mg·L-1) 电泳约100min, Gene Genius Bio Imaging System凝胶成像系统拍照分析。

1.2.3 不同退火温度的梯度试验

用以上所得最佳反应体系进行温度梯度退火实验, 设置的退火温度在47℃～60℃之间, PCR Express (HyBAID) 扩增仪上自动生成12个温度梯度为:47.1℃、47.4℃、48.0℃、49.2℃、50.5℃、52.1℃、53.6℃、55.3℃、57.1℃、58.2℃、58.8℃和59.2℃, 比较退火温度对电泳谱带的清晰度和数量的影响, 从中选择最佳的反应退火温度。

2 结果与分析

2.1 栝楼ISSR-PCR反应体系的建立

2.1.1 正交试验的直观分析

根据本试验的正交设计进行PCR的扩增结果和电泳检测, 依据琼脂糖电泳条带的强弱和杂带的多少做直观分析。PCR 的扩增结果是模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物和Taq酶等因素综合作用的结果。从图1可以看出, 在16个处理中, 由于受5个因素的浓度及组合的不同影响, 扩增结果也存在明显差异。在各个不同的组合中, 第6、11、15、16组合没有扩增出条带, 而第1、2、7、8条带扩增的拖尾严重, 而且第7、8组合的背景较重, 而其余第3、4、5、9、10、12、13和14组合有扩增出不同的条带, 但是其条带的清晰程度和多态性有明显的差别, 说明ISSR-PCR扩增的结果是模板DNA、 Mg2+、dNTPs、引物和Taq酶等因素综合作用的结果。通过多因素综合比较第5组合 (30ng模板DNA, 2.0 mmol/L MgCl2, 0.3mmol/L dNTPs, 0.5 μmol/L引物, 0.5U Taq DNA聚合酶) 扩增的谱带不但多态性好, 且谱带清晰, 是理想的组合。

1-16 treatments of orthogonal tests.

2.2 栝楼ISSR-PCR退火温度选择

用1个DNA样品和1个引物进行扩增, 退火温度为47.1℃、47.4℃、48.0℃、49.2℃、 50.5℃、52.1℃、53.6℃、55.3℃、57.1℃、58.2℃、58.8℃和59.2℃, 在这12个退火温度中, 47.1℃、47.4℃、48.0℃、49.2℃、 50.5℃、52.1℃、53.6℃、55.3℃扩增的背景依次减弱, 扩增的条带的清晰度依次增强, 而且条带的多态性依次增加, 而55.3℃、57.1℃、58.2℃、58.8℃和59.2℃扩增和条带背景清晰, 但是扩增的多态性条带依次减少, 不能够正确地表达其引物的多态性。说明退火温度过高或过低都会影响到PCR扩增条带的清晰度和其多态性的正确表达。由图2可以清晰地可以看出该ISSR引物PCR扩增的退火温度为55.3℃。

通过对上述影响ISSR-PCR扩增效果的影响因子进行优化, 得出栝楼ISSR-PCR分析的最佳反应体系 (20μL) 为:30ng模板DNA, 2.0 mmol·L-1 MgCl2, 0.3mmol·L-1 dNTPs, 0.5μmol·L-1引物, 0.5U Taq DNA聚合酶。

扩增反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s, 52℃退火1min, 72℃延伸2min, 35个循环;72℃延伸7min;4℃保存。

2.3 ISSR-PCR反应体系应用

从筛选出的引物中随机挑选引物ISSR-UBC844, 对17份栝楼种质材料进行DNA扩增, 以检测确定的ISSR-PCR反应体系的应用可靠性。结果如图3所示, 该引物在17份栝楼种质材料上都能扩增出清晰、重复性好、多态性高的DNA谱带, 表明已确立的ISSR-PCR反应体系稳定可靠, 可用于栝楼遗传多样性分析、种质资源鉴定等研究。

3 讨论

3.1 Taq酶、引物、Mg2+、dNTPs和模板DNA对ISSR-PCR扩增反应的影响

由于PCR反应体系受到各因素的相互作用的正交试验设计具有工作量小、信息量大等优点, 建立的ISSR反应体系稳定性高, 已受到一些学者重视[6,7,8,9,10,11,12,13]。本试验通过对影响栝楼ISSR-PCR反应的各因子进行正交设计试验, 得到栝楼栝楼最佳反应体系和反应程序。

ISSR-PCR反应体系 (包括Taq酶、Mg2+、dNTPs、引物和DNA模板等) 各反应成分都会影响 PCR产物的生成和质量。谢运海等认为各因素水平的变化对PCR反应的影响从小到大依次为:Taq酶、引物、Mg2+、dNTPs和模板DNA。而王彦华等认为PCR的扩增结果受Mg2+浓度影响最大。无论哪种因素是主要因素, 反应体系中的各因素间都会发生相互作用。且体系中任一因素发生变化都可能影响扩增结果[7]。

有关资料表明[8,9], Taq DNA聚合酶用量一般为1.0U, 均能扩增, 物种之间差异较大 。本试验所得Taq酶最佳浓度为0.5U (20μL) , 既能保证结果可靠, 又能节省实验成本。反应体系中, Mg2+能定量地与dNTPs分子中的磷酸基团结合, 所以两者有效浓度相互影响。本试验中Mg2+与dNTPs最佳浓度分别确定为2.0mmol·L-1和0.3mmol·L-1。过高的引物浓度易导致碱基错配、引物二聚体的形成, 过低扩增产量会下降。本试验确定0.5μmol·L-1为引物最佳浓度。

有关ISSR的反应体系和程序优化的报道很多[10,11,12,13,14,15,16,17,18,19], 但不同的植物ISSR最佳的反应体系差别很大。国内有关ISSR反应条件的优化研究大多采用单因素试验的方法[20], 导致顾此失彼, 忽视了各因素间的互作效应[11]。为了获得重复性好、稳定性好的ISSR谱带, 提高分析的准确性, 因此对其反应条件进行优化是必不可少的。

3.2 退火温度对ISSR-PCR扩增反应的影响

退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃, 可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多, 引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间, 取决于引物的长度、碱基组成及其浓度, 还有靶基序列的长度。温度过高引物与模板结合差, 多态性差, 产物少;过低则扩增特异性差。且ISSR每对引物都有其自身的最佳的退火温度, 故需要对不同的引物进行退火温度的摸索;PCR反应循环次数越多, 扩增产率越高。但反应时间过长, 又会造成DNA谱带的降解。实验中我们采用温度梯度进行ISSR-PCR进行分析, 发现退火温度过低PCR扩增产物有假阳性结果, 而退火温度过高又有阴性结果出现。因此, 在实验过程中既要考虑到尽量避免出现阳性或阴性结果, 又要增强结果的特异性, 本实验结果认为最佳的退火温度为55.3℃, 最佳循环次数为35个循环。

PCR优化 篇2

根据正交试验设计的原理,设计了探索性正交试验和细调性正交试验来确定沙打旺ISSR-PCR体系中各成分的浓度.得到既稳定又能扩出最多条带的`适合沙打旺的ISSR-PCR最佳反应体系,即20 μl的反应体系中含有1×buffer,dNTP 0.2 mmol/L,Taq酶1.0 U,引物0.3 μmol/L,Mg2+2.5 mmol/L,DNA模板2.5 ng/μl.然后对沙打旺ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火试验,得到这条引物的最佳退火温度为54.1 ℃.这一最佳体系的建立为今后利用ISSR标记技术,研究沙打旺的遗传多样性提供了标准化程序.

作 者：陈志宏 黄琳凯 张新全 王志刚  作者单位：陈志宏,王志刚(全国畜牧兽医总站畜禽牧草种质资源保存利用中心,北京,100094)

黄琳凯,张新全(四川农业大学动物科技学院草业科学系,四川雅安,625014)

PCR优化 篇3

关键词：杨梅；iPBS-PCR；体系优化

中图分类号： S667.601文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0051-04

收稿日期：2015-05-13

基金项目：江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（12）2011]；江苏省科技支撑计划（编号：BE2012361）；国家公益性行业（农业）科研专项（编号：20120389）；江苏省农业三新工程[编号：SXGC（2014）076]。

作者简介：郭志海（1965—），男，江苏江阴人，高级农艺师、副教授，主要从事园艺种质资源研究。E-mail：Gzh8115@163.com。

通信作者：王鹏凯，讲师，主要从植物分子生物学研究。E-mail：mengxiao02181@hotmail.com。杨梅（Myrica rubra） 是杨梅科杨梅属常绿小乔木，原产于我国，主要生长在长江流域以南的丘陵山地。杨梅果实营养丰富，具有较强的保健功能，是南方经济效益较高的水果之一[1]。我国杨梅栽培历史悠久，生态环境的多样性产生了性状多样的品种、品系和类型，形成了丰富的种质资源。利用形态学、同工酶等方法鉴定杨梅种质资源局限性大、效率低。因此，常利用分子标记对杨梅种质资源进行分析，包括遗传多样性、亲缘关系分析、品（杂）种鉴别等方面。目前，RAPD、AFLP、SRAP、ISSR、SSR、iPBS、ScoT等技术[2-7]在杨梅中都已得到应用[8]。

iPBS是以LTR类反转录转座子保守位点设计引物进行扩增的一种分子标记技术，针对LTR类反转录转座子中2个PBS（引物结合位点）区间进行扩增[9]。该方法简单、有效，可节约大量人力、物力，不用预先获知LTR序列，直接进行引物筛选。目前，该技术已经成功应用于亚麻[10]、大麦、小麦、苹果、玉米[9]、葡萄[11]等的研究。当材料、方法不同时，需对扩增条件进行优化才能得出更科学的标记谱带。本研究利用单因素试验对杨梅iPBS-PCR反应体系进行优化，通过对电泳结果的分析建立了杨梅iPBS-PCR反应体系。同时利用该反应体系对已有的iPBS引物进行初步筛选，研究结果将为使用iPBS标记评价、鉴定杨梅种质资源提供了技术基础。

1材料与方法

1.1试验材料

试验所用的杨梅种质资源材料均采自江苏省太湖常绿果树技术推广中心国家杨梅种质资源圃，杨梅品种为晚稻（浙江舟山）、狗色头（江苏常熟）、浪荡子（江苏苏州东山）。PCR试剂购于TaKaRa公司（10×rTaq buffer，2.5 μmol/L dNTP，25 μmol/L MgCl2，5 U/μL rTaq ），引物由上海生工合成（溶解至10 μmol/L）。

1.2试验方法

1.2.1杨梅DNA提取与检测杨梅基因组DNA提取采用改良CTAB快速提取法[12]。将杨梅嫩叶直接在CTAB提取液中匀浆，经过抽提、沉淀、溶解等步骤得到基因组DNA溶液。获得的DNA用1%琼脂糖凝胶电泳进行质量检测。通过紫外分光光度计测定260、280 nm 处的吸光度，用于测算DNA纯度（D260 nm/D280 nm）、浓度（D260 nm）。完成浓度测定的DNA溶液进一步稀释成10 ng/μL的工作液，用于后续PCR反应。

1.2.2杨梅iPBS-PCR反应体系优化杨梅iPBS-PCR扩增反应总体积为20 μL，选择在葡萄iPBS-PCR反应体系优化中使用的2249引物（5′-AACCGACCTCTGATACCA-3′）进行PCR扩增（预试验结果显示该引物在杨梅中扩增效果较好）[11]。采用单因素法对2.5 mmol/L dNTP、25 mmol/L Mg2+、10 μmol/L引物、模板用量进行试验，其中包括：（1）2 μL 10×Taq buffer，1 μL 2249引物，0.2 μL Taq酶，1.6 μL dNTP，Mg2+用量设为1.2、1.4、1.6、1.8 μL，DNA模板用量设为5、10、15、20、25、30、50 ng，用以确定最佳Mg2+和模板DNA用量。（2）2 μL 10×Taq buffer，1.6 μL dNTP，1.6 μL Mg2+，0.2 μL Taq酶，2 249引物用量设为1、2 μL，DNA模板用量设为10、20、30、40 ng，用以确定引物与模板的最佳比例和用量；（3）2 μL 10×Taq buffer，1 μL 2249引物，30 ng DNA模板，0.2 μL Taq酶，1.6 μL Mg2+，dNTP用量设为1.2、1.6、2.0 μL，用以确定dNTP的最佳用量。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳方法进行检测，通过紫外凝胶成像系统对不同反应体系进行评价，筛选出适合杨梅iPBS-PCR最佳反应体系。

1.2.3杨梅iPBS-PCR反应程序本试验中杨梅iPBS-PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，49～59 ℃（2 ℃/梯度，共6个梯度）退火50 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保温。PCR产物评价方法与“1.2.2”节相同，显示出退火温度对杨梅iPBS-PCR反应的影响，用以确定最佳退火温度。

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2结果与分析

2.1基因组DNA提取与质量控制

电泳检测结果（图1）表明得到的杨梅基因组DNA主带明亮，无明显拖尾，经RNA酶处理后RNA降解较好。分光光度计检测结果表明70 mg新鲜叶片可以得到2～3 μg基因组DNA，经RNA酶处理后D260 nm/D280 nm在1.65～1.90之间，纯度较好。

2.2PCR反应各因素对iPBS-PCR扩增反应的影响

选用3个品种的杨梅基因DNA进行iPBS-PCR反应，测试不同反应体系下的扩增效果，筛选PCR反应各因素的优化组合。

2.2.1Mg2+浓度对iPBS-PCR的影响PCR反应中的Mg2+对扩增的特异性和Taq酶活性有明显的影响。随着Mg2+用量的增加，扩增出的谱带逐渐增多且亮度也逐步增加，弥散情况基本良好，有利于谱带的判读；但Mg2+用量增至1.8 μL时，部分谱带的弥散程度有所增加，可能增加差异较小的谱带判读难度，进而影响后续的结果分析。为了结果的一致性，在测试时设置了7个模板用量（5、10、15、20、25、30、50 ng），发现Mg2+用量对iPBS-PCR的影响在不同模板量的情况下是一致的（图2）。因此，在本研究中1.2～1.8 μL Mg2+用量均适宜杨梅的iPBS-PCR反应，但是为了平衡谱带数量和判读质量，在后续试验中Mg2+用量固定为1.6 μL。

2.2.2模板DNA用量对iPBS-PCR的影响模板用量是PCR体系的重要影响因素，杨梅iPBS-PCR的预试验中就发现100 ng以上的模板用量会导致扩增失败。当Mg2+用量固定为1.6 μL时在5～50 ng模板量范围内，模板量的改变对iPBS-PCR影响较大（图3）。当模板量增加时，扩增出的谱带逐渐增多、亮度也有所增加，并且这种影响在3个杨梅品种中具有一致性；对于得到谱带较多的品种，当模板量增至50 ng时弥散程度增加，影响了结果分析。因此 综合考虑以上结果，确定后续试验中模板DNA用量为30 ng。

2.2.3引物用量对iPBS-PCR的影响引物用量对扩增的特异性和谱带的清晰度有明显影响。当引物用量由1 μL增加至2 μL后，谱带数量减少且弥散情况比较严重， 谱带的特

征性也发生变化；本试验中同时使用3个品种、4个模板梯度，电泳结果显示引物用量增加对杨梅iPBS-PCR的影响是一致的（图4）。因此，综合分析电泳结果，确定后续试验中引物用量为1 μL。

2.2.4dNTP用量对iPBS-PCR的影响dNTP用量与PCR反应的扩增效率关系密切。当dNTP用量为1.2 μL时，扩增效率低、谱带亮度不足；随着dNTP用量增加，条带逐渐变亮，但是过多的dNTP（2.0 μL）会使谱带中的主带亮度大大增加，从而影响其它条带的判读（图5）。因此，后续试验中dNTP用量确定为1.6 μL。

2.2.5杨梅iPBS-PCR最优化体系通过一系列的单因素测试，综合分析电泳结果，建立20 μL杨梅iPBS-PCR扩增体系（表1）。

表1杨梅iPBS-PCR优化体系

成分加入量（μL）10×Taq buffer2.025 mmol/L Mg2+1.62.5 mmol/L dNTP1.610 μmol/L 引物1.05 U/μL Taq酶0.210 ng/μL 模板DNA1.0灭菌ddH2O12.6

2.3退火温度对扩增反应的影响及杨梅iPBS-PCR优化体系验证

2.3.1退火温度对iPBS扩增反应的影响PCR程序中的退火温度直接决定了引物扩增的效果，对产物的特异性有重要的影响。在分子标记中，退火温度可以直接影响谱带特征。报道的引物2249理论退火温度为51 ℃，合成报告Tm值为53 ℃，为检测不同退火温度对扩增反应的影响，以浪荡子为材料，在“2.2.5”节优化体系的基础上设置49～59 ℃（2 ℃/梯度）共6个退火温度进行扩增反应；电泳结果显示随着退火温度的升高，得到的谱带逐渐减少，谱带特征发生很大变化（图6）；比较发现以Tm值（53 ℃）为退火温度得到的谱带数目较多且比较清晰， 因此在选择不同引物退火温度时推荐使用Tm值作为参考进行上下调节。

2.3.2优化体系下的扩增效果从杨梅资源圃中随机挑选10个品种提取DNA，并在已报道的iPBS引物中随机选择4条引物，以优化后的反应体系为基础、引物Tm值作为退火温度，进行iPBS-PCR扩增反应，验证优化体系和退火温度设置的有效性。结果（图7）显示，4条引物均扩增出清晰的谱带且多态性明显，说明上述优化体系的确适用于杨梅iPBS分子标记。

3结论与讨论

高等植物中过半的重复DNA由反转录转座子组成，它们散布于各染色体上，是动态的基因组组件，有能力整合新的拷贝，促进内部染色体重组[13]。用其开发分子标记，信息量高，多态性好，但是iPBS分子标记也是基于PCR反应的分子标记，虽然多态性非常丰富，但是与其他分子标记一样受到多种因素的影响。试验的稳定性和可靠性与PCR反应体系和条件关系很大，因此在使用前需要对反应体系进行优化。PCR体系中的各个组分不仅在绝对用量方面决定反应的扩增效果，各个组分之间的比例也会对反应造成影响。除此以外，扩增程序尤其是退火温度对iPBS分子标记的谱带特征影响非常大，本试验的测试结果同样支持此观点。综合本试验的扩增结果，可以看出杨梅iPBS-PCR反应体系中的各个组分在一定的用量范围内均可以得到较好的扩增效果， 因此在实际试验过程中应该根据引物和模板的实际情况进行调整，最终得到最佳效果的分子标记谱带信息。本研究利用单因素法获得了适用于杨梅iPBS标记检测的PCR体系，即在20 μL反应体系中：2 μL 10 × Taq buffer，1.6 μL 25 mmol/L Mg2+，1.6 μL 2.5 mmol/L dNTP，1 μL 10 μmol/L 引物，0.2 μL 5 U/μL Taq酶，30 ng模板DNA，灭菌ddH2O补足20 μL。该反应体系重复性好，多态性高，有利于谱带的判读。本试验结果将为利用iPBS-PCR技术进行杨梅种质遗传多样性评价及鉴定提供技术支持，也将为应用于其他植物的研究提供借鉴。

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PCR优化 篇4

由于ISSR技术是基于PCR的一种标记,所以其反应条件易受许多因素的干扰,如模板DNA、Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、引物等浓度都能影响ISSR-PCR扩增的结果。因此,为保证ISSR-PCR扩增结果的准确和稳定,有必要对反应体系进行优化。

目前,对ISSR-PCR反应体系进行优化的方法主要有单因素试验和正交试验两种。单因素试验主要是研究各个因素对ISSR-PCR反应的影响情况,从而得出各因素的最佳反应条件,各因素最佳反应条件的组合即为ISSR-PCR反应的最优体系。此方法已被广泛应用于PCR反应体系的优化试验中。而正交试验是利用统计学中正交设计方法,综合研究个影响因素及其交互作用,此法能较快速地找到PCR反应的最优体系。目前在铁皮石斛[2]、马蹄金[3]等中药材上均建立了适合的ISSR体系。

本试验综合利用单因素试验和正交试验设计两种方法,对Taq DNA聚合、Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA,5种因素4个水平上,对益智ISSR反应体系进行优化,并确定引物的最佳退火温度,获得适合于益智ISSR-PCR反应的最优体系,为今后研究益智的遗传多样性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

试验所用材料为益智叶片,采自海南吊罗山。采摘后装入冰盒带回实验室,置于-70℃冰箱中备用。

1.1.2 试剂

十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)、琼脂糖为BBI的产品;dNTPs、Taq DNA聚合酶为上海申能博彩产品;引物由上海生工合成;DL2000为TAKARA产品;硼酸(H3BO3)为国产分析纯(广东)。

1.1.3 仪器

PCR扩增仪(Biometra T1 Thermocycler型); MasterCycler Gradient梯度PCR仪(德国Eppendorf);Gel Doc EQ凝胶成像系统(美国Bio-Rad);电泳仪和电泳槽(北京六一厂 DYY-6B)。

1.2 方法

1.2.1 益智基因组DNA的提取与浓度测定

采用改良CTAB法[4]提取益智叶片的基因组DNA,通过0.8%琼脂糖凝胶电泳及Eppendorf公司的Bio Photometer核酸检测仪检测DNA的质量和浓度,并稀释至25ng/μl。

1.2.2 正交表的设计

采用正交设计L16(45)在4个水平上进行试验(表1)。表1中的16个处理各重复2次。参照Zietkiewicz E, et al. 的反应条件,反应程序设定为94℃预变性5min,94℃变性45s,50℃退火45s,72℃延伸90s,35个循环,最后72℃延伸10min,4℃保存。所用引物参照加拿大哥伦比亚大学UBC公司公布的第9套ISSR引物序列,由上海生工合成,本试验所用引物为UBC807。PCR扩增反应在Biometra公司T1PCR仪上进行,扩增产物加入4μl 6×loading buffer,用2%琼脂糖凝胶(每100mL加入5μl GoldViewTM DNA染料)电泳分离。电泳缓冲液为0.5×TBE,电压4V/cm。电泳结束后在凝胶成像系统(上海天能T4100)中观察并拍照。对试验结果分别进行直观分析,得到益智ISSR-PCR反应各因素的最佳处理。

1.2.3 单因素试验

根据表2中各因素水平分别研究5个因素对ISSR-PCR反应体系的影响。对各因素不同水平分析比较,并与正交试验结果综合分析,获得益智ISSR-PCR反应的最优反应体系。

1.2.4 退火温度的确定

根据试验结果,选择最优的反应体系,采用梯度PCR模式设定退火温度(50±5℃),自动将温度形成12个温度:45.0℃、45.1℃、45.7℃、46.6℃、47.7℃、49.0℃、50.4℃、51.8℃、53.0℃、54.1℃、55.0℃、55.4℃,确定最佳退火温度。

1.2.5 体系稳定性检测

为了验证所得最优体系的稳定性,随机选择引物UBC808[(AG)8C]和UBC880[(GGAGA)3]分别用此最优PCR反应体系对不同模板DNA进行PCR扩增,扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离。电泳结束后在凝胶成像系统中观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 正交试验结果及直观分析

参照何正文等[5]的方法,对PCR扩增(图1)依据条带的多少和强弱进行直观分析。即将16个处理中条带清晰度最高,数量最多,背景最低的记为16分,与此相反,最差的记为1分。两次重复分别独立统计,依处理次序得到的分数分别是:1,1;8,8;15,15;16,16;5,2;12,12;14,14;13,13;3,6;9,9;11,11;10,10;2,3;4,4;6,5;7,7。参照穆立蔷等[6]的方法,根枯分数求出每个因素同一水平下的试验值之和Ki以及每一因素水平下的数据平均值ki,并求出同一因素不同水平间平均值的极差R和方差SS(表3)。极差R和方差SS反映了影响因素对反应体

M:Maker DL2000.

系的影响情况,SS值越大,影响越显著。由表3可知对益智PCR反应影响最大的Mg2+浓度,而模板DNA浓度对反应的影响最小。此外,利用ki值可以确定各个因素的最佳水平,ki值越大,则该水平最佳。因此,5个因素的最佳水平为Taq酶1.0U,Mg2+ 3.0mmol/L,模板DNA 100ng,dNTP 0.25mmol/L,引物0.8μmol/L。这一组合在正交表中并没有出现,但与分值最高的4号处理接近。

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 模板DNA

反应体系中模板DNA的含量直接影响扩增产物的得率及特异性。模板含量过低,分子碰撞的机率低,扩增产物不稳定,甚至扩增不出产物;模板含量过高,会相应增加非特异性产物的扩增[7]。本试验设置了4个不同的浓度水平:25ng、50ng、75ng和100ng,经电泳检测结果显示(图2),各浓度水平差异不明显,条带的数量和亮度的强弱基本一致。说明益智ISSR反应对模板DNA的浓度不敏感,模板含量许可范围较大。故本试验所用模板DNA的浓度为25ng～100ng时均可满足扩增要求。

1～4泳道:模板DNA 25ng、50ng、75ng、100ng;5～8泳道:Mg2+浓度1.5mmol L、2.0 mmol L、2.5 mmol L、3.0 mmol L;9～12泳道:引物0.4μmol L、0.6μmol L、0.8μmol L、1.0μmol L;13～16泳道:dNTPs浓度0.1mmol L、0.15mmol L、0.2mmol L、0.25mmol L;17～20泳道:Taq DNA聚合酶0.5U、1.0U、1.5U、2.0U。Lane 1-4:template DNA 25ng,50ng,75ng,100ng;Lane 5-8:Mg2+concentration 1.5mmol L 2.0mmol L 2.5mmol L 3.0mmol L;Lane 9-12:primer0.4μmol L0.6μmol L0.8μmol L1.0μmol L;Lane 13-16:dNTPs concentration 0.1mmol L 0.15mmol L 0.2mmol L 0.25mmol L;Lane 17-20:Taq DNApolymerase 0.5U1.0U1.5U2.0U(M:100bp DNA LadderMarker).

2.2.2 Mg2+浓度

Mg2+浓度是ISSR-PCR的一个主要变化因素。作为Taq DNA聚合酶的辅助因子,Mg2+浓度不仅影响Taq酶的活性,还能与反应液中的dNTP、模板DNA及引物的结合,影响引物与模板的结合效率,模板与PCR产物的解链温度及产物的特异性和引物二聚体的形成[7]。图2中结果表明:Mg2+浓度为1.5mmol/L时,扩增出的谱带较弱,而在浓度为2.5～3.0mmol/L时,均能扩增出较为清晰的条带。但综合正交试验中的结果,确定扩增反应中的最佳Mg2+浓度为3.0mmol/L。

2.2.3 引物浓度

引物浓度会对PCR的带型产生明显的影响,浓度过低不能扩增,浓度太高产生新的位点[8]。由图2可见随着引物浓度的增加,扩增出的条带也随之由弱到强。当浓度达到1.0μmol/L时,条带的清晰度下降。故本实验确定0.6～0.8μmol/L为最佳引物浓度。

2.2.4 dNTPs浓度

dNTPs是ISSR反应的原料,当其浓度过高时会导致PCR错配,从而使扩增出现非特异性扩增;浓度过低则会影响合成效率,甚至会因过早的消耗而使产物单链化,影响扩增效果[7]。图2结果显示:1、2泳道由于dNTPs的浓度较低,扩增出的条带较少;当浓度在0.25mmol/L时得到的条带较为清晰稳定。

2.2.5 Taq DNA聚合酶的含量

在PCR反应中,Taq DNA聚合酶是影响PCR扩增的一个重要因素。Taq DNA聚合酶的用量太多会产生非特异性扩增,而且增加试验成本。太少则使酶过早地消耗完,产物合成效率低。依照图2的扩增结果表明:4个Taq DNA聚合酶含量均能得到条带一致的扩增结果,但酶的用量为0.5U时,扩增出的条带较弱;而为1.0U～2.0U之间均可得到良好的扩增结果。从降低试验成本的角度,试验选择Taq DNA聚合酶的用量为1.0U。

根据上述5个因素对益智ISSR-PCR的影响,确定益智ISSR-PCR扩增的最优体系为:模板DNA 100ng,Mg2+ 3.0mmol/L,引物0.8μmol/L,dNTP 0.25mmol/L,Taq DNA聚合酶1.0U。

2.3 PCR退火温度的选择

PCR反应中,退火温度的高低直接影响到引物与模板DNA的特异性结合。一般较低的退火温度能保证引物与模板结合的稳定性。而在允许的范围内选择较高的退火温度则可减少引物与模板DNA之间的非特异性结合[9]。用以上所得的最佳体系进行梯度退火试验,在梯度PCR仪(Eppendorf)上自动生成12个温度,PCR产物进行电泳检测,图3结果表明,温度过低则特异性差,造成小片段缺失,且背景较深;图中1、2、3、4泳道,条带较多但缺失小片段。温度退火温度过高使引物与模板的结合性差,造成大片段的缺失,PCR产物条带数降低,且亮度较弱;8～12泳道缺失大片段。因此UBC807的最佳退火温度介于第6与第7个温度之间,确定为50℃。

1～12泳道温度:45.0℃、45.1℃、45.7℃、46.6℃、47.7℃、49.0℃、50.4℃、51.8℃、53.0℃、54.1℃、55.0℃、55.4℃。Temperature of Lane 1-12:45.0℃、45.1℃、45.7℃、46.6℃、47.7℃、49.0℃、50.4℃、51.8℃、53.0℃、54.1℃、55.0℃、55.4℃;M:100bp DNALadderMaker.

2.4 最优体系稳定性检测结果

随机选取ISSR引物UBC808和UBC880采用最优体系分别确定最佳退火温度后对部分益智材料进行PCR扩增,能够扩增出比较清晰的条带,且稳定性较好,说明该反应体系适合于益智ISSR-PCR反应。

3 讨论

影响ISSR扩增效果的因素包括Mg2+、dNTPs、模板DNA、引物浓度、Taq DNA聚合酶及退火温度等。谢运海等[10]认为个因素水平变化对PCR反应的影响最大的是Taq酶,而本试验同时采用单因素设计和正交设计两种方法进行ISSR体系优化,并综合2种方法所得结果,获得适合益智的ISSR-PCR最优反应体系。结果发现,在正交试验中Mg2+浓度对反应体系的影响最大,这与王彦华等[11]实验的结果相同。而在单因素试验中除模板DNA外,其余4个因素对反应体系均有显著影响。2种方法所得各因素的最佳水平不尽相同。这可能与PCR反应的不稳定性有关,也可能与正交试验采用的直观打分方法有关。

虽然单因素试验可直观地表现出各因素对反应体系的影响,但却易忽视各个因素间的交互作用;而利用正交设计虽能够较快地获得最优体系,但对于结果的判断存在一定的主观性,因此最佳体系的确定也缺乏可靠性。虽然有研究对正交试验结果进行方差分析[12],但由于打分仍是依靠主观判断,所以无法避免主观因素在一定程度上对试验结果分析的影响。此外,不同的试验条件,如不同厂家和不同批次的试验试剂,不同的试验仪器,不同的试验材料等,都可能对扩增结果产生影响[13]。因此,在新的试验条件下建立和优化PCR反应体系,综合考虑上述两种方法是值得参考的。

摘要：目的:获得适合的益智ISSR-PCR扩增反应体系。方法:利用正交设计L16(45)和单因素试验对益智ISSR-PCR反应体系的5因素(Taq酶,Mg2+,模板DNA,dNTPs,引物)在4个水平上进行优化试验,将二者所得结果进行综合比较分析。结果:最终获得益智ISSR-PCR反应的最优体系(20μl)为:模板DNA100ng,Mg2+3.0mmol/L,引物0.8μmol/L,dNTPs0.25mmol/L,TaqDNA聚合酶1.0U。最后,对益智ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火,得到最佳退火温度为50℃。结论:这一优化系统的建立为今后利用ISSR标记技术研究分析益智遗传多样性奠定基础。

PCR学习心得 篇5

班》心得

本人于2015年3月10至15日参加了广东省临检中心举办的临床基因扩增实验室技术人员上岗培训班。通过学习，除了取得广东省临检中心颁发的培训证书外，还极大的提高了理论和实验操作水平，现总结如下。

此次培训包括理论培训和实验操作。在理论培训课程当中，卫生部临床检验中心的李金明教授为我们详细讲解了《临床基因扩增实验室设计及质量管理体系的建立》、《临床基因扩增检验的质量保证》等内容。通过学习，了解到临床PCR实验室设计必须遵循各区独立、注意风向、因地制宜，方便工作的原则。质量管理的内涵：写你所做的，做你所写的，记录你已做的，分析你已做的。认识到临床标本的正确采集、运送、保存的重要性，是临床检验的质量保证的关键性环节，是解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一。同时通过病例分析，对于临床基因扩增检验的检验前，检验中，检验后的质量控制，还有实验的结果处理和分析有了重新认识。对于实验室是否出现污染的鉴别，以及出现污染的处理措施有了深刻了解。

临床实验医学的发展现在经历了三个时代，分别是生化诊断时代，免疫诊断时代，和和现在的分子（基因）诊断时代，而现今时代的标志性技术正是PCR技术，是反映疾病本质的实验。正是有临床基因扩增检验技术在癌症等疾病的诊断方面有了多方应用，通过驱动基因的选择，为靶向治疗患者延长了生存期。为个体化诊疗中对疾病的鉴别诊断，诊治方案的设定提供重要的参考依据，同时也为治疗过程中临床对于治疗方案的调整提供依据。临床基因扩增检验技术在个体化诊疗中是不可或缺的一部分，是其重要的组成部分，具有强大的发展潜力和前景。

实验操作内容为EGFR突变基因检测。实验操作过程中，通过认真学习和细致听讲带教老师的规范实验操作，了解到了实验的关键操作，纠正了平常在临床实际工作操作上的一些不良习惯，为日后规范检验操作提供了基础。通过分组亲自操做实验，分析和判断自己的实验结果，做实验记录笔记，基本掌握EGFR突变基因检测。

PCR优化 篇6

关键词:苹果;S基因;PCR体系优化

中图分类号:S661.1; Q503文献标识码:A DOI编码:10.3969/j.issn.1006-6500.2009.04.008

Optimized Study on PCR Amplification Procedure of the Apple Self-incompatibility Gene

CHEN Chao1,YU Bao-jie1,LI Bao-guo2

(1.Forestry Science Institute of Cangzhou,Cangzhou,Hebei 061001,China;2. Forestry College,Hebei Agricultural University,Baoding,Hebei071000,China)

Abstract:Through analyzing the effect of PCR system (DNA, Primer, Mg2+, dNTP, Taq polymerase, and buffer) and annealing temperature on amplification of apple self-incompatibility gene (s-gene), we constructed a optimized system of PCR amplification procedure which was fit for apple self-incompatibility gene. The result showed that the optimized content in 20 μL system contained 40 ng DNA template, 0.25 mmol/L dNTP, 0.4 μmol/L primer, 2.5 mmol/L Mg2+, 1 U Taq polymerase, 1×buffer, and the optimized annealing temperature was 50 ℃.

Key words: apple;s-gene;optimized PCR system

苹果自交不亲和是在长期的生物进化过程中形成的自我保护机制。但是,对苹果栽培生产却有很大影响。随着分子生物学技术的发展,查明苹果的自交不亲和是由S基因控制的[1]。利用PCR技术可以进行特异基因的扩增,但目前对苹果S基因PCR扩增的研究报道极少,采用常规的PCR反应体系难以获得较高浓度的产物,不能进行正常回收鉴定。因此,笔者对苹果S基因PCR扩增程序进行了优化研究。

1材料和方法

1.1材料

2004年5月上旬,于河北农业大学果树标本园采集富士苹果新梢顶端完全展开的第1~2片幼叶,液氮速冻后置于-70 ℃冰箱保存备用。

1.2方法

基因组DNA提取参照CTAB法[2],DNA质量和浓度的检测用萨姆布鲁克[3]的方法。引物按Shogo matsumoto[4]的设计合成,其上游引物为:5'-TTTACGCAGCAATATCAG-3',下游引物为:5'-ACGTTCGGCCAAATA/CATT-3',由宝生物工程(大连)有限公司合成。

PCR反应体系及热循环条件在Ishimizu T[5]的基础上进行优化试验。在20 μL PCR反应体系中,DNA模板含量设5,10,20,40,60,80 ng 6个浓度梯度;Mg2+浓度设1,1.5,2,2.5,3,3.5,4 mmol/L 7个浓度梯度;TaqDNA聚合酶设0.5,1,2.5,5,7,15 U 6个浓度梯度;dNTP浓度设0.1,0.15,0.2,0.25,0.3,0.4 mmol/L 6个浓度梯度;引物浓度分别设0.1,0.2,0.25,0.3,0.4,0.5 μmol/L 6个浓度梯度;buffer浓度设0.5×buffer、1×buffer、2×buffer、3×buffer、4×buffer、5×buffer 6个浓度梯度;退火温度设41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52 ℃共12个温度梯度。

2结果与分析

2.1不同DNA模板含量对苹果S基因的PCR扩增的影响

不同DNA模板含量对苹果S基因的PCR扩增结果如图1所示。由此表明,在DNA模板含量5～40 ng都得到了较好的扩增,说明DNA模板含量在此范围内对苹果S基因PCR扩增结果影响较小,5 ng即可满足扩增需要。随着模板含量的增加,扩增条带的亮度有所增强,以40 ng扩增效果最好,当DNA含量达到60～80 ng时扩增条带亮度变弱且宽度变小。因此认为,进行苹果S基因的PCR扩增时DNA模板含量以40 ng为宜。

2.2不同Mg2+浓度对苹果S基因的PCR扩增的影响不同Mg2+浓度条件下苹果S基因的PCR扩增结果如图2所示。由此表明,当Mg2+浓度为1.0 mmol/L时扩增条带少而且弱,随着浓度的增加,特异性结合增强,扩增条带越来越清晰;当浓度达到4 mmol/L时,特异性降低,出现一些非特异性条带,使扩增的条带变宽;Mg2+浓度在1.5～3.0 mmol/L之间均能获得清晰稳定的条带,以浓度在2.5 mmol/L最好。因此认为,进行苹果S基因的PCR扩增时Mg2+浓度以2.5 mmol/L为宜。

2.3不同dNTP浓度对苹果S基因的PCR扩增的影响

不同dNTP浓度对苹果S基因的PCR扩增结果如图3所示。由此表明,dNTP浓度从0.1～0.3 mmol/L均能扩增清晰的条带,以0.25 mmol/L时扩增条带最清晰,浓度达0.4 mmol/L时扩增条带变弱。因此认为,进行苹果S基因的PCR扩增时dNTP浓度以0.25 mmol/L为宜。

2.4不同引物浓度对苹果S基因的PCR扩增的影响

不同引物浓度对苹果S基因的PCR扩增结果如图4所示。由此表明,引物浓度为0.1 μmol/L时没有扩增产物,浓度为0.2～0.3 μmol/L时扩增条带不清晰,说明在引物浓度较低时,扩增产物效率低;在0.3～0.4 μmol/L时较好,以0.4 μmol/L最佳。因此认为,进行苹果S基因的PCR扩增时引物浓度以0.4 μmol/L为宜。

2.5不同Taq聚合酶浓度对苹果S基因的PCR扩增的影响

不同Taq聚合酶浓度对苹果S基因的PCR扩增结果如图5所示。由此表明, Taq聚合酶浓度在0.5～1 U时,能够得到条带清晰、特异性强的扩增产物,以1 U时最佳;在0.25～15 U时,有一些非特异性条带得到了扩增。因此认为,进行苹果S基因的PCR扩增时Taq聚合酶浓度以1 U为宜。

2.6不同buffer浓度对苹果S基因的PCR扩增的影响

不同buffer浓度对苹果S基因的PCR扩增结果如图6所示。由此表明,当buffer浓度为0.5×buffer、1×buffer、2×buffer时,能够得到特异性强而且清晰的条带。以后随着buffer浓度的增加, PCR扩增产率降低。1×buffer时条带清晰,特异性好。因此认为,进行苹果S基因的PCR扩增时buffer浓度以1×buffer为宜。

2.7不同退火温度对苹果S基因的PCR扩增的影响

不同退火温度对苹果S基因的PCR扩增结果如图7所示。由此表明,温度在47 ℃以下时扩增条带轮廓不清且出现非特异性条带;在48～50 ℃之间时出现了鲜明的谱带,且特异性很强;在51 ℃以上时,得不到扩增产物。试验结果说明,退火温度太低,有条带模糊不清或扩增效率下降的趋势;而退火温度太高,几乎看不到扩增产物。可见,只有在温度允许的范围内,适当提高退火温度,可以提高PCR反应的特异性,使扩增条带清晰。因此认为,进行苹果S基因的PCR扩增时退火温度以50 ℃为宜。

3结论与讨论

本试验结果表明,苹果S基因PCR最优化反应体系为:总体积20 μL时,DNA模板含量为40 ng,Mg2+浓度为2.5 mmol/L,引物浓度为0.4 μmol/L, dNTP浓度为0.25 mmol/L,Taq聚合酶浓度为1 U,buffer浓度为:1×buffer,退火温度为50 ℃。

PCR对DNA质量要求不高[6],当DNA模板含量在5～40 ng范围内均扩增出清晰条带,说明苹果DNA模板含量在此范围内不会影响苹果S基因的PCR扩增结果。但当DNA含量超出此范围以后,随着DNA含量的提高,扩增条带不清晰。因为,当DNA含量超过60 ng以后,由于引物浓度相对较少,在PCR反应过程中高浓度的DNA对引物有竞争作用,可能对引物有一定的分散效应,使扩增产率降低。

参考文献:

[1] Kobel F,Steinegger P,Anliker J. Wertere untersuchungen uber die befruchung sverhaftnisse der apfel und birnsorien[J].Landw Jbschweiz,1939,53:160-191.

[2] 顾红雅.植物分子生物学实验手册[M].北京:高等教育出版社,1998:3-12.

[3]萨姆布鲁克 J,拉塞尔D W.分子克隆实验指南[M].北京:科学出版社,2002:387-400.

[4] Matsumoto S, Kitahara K. Discovery of a new self-incompatibility allele in apple[J]. HortScience,2000,35(7):1329-1332.

[5] Ishimizu T, Inoue K, Shimonaka M, et al. PCR-based method for identifying the S-genotypes of Japanese pear cultivars[J]. Theor Appl Genet,1999(98):961-967.

PCR优化 篇7

1 材料与方法

1.1 材料

供试的3个刺梨品种均来自贵州大学, 为贵农7号、贵农5号、贵农2号。

1.2 方法

1.2.1 PCR扩增及检测

初始反应体系:20μL反应体系中含10×buffer2.0μL, 0.15 mmol/L dNTPs, 1.25μmol/L引物, 2.0mmol/L MgC12, 20 ng模板DNA, 1.0 U Taq聚合酶, 以双蒸水补足体系至20μL。扩增程序为:94℃预变性5 min, 94℃变性1 min, 50℃退火温度45 s, 72℃延伸1 min, 34个循环, 72℃延伸6 min, 4℃保存。PCR扩增反应结束后, 每管加溴酚蓝1μL, 离心混匀后, 取6μL用1.5%的琼脂糖凝胶 (100 mL含5 mL Goldview) 电泳检测, 电压不超过5 V/cm, 电泳结束后用FR-980生物电泳图像分析系统观测并照相, 最终选用刺梨贵农2号和引物845 (W18450) 构建优化体系。

1.2.2 ISSR反应条件优化

反应体系总体积为20μL。根据ISSR反应各影响因素间的关系将Mg 2+、Taq DNA聚合酶, 分为一组;引物、模板DNA的浓度, 分为一组;dNTPs单独为一组, 各反应参数变化量见表1。

(1) ISSR影响因素设计组合。Mg 2+与Taq DNA聚合酶, 两因素正交共20个样, d NTPs 0.15 mmol/L, Primer 1.25μmol/L, 10×buffer 2.0μL, 模板DNA 20 ng。引物与模板D N A两因素正交共2 0个样, d N T P s0.15 mmol/L, Mg2+2.0 mmol/L, Taq DNA聚合酶1.0 U, 10×buffer 2μL。dNTPs8个浓度梯度, Primer1.25μmol/L, 10×buffer 2μL, 模板DNA 20 ng, Mg2+2.0 mmol/L, Taq DNA聚合酶1.0 U。利用梯度P C R对退火温度进行优化, 设定1 2个退火温度, 20μL反应体系中含10×buffer 2.0μL, Mg2+1.875 mmol/L, Taq DNA聚合酶1.0 U, dNTPs 0.1 mmol/L, Primer 2.0μmol/L, 模板DNA 20 ng。

(2) 反应体系稳定性检测。选取6条多态性好的引物对3个刺梨品种进行PCR扩增, 检测反应体系的稳定性。

2 结果与分析

2.1 ISSR反应体系的优化

2.1.1 Mg 2+浓度和Taq DNA聚合酶对ISSR扩增的影响

从图1看出, 当Mg2+浓度为0.625 mmol/L时, 大分子量的条带出现缺失现象, 扩增不稳定;当浓度为1.25～2.50 mmol/L时, 扩增带型稳定一致, 扩增的条带比较清晰背景浅;浓度为3.75 mmol/L时, 扩增条带呈弥散趋势, 背景加深有非特异性产物产生。因此以Mg2+1.875 mmol/L浓度为最佳浓度。而Taq酶用量为0.15～6.0 U时, 均有扩增产物出现;浓度为0.15～0.25 U时, 扩增产物少带;浓度为1.0～1.5 U时Taq酶扩增的条带比较稳定一致, 选用1.0 U的Taq聚合酶为最佳用量。

2.1.2 模板DNA浓度对ISSR扩增的影响

从图2看出, 在一定范围内模板D N A含量影响不大, 均能扩增出条带。当模板浓度为2～10 ng时, 弱带杂带多;模板浓度在50 ng以上时, 强带更强, 弱带不稳定。因此适合刺梨ISSR分析的DNA模板浓度为20～30 ng, 本试验选用20 ng。

2.1.3 引物浓度对ISSR扩增的影响

从图2可知, 当引物浓度为0.125～1.25μmol/L时, 扩增的条带比较少, 弱带不能扩增出来。当浓度为2.50～3.75μmol/L, 强带不清楚, 从稳定性和扩增条带的强度来看, 浓度为1.25～2.50μmol/L时, 能扩增出比其它更清晰稳定的条带, 因此把2.0μmol/L时为最佳浓度。

2.1.4 dNTPs浓度对ISSR扩增的影响

本试验设置了8个dNTPs浓度梯度, 当dNTPs浓度为0.025～0.05 mmol/L时, 扩增的条带少而模糊, 在浓度为0.10～0.30 mmol/L时, 条带清晰度高, 亮度大, 条带稳定, 当浓度为0.35 mmol/L时, 扩增条带数目少, 亮度弱 (见图3) 。从节省成本角度选择dNTPs的最适浓度为0.10 mmol/L。

2.2 退火温度对ISSR的影响

退火温度明显影响扩增条带式样。从筛选引物中选6条引物进行退火温度的测定 (表1) 。当退火温度为40.0～45.0℃扩增条带少且弱;而在45.0～50.7℃, 扩增条带数增多, 条带亮度增亮, 背景加深;在56.0～30.6℃时条带逐渐变得模糊, 不清楚, 亮度减弱, 部分条带不能扩增出来。如图4, 为引物848退火温度筛选图像。因此, 综合6条引物的最佳退火温度选定最适合刺梨ISSR-PCR的退火温度为48.0℃。

2.3 I S S R-P C R反应体系及反应参数的稳定性检测

利用优化的ISSR反应体系, 以845、842、841、840、834、727、826等六条引物, 退火温度为48℃, 对贵农7号, 贵农5号, 贵农2号3个刺梨品种进行扩增, 结果如图5所示, 能扩增出清晰、重复性好的条带。

3 讨论

Taq DNA聚合酶是Mg 2+依赖性酶, 对Mg 2+浓度非常敏感, 选择合适的Mg 2+浓度, 对PCR反应至关重要, 通过试验表明Mg 2+浓度过低, 不能有效的进行P C R扩增, Mg 2+浓度过高, 则电泳背景加深, 出现非特异性扩增。模板D N A的含量也是制约扩增产物得率及特异性的一个重要因子。模板含量过低, 分子碰撞的几率低, 偶然性大, 扩增产物无或不稳定, 模板含量过高, 又会相应增加非特异性产物的扩增, 导致电泳背景加深, 不利于读带, 可能使引物或dNTP过早被耗尽, 出现扩增结果不稳定的假象[3]。本试验表明, 模板的浓度在20～30 ng/20μL时, 条带比较清晰。引物浓度太低, 导致扩增产物减少, 甚至不能通过电泳检测出;浓度太高, 则容易形成引物二聚体, 或者导敛非特异性扩增[4], 严重影响实验结果。底物dNTPs浓度过低, 会影响合成效率, 甚至会因dNTPs过早消耗而使产物单链化, 影响扩增结果, 过高, 会导致非特异性扩增, 当dNTPs浓度高于50 mmol/L还会抑制Taq DNA聚合酶的活性。

退火温度明显影响扩增谱带式样。引物长度不同, 退火温度就不同, 而且同一引物对于不同材料的退火温度也不同。较低的退火温度能保证引物与模板结合的稳定性, 但也会引起引物与模板产生错配, 产生非特异性条带;退火温度过高则会抑制引物与模板的结合[5]。对于ISSR引物的退火温度, 一般根据引物的Tm值浮动1～3℃。

参考文献

[1]文晓鹏, 邓秀新, 樊卫国.刺梨主要基因型的RAPD鉴别[J].山地农业生物学报, 2003, 22 (4) :317.

[2]马翠兰, 刘星释, 张玉兰.DNA分子标记技术在果树上的应用[J].内蒙古农业大学学报, 2001, 22 (2) :105—112.

[3]桂腾琴, 乔爱民, 孙敏, 等.果梅ISSR-PCR反应体系的建立和优化[J].西南大学学报, 2007, 29 (10) :125—126.

[4]何桥, 梁国鲁, 谢江辉.莲雾ISSR反应体系的优化与应用[J].果树学报, 2005, 22 (2) :186—189.

PCR优化 篇8

太行菊 (Opisthopapus taihangensis (Ling) Shih) 是菊科太行菊属的多年生宿根草本植物, 是我国太行山区特有珍稀物种, 多生于海拔1 000 m左右的山坡上以及悬崖峭壁的石缝中, 仅见于豫、晋、冀三省交界的太行山区。由于太行菊分布范围狭窄, 生态环境独特, 繁殖能力较弱, 加上人为采摘严重, 已处于濒危状态, 已被国家列入第二批珍稀濒危保护植物。太行菊耐旱、耐荫、耐寒, 是一种宝贵的野生资源, 具有很高的观赏价值和经济价值。

ISSR (inter-simple sequence repeat) 是加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewicz Ewa等[1]于1994年发展起来的一种微卫星 (SSR) 基础上的分子标记技术, 具有操作简便, 重复性高, 稳定性好、多态性丰富等特点。它利用真核生物基因组中广泛存在SSR的特点, 在SSR的3’或5’端锚定1~4个碱基作引物, 导致位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的一段序列进行扩增。自ISSR技术发明以来已广泛应用在遗传多样性分析、基因定位、遗传图谱构建等方面[2,3,4,5,6]。目前, 还未见到利用均匀设计优化太行菊ISSR-PCR反应体系的报道。本研究将利用均匀设计的试验方法, 建立并优化适合太行菊DNA的ISSR-PCR反应体系, 以期为进行太行菊的遗传多样性分析和遗传图谱构建提供可靠的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

供试材料采自河南省辉县市宝泉水库。

1.1.2 试剂

2×Taq Master Mix (含有Taq DNA Polymerase, 2×Taq PCR Buffer, 3mmol/L Mg Cl2和400μmol/L d NTP mix) 购自北京康为世纪生物科技有限公司, ISSR引物参照加拿大哥伦比亚大学 (UBC) 公布的ISSR引物序列, 由金唯智生物科技 (北京) 有限公司合成。

1.1.3 仪器

BIOFUGE PRIMO R型冷冻离心机;NANODROP 1000紫外分光光度计;9700型PCR仪;G:BOX-HR凝胶成像系统。

1.2 太行菊基因组总DNA的提取

采用改良CTAB法[7]。

1.3 ISSR反应体系的优化

试验采用两轮均匀设计进行优化。每轮优化针对的因素均为模板DNA (浓度为20ng/μL) , 引物 (浓度为30mmol/μL) 和2×Taq Master Mix。在第一轮优化中2×Taq Master Mix设4个水平, 其他两个因素设6个水平, 选用U12 (62×4) 均匀设计表 (表1) 。以第一轮结果为基础进行第二轮优化 (表2) 。以采自河南省辉县市宝泉水库的太行菊为模板, 选用UBC 813引物 (引物序列为: (CT) 8T) 。扩增体系为10μL, 每轮优化中DNA, 引物和2×Taq Master Mix的用量按表1和表2添加, 不足部分用RNase-Free water补齐。扩增程序:94℃, 5min;94℃, 1min, 50℃, 1min, 72℃, 1.5min, 40个循环;72℃, 10min。4℃保存。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果。

1.4 ISSR-PCR优化体系的验证和确立

根据上述均匀设计优化的太行菊的反应体系, 利用引物UBC807 (引物序列为: (AG) 8T) 对10株太行菊进行验证, 进一步确定最优的太行菊ISSR-PCR扩增体系。

2 结果与分析

2.1 ISSR-PCR反应体系的优化

通过两轮均匀设计优化ISSR-PCR反应体系。第一轮均匀设计ISSR-PCR反应体系的扩增结果如图1。结果显示, 除1号、4号、5号和9号扩增出3条清晰的条带外, 其余均有4条清晰条带, 尤以8号和12号组合扩增条带更为清晰。考虑到8号组合的引物和2×Taq Master Mix的用量较多, 因此, 以12号组合为最佳, 即DNA1.5μL, 引物0.8μL, 2×Taq Master Mix 4.8μL。以此为基础进行第二轮均匀设计, 各组合配比见表2, 扩增结果见图2。从图2可以看出, 12个组合均扩增出4条带, 其中1号、5号、6号和7号组合条带较清晰。综合考虑DNA、引物和2×Taq Master Mix的用量, 以6号组合各成分用量较为经济, 因此, 确定6号组合为最佳组合, 即在10μL反应体系中, DNA 1.2μL, 引物0.8μL, 2×Taq Master Mix 4.6μL。

根据上述ISSR-PCR反应体系的优化试验结果, 确立本试验ISSR-PCR反应体系为:反应体积10μL, DNA1.2μL, 引物0.8μL, 2×Taq Master Mix4.6μL;扩增程序为:94℃、5min;94℃、1min, 50℃、1min, 72℃、1.5min, 40个循环;72℃、10min。4℃保存。

2.2 ISSR-PCR反应体系的稳定性验证

根据上述试验结果确立的ISSR-PCR反应体系和扩增程序, 利用引物UBC807 (引物序列为: (AG) 8T) 对采自河南省辉县市宝泉水库的10株太行菊进行验证性试验 (图3) 。从图3可以看出, 10株太行菊均被扩增出清晰条带, 证实上述优化结果的稳定性较好。

M:Marker;1~12:不同反应体系处理号, 见表1。M:Marker;1-12:12 reaction system treatment listed in Table 1.

M:Marker;1~12:不同反应体系处理号, 见表2。M:Marker;1-12:12 reaction system treatment listed in Table 2.

M:Marker;1~10:采自辉县市宝泉水库的10株太行菊。M:Marker;1-10:10 Opisthopappus taihangensis of Baoquan reservoir in Huixian city.

3 讨论

在以往的研究中, PCR反应体系可以采用单因素优化和正交优化。近年来, 均匀设计已越来越多地应用在PCR反应体系优化研究中[8,9,10,11,12,13,14,15]。均匀设计的最大特点是充分考虑试验点在试验范围内的“均衡分散”性[16], 既避免了单因素优化的繁琐过程, 又能象正交试验设计那样反映出各因子不同水平间的交互作用。在均匀设计中, 当因素的水平数增加时, 试验数随水平数的增加而增加, 但并非像正交设计那样按其水平数平方增加, 这样使其试验次数大大减少。

ISSR-PCR反应的扩增受反应体系中Taq DNA聚合酶、Mg2+、d NTPs、模板DNA和引物等多种因素不同程度的影响。每种成分用量的过高或过低均影响PCR扩增的特异性和精确性, 特别是反应体系中Taq DNA聚合酶、Mg2+、d NTPs三者用量的影响更为显著, 因此必须通过优化反应以确定各成分的最佳用量来保证PCR反应的顺利进行。

在本试验中, ISSR-PCR扩增采用了试剂2×Taq Master Mix, 它含有Taq DNA Polymerase、2×Taq PCR Buffer、3mmol/L Mg Cl2和400μmol/L d NTP mix, 具有操作简便快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好的优点, 可最大限度地减少人为误差和污染。因此, 在PCR优化反应中不再单独考虑Taq DNA Polymerase, Mg Cl2和d NTP等各单因子的影响, 有效地减少了试验数。而且试剂公司提供了2×Taq Master Mix的参考用量, 因此, 在第一轮均匀设计中, 除DNA和引物设置6个水平数外, 2×Taq Master Mix设置4个水平, 选用U12 (62×4) 混合均匀设计表[17], 使试验次数进一步减少。

4 结论

本试验通过两轮均匀设计, 确定了10μL反应体系中各成分的最佳用量为:DNA 1.2μL, 引物0.8μL, 2×Taq Master Mix4.6μL。扩增程序为:扩增程序:94℃, 5min;94℃, 1min, 50℃, 1min, 72℃, 1.5min, 40个循环;72℃, 10min。4℃保存。利用该反应体系已对不同居群的太行菊遗传多样性进行了初步分析, 证实该反应体系稳定可靠。

摘要：目的:优化太行菊ISSR-PCR反应体系, 为利用ISSR标记进行太行菊遗传多样性研究服务。方法:采用均匀设计法优化太行菊ISSR-PCR反应体系。结果:在10μL ISSR-PCR反应体系中, 模板DNA 1.2μL;引物0.8μL;2×Taq MasterMix 4.6μL。反应程序为94℃预变性5min;94℃变性1min, 50℃退火1min, 72℃延伸1.5min, 40个循环;72℃延伸10min。结论:此反应条件适合于太行菊的ISSR-PCR反应体系, 为利用ISSR标记技术研究太行菊遗传多样性奠定了基础。

PCR优化 篇9

1 SSR-PCR反应体系建立的方法

SSR-PCR反应体系所含组分较多,各组分均可能对扩增反应的敏感性、特异性和产量产生影响[8]。因此,SSR-PCR是一个多因素影响的综合反应,如反应体系中的Mg2+、引物、d NTPs、Taq DNA聚合酶、模板DNA等[10,11],在确定因素和水平时,多以反应体系中的5个因素即Taq酶、Mg2+、模板DNA、d NTP和引物作为优化的对象,每个因素确定的试验水平以参考PCR标准反应体系或参照近缘种的结果为主。

单因素设计试验即当一种成分进行浓度梯度时,固定其它组分,逐步进行每一因素的研究[6];完全随机设计试验或分组完全随机设计试验即对各个参试因素的完全组合,考虑所有的交互作用[12];正交设计试验即利用正交的均衡分散、综合可比及可伸缩、效应明确等特性[13,14]进行试验,可考虑交互或不考虑交互;正交与单因素的综合试验设计,其中有的是先在正交试验设计的基础上,确定主要因素和各因素的大概范围,然后再进行单因素试验[9],有的是正交试验和单因素试验同步进行(各因素和水平均相同)[8,15],有的是正交考虑一部分因素,单因素再考虑另外一部分因素[16]。

2 SSR-PCR反应的应用及其新进展

2.1 SSR-PCR反应优化体系在遗传多样性评价中的应用

SSR-PCR反应优化体系在遗传多样性评价中研究较多,反应体系的建立与优化常常根据多样性研究的目的,以条带的多少和强弱进行判读。张冬梅等[12]在标准PCR反应体系的基础上,对反应中的模板DNA、d NTP、Taq DNA聚合酶、引物和Mg2+用量用分组完全随机设计试验的方法进行体系的建立与优化,先将5个主要因素分3个组合:第1个组合中设立5个引物浓度各对应4个模板DNA浓度,第2个组合设立5个Mg2+浓度各对应4个Taq DNA聚合酶的浓度,第3个组合设8个不同d NTP浓度梯度,共进行48个处理,对扩增产物经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,银染,拍照,直观判断。对各个组合好的处理进行综合,确定15μl反应体系,用筛选出的引物对油松种子园内的49个无性系进行多态性检测,扩增反应表明,都能得到清晰、多态性明显的谱带。王士磊等[17]对模板DNA、d NTP、引物和Taq DNA聚合酶4因素4水平,应用L16(45)正交试验设计表,对扩增产物进行直观分析,获得最佳处理体系,获得反应总体系为10μl的反应体系,对玉米重组近交系的两亲本进行多态性筛选,扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳检测显示均可扩增出非常理想的条带,完全适合SSR分子标记试验的要求。冯富娟等[15]采用L16(45)正交设计,对反应体系中的5个因素进行16个处理的扩增,对扩增结果按条带数量丰富度和清晰度进行打分,并对结果进行统计分析,找出对扩增结果因子的影响大小,并从各因素中得分高的选出获得最佳组合体系,在此基础上对5个因素进一步开展单因子试验,确定了红松最佳的SSR反应扩增体系,用该体系对红松无性系种子园的19个优良单体的DNA进行了扩增,在此反应体系下,所扩增谱带清晰、稳定、多态性高。

2.2 SSR-PCR反应优化体系在种质鉴定中的应用

利用SSR分子标记的方法进行种质资源鉴定在育种工作中开展较多,郭海林等[16]采用10μl反应体系,采用正交设计L9(34)对Mg2+、d NTP、引物及Taq DNA聚合酶用量进行4因素3水平试验,通过直观分析,获得最佳处理体系,在此基础上,设置模板用量8个水平的单因素试验,获得5个因素的优化体系,利用反应体系对10份结缕草属种质材料进行鉴定,以Xgwm459-6A、Xgwm149-4B和Xg-wm135-1A等3对引物进行分析,所获得的反应体系具有较好稳定性和可重复性,能有效地对结缕草属不同种源及品种进行SSR扩增,可用于种质资源鉴定等研究。

2.3 SSR-PCR反应优化体系在功能标记中的应用

通过正交和单因素试验获得的优化体系,包括结缕草属5个种1个变种的49份种源进行扩增,结果对抗寒性两极端类型和青绿期两极端类型材料找到与抗寒性或青绿期相关的分子标记,结果表明其中的两对引物可在抗寒性弱的部分材料和青绿期长的部分材料中扩增出另一极端类型材料没有的条带,从而初步认为这两标记与植物的寒性和青绿期有关[16]。

2.4 SSR-PCR反应优化体系在引物可转移性中的应用

SSR引物的通用性在近缘种间得到广泛应用,尤卫艳等[6]在20μl体系中,分别对Mg2+、d NTP、Taq DNA聚合酶、引物和模板DNA用量5个因素设置5~6个不同的浓度梯度,分别进行单因素试验,获得最佳组合体系。利用该体系随机选取3对引物进行PCR扩增产物,产物在8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳检测,对多态性片段进行割胶、检测、回收、克隆、测序等,对测定序列与原物种序列进行比对,相似度都在95%以上,说明利用该反应体系可进行引物的可转移性即通用性的研究,并利用光皮桦16个植株的DNA进行扩增,得到较好的扩增结果。

3 问题和措施

SSR-PCR反应体系的获得常以单因素、完全试验或正交试验。通过单因素获得的SSR-PCR反应体系,这种方法简便易行;但需进行多次的单因素梯度试验,这样不仅未考虑各因素间的交互作用,而且各因素的最好水平组合后的不一定是最佳扩增效果的反应体系。完全试验能考虑所有可能的组合方式,并涉及试验中各因子的相互作用,其结果利于分析,也便于筛选出适于扩增的反应体系,且最终筛选出来的体系也比较稳定;但工作量较大,试验组合数较多,比较费时费力,而且容易因试验组合数的增加而导致试验的混淆。采用多因素的正交设计试验,利用正交表的均衡分散性和整齐可比性[8,9,14],在减少试验规模的同时又不损失信息,能快速找到最优的组合,同时可分析不同因素对试验结果的影响程度[13,14],是确定PCR最适条件的有效方法;但对于结果的判断存在一定的主观性,因此最佳体系的确定也缺乏可靠性[11],且较多的研究未考虑交互作用,而PCR反应体系中各因素的相互作用又是存在的,如Taq DNA聚合酶是一种Mg2+依赖性酶,而d NTP分子中的磷酸基团与Mg2+结合会使反应中Mg2+浓度的下降而降低聚合酶的活性[17],但过多的考虑交互又使试验变得很复杂[18]。因此,在一次正交试验中不可能考虑全部因素,可以先通过正交试验找出主次、先后矛盾,再进一步开展单因子试验,可分批进行[8],从而更准确地筛选出最佳反应体系。

扩增产物的判断常以直观分析或直观评分进行,通过直观的电泳图谱进行定性或评分法对各处理体系进行筛选比较简便快捷,获得较好的效果,并得到好的应用[9,15,20],但存在着对试验结果本身的评价带有主观成分,未对结果进行深入分析,也未探讨各因素对反应的影响程度以及各因素各水平对反应结果影响的内在规律性,所得到的体系稳定性有待进一步验证。因此,对SSR-PCR反应体系的筛选评价时,可通过研究的目的,对扩增的片段及其数量进行量化和分析[19]。

4 展望

随着分子生物学的飞速发展,分子标记的应用越来越方泛,其中SSR标记的应用也越来越受重视。在重视反应体系建立的同时,还要注重SSR引物的开发,虽然实践表明近缘物种间甚至同科不同属间的SSR引物可部分通用,然而,从长远来看,通过构建本物种基因组DNA文库,才可从中筛选出足够的SSR位点以用于种质资源多样性和基因分子标记的研究。目前应体系中无本物种引物情况下主要以近缘种为主,在引物选用中重点要摸索退火温度,采用近缘种的引物,由于SSR两侧序列的保守性,对扩增出来的产物进行测序比较,以分析引物的通用性,最后利用所筛选的最佳体系和退火温度可利用多个模板进行验证,从而能更好地用于遗传研究中。另外,小体积反应体系越来越多,可节约成本,但如何减少误差也需要进一步探讨。

摘要：SSR标记是基于PCR基础上的一种分子标记,其扩增效果直接影响到SSR分析,近年来从不同方面对SSR-PCR反应体系的建立与优化进行了大量的研究。该文简要介绍SSR-PCR扩增反应体系建立的方法,综述SSR-PCR扩增反应的应用及其近展,并对存在的问题进行探讨,对今后的发展进行展望,以期为从事该方面的研究奠定基础。

PCR优化 篇10

ISSR (Inter Simple Sequence Repeat), 简单重复序列区间DNA标记技术,由Zietkoewicz等[1]于1994年在微卫星(Simple Sequence Repeat SSR)序列的基础上创建的,该标记与RAPD标记一样,均为显性标记,但结合了SSR和RAPD标记的优点,模板需要量更少、多态性丰富、操作简单、稳定性高且成本较低。近年来,ISSR已广泛用于遗传多样性分析[2,3]、种质资源鉴定[4,5]及遗传图谱构建[6,7]等方面。

ISSR是基于PCR的一种分子标记技术 ,d NTP、Mg2+、引物、模板DNA、Taq酶等浓度影响其扩增结果,为保证实验结果清晰、可靠、稳定和准确,对ISSR反应体系进行优化必不可少。本研究采用单因素实验法对 影响南酸 枣ISSR反应体系 的5个因素(d NTP、Mg2+、引物、模板DNA、Taq酶)进行优化,建立ISSR最适反应体系, 以期为南酸枣种质遗传多样性分析等方面的分子研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1实验材料

植物材料来自南酸枣嫁接种质资源圃,于春季采集嫩叶后置于变色硅胶中干燥保存。反应体系优化以江西广丰南酸枣(53号)基因组DNA为模板完成。

ISSR引物根据加拿大哥伦比亚大学公布的序列设计,由上海生物工程有限公司合成;PCR反应所用Taq酶、10×buffer、d NTP及Mg2+等药品购于大连宝生物公司,植物DNA提取试剂盒购于TIANGEN公司,100bp PlusⅡDNA Ladder购自北京全式生物技术有限公司,其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1南酸枣基因组DNA提取。基因组DNA提取采用TIANGEN公司的Plant Genomic DNA Kit试剂盒提取,用超微量分光光度计(日本岛津)测定DNA浓度和纯度,并经1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量,最后稀释至50 ng/μL,-20℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增。反应体系为20μL, 反应条件为94℃预变性5 min,94℃变性30 s,51℃退火45 s,72℃延伸1.5 min, 40个循环 , 最后72℃延伸5min,12℃forever。PCR反应在eppendorf公司的Mastercycler gradient PCR仪上进行。

1.2.3 ISSR反应体系优化。采用单因子实验方法 ,5个因子(包括引物、d NTP、Taq酶、Mg2+、模板DNA)分别设置5个水平进行筛选(表1),以江西广丰南酸枣基因组DNA为模板进行PCR扩增,每个因素水平重复3次。

1.2.4最佳退火温度的确定。设置不同梯度的退火温度,分别为49.0、50.1、51.2、52.2、53.0℃,确定最佳退火温度。

1.2.5 ISSR-PCR反应体系 稳定性检 测。以53号DNA为模板 ,利用优化好的PCR反应体系对合成的85条引物进行扩增 ,1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果,筛选可用引物;随机挑选扩增效果较好的引物842对不同南酸枣模板进行扩增 , 进一步检测ISSR反应体系的稳定性。

2 结果与分析

2.1 南酸枣基因组 DNA 提取效果

采用DNA提取试剂盒提取南酸枣叶片总DNA,提取结果见图1,由图1可以看出,试剂盒提取南酸枣基因组DNA效果好,无降解、无杂带、无拖尾现象,且纯度高、质量好,可以直接用作PCR模板。

2.2 单因子实验 SSR 反应体系优化

2.2.1 Mg2+浓度对ISSR扩增的影响。Mg2+是PCR反应中不可缺少的一种二价阳离子, 是影响PCR反应效率的重要因素, 通常认为Mg2+的适宜浓度范围为1.5~2.5 mmol/L。依据Mg2+浓度适宜范围,我们设置6个梯度探索Mg2+的最佳浓度。结果显示(图2),Mg2+在较低浓度(1.0 mmol/L)下无扩增产物,1.5 mmol/L浓度下仅扩增出一条目的条带,2.0 mmol/L浓度下扩增出较多目的条带, 但大多不清晰,2.5和3.0 mmol/L浓度下扩增条带清晰,多态性好,但前者对低分子量条带的分辨率更加清楚,后者虽然对中等和高等分子量条带扩增也较清楚, 但低分子量区背景弥散 ,条带模糊难 辨 , 故确定最 佳的Mg2+浓度为2.5mmol/L。

注:M: 100bp Plus Ⅱ DNA Ladder,1~5 浓度:1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/LFig. 2 Effect of Mg2+concentration on ISSR amplificationNote: M: 100bp Plus Ⅱ DNA Ladder, 1~5 concentration:1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L

2.2.2 d NTP 浓度对 ISSR-PCR 扩增的影响

d NTP是PCR扩增的原料 , 其浓度大小与ISSR谱带数量及强弱密切相关,若浓度过低会导致扩增条带产率低,浓度过高又会产生错误渗入[8]。本实验依据ISSR反应常用的d NTP浓度, 上下浮动设置5个梯度,结果见图3。由图3可以看出,当d NTP浓度小于0.2 mmol/L时,ISSR-PCR扩增条带较清晰, 特别是d NTP浓度为0.2 mmol/L时扩增条带中的低分子量条带明显比浓度为0.1 mmol/L和0.15 mmol/L时清晰;当d NTP浓度继续增大,ISSR-PCR扩增条带则变弱且条带数目变少,即多态性降低,故从目的条带亮度和条带数目综合考虑,d NTP浓度以0.2 mmol/L为最佳。

注:M: 100bp Plus Ⅱ DNA Ladder,1~5 浓度: 0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mmol/LFig. 3 Effect of d NTP concentration on ISSR amplificationNote: M: 100bp Plus Ⅱ DNA Ladder, 1~5 concentration:0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mmol/L

2.2.3 引物浓度对 ISSR 扩增的影响

引物浓度是决定PCR扩增效果的重要因素,浓度过低导致扩增效果低,浓度过高则会引起错配和非特异性扩增。本实验对引物浓度设置5个梯度,比较引物浓度对ISSR-PCR扩增效果的影响,电泳结果见图4, 当引物浓度为0.25~0.5μmol/L时,ISSR-PCR扩增条带较好,且较清晰,浓度偏低,扩增目的条带减少,浓度偏高则增加非特异扩增条带数,且原有高分子量的条带变淡,故ISSR-PCR扩增最适引物浓度在0.25~0.5μmol/L。

注:M: 100bp Plus Ⅱ DNA Ladder,1~5 引物浓度:0.1、0.25、0.5、0.75、1.0 mol/LFig. 4 Effect of primer concentration on ISSR amplificationNote: M: 100bp Plus Ⅱ DNA Ladder, 1~5 primer concentration:0.1、0.25、0.5、0.75、1.0 mol/L

2.2.4 DNA模板用量对ISSR扩增的影响。DNA模板是PCR扩增的基础, 其用量的多少直接影响到扩增产物的效率, 用量过少则扩增不稳定或无法扩增,而用量过多又会出现非特异性扩增,为了得到最佳模板浓度,本研究参考以往模板用量的研究结果,设置5个DNA用量梯度, 分别为20、30、40、50和60 ng,扩增结果见图5。图5表明,模板用量为20和30 ng时,扩增效果均较好,且没有明显差异,随着模板用量的增加,扩增条带逐渐清晰度变低,且在DNA模板用量为60 ng时,仅扩增出一条目的条带。因此,从扩增效果及节约模板成本考虑,模板用量以20 ng为最佳。

注:M: 100bp Plus Ⅱ DNA Ladder,1~5 DNA 用量:20、30、40、50、60 ngFig. 5 Effect of DNA content on ISSR amplificationNote: M: 100bp Plus Ⅱ DNA Ladder, 1~5 DNA content: 20、30、40、50、60 ng

2.2.5 Taq聚合酶用量对ISSR扩增的影响。Taq聚合酶用量也是ISSR-PCR扩增效果的重要影响因素,用量过多不仅会增加实验成本,而且还容易产生非特异性扩增产物,故最为理想的Taq聚合酶用量是以较少的量扩增出最好的效果, 为此, 本研究设置了5个Taq聚合酶用量梯度,扩增结果见图6,当Taq聚合酶用量较低 (0.25 U) 时,ISSR-PCR扩增效率较低,当Taq聚合酶用量为0.5 U时,扩增效果最好,多态性好且条带较为清晰,随着Taq聚合酶用量的增多则出现非特异性扩增,且有弥散出现,因此,Taq聚合酶最佳用量为0.5 U。

注:M: 100bp Plus Ⅱ DNA Ladder,1~5 Taq 聚合酶用量:0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 UFig. 6 Effect of Taq DNA polymerase on ISSR amplificationNote: M: 100bp Plus Ⅱ DNA Ladder, 1~5 Taq DNA polymerasecontent:0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 U

2.3 退火温度对 ISSR 扩增效果的影响

在PCR反应中, 退火温度的高低直接影响到引物与模板DNA的特异性结合, 较低的退火温度可以保证引物与模板结合的稳定性,而在适当范围内提高退火温度则可以减少引物与模板之间的非特异性结合[9],因此,有必要对ISSR引物进行退火温度的优化。本研究选择815引物,设置5个退火温度梯度,分别为49.0、50.1、51.2、52.2、53.0℃,结果见图7。由图7可以看出, 退火温度为52.2℃时扩增条带较多,且清晰,高于52.2℃扩增条带数明显减少,低于52.2℃扩增效果明显差于52.2℃, 故引物815最佳退火温度为52.2℃。

注:M: 100bp Plus Ⅱ DNA Ladder,1~5 退火温度:49.0、50.1、51.2、52.2、53.0 ℃Fig.7 Effect of the annealing temperature on ISSR amplificationNote: M: 100bp Plus Ⅱ DNA Ladder, 1~5 annealing temperature:49.0、50.1、51.2、52.2、53.0 ℃

2.4 ISSR 反应体系稳定性检测

根据优化ISSR-PCR体系及条件, 以53号为模板对合成的85条ISSR引物进行筛选,其中,65条引物能扩增出目的条带,占总引物的76.47%,在65条引物中有38条具有多态性,占总引物的58.46%。图8是从已筛选出重复性好、条带清晰的ISSR引物中随机挑选11条进行扩增效果,从图8可以看出,筛选到的引物均能扩增出清晰、亮度较好的条带,并且多态性较高。为了进一步确认ISSR-PCR反应体系的稳定性,我们以842为引物,利用确立的最优反应体系对6个南酸枣不同DNA模板进行PCR扩增,得了较好的指纹图谱( 图9)。由此可见,优化确定的南酸枣ISSR-PCR反应体系稳定可靠 ,可用于后期南酸枣种质资源的分子鉴定和遗传多样性分析等研究。

注:M: 100bp Plus Ⅱ DNA Ladder,1~11 引物:807、841、842、843、845、847、864、868、866、850、851Fig. 8 The result of ISSR amplification with thesame sample of Ch. axillarisNote: M: 100bp Plus Ⅱ DNA Ladder, No. 1~11 primers:807、841、842、843、845、847、864、868、866、850、851

Fig. 9 The result of amplification on the differentgermplasm of Ch. axillaris with primer 842

3 结论与讨论

南酸枣为漆树科南酸枣属植物,由于其遗传背景不清楚,以往研究主要集中在地理种源研究[10,11]、造林栽培技术[12,13]等方面,而对其在分子方面几乎是空白。ISSR是一种简单、快速、重复性好、可产生丰富产物的分子标记,由于不需要清楚植物的遗传背景使其在多种植物中广泛应用[14,15]。但ISSR是基于PCR的分子标记技术,其结果受到d NTP、Mg2+、引物浓度、模板DNA浓度和纯度、Taq酶含量等影响[16,17],因此,在开展ISSR深入研究之前, 对ISSR-PCR反应体系进行优化显得尤为重要。